專利名稱：豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，特別是一種對豬氣喘病活疫苗沒有毒性的、并能特異 性增強(qiáng)其免疫刺激能力的豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑。
背景技術(shù)：
豬氣喘病，又稱豬地方流行性肺炎(Swine enzooic pneumonia)，俗稱豬氣喘病， 是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)引起的一種豬的慢性呼吸道傳染性 疾病，主要癥狀為咳嗽和氣喘。該病主要引起豬的飼料轉(zhuǎn)化率下降和生長受阻，發(fā)病率高、 死亡率低。豬氣喘病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。豬氣喘病是一種頑固性慢性傳染病，藥物治療效果不夠理想，停藥后容易復(fù)發(fā)，該 病一旦在豬場流行，就很難根除。因此，預(yù)防、控制和凈化豬氣喘病須采取早期診斷、及時隔 離、抗生素治療或淘汰病豬、疫苗預(yù)防、全進(jìn)全出、嚴(yán)格消毒等綜合性措施，其中疫苗預(yù)防在 控制豬氣喘病中起著關(guān)鍵性的作用。目前，國內(nèi)外對于該病的防治主要依靠國外進(jìn)口滅活疫苗，其中以美國輝瑞動物 保健品公司采用Amphigen佐劑制備的“瑞倍適”滅活疫苗應(yīng)用最為廣泛。但滅活疫苗的保 護(hù)效力不足、需要多次免疫且成本較高，并不能完全滿足實(shí)際的需要。減毒活疫苗能在體內(nèi) 短暫增殖，具有接種劑量小、接種次數(shù)少、免疫效果強(qiáng)而持久的優(yōu)勢。國內(nèi)研究者在豬氣喘 病活疫苗的開發(fā)上做了大量而有價值的工作，已研制的活疫苗(如江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī) 研究所研制申報的豬氣喘病活疫苗(豬支原體肺炎(168株)活疫苗)[證號(2007)新獸 藥證字10號])免疫效力優(yōu)于滅活疫苗，而成本相對較低，具有很強(qiáng)的市場競爭力。但由于 現(xiàn)有活疫苗采用的是肺內(nèi)注射的免疫途徑，一定程度上影響了疫苗的廣泛推廣，因此，開發(fā) 新的方便的免疫途徑成為進(jìn)一步研究的迫切需要。肺內(nèi)免疫的優(yōu)勢在于活疫苗可直接到達(dá) 肺部起效，而當(dāng)采用其他的免疫途徑時作用較為間接，同等劑量下的免疫效力勢必較弱，因 此，如何增強(qiáng)疫苗的免疫刺激能力是開發(fā)該疫苗非肺內(nèi)注射免疫途徑的技術(shù)關(guān)鍵。向疫苗 中添加佐劑是增強(qiáng)疫苗免疫效力的主要手段。佐劑(adjuvant)，是指一類預(yù)先或與抗原同 時注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的非特異性免疫增強(qiáng)性 物質(zhì)。最常見的佐劑為油類佐劑，例如弗氏佐劑、白油佐劑、MF-59、SAF等。這類佐劑通常 具有良好的免疫增強(qiáng)作用，但是由于油類物質(zhì)對細(xì)胞膜的破壞性，對于減毒活疫苗而言，油 包水類佐劑不適用，而即便是水包油類佐劑對其穩(wěn)定性和制備工藝的要求也很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于公開一種對豬氣喘病活疫苗沒有毒性的、不顯著影響活疫 苗活力的、并能增強(qiáng)其免疫刺激能力的適用于豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑。本發(fā)明的另一個目的是為上述疫苗佐劑提供一種操作簡單方便的制備方法。本發(fā)明的再一個目的是公開該佐劑在豬氣喘病活疫苗免疫中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下措施即可實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明的豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑，主要由左旋咪唑、中草藥多糖、殼聚糖以及 磷酸鹽緩沖液組成，所述佐劑的每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)? 10mg、中草藥多糖為20 lOOmg、殼聚糖為3 15mg、其余為磷酸鹽緩沖液。上述中草藥多糖選用香菇多糖或黃芪多糖或枸杞多糖或女貞子多糖。