專利名稱：一種新穎的多肽化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多肽化合物，具體而言涉及一種能夠降低血漿脂質(zhì)的多肽化 合物，以及該多肽化合物的合成和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致血漿中的一種或多種脂質(zhì)高于正常水平稱為高血脂癥。 高血脂癥是一種全身性疾病，是指血中膽固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)過高或高密度脂 蛋白膽固醇(HDL-C)過低，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱之為血脂異常。脂質(zhì)不溶或微溶于水，必須與蛋白 質(zhì)結(jié)合以脂蛋白形式存在，因此，高血脂癥通常為高脂蛋白血癥，即血清脂蛋白濃度升高。 目前已經(jīng)公認(rèn)高血脂癥，包括高膽固醇血癥(Hypercholesterolemia)、高甘油三脂血癥 (Hypertriglyceridemia)及二者都高的復(fù)合性高血脂癥。高血脂癥對(duì)身體的損害是隱匿、進(jìn)行性和全身性的。它直接導(dǎo)致和加速全身動(dòng)脈 粥樣硬化。因?yàn)槿淼闹匾鞴俣家揽縿?dòng)脈供血、供氧，一旦動(dòng)脈被粥樣斑塊堵塞，就會(huì) 導(dǎo)致嚴(yán)重后果。其中最常見的一種致命性疾病就是冠心病。大量研究資料表明，高血脂癥 是腦卒中、冠心病、心肌梗死、心臟猝死等致命性心腦血管疾病獨(dú)立而重要的危險(xiǎn)因素。而 高血脂癥中嚴(yán)重乳糜微粒血癥可導(dǎo)致急性胰腺炎，這同樣是一種致命性疾病。此外，高血脂癥也是促進(jìn)高血壓、糖耐量異常、糖尿病等疾病的發(fā)展。高血脂癥還 可導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化、膽石癥、胰腺炎、眼底出血、失明、周圍血管疾病、跛行、高尿酸血癥。 有些原發(fā)性和家族性高血脂癥患者還可出現(xiàn)腱狀、結(jié)節(jié)狀、掌平面及眼眶周圍黃色瘤、青年 角膜弓等。目前臨床上常用的降脂藥物為三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑 (HMG-CoA還原酶)。這類藥物是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成限速酶即HMG-CoA還原酶的抑制劑，是 目前臨床上應(yīng)用最廣泛的一類調(diào)脂藥，由于這類藥物的英文名稱均含有"statin"，故常 簡(jiǎn)稱為他汀類。自1987年第一個(gè)他汀藥物即洛伐他汀(lovastatin)被批準(zhǔn)用于治療高脂 血癥以來，現(xiàn)已有多個(gè)他汀類藥物可供臨床選用。他汀類降脂作用的機(jī)制目前認(rèn)為是由于 該類能抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成早期階段的限速酶即HMG-CoA還原酶，造成細(xì)胞內(nèi)游離膽固 醇減少，并通過反饋性上調(diào)細(xì)胞表面LDL受體的表達(dá)，因而使細(xì)胞LDL受體數(shù)目增多及活性 增強(qiáng)，加速了循環(huán)血液中VLDL殘粒(或IDL)和LDL的清除。臨床使用中發(fā)現(xiàn)該類藥物存在一定的副作用，主要表現(xiàn)為胃痛、腹脹、腹瀉等胃腸 道反應(yīng)及一過性ALT升高和腎功能損害，因此臨床使用中受到一定的限制，如孕婦及哺乳 期婦女應(yīng)當(dāng)禁用該類藥物，肝、腎功能不全者需慎用此類藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新穎的多肽化合物，具體氨基酸序列如下HX1 QGTFTSDYSKYL X9 X, QAAKEFIAffL Χ, X, Xk Xv Xs Xq當(dāng)Xl XlO是選自組合I時(shí)所得的多肽為
(多肽 1):HSQGTFTSDYSKYLDEQA AK E AffLMNTKRNRNNIA 當(dāng)Xl XlO是選自組合II時(shí)所得的多肽為
(多肽 2):HAQGTFTSDYSKYLEGQAAKE AffLVKGRPSKNNIA
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供另一種新穎的多肽化合物，具體氨基酸序列如下 HdSQGTFTSX1YSKX2LEEEAVRLFVQff NTKRNRNDIA
