專利名稱：一種含有抑制血管增生的融合蛋白的藥物組合物及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物制劑領域，涉及包含VEGF受體片段和免疫球蛋白Fc融合而成的蛋白的藥物組合物，以及其在醫(yī)療上的應用。
背景技術：
隨著現(xiàn)代細胞分子生物學的發(fā)展，細胞因子和細胞表面相關分子在眼科疾病中的作用已經(jīng)被廣泛的關注和研究，VEGF是血管內(nèi)皮細胞促有絲分裂素具有增加血管通透性的生物特性，在胎兒時期VEGF對血管的發(fā)生極為重要，出生后水平下降。生理狀態(tài)下 VEGF呈低水平表達狀態(tài)，對于維持血管的功能是必要的。最新的研究結(jié)果提示，對于老年性視網(wǎng)膜血管病變(Age-related macular degeneration，簡稱為AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)等血管新生相關的疾病都起著廣泛和重要的作用。AMD多發(fā)生于45歲以上，其患病率隨年齡的增長而增高，是當前中老年人致盲的重要疾病。濕性 AMD主要為玻璃膜的破壞，脈絡膜血管侵入視網(wǎng)膜下構成脈絡膜新生血管，發(fā)生黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮下或神經(jīng)上皮下漿液性或出血性的盤狀脫離，最終成為機化瘢痕，有效抑制導致濕性黃斑病變的血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF，阻斷VEGF或VEGF受體從而達到抑制血管新生具有重要的有著重要的治療作用。在DR中，細胞和體液中VEGF的含量高于正常水平。 VEGF增高，引起毛細血管通透性改變，引起視網(wǎng)膜滲出，出血及視網(wǎng)膜黃斑水腫，誘導血管生成素(Angiogenin)生成增加，協(xié)同促進視網(wǎng)膜新生血管的形成，造成視力損害。鹽鍵、氫鍵、二硫鍵和疏水作用是維持蛋白質(zhì)構象穩(wěn)定作用力。金屬離子、底物、輔助因子和其他低相對分子量配體的相互作用使蛋白構象穩(wěn)定。蛋白質(zhì)與其它的生物大分子尤其是蛋白質(zhì)與脂的作用。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)常與脂類或多糖相互作用形成復合物，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域，從而顯著增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。蛋白不穩(wěn)定主要由以下因素引起(1)物理作用由布朗運動調(diào)節(jié)的極性水分子與蛋白質(zhì)疏水核的接觸會導致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。( 化學作用活性部位的氨基酸殘基的氧化作用是酶失活的最常見機理之一。如半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚環(huán)，對氧化特別敏感。( 生物學作用蛋白質(zhì)水解酶作用。 微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽鍵水解。由基因工程菌純化真核細胞多肽時收率低， 是由于體外蛋白水解造成的。聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸殘基暴露于水溶劑，導致蛋白質(zhì)可逆變性； 其次，蛋白質(zhì)分子彼此締合，以減少疏水氨基酸的不利裸露；最后，如果蛋白質(zhì)分子含有半胱氨酸和胱氨酸殘基，則會發(fā)生分子間二硫鍵交換反應。聚合作用有時可通過還原和再氧化再生天然二硫鍵，使蛋白質(zhì)再活化。聚合和簡單沉淀是有區(qū)別的，后者并未使蛋白質(zhì)發(fā)生顯著的構象變化。本發(fā)明人還觀察到一個明顯的問題是溶液制劑在長期儲存后容易形成可溶聚合物和不可溶顆粒，如何解決這個問題，找到一種在物理和化學上都穩(wěn)定的藥物組合物，能夠抑制聚合物生成，并能夠在長期儲存后形成較少的可溶聚合物和不溶顆粒。另外，由于其組分是藥學上可接受的組分，可以用于治療眼部疾病，包括玻璃體內(nèi)注射和外部給藥。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)得到的制劑處方在注射器中比在小瓶中更加穩(wěn)定。本發(fā)明中采用能夠抑制血管新生，由血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)受體1的細胞外結(jié)構域2(Flt-2)和VEGF受體2的細胞外結(jié)構域3和4(KDR-3，4)與人免疫球蛋白I(Gl) Fc的融合而成的蛋白(FP3蛋白)是通過重組技術的工作細胞表達并經(jīng)過純化后達到藥用純度，經(jīng)過換液制劑分裝制得合適的藥物制劑。