專利名稱：一種o型口蹄疫病毒vp2抗原表位的分子模擬肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物傳染病預(yù)防和疫苗研制領(lǐng)域，具體涉及一種能模擬0型口蹄疫病 毒VP2抗原表位的短肽，以及該短肽在制備免疫原、豬0型口蹄疫疫苗上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸 性傳染病。該病傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)發(fā)生大流行。雖然該病的死 亡率不高(幼畜除外)，但造成動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，撲殺動(dòng)物花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力， 影響國(guó)際貿(mào)易，經(jīng)濟(jì)損失慘重。如1997我國(guó)臺(tái)灣、2000年日本和韓國(guó)、2001年英國(guó)暴發(fā)的 口蹄疫可以說(shuō)給這些地區(qū)或國(guó)家畜牧經(jīng)濟(jì)造成了致命的打擊。為此，世界各國(guó)非常重視口 蹄疫防控措施的研究。該病的致病病原體為口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)，屬于 小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，該病毒有七個(gè)血清型，各型之間無(wú)交叉保護(hù)反應(yīng)。疫苗接種 是特異性預(yù)防口蹄疫的可靠和有效手段。雖然目前使用的口蹄疫病毒弱毒疫苗和滅活疫苗 等常規(guī)疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制口蹄疫病毒的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但 由于病毒毒力返強(qiáng)、病毒滅活不徹底、活病毒在工廠制備時(shí)逃逸等不安全因素，世界上一些 地區(qū)口蹄疫的暴發(fā)似乎與滅活疫苗中殘存的活病毒有關(guān)，促使人們尋求一種更加安全有效 的口蹄疫疫苗。噬菌體表面展示技術(shù)是上世紀(jì)九十年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的基因操作技術(shù)，它 使表達(dá)的外源肽與噬菌體表面特定蛋白融合并展示于其表面，被展示的多肽可以保持相對(duì) 獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物特性，借以研究多肽的性質(zhì)、相互識(shí)別和作用，并據(jù)此從巨大的展示 肽庫(kù)中選擇出具有特定功能的多肽(噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)及其應(yīng)用研究現(xiàn)狀，中國(guó)病原生 物學(xué)雜志，2007，2 (2) 152-154)。由于抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的過(guò)程中起決定作用的結(jié)構(gòu)是抗原表位，而通常表 位的長(zhǎng)度不過(guò)幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸，因此以抗原表位為免疫原的疫苗設(shè)計(jì)是基因工程疫苗 的一種重要形式。多肽表位使靶分子的抗原性與毒性作用分離，疫苗載體表面僅展示抗原 表位肽段，不存在完整的靶分子結(jié)構(gòu)，也不具有完整的靶分子功能。但是，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)抗 原表位分析方法主要是通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克 隆抗體篩選能與之起陽(yáng)性反應(yīng)的片段，并以此間接推測(cè)抗原表位分布區(qū)域及構(gòu)成表位的關(guān) 鍵M基酸(Mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein of the severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 2004 Nov ；42(11) 5309-14.蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位測(cè)定方法的研究進(jìn)展，黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，7 :23-24)。 