本發(fā)明的豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑的制備方法，包括先配制高濃度母液，再配 制低濃度佐劑溶液，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度，過濾除菌后即得，其具體步驟如 下A)先配制高濃度母液1、左旋咪唑母液用市售的左旋咪唑含量為50mg/ml的獸用鹽酸左旋咪唑注射液 為50mg/ml的左旋咪唑母液；2、中草藥多糖母液將中草藥多糖粉末溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到500mg/ ml的中草藥多糖母液；3、殼聚糖母液將殼聚糖粉末投入到適量的醋酸溶液中充分溶解后，用NaOH溶液 調(diào)節(jié)PH至中性，再加入適量的磷酸鹽緩沖液稀釋混合均勻得30mg/ml的殼聚糖母液；B)配制低濃度佐劑溶液以IOOml佐劑為例進(jìn)行配制時，分別取50mg/ml的左旋咪唑母液4 20ml、500mg/ ml的中草藥多糖母液4 20ml、30mg/ml的殼聚糖母液10 50ml、與其余為磷酸鹽緩沖液 稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)? 10mg、中草藥多糖為20 lOOmg、殼聚糖為3 15mg的疫苗佐劑。所述疫苗佐劑在豬氣喘病活疫苗中應(yīng)用時，按豬氣喘病活疫苗與疫苗佐劑的體積 比為1 1 1 5的比例配制混勻后即為含佐劑的豬氣喘病活疫苗。所述豬氣喘病活疫 苗與疫苗佐劑的優(yōu)選體積比為1 2 1 3。本發(fā)明佐劑中的左旋咪唑是一種廣譜驅(qū)蟲藥，作為常用的疫苗佐劑，具有較強(qiáng)的 直接免疫刺激能力，與中草藥多糖等都屬于可直接溶解于水的免疫增強(qiáng)劑，這類免疫增強(qiáng) 劑在不影響活疫苗活性的前提下溶解后可直接作為活疫苗佐劑使用，但這類佐劑的缺陷在 于為均一水相，缺乏儲庫效應(yīng)。常用的水包油類佐劑雖有較好的儲庫作用，其外相為水溶液 也可作為活疫苗的佐劑使用，但是用于活疫苗佐劑時對制備工藝和穩(wěn)定性的要求很高，一 旦發(fā)生破乳，對活疫苗活力損傷較大。在本發(fā)明中添加了殼聚糖，一方面其本身具有免疫刺 激能力，另一方面其為大分子多糖，具有較高黏度，可起到一定抗原儲庫的作用，免疫刺激 時間延長。本發(fā)明的佐劑不僅能增強(qiáng)豬氣喘病活疫苗的免疫刺激能力，加強(qiáng)疫苗免疫效果， 還具有制備方法簡單方便，佐劑性能穩(wěn)定，便于量產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用時，只需將一定比例的豬 氣喘病活疫苗與本發(fā)明的佐劑混合后即可進(jìn)行肌肉注射免疫，實(shí)現(xiàn)豬氣喘病活疫苗的肌肉 注射免疫，克服了現(xiàn)行肺內(nèi)注射免疫的缺點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明佐劑中的有效成分分別對豬氣喘病活疫苗的毒性檢測圖；圖2是本發(fā)明佐劑不同劑量的攻毒保護(hù)效力研究圖。圖中誤差線表示的是樣本的 標(biāo)準(zhǔn)偏差；*表示與攻毒對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P < 0. 05) ；**表示與攻毒對照組 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異(P < 0.01)。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述和論證，但是本發(fā)明所包括的內(nèi)容并不 局限于此。為了驗(yàn)證本發(fā)明的佐劑對豬氣喘病活疫苗既沒有毒性、又能增強(qiáng)豬氣喘病活疫苗 的免疫刺激能力，特做以下實(shí)驗(yàn)和制備。實(shí)施例1不同佐劑成分對豬氣喘病活疫苗的毒性檢測一、實(shí)驗(yàn)材料1、疫苗豬氣喘病活疫苗(豬支原體肺炎168株活疫苗)，由南京天邦生物科技有 限公司提供；2、佐劑成分黃芪多糖(購自陜西錦泰生物工程有限公司)；鹽酸左旋咪唑注射液 (購自江蘇華東貝爾生物藥業(yè)有限公司)；殼聚糖(購自Fluka公司)。二、實(shí)驗(yàn)方法將各種不同佐劑成分分別用磷酸鹽緩沖液配制成一定的濃度的溶液，各種佐劑成 分的濃度如下黃芪多糖200mg/ml左旋咪唑25mg/ml殼聚糖20mg/ml上述三種佐劑溶液分別與豬氣喘病活疫苗(豬支原體肺炎168株活疫苗)溶液按 體積比5 1混合，20分鐘后取樣，測定CXU(color change unit，顏色改變單位)；同時以 磷酸鹽緩沖液作為對照，比較兩者CCU的差異，判斷佐劑對活疫苗的毒性。