專利名稱：一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組載體，特別涉及一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重 組載體及其用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，人類全身腫瘤中90%以上常見(jiàn)的惡性腫 瘤都是實(shí)體瘤；隨著環(huán)境污染的加劇，其發(fā)病率逐年上升。實(shí)體瘤的傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)、 化療及放療為主，但腫瘤的轉(zhuǎn)移率和治療后的復(fù)發(fā)率都較高，生存率仍不理想。因此，結(jié)合 最新的腫瘤生理學(xué)和醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究成果，進(jìn)一步研究開發(fā)新型高效的實(shí)體瘤治療方 法，具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。利用自殺基因治療實(shí)體瘤是近年來(lái)腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。所謂自殺基因治療 腫瘤就是用基因工程技術(shù)將特定的外源基因?qū)肽[瘤宿主細(xì)胞或腫瘤組織中，該外源基因 表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠?qū)o(wú)毒的前體藥物分解成對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性的藥物成分，直接殺死腫瘤 細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。然而，目前基因治療面臨的關(guān)鍵問(wèn)題是如何解決載體的安 全性和靶向性問(wèn)題，選擇一個(gè)高效、安全、特異性強(qiáng)的載體，是實(shí)現(xiàn)目的基因在腫瘤細(xì)胞中 特異表達(dá)的前提。I 型單純皰疫病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus-1 thymidinekinase, HSV-TK)/丙氧鳥苷(ganciclovir，GCV)是目前研究最早最徹底的，廣泛用于腫瘤基因治療 的自殺基因系統(tǒng)之一。目前研究認(rèn)為該自殺基因治療腫瘤的機(jī)制有兩個(gè)一是自殺效應(yīng)，即 HSV-TK編碼由376個(gè)氨基酸組成的胸甘激酶，導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，這種胸苷激酶將無(wú)毒的丙 氧鳥苷(GCV)磷酸化成單磷酸丙氧鳥苷，再進(jìn)一步磷酸化為三磷酸丙氧鳥苷后，摻合到新 合成的腫瘤細(xì)胞DNA鏈中，使DNA鏈斷裂且抑制DNA聚合酶活性，從而干擾DNA合成導(dǎo)致腫 瘤細(xì)胞死亡。另外一種是TK-GCV系統(tǒng)引發(fā)的“旁觀者效應(yīng)”，所謂“旁觀者效應(yīng)”即是轉(zhuǎn)導(dǎo)的 腫瘤細(xì)胞被敏感藥物殺死的同時(shí)，周圍未被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞也被殺死的現(xiàn)象。HSV-TK/GCV 系統(tǒng)通過(guò)這種獨(dú)特的自殺效應(yīng)或“旁觀者效應(yīng)”能選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，保護(hù)正常組織細(xì) 胞，從而避免傳統(tǒng)的化療等治療方法對(duì)人體帶來(lái)的傷害。自1986年Moolten首先報(bào)道腺病 毒介導(dǎo)的HSV-TK基因可使腫瘤獲得對(duì)某些藥物的敏感性以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)將腺病毒 介導(dǎo)的HSV-TK基因應(yīng)用于肝癌、胃癌、舌癌、前列腺癌、黑色素瘤等實(shí)體瘤的基因治療的實(shí) 驗(yàn)研究，并取得了可喜進(jìn)展。然而，尋找安全有效的tk基因表達(dá)載體仍然是困擾HSV-TK基 因治療的一大難題。腫瘤基因治療的載體系統(tǒng)主要有病毒載體和非病毒載體(脂質(zhì)體等)兩大類。由 于病毒載體本身有很多局限性，如病毒滴度低、生產(chǎn)成本高、靶向性差；同時(shí)，對(duì)某些靜止期 細(xì)胞無(wú)感染性(腺病毒載體)、宿主范圍有限、插入宿主基因組可能引起突變及病毒本身缺 乏安全性等缺點(diǎn)，因而不能滿足臨床應(yīng)用需要，使得該項(xiàng)技術(shù)還處在摸索階段。脂質(zhì)體等非 病毒載體，普遍存在基因轉(zhuǎn)染效率低、缺乏腫瘤特異靶向性等缺點(diǎn)。因而尋找一種高效、特
3異、安全的載體系統(tǒng)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究表明，厭氧細(xì)菌具有良好的腫瘤靶向定植性，許多抗腫瘤研究已經(jīng)嘗試以厭 氧菌作為轉(zhuǎn)移載體攜帶各種抑瘤基因到腫瘤組織處進(jìn)行腫瘤基因治療。厭氧菌載體的應(yīng)用 解決了傳統(tǒng)基因治療載體(病毒載體或非病毒載體)靶向性不強(qiáng)的問(wèn)題，避免載體在到達(dá) 腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中所要面臨的生理和免疫上的多重障礙，提高了治療基因在體內(nèi)的表達(dá)水 平。目前，廣泛研究的厭氧菌包括梭狀芽孢桿菌屬、沙門氏菌屬和雙歧桿菌屬等。沙門氏菌 是革蘭氏陰性菌，菌體含有內(nèi)毒素，安全性要比雙歧桿菌差。