此方法篩選出的表位為線性表位，而天然完整蛋白質(zhì)的抗原表位中，僅10%為線性抗原表 位，90%是構(gòu)象型表位，因此傳統(tǒng)方法篩選的序列肽僅模擬蛋白質(zhì)的線性表位，難以形成構(gòu) 象表位。而且這種方法存在工作量大，工作效率低，成本高等缺陷。雖然，早在1982年，Bittle和PfafT等就利用免疫原性多肽首次確定了位于FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VPl第140 160位氨基酸之間的G2H環(huán)內(nèi)含有一個(gè)免疫原性位點(diǎn)，稱之為siteA，是最主要的抗原位點(diǎn)；Krebs和Baxt等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，O型FMDV的VPl變異主要發(fā)生 在140 160位和200 211位兩段抗原表位區(qū)，這兩個(gè)肽段是決定免疫原性的抗原決定 簇，但是以這些抗原表位區(qū)構(gòu)建或合成的表位疫苗均無(wú)法在仔豬體內(nèi)誘導(dǎo)高效的免疫應(yīng) 答(Induction of an antigen-specific immune response and partial protection of cattle against challenge infection with foot-and-mouth disease virus(FMDV)after lipopeptide vaccination with FMDV-specific B-cell epitopes. JGen Virol. 2003 ； 84 (Pt 12) :3315-24.)。另有報(bào)道位于VP2的70 78位氨基酸和131-134位氨基酸也是B 細(xì)Ifi^:位(Sequence analysis of monoclonal antibody resistant mutant s of type 0 foot2and2mouth disease virus :evidence for the involvement of the three surface exposed cap sid proteins in four antigen sites. J Virol, 1990,179 :26 34.),但未 有誘導(dǎo)有效免疫保護(hù)的報(bào)道。因此在口蹄疫病毒外殼蛋白(VP1、VP3、VP2和VP4)中篩選出 能誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答和保護(hù)效果的抗原表位將極大地促進(jìn)口蹄疫疫苗的研制。而噬菌體表面展示技術(shù)，是一種抗原多肽篩選的簡(jiǎn)便有效、成本低廉的方法。噬菌 體展示技術(shù)篩選到的多肽與普通的線性多肽相比擴(kuò)大了疫苗靶分子選擇范圍。因?yàn)樵摷夹g(shù) 篩選的模擬抗原表位不僅可以模擬多肽、蛋白質(zhì)的線性表位，還能模擬空間表位以及多糖、 寡核苷酸等抗原性較弱的抗原位點(diǎn)，從而以此設(shè)計(jì)的表位疫苗可能誘導(dǎo)更為有效的免疫應(yīng) 答。目前，基因工程疫苗在許多疫病的控制中已經(jīng)發(fā)揮了重要作用。但是，可接近或超 過(guò)口蹄疫滅活疫苗免疫保護(hù)效果的FMDV基因工程疫苗尚缺乏，若能篩選獲得具有FMDV中 和活性的FMDV模擬表位，將有利于研制更為有效的基因工程疫苗。本申請(qǐng)人已于2008年10月28日申請(qǐng)了中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200810201859. 3，發(fā) 明名稱為“一種0型口蹄疫病毒抗原表位的分子模擬肽及其用途”，是針對(duì)0型口蹄疫病毒 VPl抗原表位的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出一種0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽，并提供 該短肽在制備免疫原、豬口蹄疫表位肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明利用噬菌體表面展示技術(shù)來(lái)篩選有效的FMDV表位，篩選的結(jié)果為本發(fā)明 提供了一種0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽，所述肽的氨基酸序列如下所示KGYDQELATSPE(SEQ ID NO 1)上述0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽為12個(gè)氨基酸的短肽。本發(fā)明提供的是具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的短肽。