專利名稱：腦紅蛋白在促進神經元突起生長中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及促進神經元突起生長技術，具體涉及腦紅蛋白在 促進神經元突起生長中的應用。
背景技術：
近年來，腦卒中、老年癡呆的發(fā)病率不斷上升，因交通和建筑及工程等事故引發(fā)的 腦/脊髓損傷也呈多發(fā)趨勢。在腦卒中、老年癡呆、腦/脊髓損傷等疾病中，神經元突起的 斷損、縮短是導致腦功能障礙的重要原因。而促進神經元突起的生長、再生是治療以上腦疾 病的關鍵。尋找能夠有效促進神經元突起生長的藥物和方法，是當前醫(yī)學和醫(yī)藥界面臨的
重要課題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是提供一種能夠促進神經元突起生長的物質。實現本發(fā)明的技術方案是本發(fā)明提供的能夠促進神經元突起生長的物質是腦紅蛋白(Neuroglobin，簡稱 Ngb，譯為腦紅蛋白或神經紅蛋白)。腦紅蛋白Neuroglobin(簡稱Ngb，譯為腦紅蛋白或神經紅蛋白)，為新近發(fā)現 的腦組織、神經元特異表達的含血卟啉結構的血紅蛋白家族成員。與已知的血紅蛋白 (hemoglobin)、肌紅蛋白(myoglobin)的最大不同是腦紅蛋白所含的血紅素為六配位鍵， 而非五配位鍵結構。Cytoglobin(簡稱Cygb，譯為細胞紅蛋白)是與腦紅蛋白結構相近的 另一新發(fā)現的血紅蛋白家族成員，廣泛表達于各種細胞和組織。腦紅蛋白的生理功能還不清楚，迄今為止，國內外還未見有關腦紅蛋白與神經突 起生長的報道。本發(fā)明在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元中發(fā)現，隨神經元突起的生長，腦紅蛋 白(Ngb)基因表達量顯著增加，而細胞紅蛋白(Cygb)的基因表達沒有變化。在原代培養(yǎng)的 小鼠大腦皮層神經元和小鼠神經瘤母細胞(neuroblastoma cell, N2acell)中轉染本課題 組構建的腦紅蛋白質粒，與對照組相比，腦紅蛋白基因編碼的蛋白表達量增加，神經元的突 起明顯增長。反之，采用RNA干擾技術抑制原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元和小鼠神經瘤 母細胞的內源性腦紅蛋白蛋白的表達，與對照組相比，神經細胞的突起明顯變短。本發(fā)明 研究充分證明腦紅蛋白具有促進神經元突起的生長作用。在小鼠神經瘤母細胞中轉染腦 紅蛋白質粒兩天后再予無氧無糖(體外模擬缺血)處理，與對照組相比，細胞的突起明顯增 長，證明增加腦紅蛋白在缺血病理狀態(tài)下仍具有促進神經元突起生長的作用。在腦卒中、老 年癡呆、腦/脊髓損傷等疾病中，神經元突起的斷損、縮短是腦功能障礙的重要原因，而促 進神經元突起的生長或再生是治療以上腦疾病的關鍵。因此，腦紅蛋白促進神經元突起生 長的這一新發(fā)現使得腦紅蛋白基因及其編碼的蛋白可用于制備治療腦卒中、老年癡呆、腦/ 脊髓損傷等疾病藥物。
實驗資料實驗目的1)明確腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)與神經元突起生長是否相關；2) 證明通過轉染腦紅蛋白基因，增加腦紅蛋白的蛋白表達，可促進神經元突起的生長；3)證 明通過RNA干擾技術抑制腦紅蛋白基因和蛋白的表達，可抑制神經元突起的生長；4)證明 在無氧無糖培養(yǎng)條件下，通過轉染腦紅蛋白基因，可促進神經細胞突起的生長。實驗動物、實驗細胞、試劑、實驗步驟及實驗結果與實施例中相應部分的內容一 致，見實施例。本發(fā)明實驗揭示l.Neuroglobin (腦紅蛋白)mRNA表達量與神經元突起生長呈正相關；2.轉染腦紅蛋白基因，提高腦紅蛋白的蛋白表達量，可以促進神經元突起的生長 和長度；3. RNA干擾可降低細胞內源性腦紅蛋白的蛋白表達量，并阻斷神經元突起的生 長；4.轉染腦紅蛋白基因，可以促進受無氧無糖(即缺血)損傷的神經元的突起生 長；5.利用基因或蛋白轉染技術增加腦紅蛋白的表達，對腦卒中、老年癡呆、腦外傷、 脊髓外傷等疾病造成的神經突起斷裂、回縮有潛在治療作用。利用腦紅蛋白(neuroglobin)促進神經元突起生長的功能，可將其用于治療神經 元突起損傷性疾病(包括腦卒中、老年癡呆、腦/脊髓損傷)的藥物或直接作為治療這類疾 病的藥物使用。具體可以利用基因或蛋白轉染技術提高腦紅蛋白表達，促進神經突起的生 長或修復，達到治療這類疾病的目的。


