專利名稱：脾臟免疫因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫因子，尤其涉及脾臟免疫因子及其制備方法，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脾臟是人、動(dòng)物體內(nèi)最大的淋巴器官；脾臟亦是機(jī)體的中樞免疫器官。脾臟的免疫學(xué)功能主要體現(xiàn)在生成免疫活性細(xì)胞、識(shí)別抗原、生成抗體等方面。脾臟中T淋巴細(xì)胞和 B淋巴細(xì)胞可以制造免疫球蛋白、補(bǔ)體等免疫活性物質(zhì)以及干擾素、轉(zhuǎn)移因子等各種活性因子。當(dāng)血液中出現(xiàn)病菌、病毒、原蟲等抗原或異物時(shí)，脾臟中的這些活性細(xì)胞和活性物質(zhì)就可以發(fā)揮主動(dòng)或被動(dòng)的免疫作用，將進(jìn)入機(jī)體的細(xì)菌、病毒及其它異物吞噬、中和或殺滅。禽類(雞、鴨等)、畜類(豬、牛、羊等)的脾臟容易獲得，尤其是雞、豬的脾臟資源量非常大。肉雞及豬的脾臟為屠宰加工過程中的下腳料，因?yàn)槿藗儧]有食用脾臟的習(xí)慣，脾臟經(jīng)常作為非食用部分被棄去。將這些下腳料資源充分利用，變廢為寶，能夠創(chuàng)造極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但目前對(duì)脾臟的利用僅僅是從中提取轉(zhuǎn)移因子(Transfer Factor, TF)。TF的制備方法已有多個(gè)專利，如中國發(fā)明專利CN1087520公開了豬脾臟提取轉(zhuǎn)移因子的方法；中國發(fā)明專利CN1408367A則闡述了一種雞脾轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)工藝及其制備方法。 TF為分子量介于3000 6000道爾頓的小分子核苷酸_多肽類物質(zhì)，它作為一種特定的細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，能夠提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細(xì)菌性感染；同時(shí)有促進(jìn)B細(xì)胞的抗體分泌作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞釋放干擾素，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體抗感染、 防御能力。然而脾臟中的活性物質(zhì)遠(yuǎn)非僅僅轉(zhuǎn)移因子TF—族。脾臟的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步挖掘。本發(fā)明經(jīng)過研究探索，提取出了動(dòng)物脾臟免疫因子，經(jīng)檢索，未見現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)脾臟免疫因子的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在充分利用動(dòng)物屠宰環(huán)節(jié)產(chǎn)生的豐富下腳料——脾臟，制備具有多種生物活性的脾臟免疫因子，從而提供一種能夠提高人類、動(dòng)物機(jī)體免疫功能以及防治病毒性、細(xì)菌性等疾病的生物制劑，使脾臟這種豐富的生物資源得以充分利用；另一目的在于提供其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)實(shí)施方案如下我們利用經(jīng)過檢疫的雞、豬等的脾臟為原料，經(jīng)凍融破碎細(xì)胞后將脾臟成份提取出來，經(jīng)過濾、離心，然后超濾；超濾后收集分子量小于20000 道爾頓的脾臟成份，我們將其稱為脾臟免疫因子(Spleen Immune Factor)、脾臟因子 (Spleen Factor)或活性蛋白因子(Active Protein Factor，簡稱 APF)。與轉(zhuǎn)移因子TF相似(任麗君等，轉(zhuǎn)移因子研究及其臨床應(yīng)用，生物學(xué)雜志，1997年第14卷第15期)，脾臟免疫因子可分為特異性脾臟免疫因子和非特異性脾臟免疫因子兩大類。特異性脾臟免疫因子系采用某種特定病原感染或免疫機(jī)體后再提取含該抗原特異活性的脾臟免疫因子，針對(duì)性強(qiáng)，治療效果突出。非特異性脾臟免疫因子是指用自然機(jī)體脾臟提取的具有多種免疫活性的脾臟免疫因子，可非特異性調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，從而提高機(jī)體的抵抗力或疫苗的免疫效果。試驗(yàn)表明，由對(duì)病原體的抑殺效果和免疫活性來看，特異性脾臟免疫因子活性為非特異性脾臟免疫因子活性的40 50倍。 一、非特異性脾臟免疫因子通過如下步驟制備首先將經(jīng)過檢疫的新鮮、健康脾臟，用無菌純水反復(fù)清洗，將脾臟表面的油脂、筋膜處理干凈；將脾臟切塊放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎，分盤后入冷庫(_25°C -30°C )速凍，凍融3 5次，加3 5倍無菌純水，混勻，然后置于膠體磨中乳化，離心分離固體物與提取物，每分鐘3000 16000轉(zhuǎn)；濾液收集于容器中，濾液過濾；超濾，截留分子量小于20000 道爾頓得到的超濾產(chǎn)物即為脾臟免疫因子。其為分子量小于20000道爾頓的混合物。