雙歧桿菌(bifidobacterium)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，嚴(yán)格厭氧菌，不產(chǎn)生外毒素，不 含有內(nèi)毒素，本身無(wú)致病性；該菌是人體中的重要益生菌，在健康人腸道內(nèi)定植且占有一定 數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)細(xì)菌，廣泛用于各種奶制品發(fā)酵，其非致病性在許多國(guó)家已經(jīng)得以接受，美國(guó)食品 與藥物管理局(FDA)將該菌的安全級(jí)別定為最高級(jí)一A級(jí)。Li等將轉(zhuǎn)人內(nèi)皮抑素的雙歧 桿菌經(jīng)尾靜脈注射荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)抑瘤效果比天然雙歧桿菌更好。2008年Do Kyung Lee 等人用實(shí)驗(yàn)證實(shí)人源雙歧桿菌能顯著提高人的自身免疫并且抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，并 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。這些研究提示雙歧桿菌可以作為腫瘤基因治療靶向載體系統(tǒng)。已有 研究證明在實(shí)體瘤中存在一些低氧區(qū)域(尤其是瘤體的中央?yún)^(qū))，而這些低氧區(qū)域適合厭 氧菌的存活。Vaupel等研究了腫瘤組織中的氧分壓，發(fā)現(xiàn)惡性實(shí)體瘤中心區(qū)域氧分壓低至 2. 5mmHg以下，遠(yuǎn)低于正常組織的24-66mmHg，這表明惡性實(shí)體瘤中心區(qū)域較正常組織更適 合雙歧桿菌的生存。申請(qǐng)者在前期研究中連續(xù)4天將Iml濃度為2. OX 104/ml的人雙歧桿 菌活菌通過(guò)耳靜脈注入健康家兔(2. OKg)，血培養(yǎng)法結(jié)果證明雙歧桿菌入血后，不會(huì)在血 液中大量繁殖和生存，不會(huì)出現(xiàn)高熱和休克等菌血癥表現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)組家兔脾、腎、骨骼肌、心肌 和癌旁肝組織經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)明顯異常。這些研究均表明雙歧桿菌作為腫瘤基因治療靶 向載體系統(tǒng)具有較高的安全性。作為腫瘤基因腫瘤載體系統(tǒng)，雙歧桿菌的優(yōu)越性在于第一、作為一種胞外菌，雙 歧桿菌自身的繁殖不依賴于腫瘤細(xì)胞活動(dòng)周期，也不借助宿主細(xì)胞的各種因子啟動(dòng)和調(diào)控 目的基因的表達(dá)，無(wú)組織特異性限制，對(duì)復(fù)制和靜息的腫瘤細(xì)胞均有作用。第二、雙歧桿菌 的基因組和外源基因都不可能插入宿主基因組，不會(huì)引發(fā)宿主基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。第三、雙歧 桿菌對(duì)實(shí)體瘤的趨化性是針對(duì)中心的厭氧區(qū)的氧分壓，不對(duì)腫瘤的部位和性質(zhì)，具有廣泛 的實(shí)用性，不需要對(duì)腫瘤特異基因的鑒定和了解，而且該細(xì)菌具備不依賴宿主生命周期的 獨(dú)立繁殖能力，理論上講，只要有一個(gè)細(xì)菌能夠順利到達(dá)腫瘤的厭氧壞死區(qū)，就能夠繁殖出 成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)菌，在局部形成高活性區(qū)，有可能改變現(xiàn)有載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的狀況，這表 明雙歧桿菌作為載體系統(tǒng)具有較高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。綜上所述，雙歧桿菌作為腫瘤基因治療的載 體系統(tǒng)具有較高的特異性、高效性和安全性，有可能克服以往腫瘤基因治療中缺乏腫瘤組 織靶向性、安全性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低等“瓶頸”。就目前國(guó)內(nèi)外發(fā)表的以雙歧桿菌為表達(dá)載體進(jìn)行腫瘤基因治療的文獻(xiàn)而言， 其表達(dá)系統(tǒng)大體上有三類一種是以PGEX-5X-1為主；另一種是以PBV220為主；第三 類是主要以研究者自己分離和構(gòu)建的載體系統(tǒng)為主，如Kano等改造的來(lái)源于pTB6的 pAV001-HU-eCD-M968等。他們的共同特點(diǎn)是大多采用了氨芐青霉素為篩選基因，因此，其臨 床應(yīng)用的安全風(fēng)險(xiǎn)非常大，本發(fā)明針對(duì)上述表達(dá)載體的優(yōu)缺點(diǎn)，研發(fā)出一套安全高效的靶 向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體，經(jīng)專利查新證實(shí)，國(guó)內(nèi)目前關(guān)于人用靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的專利未見(jiàn)公布。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靶向治療實(shí)體瘤的 雙歧桿菌PBES-tk重組載體及其用途。本發(fā)明同時(shí)提供了 一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌 pBES-tk重組載體的構(gòu)建方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體，其特征在于采用序列表中 的SEQ IDNo 1做為表達(dá)載體，即雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES ；所述靶向治療 實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體具有序列表中的SEQ ID N2 :2所表示的tk基因序列， 該基因?yàn)榘l(fā)揮治療效應(yīng)目的基因。該靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體在腫瘤組織中能夠表達(dá)HSV-I的 tk基因編碼的胸甘激酶(TK)，該TK將無(wú)毒的前體藥物丙氧鳥苷(GCV)磷酸化，成為三磷酸 丙氧鳥苷后，摻合到新合成的腫瘤細(xì)胞DNA鏈中，使DNA鏈-斷裂且抑制DNA聚合酶活性， 從而干擾DNA合成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。同時(shí)，雙歧桿菌pBES-tk重組載體表達(dá)的TK系統(tǒng)引 發(fā)的“旁觀者效應(yīng)”，所謂“旁觀者效應(yīng)”即周圍未被TK直接作用的腫瘤細(xì)胞也由于雙歧桿 菌pBES-tk重組載體表達(dá)的TK引發(fā)的CaSpaSe3表達(dá)增加而被殺死的生物學(xué)現(xiàn)象。HSV-TK/ GCV系統(tǒng)通過(guò)這種獨(dú)特的直接作用或“旁觀者效應(yīng)”能選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療實(shí)體 瘤的目的。一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的用途，其特征在于用于靶 向治療實(shí)體瘤。本發(fā)明所述的一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體，通過(guò)借助惡性 實(shí)體瘤中心區(qū)域的低氧分壓特點(diǎn)(氧分壓比正常組織低10到40倍)和雙歧桿菌的專性厭 氧生活特性，使得該重組載體經(jīng)過(guò)靜脈或局部注射后，只有到達(dá)實(shí)體瘤中心的厭氧區(qū)域的 雙歧桿菌才能生存，這樣，雙歧桿菌pBES-tk重組載體表達(dá)的TK被局限在實(shí)體瘤中。散布 正常組織中雙歧桿菌pBES-tk重組載體由于高氧分壓而不能存活，即使GCV存在于正常組 織，也由于缺乏TK而不會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生傷害，從而使本發(fā)明所述的一種靶向治療實(shí) 體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體達(dá)到對(duì)實(shí)體瘤的靶向性和對(duì)正常組織的無(wú)害性。上述靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括 以下步驟第一步，先用化學(xué)合成方法合成GenBank號(hào)為AB032875的HSV-I tk基因，其序列 特征為SEQ ID Na 2 ；在其5-端添加BamHI酶切位點(diǎn)，3’端添加SalI酶切位點(diǎn)，然后將合 成的tk基因片段克隆到pGH克隆載體中，測(cè)序檢測(cè)正確后備用，命名為pGH-tk ；第二步，將pGH-tk和pBES質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，37°C培養(yǎng)10小時(shí)后純化 質(zhì)粒，將純化的pGH-tk和pBES質(zhì)粒分別用BamHI和SalI雙酶切，電泳分離后用凝膠純化 試劑盒(北京鼎國(guó)生物生產(chǎn))分離純化tk基因片段和載體pBES片段，用連接試劑盒(大 連寶生物生產(chǎn))在25°C連接30min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò) 大培養(yǎng)后純化質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定正確后，命名為pBES-tk，-80°C保存?zhèn)溆?，其序列特?為 SEQ ID Na 3 ；第三步，a)將雙歧桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即0D_為0. 6-0. 7時(shí)，經(jīng)去離子水配制 的滅菌10%甘油洗滌處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-tk質(zhì)粒載
5體轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、200Q、25yF;所述的雙歧桿菌為受體菌，由中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC No :M203050的兩歧雙歧桿菌SHQ006 ；b)再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無(wú)抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇 60-120min，然后在含50 μ g/ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性菌落，從而獲 得轉(zhuǎn)tk基因的雙歧桿菌，PCR和SDS-PAGE鑒定后的陽(yáng)性克隆即為雙歧桿菌pBES_tk重組 載體的種子菌。c)將上述經(jīng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌復(fù)蘇后，涂布于含卡那霉素的抗性MRS 培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，然后挑取單一的抗性菌落于抗性MRS液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)， 經(jīng)PCR證實(shí)tk陽(yáng)性的雙歧桿菌單菌落再次涂布接種于含卡那霉素的抗性MRS培養(yǎng)基平板 上厭氧培養(yǎng)48小時(shí)；然后再挑取單一菌落于含卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此反復(fù)接 種培養(yǎng)至繼代培養(yǎng)不低于15代時(shí)，經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)tk基因仍然陽(yáng)性的克隆，可以作為種子 菌用于大規(guī)模液體接種擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮和洗滌純化，進(jìn)一步制備成轉(zhuǎn)tk基因 的雙歧桿菌_tk重組載體實(shí)體瘤治療的制劑。