圖1 腦紅蛋白(Ngb)mRNA在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元中的表達圖。a為反 轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)代表性結果；b為統(tǒng)計結果，證明腦紅蛋白(Ngb)的相對表達 水平(與內參肌動蛋白(β-actin)比值)隨神經元生長時間顯著上升，**表示與0天相 比P<0.01 ；c為為統(tǒng)計結果，證明細胞紅蛋白(Cygb)的相對表達水平(與內參β-actin 比值)在神經元生長過程中無顯著差異。圖2 小鼠腦紅蛋白mRNA編碼區(qū)全長序列克隆圖。a為克隆獲得的小鼠腦紅蛋白 mRNA編碼區(qū)(即開放讀碼框架)的全長核苷酸序列；其中第270個核苷酸為胸腺嘧啶(T， 粗體)，在基因庫小鼠腦紅蛋白mRNA為胞嘧啶(C) ；b為所克隆的小鼠腦紅蛋白mRNA編碼的 151個氨基酸序列，與蛋白數據庫中的小鼠腦紅蛋白(蛋白數據號NP_071859. 1，http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_071859. 1)的 151 個氨基酸序列完全一致。圖 2 中用 整個序列表示本研究使用系列和基因庫系列，用區(qū)間編號范圍表示共同序列。圖3 腦紅蛋白(Ngb)真核表達載體的構建圖。a為所構建的p-Ngb_GFP表達載 體結構示意圖，小鼠Ngb編碼DNA序列被插入到p-EGFP-Nl載體的MCS (multiple cloning site,多克隆位點)區(qū)；b為p-EGFP-Nl載體的MCS核苷酸序列圖，腦紅蛋白DNA序列連接 到p-EGFP-Nl載體MCS區(qū)的Bgl II和Bam HI兩個酶切位點之間；c為所構建的p_Ngb_GFP 質粒測序結果，粗體下劃線部分為Ngb序列，兩端為載體序列。
圖4 轉染p-Ngb-GFP-Nl質粒增加細胞腦紅蛋白的蛋白表達量結果圖。a為小鼠 神經瘤母細胞分別轉染p-EGFP-Nl、p-Ngb-GFP-Nl、p-Cygb-GFP-Nl質粒2天后提取總蛋白、 測定蛋白濃度；取20μ g總蛋白經SDS/PAGE膠電泳分離、轉膜，用腦紅蛋白(Ngb) —抗和相 應的熒光二抗孵育，顯色結果證明轉染p-Ngb-GFP-Nl質粒表達Ngb-GFP蛋白；b為小鼠神 經瘤母細胞轉染p-Ngb-GFP-Nl質粒，一天后固定細胞，Ngb —抗和相應的TRITC-標記熒光 二抗染色，結果證明轉染p-Ngb-GFP-m使細胞內腦紅蛋白的蛋白表達量增多(箭頭指示細 胞)；(顯示轉染p-EGFP-m質粒的細胞無腦紅蛋白的高表達。所有圖片放大倍數一致，標 尺長度為10微米。圖5 過表達腦紅蛋白促進神經元突起的生長結果圖。a顯示過表達腦紅蛋白使神 經元突起長度增加。b為轉染細胞紅蛋白質粒對照結果，顯示神經元突起較短。c為轉染綠 色熒光蛋白質粒對照結果，顯示神經元突起較短。本實驗結果證明增加腦紅蛋白表達具有 促進神經元突起增長的作用。圖6:轉染p-Ngb-siRNA質粒抑制腦紅蛋白表達結果圖。其中a為合成的 Ngb-siRNA的核苷酸結構和測序結果，粗體下劃線部分為發(fā)揮RNA干擾作用的正向、反向序 列；b圖為本研究所使用的RNA干擾序列與基因庫序列比對結果腦紅蛋白干擾序列與基因 庫小鼠腦紅蛋白cDNA序列(BC024263. 