本發(fā)明的0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽，是用以下方法篩選得到 的以0型FMDV感染的豬血清IgG為靶蛋白，從噬茵體展示的隨機(jī)線形十二肽庫(kù)(New England Biolabs公司)中篩選到與VP2蛋白結(jié)合的短肽。上述短肽可通過(guò)本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)如化學(xué)合成等方法制備。將本發(fā)明公開(kāi)的短肽序列與GeneBank中已公布的FMDV的蛋白序列進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)有同源性，這些短肽可部分抑制天然抗原與多抗的結(jié)合，說(shuō)明它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上能模擬天 然抗原表位，為一種新的抗原表位的分子模擬肽。本發(fā)明還提供了上述0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽在制備免疫原上 的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽在制備豬口蹄疫 表位肽疫苗中的應(yīng)用。
將上述分子模擬肽與乙肝病毒核心蛋白類病毒顆粒HBc-VLP融合表達(dá)。經(jīng)原核表 達(dá)純化后做為免疫原，免疫接種小鼠，獲得了特異識(shí)別0型FMDV的抗體，說(shuō)明該表位肽構(gòu)成 免疫原后可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)OSFMDV的抗體。利用本發(fā)明的短肽，可以提供 一種研制新型FMDV疫苗的途徑，該表位肽疫苗具有靶分子的抗原性而不具有毒性，十分安 全，且大規(guī)模生產(chǎn)成本很低，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1陽(yáng)性噬菌體抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)圖2重組表達(dá)載體pBAD-印itope的酶切鑒定其中1. DL 2000分子量標(biāo)記；2. DL 15000分子量標(biāo)記；3.重組質(zhì)粒 pBAD-epitope 經(jīng) Nco I 和 Xho I 酶切圖3融合表位的HBc嵌合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳結(jié)果及Western分析結(jié) 果其中M是分子量標(biāo)記；1 4是E. coli轉(zhuǎn)入pBAD-印itope重組質(zhì)粒后的誘導(dǎo)表 達(dá)結(jié)果；C是陰性對(duì)照；W為Western分析結(jié)果圖4pBAD_印itope表達(dá)的重組嵌合蛋白形成病毒樣顆粒的電鏡下顆粒觀察結(jié)果 (放大倍數(shù)X 5，000)圖5重組蛋白免疫Balb/C小鼠誘導(dǎo)FMDV病毒特異性抗體的產(chǎn)生
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1 豬0型口蹄疫病毒VP2抗原模擬表位的篩選及序列分析一、實(shí)驗(yàn)材料1.噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)試劑盒噬菌體表面衣殼蛋白III展示的線形12肽庫(kù)試劑盒購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。肽庫(kù)的滴度4X 1012pfu/ml，隨機(jī)多樣性1. 9X IO9 ；受體菌E. coli ER2537 基因型 % F' IacqA (IacZ)M15proA+B+fhuA2 supE thi Δ (lac-proAB) Δ (hsdMS-mcrB) 5 (rkWMcrBC)。2.化學(xué)試劑BSA 購(gòu)自 Roche 公司；IPTG、X-gal 購(gòu)自 Bebco 公司；PEG8000、PEG20000、ABTS, Tween20購(gòu)自Sigma公司；口蹄疫ELISA檢測(cè)試劑盒為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸藥研究所 生產(chǎn)；HRP標(biāo)記的抗M13單克隆抗體、DEAE sephadex A50購(gòu)自Pharmacia公司；豬0型 FMDV-VP2核酸疫苗載體(pcDNA3-VP2)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其中pcDNA3載體購(gòu)自Invitrogen公司；VP2序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中口蹄疫病毒NYOO株的序列合成(AY333431)；豬O型口蹄 疫陽(yáng)性抗血清由本室經(jīng)接種仔豬以O(shè)型口蹄疫病毒NYOO株病毒后獲得。