該實(shí)體瘤治療系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)靜脈注射或腫瘤局部注射后，雙歧桿菌通過(guò)血液 循環(huán)進(jìn)入實(shí)體瘤組織，在實(shí)體瘤中心的低氧區(qū)，雙歧桿菌存活下來(lái)并快速繁殖，將TK蛋白 直接表達(dá)在腫瘤中心區(qū)域，并將隨后注射的GCV分解為對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性的三磷酸丙氧鳥 苷。由于三磷酸丙氧鳥苷只產(chǎn)生在有TK存在的腫瘤組織的中心區(qū)，它能夠被腫瘤組織及時(shí) 和有效地吸收，有利于增加藥物的生物利用效率，減少對(duì)周圍正常組織的毒副作用。同時(shí)， 雙歧桿菌的大量繁殖，也能夠激活肌體的非特異性免疫，有利于增強(qiáng)對(duì)腫瘤的抗性。一旦腫 瘤組織被消滅殆盡，該區(qū)域的低氧厭氧條件也被破壞，雙歧桿菌的生存環(huán)境亦不復(fù)存在，進(jìn) 入正常組織的雙歧桿菌處于高氧分壓環(huán)境，不能繁殖，肌體會(huì)自動(dòng)清除這些完成使命的雙 歧桿菌，不會(huì)造成后遺癥和副作用。該靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的發(fā)酵生產(chǎn)成本十分低廉，得到 的發(fā)酵液活菌數(shù)量大、菌體活性高，經(jīng)過(guò)純化精制后將純化的菌體冷凍干燥后在安碚中真 空包裝，可以隨時(shí)使用。本發(fā)明一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的有益效果是，運(yùn)用基 因工程方法將tk基因連接到發(fā)明人擁有的雙歧桿菌_大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES中，通 過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法把tk基因?qū)氲饺梭w生菌-雙歧桿菌中制成雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)為表達(dá)載體的tk重組載體腫瘤基因治療系統(tǒng)，即雙歧桿菌pBES-tk重組載體靶向治療 實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體。


圖1是本發(fā)明的靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的結(jié)構(gòu)示意圖；其 中，(l)tk是四環(huán)素tetO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSV-I的tk基因序列區(qū)；圖2是本發(fā)明中用MNU誘導(dǎo)后的小鼠膀胱癌；圖3是本發(fā)明中小鼠膀胱癌經(jīng)靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk/GCV重組載體 (簡(jiǎn)稱雙歧桿菌pBES-tk/GCV，下同)治療后的TUNEL法原位檢測(cè)圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組均出現(xiàn) 不同程度的腫瘤細(xì)胞核呈棕褐色染色(見(jiàn)圖A、B、C)。各組的凋亡指數(shù)值分別為生理鹽水組 A(14. 33士5. 29% )、空質(zhì)粒雙歧桿菌組B (15. 50士4. 34% )和重組質(zhì)粒雙歧桿菌pBES-tk/
6GCV治療組C (29. 44士6. 64% )。重組質(zhì)粒雙歧桿菌pBES_tk/GCV治療組的凋亡指數(shù)值明顯 高于生理鹽水組和空質(zhì)粒雙歧桿菌組(P < 0. 05)，表明凋亡細(xì)胞明顯增加。說(shuō)明該系統(tǒng)治 療小鼠膀胱癌是有效的；圖4是CaSki細(xì)胞移植到裸鼠皮下的成瘤圖；圖5是本發(fā)明靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體治療裸鼠實(shí)體瘤模型 后的效果檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施 例范圍之中。實(shí)施例1一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體，其特征在于采用序列表中 的SEQ ID No=I做為表達(dá)載體，即雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES ；所述靶向治療 實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體具有序列表中的SEQ ID N2 :2所表示的tk基因序列， 該基因?yàn)榘l(fā)揮治療效應(yīng)目的基因。靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的構(gòu)建方法第一步，先用化學(xué)合成方法合成GenBank號(hào)為AB032875的HSV-Itk基因，其序列 特征為SEQ ID Na 2 ；在其5-端添加BamHI酶切位點(diǎn)，3’端添加SalI酶切位點(diǎn)，然后將合 成的tk基因片段克隆到pGH克隆載體中，測(cè)序檢測(cè)正確后備用，命名為pGH-tk ；第二步，將pGH-tk和pBES質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，37°C培養(yǎng)10小時(shí)后純化 質(zhì)粒，將純化的pGH-tk和pBES質(zhì)粒分別用BamHI和SalI雙酶切，電泳分離后用凝膠純化 試劑盒(北京鼎國(guó)生物生產(chǎn))分離純化tk基因片段和載體pBES片段，用連接試劑盒(大 連寶生物生產(chǎn))在25°C連接30min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò) 大培養(yǎng)后純化質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定正確后，命名為pBES-tk，-80°C保存?zhèn)溆?，其序列特?為 SEQ ID Na 3 ；第三步，a)將雙歧桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即0D_為0. 6-0. 7時(shí)，經(jīng)去離子水配制 的滅菌10%甘油洗滌處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-tk質(zhì)粒載 體轉(zhuǎn)化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、200Q、25yF;所述的雙歧桿菌為受體菌，由中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC No :M203050的兩歧雙歧桿菌SHQ006 ；b)再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無(wú)抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇 60-120min，然后在含50 μ g/ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性菌落，從而獲 得轉(zhuǎn)tk基因的雙歧桿菌，PCR和SDS-PAGE鑒定后的陽(yáng)性克隆即為靶向治療實(shí)體瘤的雙歧 桿菌pBES-tk重組載體的種子菌。至此，靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體構(gòu) 建成功，結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書附圖1。實(shí)施例2靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的用途是通過(guò)靜脈或局部注射的 方式進(jìn)行腫瘤的基因治療，因此，其安全性是首先要考慮的重要問(wèn)題之一，經(jīng)動(dòng)物在體試 驗(yàn)證明，本發(fā)明所使用的表達(dá)載體pBES-tk的宿主菌雙歧桿菌的特征在于所述的雙歧桿 菌-重組載體pBES-tk用于腫瘤的基因治療是以雙歧桿菌為受體菌進(jìn)行靜脈注射的方式給
7藥，經(jīng)動(dòng)物在體試驗(yàn)證明，該雙歧桿菌(受體菌)經(jīng)靜脈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，對(duì)受藥動(dòng)物是沒(méi) 有任何病理傷害的，因此，該系統(tǒng)經(jīng)靜脈注射使用是安全的。以家兔為動(dòng)物模型，在家兔靜脈注射本發(fā)明所述的雙歧桿菌進(jìn)行安全性試驗(yàn)的實(shí) 施例說(shuō)明如下a)從重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心領(lǐng)取體重為2Kg的健康雄性家兔6只。b)將雙歧桿菌培養(yǎng)12小時(shí)使OD6tltl為1. 2-1. 5時(shí)，雙歧桿菌菌液用PBSbuffer (含 0.01%的半胱氨酸鹽)洗滌3次，最后用PBS調(diào)整細(xì)菌濃度為1.0X104cell/ml。c)將2. Oml濃度1. 0X 104cell/ml的雙歧桿菌(沒(méi)有進(jìn)行外源性內(nèi)毒素檢測(cè)和 處理)經(jīng)耳靜脈注射到上述a)所述的家兔體內(nèi)，3日內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)兔與對(duì)照之間的體征差異 (如活動(dòng)能力、取食能力、是否有震顫、豎毛、糞便拉稀等)，和存活情況，3日內(nèi)共進(jìn)行3次注 射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射后5小時(shí)內(nèi)實(shí)驗(yàn)兔沒(méi)有發(fā)現(xiàn)活動(dòng)能力和取食能力的變化，也沒(méi)有震顫、 豎毛和糞便拉稀等其他體征差異和變化，更沒(méi)有死亡個(gè)體。d)將上述C)中所取的血樣進(jìn)行血象分析，主要測(cè)量紅、白細(xì)胞和血小板的變化。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除了白細(xì)胞數(shù)量在初次注射后有較明顯的升高外，紅細(xì)胞和血小板未 見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化，第3次注射后，白細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到初次注射前的基本狀態(tài)，不再有 明顯的升高現(xiàn)象。e)將第3次注射后的動(dòng)物8小時(shí)后麻醉處死，取心臟、肝臟、脾臟、腎臟進(jìn)行病理學(xué) 檢測(cè)，同時(shí)以正常家兔的上述組織做對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該受體菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后對(duì)心臟等主 要的臟器無(wú)病理?yè)p害。