專利名稱：烏骨雞黑色素提取物在制備防治帕金森病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及烏骨雞黑色素提取物的醫(yī)藥用途，特別涉及烏骨雞黑色素提取物在制備防治帕金森病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
帕金森病(PD)也稱震顫麻痹，在老年人中患病率僅次于腦血管疾病和老年性癡呆。在臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、肌張力增高、運動遲緩和姿勢不穩(wěn)等一系列癥狀。目前帕金森病的病因尚未清楚，一般認為可能與諸如線粒體功能缺陷、蛋白水解應(yīng)激、免疫異常、 細胞凋亡以及遺傳因素等方面的因素相關(guān)。帕金森病的主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密帶多巴胺(DA)能神經(jīng)細胞變性。帕金森病的發(fā)病與年齡有關(guān)，年齡老化是公認的帕金森病發(fā)病危險因素，有研究報道正常成年人黑質(zhì)多巴胺含量以每年7. 4%的速率呈年齡依賴性下降。 當前，世界上許多發(fā)達國家和發(fā)展中國家已經(jīng)進入了老齡化社會，在中國，老齡化現(xiàn)象尤為顯著。然而，目前用于防治帕金森病的藥物相對匱乏，尚無有效的方法可以逆轉(zhuǎn)或阻止其發(fā)展。因此，尋求能夠有效防治帕金森病的藥物成為研究熱點。烏骨雞黑色素是從烏骨雞提取的一種以吲哚環(huán)為主體的含硫異聚物，屬于動物源性真黑色素?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，烏骨雞黑色素具有抗紫外線、螯合重金屬離子、抗腫瘤以及提高機體免疫力等功能。迄今為止，烏骨雞黑色素或其提取物在制備防治帕金森病的藥物方面的用途尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了烏骨雞黑色素提取物在制備防治帕金森病的藥物中的用途，其中， 所述烏骨雞黑色素提取物作為所述藥物的活性成分。根據(jù)本發(fā)明所述的烏骨雞黑色素提取物的用途，其中，所述藥物還包含藥學上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明所述的烏骨雞黑色素提取物的用途，其中，所述藥物的劑型包括膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液以及注射劑。本發(fā)明中烏骨雞黑色素提取物可采用如下的提取方法獲得，該方法包括如下步驟1).制備烏骨雞肉泥；2).雙酶水解采用木瓜蛋白酶和風味酶消化步驟1)制得的烏骨雞肉泥；3).采用堿液除蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，上述提取方法中，步驟2)包括如下步驟A.向步驟1)制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為1 1至1 3的蒸餾水，加熱至 90°C至100°C并保溫10分鐘至20分鐘，然后冷卻至60°C至70°C，調(diào)節(jié)pH為5. 0至6. 0，然后向其中加入終濃度為3. 0%至4. 0%的木瓜蛋白酶，在60°C至70°C條件下消化2小時至 4小時；
B.將步驟A所得的混合物冷卻至50°C至60°C，調(diào)節(jié)pH為5. 5至6. 5，向所述混合物中加入終濃度為0. 4%至0. 7%的風味酶，在50°C至60°C條件下消化5小時至7小時；C.將步驟B所得的混合物加熱至90°C至100°C并保溫20分鐘至40分鐘；靜置分層，收集上層黑色素懸浮層；在3500Xg至4500Xg條件下離心10分鐘至20分鐘。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，上述提取方法中，步驟3)的操作方法如下以1 8至1 15(按體積計)的比例向所述步驟2)所得的物質(zhì)中添加pH為8 至10的NaOH溶液，加熱至55°C至75°C并保溫1小時至2小時，然后，在3500 X g至4500 X g 條件下離心5分鐘至10分鐘，收集沉淀。作為本發(fā)明的更加優(yōu)選的實施方式，上述提取方法中，步驟2)包括如下步驟A.向步驟1)制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為1 1的蒸餾水，加熱至100°C并保溫15分鐘，然后冷卻至65°C，調(diào)節(jié)pH至5. 5，然后向其中加入終濃度為3. 8%的木瓜蛋白酶，在65°C下消化2小時；B.