其中X1選自D或E;X2選自F或Y;即 (多月太 3) =HdSQGTFTSDYSK WLMNTKRNRNDIA；
(多月太 4) =HdSQGTFTSDYSK WLMNTKRNRNDIA；
(多月太 5) =HdSQGTFTSEYSK WLMNTKRNRNDIA；
(多月太 6) =HdSQGTFTSEYSK WLMNTKRNRNDIA；
優(yōu)選X1為D時(shí)X2為F，或者X1為E時(shí)X2為Y ；即 (多月太 3) =HdSQGTFTSDYSK WLMNTKRNRNDIA；
(多月太 6) =HdSQGTFTSEYSK WLMNTKRNRNDIA；
FLEEEAVRLF
YLEEEAVRLF
FLEEEAVRLF
YLEEEAVRLF
FLEEEAVRLF
YLEEEAVRLF本文使用的氨基酸殘基的縮:寫如下所示
氨基酸三字母縮寫— 字母縮寫氨基酸三字母資旨寫-
丙氨酸AlaA亮氨酸LeuL
精氨酸ArgR賴氨酸LysK
天冬酰胺AsnN蛋氨酸MetM
天冬氨酸AspD苯丙氨酸PheF
半胱氨酸CysC脯氨酸ProP
組氨酸HisH絲氨酸SerS
異亮氨酸IleI蘇氨酸ThrT
谷氨酰胺GlnQ色氨酸TrpW
谷氨酸GluE酪氨酸TyrY
氨基乙酸GlyG纈氨酸ValV本發(fā)明所記載的多肽3-6中2位絲氨酸殘基為D構(gòu)型，用dS表示。除另外說明之 外，其余具體氨基酸均為L(zhǎng)型。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述多肽化合物在治療動(dòng)物高脂血癥中的用途。血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)都是血清脂質(zhì)的重要指標(biāo)，也是目前臨床血 脂測(cè)定的主要項(xiàng)目。目前已經(jīng)公認(rèn)高血脂癥，包括高膽固醇血癥(Hypercholesterolemia)、 高甘油三脂血癥(Hypertriglyceridemia)及二者都高的復(fù)合性高血脂癥。發(fā)明人通過給予大鼠高脂飲食，造成動(dòng)物高血脂模型，模型制備成功后皮下注射 所述多肽，試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明多肽化合物能顯著降低模型動(dòng)物血清TC、TG水平，具有明 顯的降低血清脂質(zhì)的作用。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供上述多肽化合物在降低動(dòng)物攝食量方面的用途。另一方面，發(fā)明人研究了本發(fā)明所記載多肽對(duì)小鼠攝食量的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示 小鼠在接受皮下注射所述多肽之后半小時(shí)內(nèi)攝食量明顯下降。這一作用表明本發(fā)明多肽可 以通過減少動(dòng)物攝食量從而具有減輕動(dòng)物體重的作用，可用于預(yù)防和治療肥胖癥。本發(fā)明所提供的多肽化合物在治療動(dòng)物高血脂和降低攝食量方面的作用，其中動(dòng) 物主要為哺乳動(dòng)物，尤其是指人類。本發(fā)明多肽可以與藥學(xué)合適的載體或者輔料形成多肽藥物組合物，通過包括但不 限于以下途徑給予動(dòng)物或者人體經(jīng)口、鼻內(nèi)、舌下、十二指腸內(nèi)、皮下、直結(jié)腸、陰道、粘膜、 肺、透皮、靜脈、肌肉、眼內(nèi)、皮內(nèi)等，優(yōu)選采用靜脈或皮下，最優(yōu)選采用皮下方式給藥。所得 到的多肽藥物組合物根據(jù)給藥方式可以單位劑型給藥。適當(dāng)?shù)膭┬桶ǖ幌抻诜勰﹦?片齊 、丸劑、膠囊、錠劑、栓劑、貼片、鼻內(nèi)噴霧劑、注射劑、可植入的持續(xù)釋放制劑、脂質(zhì)復(fù)合 物等，優(yōu)選采用注射劑和可植入的持續(xù)釋放制劑，最優(yōu)選采用注射劑中的皮下注射劑。本發(fā) 明多肽通?？梢耘c一種或多種生理可接受的醫(yī)藥輔料或載體聯(lián)合使用，所述的生理可接受 的醫(yī)藥輔料或載體可用于穩(wěn)定本發(fā)明多肽或增加或降低本發(fā)明多肽的吸收。生理可接受的 醫(yī)藥輔料或載體可以包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、葡聚糖，抗氧劑例如抗壞血酸或 谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質(zhì)，保護(hù)和吸收增強(qiáng)劑例如脂質(zhì)，減少本發(fā)明多肽的清除 或水解的組合物，或賦形劑或其他穩(wěn)定劑和或緩沖劑。