3.相關(guān)試劑的配制 PB 緩沖液0· 02mol/L Na2HPO4,0. 02mol/L NaH2PO4 ；TBS 緩沖液:50mmol/L Tris · Cl (ρΗ8· 0)，lmmol/L EDTA,高壓滅菌；PEG/NaCl 20% (w/v)PEG 8000,2. 5mol/L NaCl，高壓滅菌；碘化鈉緩沖液:10mmol/LTris · Cl (ρΗ8· 0)，lmmol/L EDTA，4mol/L NaI ；低鹽LB培養(yǎng)基酵母提取物5g、胰蛋白胨IOg和NaCI 5g溶解于蒸餾水并定容至 1L，高壓滅菌；頂層瓊脂糖LB培養(yǎng)基+lg/L MgCl2 · 6H20+7g/L瓊脂糖，高壓滅菌；底層LB/IPTG/X-gal平板LB培養(yǎng)基+15g/L瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70°C時(shí)，力口 Λ IPTG和X-gal (終濃度分別為50 μ g/ml，40 μ g/ml)，鋪平板。二、方法1. IgG的分離與純化對(duì)仔豬接種pcDNA3-VP2疫苗質(zhì)粒后的VP2抗血清和豬FMDV感染血清采用飽和硫 酸銨沉淀法進(jìn)行IgG粗提，PBS (0. 01mol/L,pH7. 4)緩沖液透析48h后用PEG 20000進(jìn)行濃 縮。將濃縮后的IgG粗提產(chǎn)物上平衡好的DEAE sephadex A50柱，用PBS(0. 01mol/L,pH7. 4) 緩沖液洗脫，收集洗脫的IgG，透析除鹽后，用PEG 20000進(jìn)行濃縮，紫外分光光度法測(cè)定蛋 白質(zhì)濃度，并用ELISA法檢測(cè)其生物學(xué)活性。FMDV-VP2 IgG和FMDV感染血清的IgG經(jīng)飽和硫酸銨粗提，DEAE s印hadexA50純化 后，用紫外分光光度法測(cè)得蛋白質(zhì)濃度分別為63. 25mg/mL和58. 66mg/mL ；稀釋200倍后， ELISA檢測(cè)IgG與FMDV-VP2蛋白均呈陽(yáng)性反應(yīng)。2.噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的篩選吸取150 μ L 500倍稀釋的純化FMDV-VP2 IgG (稀釋后濃度約100 μ g/mL)，加入到 預(yù)冷的微孔板板孔中，parafilm膜封口，4°C過(guò)夜。傾掉板孔中的包被液，在干凈的紙巾上用 力拍甩以除去殘余溶液。加200 μ L封阻緩沖液W. lmol/L NaHCO3 (pH 8. 6)，5mg/mL BSA, 0. 02% NaN3]，4°C作用lh。傾去封阻液，TBST洗板6次后，加入100 μ L TBS稀釋的噬菌體 文庫(kù)(含1.8 X IO11個(gè)病毒子和IyL純化的FMDV感染陰性IgG)，室溫孵育lh，傾去未結(jié)合 噬菌體，TBST緩沖液洗板。加入100 μ L FMDV-VP2溶液(100 μ g/mL)，室溫洗脫5min，棄去 洗脫液，再加入100 μ L FMDV-VP2溶液，37°C洗脫30min。將洗脫物移入干凈微量離心管中， 取2μ L用于滴度測(cè)定，其他用ER2738菌擴(kuò)增、純化后，用于下一輪篩選。篩選時(shí)設(shè)空白對(duì) 照(記作N)，不包被IgG，其他同試驗(yàn)孔(記作P)。重復(fù)上述步驟，共篩選4輪，并通過(guò)降 低靶分子濃度、延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間、提高TBST中Tween20濃度的方法，逐輪增加選擇壓力。在第 4輪篩選后，洗脫液不再擴(kuò)增，隨機(jī)挑取20個(gè)藍(lán)色噬菌斑，進(jìn)行擴(kuò)增，制備噬菌體貯液，用于 進(jìn)一步研究分析。計(jì)算每一輪篩選的回收率和P/N值，分析富集效果?；厥章视?jì)算方法回 收率(％ )=投入的噬菌體數(shù)/回收的噬菌體數(shù)X 100% .噬菌體滴度測(cè)定、洗脫物擴(kuò)增與 純化，按《PH. D-12 Phage Display Peptide Library Kit》操作手冊(cè)進(jìn)行。經(jīng)過(guò)4輪吸附2洗脫2擴(kuò)增的富集篩選，結(jié)果顯示，隨著篩選輪次的增加，試驗(yàn) 組的回收率逐輪提高(1.28X10〃 3. 34X10—6)，對(duì)照組回收率逐輪降低(4. 17X10—8 1.48 X ΙΟ"8)；而Ρ/Ν值隨著篩選輪次的增加顯著提高(7.6 186.3)，表明目的克隆得到了 有效富集，非目的克隆被有效剔除。3.雙抗體夾心ELISA鑒定噬菌體陽(yáng)性克隆 取150 μ L 500倍稀釋純化的FMDV病毒感染IgG (稀釋后濃度約100 μ g/mL)包被 酶標(biāo)板，為每個(gè)待鑒定的噬菌體克隆包被一個(gè)板孔，另外包被兩個(gè)板孔作空白對(duì)照和陰性 對(duì)照，在另一酶標(biāo)板包被相同濃度的純化的FMDV感染陰性IgG，置4°C過(guò)夜。