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示當(dāng)體外共同孵育20分鐘時，與磷酸鹽緩沖液相比，幾種佐劑成分在各自 特定的濃度下都不會影響豬氣喘病活疫苗(豬支原體肺炎168株活疫苗)的活力，CCU測 定結(jié)果無變化(如圖1所示)。說明這幾種佐劑成分在小于或等于該濃度時都可作為豬氣 喘病活疫苗的佐劑使用。實(shí)施例2適用于豬氣喘病活疫苗的佐劑的制備本發(fā)明的豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑，主要由左旋咪唑、中草藥多糖、殼聚糖以及 磷酸鹽緩沖液組成，所述佐劑的每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)? 10mg、中草藥多糖為20 lOOmg、殼聚糖為3 15mg、其余為磷酸鹽緩沖液。所述中草藥多糖選用香菇多糖或黃芪多糖或枸杞多糖或女貞子多糖。本發(fā)明的豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑的制備方法，包括先配制高濃度母液，再配 制低濃度佐劑溶液，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度，過濾除菌后即得，其具體步驟如 下A)先配制高濃度母液1、左旋咪唑母液用市售的左旋咪唑含量為50mg/ml的獸用鹽酸左旋咪唑注射液 為50mg/ml的左旋咪唑母液；2、中草藥多糖母液將中草藥多糖粉末溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到500mg/ ml的中草藥多糖母液；
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3、殼聚糖母液將殼聚糖粉末投入到適量的醋酸溶液中充分溶解后，用NaOH溶液 調(diào)節(jié)PH至中性，再加入適量的磷酸鹽緩沖液稀釋混合均勻得30mg/ml的殼聚糖母液；B)配制低濃度佐劑溶液以IOOml佐劑為例進(jìn)行配制時，分別取下述各例劑量的上述母液均可制得合格的 疫苗佐劑1)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草藥多糖母液4ml、30mg/ml的 殼聚糖母液10ml、與磷酸鹽緩沖液82ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有左 旋咪唑?yàn)?mg、中草藥多糖為20mg、殼聚糖為3mg的疫苗佐劑。2)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草藥多糖母液10ml、30mg/ml的 殼聚糖母液10ml、與磷酸鹽緩沖液76ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有左 旋咪唑?yàn)?mg、中草藥多糖為50mg、殼聚糖為3mg的疫苗佐劑。3)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml、500mg/ml的中草藥多糖母液10ml、30mg/ml的 殼聚糖母液30ml、與磷酸鹽緩沖液56ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有左 旋咪唑?yàn)?mg、中草藥多糖為50mg、殼聚糖為9mg的疫苗佐劑。4)取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、500mg/ml的中草藥多糖母液10ml、30mg/ml 的殼聚糖母液30ml、與磷酸鹽緩沖液50ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?mg、中草藥多糖為50mg、殼聚糖為9mg的疫苗佐劑。5)取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、500mg/ml的中草藥多糖母液20ml、30mg/ml 的殼聚糖母液30ml、與磷酸鹽緩沖液40ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?mg、中草藥多糖為lOOmg、殼聚糖為9mg的疫苗佐劑。6)取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml、500mg/ml的中草藥多糖母液20ml、30mg/ml 的殼聚糖母液50ml、與磷酸鹽緩沖液20ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?mg、中草藥多糖為lOOmg、殼聚糖為15mg的疫苗佐劑。