這些制劑優(yōu)選液體制劑或凍干制劑，適用于眼睛疾病的治療，尤其是用于玻璃體注射。FP3蛋白作為蛋白藥物，其穩(wěn)定性比普通小分子化學藥物差很多，相比于天然存在的免疫球蛋白，其穩(wěn)定性也更差。中國專利所述的融合蛋白是中國專利“VEGF受體融合蛋白在治療眼睛疾病中的應用”(專利號ZL200610066257.2)中描述的處方需要在_20°C保存，對藥物的生產(chǎn)，運輸保存和應用都提出了較高的要求。眾所周知，一般重組的融合蛋白的穩(wěn)定性都比較差，在保存過程中會受到多種環(huán)境因素的影響，如溫度，適度，氧，紫外線等都可以是融合蛋白發(fā)生多種物理或化學變化，造成蛋白質(zhì)的聚合，分解，氧化或變性等。這些變化都可以使蛋白的活性降低，治療效果下降并引起嚴重的毒副作用。因此，開發(fā)出穩(wěn)定且易于運輸和貯藏的融合蛋白制劑是具有十分重要的臨床意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種含有的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)受體1的細胞外結(jié)構域2(Flt-2)和VEGF受體2的細胞外結(jié)構域3和4(KDR_3，4)與人免疫球蛋白 I(Gl)Fc的融合蛋白的藥物組合物，更具體的是能用于玻璃體注射的液體制劑，該液體制劑能使融合蛋白保持穩(wěn)定，其最突出的特征是能有效抑制融合蛋白聚合物的產(chǎn)生而造成的純度下降，從而保持有效組分的生物活性。本發(fā)明一方面提供了一種含有抑制血管增生的融合蛋白的藥物組合物，其特征在于包含(a) 0. l-100mg/ml的VEGF受體1的細胞外結(jié)構域2和VEGF受體2的細胞外結(jié)構域3和4與人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，包含SEQ ID No 1的氨基酸序列；(b)5-100mM緩沖液，其中的酸選自Tris-HCl，檸檬酸，磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，醋酸，丁二酸，鹽酸中的一種或多種；(C) 5-500mM堿性氨基酸選自賴氨酸，精氨酸，和組氨酸中的一種或其組合；(d)0. 1-30%鹽滲透壓劑調(diào)節(jié)劑，其中的糖選自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一種或多種，鹽選自氯化鈉或其它藥學上可以接受的鹽中的一種或其組合；(e) 0.01-0. 1 %的一種或多種表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇，吐溫20，吐溫 80，丙二醇，二甲基亞砜或其它藥學上可以接受的表面活性劑中的一種或多種；(f)調(diào)節(jié) pH 為 7. 5 8. 3。其中藥物組合物優(yōu)選為包含下列組分的藥物組合物(a) 10-40mg/ml 的如 SEQ ID No 1 的融合蛋白；(b) 5-100mM的檸檬酸或磷酸二氫鈉的一種或兩種；(c) 5-500mM的精氨酸或組氨酸的一種或兩種；(d) 8-30%的蔗糖或海藻糖的一種或兩種；
(e)0. 01-0. 的吐溫-20或聚乙二醇的一種或兩種；(f)調(diào)節(jié) pH 為 7. 5 8. 3。本發(fā)明所述優(yōu)選的藥物組合物還可以含有氯化鈉。本發(fā)明更優(yōu)的提供了一種由10-40mg/ml的如SEQ ID No 1的融合蛋白、IOmM的檸檬酸，5%的蔗糖，IOOmM的精氨酸，0. 05%的吐溫20，pH7. 5 8. 3組成的藥物組合物。本發(fā)明還進一步提供了一種10-40mg/ml的如SEQ ID No 1的融合蛋白、55mM的檸檬酸，12. 5%的蔗糖，250mM的精氨酸，0. 05%的吐溫20，ρΗ7· 9緩沖液，ρΗ7· 5 8. 3。上述藥物組合物制成的制劑形式可為液體制劑或凍干制劑，其中液體制劑優(yōu)選為眼用制劑，尤其是滴眼液；還可以為預填充注射劑。上述藥物組合物可以用于治療血管新生或生長引起的疾病，優(yōu)選為年齡相關性黃斑變性。在本發(fā)明中，所述的融合蛋白是中國專利“VEGF受體融合蛋白在治療眼睛疾病中的應用”(專利號ZL200610066257. 2)中描述的融合蛋白，具體而言是FP3融合蛋白，因此 ZL200610066257. 2的內(nèi)容可用于進一步闡述本發(fā)明。
具體實施例方式實施例1 10mg/ml FP3融合蛋白原處方在4°C下3ml玻璃安瓿中的穩(wěn)定性研究處方如下FP3 融合蛋白10mg/ml丁二酸鈉IOmM海藻糖9.0%吐溫 200. 05%用鹽酸調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH到6. O 6. 5將蛋白原液換液后，無菌分裝得到3ml玻璃安瓿中，4°C留樣，在0，1，2，3，4，5，6， 7,8,9,10，11，12月測定樣品，通過SEC-HPLC確定穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，該處方不能有效抑制聚合物的生成，造成產(chǎn)品純度下降，與VEGF的親和力降低，進入體內(nèi)以后可能誘發(fā)免疫反應。表1. 10mg/ml FP3融合蛋白在4°C的穩(wěn)定性