各孔加滿封 阻液，4°C封阻lh，TBST洗板6次。將待鑒定的噬菌體貯液用TBS稀釋至約IO12個(gè)病毒子/ mL,在包被好的酶標(biāo)板孔中加入100 μ L，陰性對(duì)照板孔中加入含IO11個(gè)病毒子的原始肽庫(kù)。 37°C作用30min，TBST洗板6次，加入5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的抗M13單克隆抗體，37°C作 用30min，同樣用TBST洗板6次，每孔加入ABTS底物溶液，室溫避光放置10 20min后酶 標(biāo)儀測(cè)量405nm的OD值，測(cè)試樣OD大于陰性對(duì)照2. 1倍視為陽(yáng)性，與陰性IgG反應(yīng)呈陽(yáng)性 者視為假陽(yáng)性。在經(jīng)4輪篩選得到的噬菌體克隆中，隨機(jī)挑取30個(gè)藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增，制備噬 菌體貯液，經(jīng)雙抗夾心ELISA鑒定結(jié)果顯示有1個(gè)克隆(25#)與純化后的病毒感染IgG呈 OD值較高的陽(yáng)性反應(yīng)，且與陰性IgG無(wú)交叉凝聚(表1)。表1雙抗夾心ELISA鑒定噬菌體克隆結(jié)果
噬菌體克隆 25# 16#8# 啦菌體文庫(kù)
VP2 陽(yáng)性 IgG0.717 0. 174 0. 169 0.106VP2 陰性 IgG 0.112 0.092 0.128 0.128
碳酸氫鈉 0.069 0.072 0.064 0.0824.抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA包被FMDV-VP2陽(yáng)性IgG，方法同上。4°C過(guò)夜，封阻lh，洗板后加入上述步驟中經(jīng) 初步鑒定的含IO11病毒子的25#噬菌體貯液與5 μ g FMDV-VP2蛋白的混合液共100 μ L，其 他ELISA方法同上。測(cè)定0. D值，計(jì)算抑制率。公式為抑制率(％ ) = (0D未抑制-OD抑制)/OD未抑制X 100%結(jié)果表明25#陽(yáng)性克隆的檢測(cè)值表現(xiàn)出顯著的受抑現(xiàn)象(圖1)，抑制率73%。這 種被特異性抗原所抑制的現(xiàn)象說(shuō)明，在沒(méi)有被抑制的情況下，陽(yáng)性噬菌體克隆特異性地結(jié) 合在IgG的H鏈可變區(qū)的抗原抗體結(jié)合部位，而不是非特異性結(jié)合。5.陽(yáng)性克隆DNA序列推定的短肽序列分析將經(jīng)過(guò)ELISA鑒定的25#陽(yáng)性噬菌體克隆擴(kuò)增，提取ssDNA進(jìn)行DNA測(cè)序，推導(dǎo)出 其編碼的氨基酸序列，結(jié)果如下所示。25# 克隆KGYDQELATSPE(SEQ ID NO 1)實(shí)施例2 模擬表位肽在疫苗中的應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡豚鼠，體重約300克，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.菌株和基因工程載體宿主菌為大腸桿菌DH5 α和ToplO，pcDNA3載體和pBAD/ gill A載體購(gòu)自Invitrogen公司。3.常用試劑
anti-HBcAg mAb 購(gòu)自 Biodesign 公司，HRP-conjugated Rabbit anti-mouselgG 禾口 HRP-conjugated anti-guinea pig IgG 購(gòu)自 Sigma 公司。PCR引物由上?；?、博彩公司合成。常用酶類限制性內(nèi)切酶Sac I、Bbe I,Nco I,X ho I，均為Takara公司產(chǎn)品。RNase 為華舜公司產(chǎn)品。分子生物學(xué)試劑盒pGEM_T試劑盒為華舜公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、T4連接酶試劑盒 為Takara公司產(chǎn)品。常用分子生物學(xué)試劑DNA分子量Marker DL2000,為Takara公司產(chǎn)品。瓊脂糖、 Tris飽和平衡酚、EB等為Sigma公司或華舜公司產(chǎn)品。大腸桿菌培養(yǎng)用試劑胰蛋白胨、酵 母提取物、SDS、Triton X-100、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等為上海博彩公司產(chǎn)品。常規(guī)化學(xué)試劑NaCl，KAc，NaH2PO4,Na2HPO4, Tris, EDTA, NaOH, EB, HC1，NaAc，DMSO, 無(wú)水乙醇，乙醚，異丙醇，檸檬酸納，甘油，氯仿等分別為Sigma，Merck，Aldrich，Gibco等公 司產(chǎn)品和國(guó)內(nèi)分析純產(chǎn)品。