7)取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草藥多糖母液20ml、30mg/ml 的殼聚糖母液50ml、與磷酸鹽緩沖液IOml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?0mg、中草藥多糖為lOOmg、殼聚糖為15mg的疫苗佐劑。8)取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草藥多糖母液10ml、30mg/ml 的殼聚糖母液50ml、與磷酸鹽緩沖液20ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?0mg、中草藥多糖為50mg、殼聚糖為15mg的疫苗佐劑。9)取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草藥多糖母液10ml、30mg/ml 的殼聚糖母液30ml、與磷酸鹽緩沖液40ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?0mg、中草藥多糖為50mg、殼聚糖為9mg的疫苗佐劑。10)取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml、500mg/ml的中草藥多糖母液4ml、30mg/ml 的殼聚糖母液10ml、與磷酸鹽緩沖液66ml稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有 左旋咪唑?yàn)?0mg、中草藥多糖為20mg、殼聚糖為3mg的疫苗佐劑。總之，以IOOml佐劑為例進(jìn)行配制時，取50mg/ml的左旋咪唑母液4 20ml、 500mg/ml的中草藥多糖母液4 20ml、30mg/ml的殼聚糖母液10 50ml、與其余為磷酸鹽 緩沖液稀釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)? 10mg、中草藥多糖 為20 lOOmg、殼聚糖為3 15mg的疫苗佐劑。
配制過程中，如母液的濃度較高，可以少用點(diǎn)；如母液的濃度較低，可以多用點(diǎn)，所 配制的佐劑中的幾種成分的含量在上述范圍內(nèi)均可正常使用。實(shí)施例3含佐劑的豬氣喘病活疫苗的制備用上述方法完成制備的疫苗佐劑，按豬氣喘病活疫苗(豬支原體肺炎168株活疫 苗)與疫苗佐劑的體積比為11 15的比例配制混勻后即為含佐劑的豬氣喘病活疫 苗。所述豬氣喘病活疫苗與疫苗佐劑的優(yōu)選體積比為1 2 1 3。實(shí)施例4含佐劑的豬氣喘病活疫苗肌肉注射免疫途徑及免疫效力的研究一、實(shí)驗(yàn)材料1.動物5_10日齡蘇鐘豬，購自六合竹鎮(zhèn)畜禽養(yǎng)殖科技示范園；2.疫苗豬氣喘病活疫苗(豬支原體肺炎168株活疫苗)，由南京天邦生物科技有 限公司提供；3.攻毒用強(qiáng)毒豬肺炎支原體JS株及其組織毒，由南京天邦生物科技有限公司提{共。二、實(shí)驗(yàn)方法1.佐劑溶液配制按實(shí)施例2所述方法制備得到佐劑。2.免疫采用5-10日齡豬肺炎支原體血清抗體陰性豬，隨機(jī)分組，每組5頭，首先設(shè)置一組 為健康對照組，即不免疫不攻毒，其余組分別為攻毒對照組、無佐劑對照組、低劑量佐劑組、 高劑量佐劑組，分別免疫磷酸鹽緩沖液、不含佐劑的豬氣喘病活疫苗、添加等體積佐劑的活 疫苗，添加5倍體積佐劑的活疫苗，這四組皆于兩月齡時用強(qiáng)毒攻毒。免疫時，用實(shí)施例3所述方法配制的含佐劑的豬氣喘病活疫苗，采用頸部肌肉多 點(diǎn)注射方式免疫。3.攻毒免疫后8周，動物氣管內(nèi)注射豬肺炎支原體強(qiáng)毒攻毒。強(qiáng)毒配制方法用3ml生理 鹽水溶解凍干組織毒，加入Iml新鮮培養(yǎng)毒，共注射4ml/頭。4.剖檢評分攻毒后25天處死動物，參照MADEC和K0BISCH(1982)報道的方法對實(shí)驗(yàn)豬肺部的 損傷進(jìn)行評分。整個肺臟分左心葉(LCL)、左尖葉(LAL)、左膈葉(LDL)、右心葉(RCL)、右尖 葉(RAL)、右膈葉(RDL)和副葉(IL)，共7個肺葉。每個肺臟的損傷分?jǐn)?shù)為上述7個肺葉的 背側(cè)面和腹側(cè)面損傷得分之和，總分為28分。每個肺葉按照損傷的面積分別打0-4分，其 中無損傷為0分，1-25%面積損傷為1分，26-50%面積損傷為2分，51-75%面積損傷為3 分，76-100%面積損傷為4分。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.