還可以包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑， 或特別可用于防止微生物生長(zhǎng)或起作用的防腐劑。各種防腐劑是公知的并且包括例如酚和 抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多種生理可接受的醫(yī)藥輔料或載體的選擇依賴于例 如本發(fā)明多肽的給藥途徑以及特定的物理化學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明多肽采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的多肽合成方法合成。優(yōu)選采用固相合成法合 成。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍?；诒景l(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 確定和使用可用于實(shí)施本發(fā)明的其他組分和操作方法。CN 101974077 A說明書4/8 頁(yè) 實(shí)施例1多肽的制備(多肽1):HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEF IAWLMNTKRNRNNIA；
(多肽2):HAQGTFTSDYSKYLEGQAAKEF IAWLVKGRPSKNNIA；
(多肽3):HdS QGTFTSDYSKFLEEEAVRLFV QWLMNTKRNRNDIA；
(多肽4):HdS QGTFTSDYSKYLEEEAVRLFV QWLMNTKRNRNDIA；
(多肽5):HdS QGTFTSEYSKFLEEEAVRLFV QWLMNTKRNRNDIA；
(多肽6):HdS QGTFTSEYSKYLEEEAVRLFV QWLMNTKRNRNDIA；上述多肽按照本領(lǐng)域常規(guī)的多肽固相合成技術(shù)合成。具體步驟如下1、樹脂的準(zhǔn)備把改造好的FMOC-His (TRT) -2-C1-TRT RESIN樹脂350mg置于多肽合成儀的中號(hào) 反應(yīng)器中，加入二氯甲烷(DCM)浸泡5min，加入適量二甲基甲酰胺(DMF)使樹脂充分溶脹。2、肽鏈的延長(zhǎng)將反應(yīng)器中溶液抽干后，加入3ml的20%哌啶/DMF溶液反應(yīng)震蕩30min，脫除 9-芴甲氧羰基(Fmoc)，用DMF和DCM進(jìn)行洗滌后加入茚三酮檢測(cè)試劑A :20g苯酚加無水 乙醇(分析純)5ml，加入147ml重蒸吡啶，溶解后，混合均勻；B :5g茚三酮溶解到IOOml無 水乙醇(分析純)進(jìn)行茚三酮檢測(cè)，呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)構(gòu)后進(jìn)行下一步反應(yīng)。按照所設(shè)計(jì)多肽序列的順序，依次選取Fmoc-AA-OH置于反應(yīng)器中進(jìn)行多肽序列 的延長(zhǎng)(即依照多肽1、2、3、4、5、6序列從C端開始依次選擇以Fmoc保護(hù)的氨基酸，所選用 的Fmoc-AA-OH其中氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基對(duì)于Asp、Glu的支鏈保護(hù)基叔丁酯(OtBu) ；Ser, Tyr、Thr的支鏈保護(hù)基是叔丁基(tBu)，對(duì)于Asn、Cys、Gln和His是三苯甲基(Trt)；對(duì)于 Lys、Trp是叔丁氧羰基(Boc)；對(duì)于Arg是2，2，4，6，7_五甲基二氫苯并呋喃_5_磺?；?(Pbf)。具體步驟如下稱取0. 5mmoIFmoc-AA-OH 和 0. 5mmol (0. 068mg) 1-羥基 _ 苯并-三氮唑(無水) (HOBT)，溶解在Iml DMF中，加入100 μ 1 (0. 5mmol) 二異丙基碳二亞胺(DIC)，混合2min，加 入到反應(yīng)器中反應(yīng)lh，以茚三酮反應(yīng)確定反應(yīng)終點(diǎn)，用DMF和DCM進(jìn)行洗滌。按照各多肽序列依次重復(fù)上述肽鏈延長(zhǎng)過程，至37肽縮合完畢。將反應(yīng)器中溶液 抽干后，加入3ml的20%哌啶/DMF溶液反應(yīng)震蕩30min，脫除9-芴甲氧羰基(Fmoc)。最 后用DMF，DCM和甲醇進(jìn)行洗滌，真空抽干2h，加入切割試劑(切割試劑的配比為TFA/水/ 茴香硫醚/苯酚/EDT = 82. 5 5 5 5 2.5)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，切割完畢后，用 洗耳球過濾到40ml冰乙醚中，再加入Iml TFA洗一次樹脂，在過濾到乙醚中，加乙醚加到最 滿。放置0°C預(yù)冷30min。然后離心沉淀，去上清，真空干燥2小時(shí)得到粗肽，所得到的多肽 1-6均為白色粉末。采用平板等電點(diǎn)聚焦法測(cè)多肽1-6等電點(diǎn)(PI)