將步驟A所得的混合物冷卻至55°C，調(diào)節(jié)pH至6. 0，加入終濃度為0. 6%的風味酶，在55°C下消化6小時；C.將步驟B所得的混合物加熱至100°C并保溫30分鐘；靜置分層，收集上層黑色素懸浮層；在4000Xg條件下離心15分鐘。作為本發(fā)明的更加優(yōu)選的實施方式，上述提取方法中，步驟3)的操作方法如下以1 10 (按體積計)的比例向所述步驟2)所得的物質(zhì)中添加pH為10的NaOH 溶液，加熱至60°C并保溫1. 5小時，然后，在4000Xg條件下離心5分鐘，收集沉淀。根據(jù)本發(fā)明所述的烏骨雞黑色素提取物的用途，其中，可將所述烏骨雞黑色素提取物懸浮于生理鹽水中使用。通過以下描述的本發(fā)明的具體實施方式
可以看出，烏骨雞黑色素提取物可有效阻止帕金森病發(fā)病過程中的多巴胺能神經(jīng)細胞變性，對多巴胺能神經(jīng)細胞具有保護作用。本發(fā)明將烏骨雞黑色素提取物應(yīng)用于防治帕金森病的藥物中，從而有效防治帕金森病。


圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例1在6-0H DA誘導的SHSY-5Y細胞損傷模型試驗中各組的LDH釋放量檢測值的統(tǒng)計分析圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例1在6-0H DA誘導的SHSY-5Y細胞損傷模型試驗中各組的細胞活力檢測值的統(tǒng)計分析圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例2在MPP+誘導的MN9D細胞損傷模型試驗中各組的LDH 釋放量檢測值的統(tǒng)計分析圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例2在MPP+誘導的MN9D細胞損傷模型試驗中各組的細胞活力檢測值的統(tǒng)計分析圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明實施例3在MPTP誘導的小鼠帕金森病模型試驗中各組小鼠轉(zhuǎn)棒儀上停留時間改變值的統(tǒng)計分析圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合附圖和具體實施方式
來進一步詳細描述本發(fā)明。
在本發(fā)明的實施方式中，分別利用細胞模型試驗和動物模型試驗來評價烏骨雞黑色素提取物對帕金森病發(fā)病中多巴胺能神經(jīng)細胞的保護作用。其中，細胞模型試驗所使用的兩種細胞株為SHSY-5Y細胞和MN9D細胞，兩者均為多巴胺能神經(jīng)細胞，分別使用6_0H DA 和MPP+來誘導。動物模型使用MPTP來誘導。本發(fā)明在細胞模型的試驗中分別使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放量和細胞活力作為檢測指標來分析細胞損傷的程度。LDH是存在于細胞胞漿中的一種脫氫酶，在各種細胞中穩(wěn)定表達，在細胞受損傷之后迅速釋放。因此，通過檢測細胞培養(yǎng)液的上清液中LDH的含量， 可以反映細胞受損傷的程度。本發(fā)明使用商業(yè)試劑盒檢測LDH的原理如下LDH氧化乳酸生成丙酮酸，后者進一步同四唑鹽INT反應(yīng)生成水溶性的甲臜，甲臜的生成量與細胞受損傷的程度呈正相關(guān)，通過比色檢測甲臜的含量可以靈敏、快速、準確地反映細胞受損傷的情況。MTS是一種四甲基偶氮唑鹽，在活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，被還原成藍色甲臜顆粒，該藍色甲臜顆粒的形成量與活細胞數(shù)和琥珀酸脫氫酶活性呈正相關(guān)，所以MTS與細胞共孵育后，所形成的藍色甲臜顆粒的量可以反映細胞活力。以下實施例中的試驗數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5. 0軟件進行統(tǒng)計分析并繪制分析圖，多組數(shù)據(jù)間差異用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計分析，并繼之以Tukey氏事后檢驗法進行檢驗。烏骨雞黑色素的提取可以采用本領(lǐng)域已知的方法，本發(fā)明采用了雙酶水解法并結(jié)合堿液除蛋白來提取烏骨雞黑色素，其中，分別使用木瓜蛋白酶和風味酶(也可使用復(fù)合蛋白酶)進行第一步和第二步的酶解。具體操作步驟如下1).制備烏骨雞肉泥將市售的烏骨雞屠宰，去毛，去內(nèi)臟，去骨，保留骨膜，絞成肉泥，取肉泥IOOOg ；2).雙酶水解A.