二、特異性脾臟免疫因子通過如下步驟制備用某種特定疾病抗原免疫豬、雞等動(dòng)物，待免疫成功后取免疫動(dòng)物的脾臟，無菌勻漿，凍融3 5次，使細(xì)胞徹底破壞；將勻漿凍融液放入透析袋中透析，收集其中分子量 20000道爾頓以下部分，即為特異性脾臟免疫因子。其為分子量小于20000道爾頓的混合物。三、脾臟免疫因子檢測(cè)1、蛋白質(zhì)定性試驗(yàn)蛋白質(zhì)具有縮二脲顯色反應(yīng)，而多肽沒有；在試管中加入2mL 脾臟免疫因子溶液，再加10%氫氧化鈉溶液2mL，然后加幾滴Imol 硫酸銅溶液，可觀察到在脾臟免疫因子溶液內(nèi)有紫色出現(xiàn)；表明脾臟免疫因子含有蛋白質(zhì)成份；而主要為多肽成份的脾臟轉(zhuǎn)移因子TF蛋白質(zhì)鑒定為陰性。2、蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白及多肽含量測(cè)定采用Bradford法進(jìn)行，計(jì)算公式為蛋白及多肽含量(mg/g)=(濃度X提取液總體積/測(cè)定時(shí)取樣體積)/脾臟重量。結(jié)果為脾臟免疫因子中蛋白及多肽含量6 10mg/g，平均值為7mg/g。3、外觀鑒定脾臟免疫因子為澄明液體，無異物、渾濁或沉淀。4、脾臟免疫因子成份組成所述脾臟免疫因子用SDS-PAGE電泳(7. 5%分離膠) 檢測(cè)，電泳圖譜呈現(xiàn)分散的數(shù)條區(qū)帶(見附

圖1)，經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈現(xiàn)藍(lán)色； 經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照物比較，各區(qū)帶的分子量依次為3000 6000、14000、17000、18000以及接近20000道爾頓；通過免疫印記Western-blotting檢測(cè)表明，上述區(qū)帶所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分別為溶菌酶、干擾素、白細(xì)胞介素以及補(bǔ)體系統(tǒng)的分子片段(見表1)。由此可知，脾臟免疫因子是一類分子量在20000道爾頓以下(3000 20000道爾頓)、包含轉(zhuǎn)移因子、溶菌酶、干擾素、白介素及補(bǔ)體系統(tǒng)等細(xì)胞因子的復(fù)合體；但其成份組成以及組成比例會(huì)隨不同的脾臟來源或者不同的生理狀況等因素的變化而變動(dòng)。脾臟免疫因子制備過程中，分子量上限設(shè)定為20000道爾頓具有很好的實(shí)際意義。分子量在20000道爾頓以下能充分保證脾臟免疫因子溶液的澄清，為下一步發(fā)展注射用制劑奠定良好基礎(chǔ)；若分子量超過20000道爾頓，一是水溶性不好，影響制劑穩(wěn)定性和療效，二是脾臟免疫因子制備過程中的反復(fù)凍融環(huán)節(jié)容易破壞大分子的空間結(jié)構(gòu)而使其失去活性。表1凝膠電泳區(qū)帶所對(duì)應(yīng)的多肽、蛋白質(zhì)種類
權(quán)利要求
1.脾臟免疫因子的其制備方法，其特征在于，非特異性脾臟免疫因子通過如下步驟制備首先將經(jīng)過檢疫的新鮮、健康脾臟，用無菌純水反復(fù)清洗，將脾臟表面的油脂、筋膜處理干凈；將脾臟切塊放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎，分盤后入冷庫(_25°C -30°c )速凍，凍融3 5次，加3 5倍無菌純水，混勻，然后置于膠體磨中乳化，離心分離固體物與提取物， 每分鐘3000 16000轉(zhuǎn)；濾液收集于容器中，濾液過濾；超濾，截留分子量小于20000道爾頓得到的超濾產(chǎn)物即為脾臟免疫因子。
2.脾臟免疫因子的制備方法，其特征在于，特異性脾臟免疫因子通過如下步驟制備 用某種特定疾病抗原免疫豬、雞等動(dòng)物，待免疫成功后取免疫動(dòng)物的脾臟，無菌勻漿，凍融3 5次，使細(xì)胞徹底破壞；將勻漿凍融液放入透析袋中透析，收集其中分子量小于 20000道爾頓的成份，即為特異性脾臟免疫因子。
3.脾臟免疫因子，其特征在于，其通過權(quán)利要求1或2所述的方法制得，為分子量小于 20000道爾頓的混合物。
4.如權(quán)利要求3所述的脾臟免疫因子，其特征在于，其包含有轉(zhuǎn)移因子、溶菌酶、干擾素、白介素及補(bǔ)體系統(tǒng)分子片段。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脾臟免疫因子及其制備方法，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該脾臟免疫因子或特異性脾臟免疫因子采用超濾法或透析法制備。本發(fā)明脾臟免疫因子的分子量小于20000道爾頓，含有轉(zhuǎn)移因子所沒有的蛋白質(zhì)成份，生物活性高。本發(fā)明脾臟免疫因子的開發(fā)與應(yīng)用，不僅拓展了動(dòng)物(雞、豬等)脾臟資源的利用效率，增強(qiáng)了脾臟提取物的生物活性，而且為治療人類、動(dòng)物界的頑固性疾病，如禽流感、腫瘤等，提供了一種原料易得、成本低廉、無毒副作用的制劑原料，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102397293SQ201010285529
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者曹吉祥 申請(qǐng)人:曹吉祥