4.主要儀器設(shè)備PCR儀PE480和PE2400兩種型號(hào)均為Perkin-Elmer(PE)公司產(chǎn)品；紫外分光光 度計(jì)Pharmacia Biotech, ULTRASPEC1000 ；TGL-臺(tái)式高速離心機(jī)MIKR0 12-24，HETTICH 公司產(chǎn)品；細(xì)菌培養(yǎng)搖床上海離心機(jī)械研究所；超純水制備設(shè)備LabCOnCO Water pro PS ；生化培養(yǎng)箱LDR-15B廣東省醫(yī)療器械廠；細(xì)胞室離心機(jī)TL_5. O臺(tái)式離心機(jī)，上 海市離心機(jī)械研究所；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱=Heraeus產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)ChemiImager 5500 ；電穿孔儀美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品。二、方法1. HBc-VLP疫苗載體的構(gòu)建根據(jù)0型FMDV-VP2多抗豬IgG對(duì)線性12肽庫(kù)的篩選結(jié)果，將帶有模擬表位序列 KGYDQELATSPE (SEQ ID NO 1)的噬菌體克隆命名為Phage_25。人工合成該肽段的編碼堿基 酸序列。將其插入原核表達(dá)載體PBAD表達(dá)HBc蛋白1-144位氨基酸的基因序列的主要免 疫顯性區(qū)域部位(第75位氨基酸)，使其展示于HBc類病毒顆粒的表面。重組質(zhì)粒命名為 pBAD—epitope?；蚱蔚脑O(shè)計(jì)合成人工合成編碼目的肽段的互補(bǔ)堿基序列，并且在兩端各加 酶切位點(diǎn)，分別命名為P1、P2。按照原始Phage-25測(cè)序結(jié)果合成如下堿基序列，并在5’端 加 Bbe 1，3，端加 Sac I Pl:GAGGCGCC AAG GGC TAC GAT CAG GAG CTC GCT ACC TCA CCT GAG GAGCTCGCP2 :GCGAGCTC CTC AGG TGA GGT AGC GAG CTC CTG ATC GTA GCC CTT GGCGCCTC將上述DNA片段退火后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切目的片段和pBAD載體，進(jìn)行連 接、轉(zhuǎn)化。小量快速抽提質(zhì)粒并酶切鑒定。重組子分別經(jīng)相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切，切出2條片段，大片段約5. Okb，為線性載體，小 片段約為0. 5kb，與設(shè)計(jì)值相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明，含目的表位的全基因合成片斷正確 地插入到HBc的第75位形成嵌合基因，序列與設(shè)計(jì)的完全相符。2.原核表達(dá)質(zhì)粒pBAD-HBc-multi印itope嵌合抗原的表達(dá)與純化誘導(dǎo)表達(dá)原核表達(dá)所用的宿主菌為E. coli T0P10，將含有目的基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒的甘油菌 ο μ 1接種至3ml含氨芐青霉素的LA培養(yǎng)基中(LA)，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜， 然后以1 %的接種量接種至另一含有LA培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37°C培養(yǎng)至OD值約為0. 4 0. 6后，加入合適濃度的阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集菌體，每3g大腸桿菌重懸于20ml 緩沖液A中；經(jīng)超聲破碎后，離心收集超聲上清和沉淀，進(jìn)行15%的SDS-PAGE電泳，觀察有 無(wú)蛋白的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物存在于上清中還是包涵體中。結(jié)果顯示，與空載體誘導(dǎo)物相比， 抗原均獲得了表達(dá)，分子量約27kDa，與推測(cè)的分子量相符，在誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖的濃度為 0. 02%時(shí)，目的蛋白約占菌體總蛋白的15%以上(圖3)。包涵體的變性、親和層析及復(fù)性。將收集的菌體超聲后，12000rpm 4°C離心20min。 