實(shí)施例3用靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體治療原位實(shí)體瘤(膀胱癌)的方 法如下a)在重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心購(gòu)買SD(Sprague-DawIey)大鼠30只(雌性)， 經(jīng)MNU誘導(dǎo)成瘤后待用(9周)，結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書附圖2。b)將雙歧桿菌pBES-tk重組載體轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌_tk工程菌(即靶向治療實(shí)體 瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體)培養(yǎng)過(guò)夜，使0D_為1.2-1. 5時(shí)，雙歧桿菌菌液用PBS buffer (含0. 01 %的半胱氨酸鹽)洗滌3次，最后用PBS調(diào)整細(xì)菌濃度為1. 0 X IO10Cell/ ml οc)將上述a)中確認(rèn)的腫瘤模型裸鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組9只，其中A組每 只經(jīng)尾靜脈注射Iml濃度4. OX 108cell/ml的雙歧桿菌_tk工程菌；B組注射同樣濃度的雙 歧桿菌空白對(duì)照(只轉(zhuǎn)化PBES空質(zhì)粒)；C組注射同樣體積的PBS，逐日觀察動(dòng)物的體征，并 稱量體重，記錄食量。注射雙歧桿菌-tk工程菌后的第二天開始經(jīng)腹腔注射GCV(50mg/Kg)， 隨后按照ABC組分組分別注射雙歧桿菌_tk工程菌及其相應(yīng)的對(duì)照物，每周注射一次，連續(xù) 注射4周；次日對(duì)上述大鼠經(jīng)腹腔注射GCV(50mg/Kg)，每天一次，注射4周。結(jié)果證明，靶 向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體治療的A組動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯縮小，重量 減輕；進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌介導(dǎo)的HSV-TK/GCV治療荷瘤大鼠 膀胱癌后激活型的CaSpaSe3表達(dá)增加，通過(guò)TUNEL方法證實(shí)治療后腫瘤切片中凋亡細(xì)胞明 顯增加，說(shuō)明該系統(tǒng)對(duì)原發(fā)性實(shí)體瘤的治療有效。結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書附圖3。實(shí)施例4
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用靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體治療轉(zhuǎn)移實(shí)體瘤(宮頸癌Caski 細(xì)胞轉(zhuǎn)移)的方法如下a)在重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心購(gòu)買裸鼠10只(雌雄不限)，經(jīng)尾靜脈注射Iml 濃度1. 0 X 106cell/ml的人CaSki細(xì)胞，20天后隨機(jī)檢測(cè)腫瘤形成情況，結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書附圖4。b)將雙歧桿菌pBES-tk重組載體轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌_tk工程菌(即靶向治療實(shí)體 瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體)培養(yǎng)過(guò)夜，使0D_為1.2-1. 5時(shí)，雙歧桿菌菌液用PBS buffer (含0. 01 %的半胱氨酸鹽)洗滌3次，最后用PBS調(diào)整細(xì)菌濃度為1. 0 X 104cell/ml。c)將上述a)中確認(rèn)的腫瘤模型裸鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組3只，其中A組每 只經(jīng)尾靜脈注射Iml濃度1. OX 104cell/ml的雙歧桿菌_tk工程菌；B組注射同樣濃度的雙 歧桿菌空白對(duì)照(只轉(zhuǎn)化PBES空質(zhì)粒)；C組注射同樣體積的PBS，逐日觀察動(dòng)物的體征，并 稱量體重，記錄食量。注射雙歧桿菌-tk工程菌后的第二天開始經(jīng)腹腔注射GCV(50mg/Kg)， 隨后按照ABC組分組分別注射雙歧桿菌_tk工程菌及其相應(yīng)的對(duì)照物，每周注射一次，連續(xù) 注射4周；次日對(duì)上述大鼠經(jīng)腹腔注射GCV(50mg/Kg)，每天一次，注射4周。結(jié)果證明，靶 向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體治療的A組動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯縮小，重量 減輕，說(shuō)明該系統(tǒng)對(duì)移植瘤(或轉(zhuǎn)移瘤)的治療同樣有效，結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書附圖5。