向步驟1)制得的烏骨雞肉泥中添加蒸餾水，蒸餾水與雞肉泥的重量比為 1 1，攪拌均勻，加熱至100°C并保溫15分鐘，然后冷卻至65°C，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入終濃度為3.8%的木瓜蛋白酶(購自廣西南寧龐博生物工程有限公司)，攪拌均勻，在65°C下消化2小時；B.將步驟A所得的混合物冷卻至55°C，調(diào)節(jié)pH至6. 0，然后，向所述混合物中加入終濃度為0. 6%的風味酶(購自廣西南寧龐博生物工程有限公司)，在55°C下消化6小時；C.通過將步驟B所得的混合物加熱至100°C并保溫30分鐘，對酶進行滅活；靜置分層，收集上層黑色素懸浮層；在4000Xg條件下離心15分鐘，收集沉淀，得到烏骨雞黑色素粗提品；3).采用堿液除蛋白。以1 10 (按體積計)的比例向步驟3)所得的粗提品中添加pH為10的NaOH溶液，攪拌均勻，加熱至60°C并保溫1. 5小時，然后，在4000 X g條件下離心5分鐘，收集沉淀；
重復(fù)該過程，共4次。使用蒸餾水洗滌上述方法所得的沉淀3次，真空干燥洗滌后的沉淀物，得到烏骨雞黑色素精提品。由上述步驟1)的IOOOg烏骨雞肉泥獲得了 Ig烏骨雞黑色素精提品。實施例1、烏骨雞黑餼素提取物在6-0H DA誘導的SHSY-5Y細胞損傷模型中的保護作用1、實驗材料1、烏骨雞黑色素提取物取根據(jù)上述烏骨雞黑色素提取方法制備的烏骨雞黑色素精提品，以0. 2g/ml的濃度將其懸浮于生理鹽水中備用。2)、IOmM 6_0H DA儲存液準確稱取5mg的6_0H DA 'HBr (購自SIGMA)，將其溶于 2ml含0. 01 %維生素C的蒸餾水中，使用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，分裝保存于_20°C。 使用前將其稀釋至相應(yīng)濃度。3)、SHSY-5Y 細胞購自 ATCC。4)、SHSY-5Y細胞培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液(購自 SIGMA)，加入 10% FBS(購自 SIGMA)。5)、0· 125% 胰蛋白酶-0.01 % EDTA (ρΗ 7. 4，1L)取 12. 5g 胰蛋白酶(購自 SIGMA)和0. Ig EDTA置于容器中，然后，使用0. OlM PBS (磷酸鹽緩沖液)定容至1L，使用 0.22 um微孔濾膜過濾，在-20°C條件下保存。2、實驗方法1)、細胞的換液與傳代在37°C、5% CO2條件下，在細胞培養(yǎng)箱中進行SHSY-5Y細胞的培養(yǎng)。使用SHSY-5Y 細胞培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液)在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)SHSY-5Y細胞，每2至3天換液一次。待細胞貼壁生長至鋪滿所述培養(yǎng)瓶底面的80%時，用0. 125%胰酶-0. 01% EDTA將細胞消化至即將漂浮，向培養(yǎng)瓶中加入至少10倍體積的SHSY-5Y細胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)，并用滴管仔細吹打，形成單細胞懸液，以1 3分瓶傳代。2)、分組試驗將SHSY-5Y細胞接種于聚左旋賴氨酸(購自SIGMA)包被的96孔板，分6組，每組設(shè)6個微孔，接種密度為3 X104/ml，每孔接種體積為200μ 1。于37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)所述細胞M小時后更換新鮮的SHSY-5Y細胞培養(yǎng)液。向組1的微孔分別添加25 μ M的生理鹽水；向組2的微孔分別添加25 μ M的6-0Η DA ；向組6的微孔分別添加100 μ g/ml的烏骨雞黑色素提取物；組1、組2以及組6的微孔分別在培養(yǎng)箱中于37°C和5% CO2條件下共孵育36小時；向組3、組4以及組5的各微孔分別添加終濃度為1 μ g/ml、10 μ g/ml以及 100 μ g/ml的烏骨雞黑色素提取物，共孵育1小時，然后分別添加25 μ M的6-0Η DA,在培養(yǎng)箱中于37°C和5% CO2條件下共孵育36小時。3)、LDH釋放量的檢測采用Cyt0I10x 96 試劑盒(購自Promega公司)，操作方法如下取上述各組的細胞培養(yǎng)液的上清液，在250 X g條件下離心15分鐘，然后以50 μ 1/孔將上清液加至96孔板，再加入等量LDH反應(yīng)混合液，混勻后，避光室溫反應(yīng)20分鐘，用酶標儀檢測甲臜的生成量，檢測波長為490nm。使用SHSY-5Y細胞培養(yǎng)液作為空白對照，使用含1 % Triton X-100 的SHSY-5Y細胞培養(yǎng)液處理SHSY-5Y細胞的上清液作為陽性對照。由此得到的上述各組的 LDH檢測數(shù)據(jù)見表1。表1 :6-0H DA誘導的SHSY-5Y細胞損傷模型試驗中各組的LDH釋放量檢測值