PI 多肽 i = 7. 50-9. 40 ；PI 多肽 2 = 7. 85-9. 95 ；PI 多肽 3 = 4. 10-7. 20 ；PI 多肽 4 = 5. 05-7. 40 ；PI 錄5 = 5. 80-8. 45 ；PI 錄6 = 4. 55-7. 30 ；ESI-MS 測(cè)定
理論值(分 子量MW)結(jié)果實(shí)驗(yàn)條件多肽14349.85與理論值一致ProbeiESI Gas Flow: 1.5L/min DL Temp :3 00 °C Block Temp:250 °C T.Flow:0.2ml/min B.conc:50%H20/50%ACN多肽24127.67與理論值一致多肽34432.94與理論值一致多肽44448.94與理論值一致多肽54446.96與理論值一致多肽64462.96與理論值一致
實(shí)施例2HPLC含量測(cè)定
將所獲得多肽1、2在如下的HPLC條件下進(jìn)行測(cè)定 色譜柱4· 6mmX250mm, Inertsil ODS-SP ； 檢測(cè)波長(zhǎng):220nm ； 進(jìn)樣體積:10μ 1 ； 流速1. Oml/min
流動(dòng)相:A 0. 1% trifluoroacetic in 100% acetonitrile
B :0. 1% trifluoroacetic in 100% water ； 洗脫方式梯度洗脫
AB
O.Olmin25%75%25min50%50%
25. Imin100%30. Ominstop
結(jié)果
多肽1 (峰1)
Peak#Ret.timeAreaheightArea%122.794342160102049. 601223.387322157223332990.399
權(quán)利要求
一種多肽化合物，具體氨基酸序列如下H X1 Q G T F T S D Y S K Y L X2 X3 Q A A K E F I A W L X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10N N I A，其中X1～X10是選自組合I或組合II所列氨基酸殘基 組合 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 I S D E M N T K R N R II A E G V K G R P S K
2.權(quán)利要求1所述的多肽化合物，其中氨基酸序列如下HSQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFIAffL MNTKRNRNNIA。
3.權(quán)利要求1所述的多肽化合物，其中氨基酸序列如下HAQGTFTSDYSKYLEGQAAKEFIAffL VKGRPSKNNIA。
4.一種新穎的多肽化合物，具體氨基酸序列如下HdSQGTFTSX1YSKX2LEEEAVRLFVQffL MNTKRNRNDIA 其中X1選自D或E;X2選自F或Y。
5.權(quán)利要求4所述的多肽化合物，特征是X1為D時(shí)X2為F。
6.權(quán)利要求4所述的多肽化合物，特征是X1為E時(shí)X2為Y。
7.權(quán)利要求1-6任一所述的多肽化合物在制備治療高血脂癥藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-6任一所述的多肽化合物在制備抑制動(dòng)物攝食量藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的多肽化合物，具體而言涉及一種能夠降低血漿脂質(zhì)的多肽化合物，以及該多肽化合物的合成和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。所述的多肽化合物具有如下氨基酸序列H X1 Q G T F T S D Y S K Y L X2 X3 Q A A K E F I A W L X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 N N I A。
文檔編號(hào)A61P3/06GK101974077SQ20101028118
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者穆加兵 申請(qǐng)人:南京瑞年天平醫(yī)藥科技有限公司