1)片段480-498 —致；c圖為RT-PCR結果，證明轉 染p-Ngb-siRNA顯著降低小鼠神經瘤母細胞內腦紅蛋白基因的表達，Ngb質粒為陽性對照， N2a/Ngb-siRNA為轉染p-Ngb-siRNA質粒的N2a細胞，N2a/vec為轉染對照質粒的N2a細胞； 內參為β-actin ;d圖為Western blot結果，證明轉染p-Ngb-siRNA顯著降低N2a細胞內 Ngb蛋白的表達。*，P<0. 05。圖7 :siRNA干擾抑制腦紅蛋白表達阻礙神經突起的生長結果圖。在N2a神經瘤母 細胞中分別轉染腦紅蛋白RNA干擾質粒(即Ngb-siRNA)和空載體(即vec)三天，換無血清 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不同時間(0、3、6、12、24小時)，固定細胞，照相。結果顯示轉染Ngb-siRNA 的細胞突起長度比vec組細胞及未轉染的野生型細胞(wild type)明顯變短。標尺，20微 米。
具體實施例方式實施例1動物孕16天昆明小鼠(購白華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心)；細胞原代小鼠大腦皮層神經元，小鼠神經瘤母細胞(N2a細胞，50代以內用于實 驗)；試劑過表達質粒p-Ngb-EGFP-m、p-EGFP-Nl、p-Cygb-EGFP-Nl 本課題組構建；RNA 干 擾質粒Ngb-siRNA、N-control由本專利申請發(fā)明人應用計算機軟件設計干擾序列，上海 英濰捷基公司合成，本課題組構建；DMEM，0ΡΤΙ-ΜΕΜ，胎牛血清，Neurobasal (Gibco公司， 美國)；限制性內切酶EcoR I、Hind III、BamHI和Sal I以及PCR試劑(TAKARA公司，中 國)；Rnasin, oligo (dT) 15Primer 禾口 M-MLV reverse transcriptase (Promega 公司，美 國)；引物(上海生工生物工程有限公司)；siRNA載體質粒pGenesil-Ι (武漢晶賽生物技 術有限公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒(OMEGA公司，美國)；質粒大提試
5劑盒(QIAGEN 公司，美國)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司，美國)；Mouse Neuron Nucleofector Kit(Amaxa) ；neuroglobin Jfi# (Santa Cruz &司，_國)；―
酸點突變試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma，美國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus 1X70，日本)； 凝膠電泳分析系統(tǒng)(上海培新科技有限公司)；圖像分析系統(tǒng)(Image pro-plus Kodak，美 國)；厭氧艙(上海新苗科技有限公司)；多功能酶標儀SYNERGY2 (Bio-tech，美國)；紫外 分光光度計(Pharmacia Biotech，美國)，共聚焦顯微鏡LSM 510 (ZEISS，德國)。實驗步驟1.腦紅蛋白表達水平與神經元突起生長的相關性取孕16天小鼠胚胎，分離大腦 皮層神經元，接種到35-mm細胞培養(yǎng)皿正常培養(yǎng)(細胞培養(yǎng)方法參見申請人已發(fā)表文章 Chen et al.，J Neurosci Res 79 :114_8，2005)，分別提取培養(yǎng) 0、2、4、6、8 天的神經元總 RNA，取RNA 2微克，隨機引物(0. 5微克/微升)1微升，用無RNA酶水補足至12微升。在70°C 反應5分鐘，再在4°C反應3分鐘。依次加入5Xbuffer 4微升，RNasin (40單位/微升)1 微升，dNTPs (10微摩爾)2微升；混勻后置室溫5分鐘。加逆轉錄酶M-MLV 1微升后總體積 為20微升。