實(shí)施例5用靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體局部注射治療轉(zhuǎn)移實(shí)體瘤(宮頸 癌Caski細(xì)胞轉(zhuǎn)移)的方法如下a)在重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心購(gòu)買裸鼠10只(雌雄不限)，經(jīng)尾靜脈注射Iml 濃度1. 0 X 106cell/ml的人CaSki細(xì)胞，20天后隨機(jī)檢測(cè)腫瘤形成情況，結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書附圖4。b)將雙歧桿菌pBES-tk重組載體轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌_tk工程菌(即靶向治療實(shí)體 瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體)培養(yǎng)過(guò)夜，使0D_為1.2-1. 5時(shí)，雙歧桿菌菌液用PBS buffer (含0. 01 %的半胱氨酸鹽)洗滌3次，最后用PBS調(diào)整細(xì)菌濃度為1. 0 X 104cell/ml。c)將上述a)中確認(rèn)的腫瘤模型裸鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組3只，其中A組每 只經(jīng)腫瘤組織內(nèi)部局部注射Iml濃度1. OX 104cell/ml的雙歧桿菌_tk工程菌；B組局部注 射同樣濃度的雙歧桿菌空白對(duì)照(只轉(zhuǎn)化PBES空質(zhì)粒)；C組局部注射同樣體積的PBS，逐 日觀察動(dòng)物的體征，并稱量體重，記錄食量。注射雙歧桿菌_tk工程菌后的第二天開始經(jīng)腹 腔注射GCV(50mg/Kg)，隨后按照ABC組分組分別局部注射雙歧桿菌_tk工程菌及其相應(yīng)的 對(duì)照物，每周注射一次，連續(xù)局部注射4周；次日對(duì)上述大鼠經(jīng)腹腔注射GCV(50mg/Kg)，每 天一次，注射4周。結(jié)果證明，靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體經(jīng)局部注射治 療的A組動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯縮小，重量減輕，說(shuō)明該重組載體經(jīng)腫瘤組織局部注射對(duì) 移植瘤(或轉(zhuǎn)移瘤)的治療與靜脈注射治療的效果一樣。實(shí)施例6所述的靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體，可以制備成真空安碚包裝 的常溫保存和注射使用的針劑，其特征在于按以下步驟構(gòu)建a)將雙歧桿菌pBES-tk重組載體轉(zhuǎn)化后的雙歧桿菌_tk工程菌(即靶向治療實(shí) 體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體)先在含50 μ g/ml卡那霉素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，
9然后在該固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性菌落，從而獲得靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk 重組載體，PCR和SDS-PAGE鑒定后的陽(yáng)性克隆用20%的脫脂牛奶冷凍真空干燥后保藏，即 為靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的種子菌。b)將上述a)中所述的經(jīng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌復(fù)蘇后，涂布于含卡那霉 素的抗性MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，然后挑取單一的抗性菌落于抗性MRS液體培養(yǎng)基 中增菌培養(yǎng)，經(jīng)PCR證實(shí)tk陽(yáng)性的雙歧桿菌單菌落再次涂布接種于含卡那霉素的抗性MRS 培養(yǎng)基平板上厭氧培養(yǎng)48小時(shí)；然后再挑取單一菌落于含卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 如此反復(fù)接種培養(yǎng)至繼代培養(yǎng)不低于15代時(shí)，經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)tk仍然陽(yáng)性的克隆，可以作 為種子菌用于大規(guī)模液體接種擴(kuò)增培養(yǎng)。c)將作為種子菌的雙歧桿菌_tk接種在含卡那霉素的抗性MRS液體培養(yǎng)中，在接 種后第4、8、10小時(shí)分別取樣，培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮后，進(jìn)一步經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)TK蛋白的表 達(dá)情況，確證重組載體是能夠表達(dá)TK的靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體。d)將培養(yǎng)過(guò)夜的靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體(雙歧桿菌_tk 工程菌)經(jīng)過(guò)含有0. 01%半胱氨酸鹽酸的PBS洗滌菌體5-7次，完全除去培養(yǎng)基所含有的 蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后用10%的甘油液調(diào)整菌液濃度為lX101(lcell/ml，然后按照每安碚分 裝2ml含有10%甘油的菌液，冷凍真空干燥后常溫保存，即為靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌 pBES-tk重組載體的針劑。雖然結(jié)合了附圖描述了本發(fā)明的實(shí)施方式，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在所附 權(quán)利要求的范圍內(nèi)作出各種變形或修改。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí) 施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神 和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā) 明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