權(quán)利要求
1.烏骨雞黑色素提取物在制備防治帕金森病的藥物中的用途，其中，所述烏骨雞黑色素提取物作為所述藥物的活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述藥物還包含藥學上可接受的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述藥物的劑型包括膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液以及注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述烏骨雞黑色素提取物的提取方法包括如下步驟1).制備烏骨雞肉泥；2).雙酶水解采用木瓜蛋白酶和風味酶消化步驟1)制得的烏骨雞肉泥；3).采用堿液除蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，步驟2)包括如下步驟A.向步驟1)制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為1 1至1 3的蒸餾水，加熱至90°C 至100°C并保溫10分鐘至20分鐘，然后冷卻至60°C至70°C，調(diào)節(jié)pH為5. 0至6. 0，然后向其中加入終濃度為3. 0%至4. 0%的木瓜蛋白酶，在60°C至70°C條件下消化2小時至4小時；B.將步驟A所得的混合物冷卻至50°C至60°C，調(diào)節(jié)pH為5.5至6. 5，向所述混合物中加入終濃度為0. 4%至0. 7%的風味酶，在50°C至60°C條件下消化5小時至7小時；C.將步驟B所得的混合物加熱至90°C至10(TC并保溫20分鐘至40分鐘；靜置分層， 收集上層黑色素懸浮層；在3500Xg至4500Xg條件下離心10分鐘至20分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，步驟3)的操作方法如下以1 8至1 15(按體積計)的比例向所述步驟2)所得的物質(zhì)中添加pH為8至10 的NaOH溶液，加熱至55°C至75°C并保溫1小時至2小時，然后，在3500 X g至4500 X g條件下離心5分鐘至10分鐘，收集沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，步驟2)包括如下步驟A.向步驟1)制得的烏骨雞肉泥中添加重量比為1 1的蒸餾水，加熱至100°C并保溫 15分鐘，然后冷卻至65°C，調(diào)節(jié)pH至5. 5，然后向其中加入終濃度為3. 8%的木瓜蛋白酶， 在65°C下消化2小時；B.將步驟A所得的混合物冷卻至55°C，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入終濃度為0. 6%的風味酶， 在55°C下消化6小時；C.將步驟B所得的混合物加熱至100°C并保溫30分鐘；靜置分層，收集上層黑色素懸浮層；在4000 Xg條件下離心15分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，步驟3)的操作方法如下以1 10(按體積計)的比例向所述步驟2)所得的物質(zhì)中添加pH為10的NaOH溶液， 加熱至60°C并保溫1. 5小時，然后，在4000Xg條件下離心5分鐘，收集沉淀。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的用途，其中，將所述烏骨雞黑色素提取物懸浮于生理鹽水中使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了烏骨雞黑色素提取物在制備防治帕金森病的藥物中的用途，其中，所述烏骨雞黑色素提取物作為所述藥物的活性成分。本發(fā)明提供的烏骨雞黑色素提取物可通過雙酶水解法并結(jié)合堿液除蛋白來制備。根據(jù)本發(fā)明可知，烏骨雞黑色素提取物能夠有效阻止帕金森病發(fā)病過程中的多巴胺能神經(jīng)細胞變性，對多巴胺能神經(jīng)細胞具有保護作用，從而有效防治帕金森病。
文檔編號A61P25/16GK102370661SQ20101025774
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者李博, 賀毅 申請人:首都醫(yī)科大學