置室溫10分鐘后，在42°C反應60分鐘，再70°C反應10分鐘，合成cDNA，采用上 海生工合成特異性小鼠腦紅蛋白的PCR引物(正向引物5’ -catcgggcagtgggagtgaggc-3 ； 反向引物5，-tccaggcggtccttgtagctg-3，)，按PCR標準反應體系以94°C反應2分鐘，94°C 變性45秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒，25個循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘，同時擴增腦 紅蛋白和內參β-actin(肌動蛋白)，將PCR產物電泳進行定量分析，以同一樣本的腦紅蛋 白/肌動蛋白比值代表腦紅蛋白的相對表達水平，實驗重復3次，SPSS統(tǒng)計軟件分析腦紅 蛋白基因在神經元突起生長過程中的表達差異，RT-PCR方法參見Chen et al. ,JNeurosci Res 79 :114-8，2005。2.腦紅蛋白(Ngb)促進小鼠神經瘤母細胞突起生長的作用小鼠神經瘤母細胞 按4X IO5個細胞傳35-mm細胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)約24小時至細胞有80-90 %融合時，將 培養(yǎng)液替換成Iml OPTI-M繼續(xù)培養(yǎng)1小時。將1. 5微升lipofectamine2000用500微 升OPTI-M稀釋并置室溫5分鐘，即為溶液A ；將質粒p-Ngb-EGFP-Nl或p_EGFP_Nl分別 用500微升OPTI-M稀釋，即為溶液B。將溶液B加到溶液A，混勻并置室溫30分鐘，即為 轉染緩沖液溶液C。用溶液C替換上述培養(yǎng)細胞的0ΡΤΙ-Μ，繼續(xù)培養(yǎng)6小時后換成正常培 養(yǎng)基(小鼠神經瘤母細胞培養(yǎng)及轉染方法參見申請人已發(fā)表文章Li et al.，Neurochem Res32(8) 1375-80. 2007)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，1)提取總蛋白，Western blot方法檢 測轉染細胞Ngb-EGFP蛋白的表達量；(Western blot方法參見申請人已發(fā)表文章Ye et al.，Pharmacologica Sinica 30:913-8,2009)。2)固定細胞，免疫熒光染色檢測腦紅 蛋白表達；(免疫熒光染色方法參見申請人已發(fā)表文章Li et al. , Neurochem Res 32: 1375-80.2007)。3)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時間點固定細胞，顯微鏡照相， Image-Pro Plus 6. 0軟件測量50個以上轉染細胞的突起長度；獨立重復實驗三次，SPSS統(tǒng) 計軟件分析數據。3.腦紅蛋白(Ngb)促進原代培養(yǎng)的神經元突起生長的作用取孕16天小鼠胚胎， 分離大腦皮層神經元，按Mouse Neuron Nucleofector Kit說明書分別轉染p-Ngb-EGFP-Nl 或p-EGFP-Nl或p-Cygb-EGFP-Nl質粒，轉染神經元并接種到35_mm細胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)3 6天，不同時間點固定細胞，顯微鏡照相，使用Image-Pro Plus 6. 0軟件測量50個以上神經 元的突起長度，重復獨立實驗至少3次，SPSS統(tǒng)計軟件分析數據。4.