時間(月)外觀Pt^濃度(mg/ml)聚合物(％ )親和力(PM)0合格6. 010. 00. 310. 61合格6. 09. 41. 99. 52合格6. 010. 22. 89. 13合格6. 010. 23. 68. 76合格6. 010. 09. 18. 權利要求
1.一種含有抑制血管增生的融合蛋白的藥物組合物，其特征在于包含(a)0.l-100mg/ml的VEGF受體1的細胞外結(jié)構域2和VEGF受體2的細胞外結(jié)構域3 和4與人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，包含SEQ ID No 1的氨基酸序列；(b)5-100mM緩沖液，其中的酸選自Tris-HCl，檸檬酸，磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，醋酸，丁二酸，鹽酸中的一種或多種；(c)5-500mM堿性氨基酸選自賴氨酸，精氨酸，和組氨酸中的一種或其組合；(d)0. 1-30 %鹽滲透壓劑調(diào)節(jié)劑，其中的糖選自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一種或多種，鹽選自氯化鈉或其它藥學上可以接受的鹽中的一種或其組合；(e)0.01-0. 的一種或多種表面活性劑或助溶劑，選自聚乙二醇，吐溫20，吐溫80， 丙二醇，二甲基亞砜或其它藥學上可以接受的表面活性劑中的一種或多種；(f)調(diào)節(jié)pH為7.5 8. 3。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于包含(a)10-40mg/ml 的如 SEQ ID No 1 的融合蛋白；(b)5-100mM的檸檬酸或磷酸二氫鈉的一種或兩種；(c)5-500mM的精氨酸或組氨酸的一種或兩種；(d)8-30%的蔗糖或海藻糖的一種或兩種；(e)0.01-0. 的吐溫-20或聚乙二醇的一種或兩種；(f)調(diào)節(jié)pH為7.5 8. 3。
3.根據(jù)權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于還可以含有氯化鈉。
4.根據(jù)權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于由以下組分組成10-40mg/ml的如 SEQ ID No :1的融合蛋白、IOmM的檸檬酸，5%的蔗糖，IOOmM的精氨酸，0.05%的吐溫20， ρΗ7· 5 8. 3。
5.根據(jù)權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于由以下組分組成10-40mg/ml的如 SEQ ID No :1的融合蛋白、55mM的檸檬酸，12. 5%的蔗糖，250mM的精氨酸，0. 05%的吐溫 20，ρΗ7· 5 8. 3。
6.根據(jù)權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的如SEQID No :1的融合蛋白為 10mg/mlo
7.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的藥物組合物，其特征在于制成液體制劑或凍干制劑。
8.根據(jù)權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于制成的液體制劑為眼用制劑，尤其是滴眼液。
9.根據(jù)權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于制劑形式為預填充注射劑。
10.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的藥物組合物，其特征在于在制備治療由血管新生或生長引起的疾病的藥物中的用途，尤其是年齡相關性黃斑變性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有抑制血管增生的融合蛋白的藥物組合物及用途，具體涉及一種含有的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)受體1的細胞外結(jié)構域2(Flt-2)和VEGF受體2的細胞外結(jié)構域3和4(KDR-3，4)與人免疫球蛋白1(G1)Fc的融合蛋白的藥物組合物，該藥物組合物能使融合蛋白保持穩(wěn)定，其最突出的特征是能有效抑制融合蛋白聚合物的產(chǎn)生而造成的純度下降，從而保持有效組分的生物活性。
文檔編號A61P27/02GK102380096SQ20101026750
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者柯瀟, 鄭強 申請人:成都康弘生物科技有限公司