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權(quán)利要求
一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES tk重組載體，其特征在于采用序列表中的SEQ ID №1做為表達(dá)載體；所述靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES tk重組載體具有序列表中的SEQ ID №2所表示的tk基因序列。
2.一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的用途，其特征在于用于靶向 治療實(shí)體瘤。
3.權(quán)利要求1所述靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體的構(gòu)建方法，其特征 在于包括以下步驟第一步，先用基因合成方法合成GenBank號(hào)為AB032875的HSV-Itk基因，其序列特征 為SEQ ID No 2 ；在其5-端添加BamHI酶切位點(diǎn)，3’端添加SalI酶切位點(diǎn)，然后將合成的 tk基因片段克隆到pGH克隆載體中，測(cè)序檢測(cè)正確后備用，命名為pGH-tk ；第二步，將PGH-tk和pBES質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，37°C培養(yǎng)10小時(shí)后純化質(zhì) 粒，將純化的pGH-tk和pBES質(zhì)粒分別用BamHI和SalI雙酶切，電泳分離后用凝膠純化試 劑盒(北京鼎國(guó)生物生產(chǎn))分離純化tk基因片段和載體pBES片段，用連接試劑盒(大連 寶生物生產(chǎn))在25°C連接30min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，37°C培養(yǎng)過(guò)夜后挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大 培養(yǎng)后純化質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定正確后，命名為pBES-tk，-80°C保存?zhèn)溆茫湫蛄刑卣鳛?SEQ ID Na 3 ；第三步，a)將雙歧桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即0D_為0. 6-0. 7時(shí)，經(jīng)去離子水配制的滅 菌10%甘油洗滌處理后，以雙歧桿菌為受體菌，用電轉(zhuǎn)化法將純化的pBES-tk質(zhì)粒載體轉(zhuǎn) 化到受體菌中；轉(zhuǎn)化條件為15KV、200Q、25yF;所述的雙歧桿菌為受體菌，由中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC No :M203050的兩歧雙歧桿菌SHQ006 ；b)再將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無(wú)抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇60-120min，然 后在含50μ g/ml卡那霉素的MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇抗性菌落，從而獲得轉(zhuǎn)tk基因的 雙歧桿菌，PCR和SDS-PAGE鑒定后的陽(yáng)性克隆即為雙歧桿菌pBES-tk重組載體的種子菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體，采用序列表中的SEQ ID No1做為表達(dá)載體，即雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES；所述靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體具有序列表中的SEQ ID No2所表示的tk基因序列，該基因?yàn)榘l(fā)揮治療效應(yīng)目的基因，可擇性地殺死腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療實(shí)體瘤的目的。本發(fā)明運(yùn)用基因工程方法將tk基因連接到雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pBES中，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法把tk基因?qū)氲饺梭w生菌-雙歧桿菌中制成雙歧桿菌為表達(dá)載體的tk重組載體腫瘤基因治療系統(tǒng)，即雙歧桿菌pBES-tk重組載體靶向治療實(shí)體瘤的雙歧桿菌pBES-tk重組載體。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101974557SQ20101027982
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者唐偉, 宋方洲, 馬永平 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)