再將沉淀重懸于9倍體積的含0. 5% TritonX-IOO的緩沖掖A中，用研磨棒研磨充 分，室溫 放置IOmin, 13000rpm，4°C離心lOmin，重復(fù)3遍。加含有變性劑(0-8M尿素)的NTA緩沖 液(3g濕菌加入20ml液體)，室溫在磁力攪拌器上攪拌30min，13000rpm 4°C離心lOmin，分 別收集上清和沉淀；進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳，觀察溶解包涵體的變性劑的濃度。用該濃度 的變性劑尿素溶解包涵體，加到NTA親和層析柱上，分別用含NTA洗脫緩沖液(含20mmol/ L-lOOOmmol/L咪唑和尿素)洗脫，收集洗脫的蛋白，15% SDS-PAGE電泳觀察。結(jié)果顯示， 當(dāng)洗脫液中的咪唑濃度lmol/L時(shí)，大部分目的蛋白被洗脫下來(lái)，變復(fù)性后蛋白的純度約有 95%以上。稀釋目的蛋白(至終濃度約為0. lmg/ml)，裝入透析袋中透析復(fù)性，透析液中加入 氧化型和還原型的谷胱甘肽(2mmol/L)，復(fù)性72h。將復(fù)性后的蛋白用PEG濃縮，再用緩沖 液A進(jìn)行透析，13000rpm 4°C離心20min，收集上清待用。3.表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15%的SDS-PAGE電泳，切10張大小與凝膠一樣的3mmWhatman濾紙 和1張硝酸纖維素膜，凝膠在陰極，硝酸纖維素膜在陽(yáng)極，根據(jù)凝膠面積按0. 65mA/cm2的電 流量進(jìn)行轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)間為2 3h。轉(zhuǎn)移完畢后，取膜，用洗膜液洗3次，以0. lml/cm2的封 閉液I 37°C封閉lh，加入用封閉液I稀釋的一抗，37°C孵育lh，用洗滌液I洗膜3次，用洗 滌液II洗1次后加入用封閉液II稀釋二抗(1 100)37°C孵育lh，用洗滌液II洗3次， 以免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑Supersignal CL-HRP底物溶液顯示特異蛋白信號(hào)并曝光顯影。 Western結(jié)果顯示，變復(fù)性后的目的蛋白能被抗HBc單抗特異性地識(shí)別，說(shuō)明抗原經(jīng)純化、 復(fù)性后保持了原來(lái)的免疫原性(圖3)。4.電鏡觀察顆粒樣蛋白的形成將純化得到的HBc-印itope嵌合蛋白(HBc 1_76_印itope-HBc76_144)吸附到400 目銅網(wǎng)上進(jìn)行負(fù)染，透射電鏡觀察。發(fā)現(xiàn)重組嵌合蛋白具有明顯的顆粒樣結(jié)構(gòu)(圖4)。5.疫苗免疫及免疫應(yīng)答檢測(cè)18只豚鼠隨機(jī)分為3組。每組6只，間隔21d進(jìn)行兩次免疫接種，接種方法均為肌 肉注射。組1為VLP不含表位的對(duì)照組，并加弗氏佐劑(HBc對(duì)照+佐劑)；組2為VLP融 合表位免疫組(HBc-模擬表位+佐劑)，分別用200 μ g的疫苗蛋白頸背部皮下多點(diǎn)注射； 組3為商品化FMDV滅活疫苗(HBc-模擬表位+佐劑)。免疫分組及劑量見(jiàn)下表。表2豚鼠實(shí)驗(yàn)分組及免疫劑量
權(quán)利要求
一種O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽在制備免疫原上的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的0型口蹄疫病毒VP2抗原表位的分子模擬肽在制備豬口蹄疫表 位肽疫苗上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物傳染病預(yù)防及疫苗研制領(lǐng)域。世界各國(guó)非常重視口蹄疫防控措施的研究，本發(fā)明公開(kāi)了O型口蹄疫病毒VP2蛋白的一個(gè)模擬表位肽。本發(fā)明利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選有效的口蹄疫病毒表位，提供了一種O型口蹄疫病毒VP2抗原表位的一個(gè)分子模擬肽。它是具有下述氨基酸殘基序列之一的多肽序列表中的SEQ ID No1。本發(fā)明還提供該模擬肽在制備免疫原、豬口蹄疫表位肽疫苗中的應(yīng)用，能起到預(yù)防O型口蹄疫病毒感染的作用，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61K39/135GK101948510SQ20101027858
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者周奇, 孫樹(shù)漢, 張毅, 章意亮, 郭瀛軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)