腦紅蛋白(Ngb) SiRNA干擾抑制小鼠神經瘤母細胞突起生長的作用小鼠神經 瘤母細胞按4X IO5個/毫升的密度接種到35-mm細胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)24小時，按步驟2 的方法分別轉染Ngb-siRNA或p-Gensil空載體6小時，換新鮮正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72小 時，按4X IO5個/ml傳35-mm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，1)PCR或Western blot分別檢測腦 紅蛋白基因和蛋白的表達；2)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)不同時間，固定細胞，顯微鏡照相， 使用Image-Pro Plus 6. 0軟件測量50個以上神經元的突起長度，重復實驗3次，SPSS統(tǒng) 計軟件分析數據。5.腦紅蛋白(Ngb) SiRNA干擾抑制原代培養(yǎng)神經元細胞突起生長的作用取孕16 天小鼠胚胎，分離大腦皮層神經元，按Mouse Neuron Nucleofector Kit說明書分別轉染 p-Ngb-siRNA-Gensil 或 p-N-control-Gensil 或 p-Cygb-siRNA-Gensi 質粒，轉染神經元并 接種到35-mm細胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)5天，不同時間點固定細胞，顯微鏡照相，測量轉染神經 元的突起長度，重復實驗至少3次，SPSS統(tǒng)計軟件分析數據。6.腦紅蛋白(Ngb)促進無氧無糖條件下N2a細胞突起生長的作用小鼠神經瘤母 細胞按4X IO5個細胞傳35-mm細胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)約24小時至細胞有80-90%融合時， 采用Iipofectamine 2000轉染方法(同前)轉染p-Ngb-EGFP-Nl或p-EGFP-Nl質粒6小 時。繼續(xù)正常培養(yǎng)24小時后，換無糖無血清培養(yǎng)液在厭氧艙37°C無氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)0、3、 6、9小時(無糖無氧培養(yǎng)具體方法參見申請人已發(fā)表論文Chen et al,Glia 42:315-324， 2003 ；Chen et al，J Cereb Blood Flow Metab 25 :338_347，2005)，固定細胞，顯微鏡照相， Image-Pro Plus 6. 0軟件測量50個以上轉染細胞的突起長度；獨立重復實驗三次，SPSS統(tǒng) 計軟件分析數據。實驗結果1.在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元，隨時間的延長神經元突起逐步增長，用反 轉錄(RT)-PCR方法證明腦紅蛋白mRNA表達量也隨神經元突起生長時程顯著增加，見圖la， b，而細胞紅蛋白(Cygb)mRNA表達不變，見圖Ic ；表明神經元突起的生長與腦紅蛋白的表達 正相關。2.采用RT-PCR方法從小鼠腦組織提取的總RNA中克隆出編碼小鼠腦紅蛋白的 cDNA全長序列(456個核苷酸)，經上海英濰捷基(Invitrogen)公司測序，圖2a結果顯示 所克隆的編碼小鼠腦紅蛋白的cDNA全長序列；將測序結果通過http://blast.ncbi.nlm. nih. gov網頁的neucleotide BLAST程序與基因庫mRNA序列相比對，結果顯示所克隆的小 鼠腦紅蛋白cDNA序列全長中僅第270個核苷酸不同(C — T)，見圖2a中粗體；blastx程 序顯示所克隆的小鼠腦紅蛋白cDNA序列編碼的氨基酸序列，見圖2b，與蛋白數據庫中小 鼠腦紅蛋白序列完全一致(蛋白數據號:NP_071859. 1，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ protein/NP_071859. 1)。小鼠腦紅蛋白基因編碼的腦紅蛋白蛋白全長與人源腦紅蛋白基因 編碼的蛋白有94%的同源性。3.用Bgl II和Bam HI酶將編碼腦紅蛋白的DNA片段雙酶切，與相同處理的 P-EGFP-Nl載體經T4連接酶相連接，構建成表達Ngb-GFP融合蛋白的p-Ngb_GFP質粒，結構 見圖3a ；圖3b 顯示腦紅蛋白基因插入p-EGFP-Nl載體MCS區(qū)的核苷酸序列；經上海英濰捷基公司測序顯示所插入的腦紅蛋白序列正確，見圖3c粗體部分，腦紅蛋白終止密碼序列 被去除以表達熒光融合蛋白。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為指示 蛋白，在熒光顯微鏡下可以直接觀察到。同樣方法制備了 P-Cygb-GFP表達質粒。4.將p-Ngb-GFP、p-Cygb-GFP、p-EGFP-Nl質粒分別轉染小鼠神經瘤母細胞(N2a)， Western blot方法證明只有轉染p-Ngb-GFP質粒的細胞表達大量的Ngb-GFP蛋白，該蛋白 可被腦紅蛋白(Ngb)抗體特異識別，見圖4a;細胞免疫熒光方法也證明轉染p-Ngb-GFP質 粒的細胞表達大量的Ngb-GFP，該蛋白可被Ngb抗體識別，見圖4b (箭頭指示細胞)，而轉染 p-EGFP-m質粒的細胞表達大量的綠色熒光蛋白(GFP)，該蛋白不被腦紅蛋白抗體識別，見 圖4c。這些結果均證明轉染p-Ngb-GFP質?？梢蕴岣呒毎X紅蛋白的量。5.小鼠神經瘤母細胞分別轉染p-Ngb-GFP、p-Cygb-GFP、p-EGFP-Nl質粒，換無血 清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3、6、9、18小時，測量細胞最長突起長度(> 50個細胞)，計算平均長度， 統(tǒng)計分析，結果證明過表達腦紅蛋白明顯促進小鼠神經瘤母細胞突起的長度(表1)。表1 過表達腦紅蛋白增加無血清培養(yǎng)基處理誘導的小鼠神經瘤母細胞突起長度 (χ ±5, η = 50-150)
權利要求
腦紅蛋白在促進神經元突起生長中的應用。
2.一種用于促進神經元突起生長的藥物組合物，其特征在于含有有效量的腦紅蛋白和 制藥學上可接受的載體。
3.腦紅蛋白在制備用于促進神經元突起生長藥物中的應用。
4.一種突變腦紅蛋白，其特征在于腦紅蛋白的第136位氨基酸位點由亮苷酸變?yōu)楦彼帷?br> 5.一種表達突變腦紅蛋白的基因，其特征在于腦紅蛋白基因編碼區(qū)第270個核苷酸由 胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏ぁ?br> 6.權利要求1至3任一項中所述的腦紅蛋白是權利要求4所述的突變腦紅蛋白。
7.—種表達載體，其特征在于，它包含權利要求5所述的表達突變腦紅蛋白的基因。
全文摘要
本發(fā)明在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元中發(fā)現，隨神經元突起的生長，腦紅蛋白基因表達量顯著增加。在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元以及小鼠神經瘤母細胞中轉染本發(fā)明構建的腦紅蛋白質粒，與對照組相比，腦紅蛋白基因編碼的蛋白表達增加，神經元的突起明顯增長，證明增加腦紅蛋白具有促進神經元突起的生長作用。在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經元以及小鼠神經瘤母細胞中轉染本發(fā)明構建的腦紅蛋白RNA干擾質粒，與對照組相比，內源性腦紅蛋白表達減少，神經細胞突起明顯變短，證明內源性腦紅蛋白具有促進神經元突起生長的生理作用。在小鼠神經瘤母細胞中轉染腦紅蛋白質粒后再予無氧無糖處理，與對照組相比，神經細胞的突起明顯增長，證明增加腦紅蛋白具有促進受損神經元突起的生長作用。
文檔編號A61P9/10GK101934069SQ20101025765
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權日2009年12月10日
發(fā)明者余上斌, 劉倩蓉, 李莉, 羅振釗, 賴曉晶, 陳曉釬 申請人:華中科技大學