安全檢驗(yàn)免疫前及免疫后3天，連續(xù)3天測定肛溫，各組動物均無明顯發(fā)熱現(xiàn)象；肌肉注射 部位局部無明顯紅腫，說明添加上述佐劑的豬氣喘病活疫苗在所用劑量下對實(shí)驗(yàn)豬安全。2.疫苗保護(hù)力比較攻毒后25天剖殺動物，對肺部支原體肺炎病變程度進(jìn)行評分，結(jié)果見圖2。圖中誤差線表示的是樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差；*表示與攻毒對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P <0.05)； **表示與攻毒對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異(P < 0. 01)。
結(jié)果表明，不添加佐劑時，肌肉注射活疫苗無法提供攻毒保護(hù)力，而添加佐劑后免 疫，動物肺臟病變程度較攻毒對照組明顯減輕，其中添加1倍體積佐劑的低劑量佐劑組具 有顯著差異(P < 0. 05)，添加5倍體積佐劑的高劑量佐劑組具有極顯著差異(P < 0. 01)。實(shí)驗(yàn)證明，該佐劑能有效輔助疫苗刺激動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在實(shí)施例中該佐劑與 豬支原體肺炎168株活疫苗聯(lián)用，可對后續(xù)強(qiáng)毒攻毒起到保護(hù)。
權(quán)利要求
一種豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑，其特征在于該佐劑溶液中含有左旋咪唑、中草藥多糖、殼聚糖以及磷酸鹽緩沖液，所述佐劑的每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)?～10mg、中草藥多糖為20～100mg、殼聚糖為3～15mg、其余為磷酸鹽緩沖液。
2、中草藥多糖母液將中草藥多糖粉末溶解于磷酸鹽緩沖液中配制得到500mg/ml的 中草藥多糖母液；
3、殼聚糖母液將殼聚糖粉末投入到適量的醋酸溶液中充分溶解后，用NaOH溶液調(diào)節(jié) PH至中性，再加入適量的磷酸鹽緩沖液稀釋混合均勻得30mg/ml的殼聚糖母液；B)配制低濃度佐劑溶液以IOOml佐劑為例進(jìn)行配制時，分別取50mg/ml的左旋咪唑母液4 20ml、500mg/ml 的中草藥多糖母液4 20ml、30mg/ml的殼聚糖母液10 50ml、與其余為磷酸鹽緩沖液稀 釋混合均勻過濾除菌后，即為每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)? 10mg、中草藥多糖為20 lOOmg、殼聚糖為3 15mg的疫苗佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗佐劑在豬氣喘病活疫苗中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗佐劑在豬氣喘病活疫苗中的應(yīng)用，其特征在于所述豬氣 喘病活疫苗與疫苗佐劑混合的體積比為1 1 1 5，為含佐劑的豬氣喘病活疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗佐劑在豬氣喘病活疫苗中的應(yīng)用，其特征在于所述豬氣 喘病活疫苗與疫苗佐劑混合的優(yōu)選體積比為1 2 1 3，為含佐劑的豬氣喘病活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明的豬氣喘病活疫苗的疫苗佐劑，主要由左旋咪唑、中草藥多糖、殼聚糖以及磷酸鹽緩沖液組成，所述佐劑的每ml溶液中含有左旋咪唑?yàn)?～10mg、中草藥多糖為20～100mg、殼聚糖為3～15mg、其余為磷酸鹽緩沖液。其制備方法是先配制高濃度母液，再配制低濃度的佐劑溶液。將該佐劑與豬氣喘病活疫苗按一定比例混合后，即為含佐劑的豬氣喘病活疫苗，可顯著增強(qiáng)疫苗的免疫刺激能力，提高疫苗的保護(hù)效力。還具有制備方法簡單方便，佐劑性能穩(wěn)定，便于量產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用時，只需將一定比例的豬氣喘病活疫苗與本發(fā)明的佐劑混合后即可進(jìn)行肌肉注射免疫，實(shí)現(xiàn)豬氣喘病活疫苗的肌肉注射免疫，克服了現(xiàn)行肺內(nèi)注射免疫的缺點(diǎn)。
文檔編號A61K39/02GK101954078SQ20101028802
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者馮志新, 劉茂軍, 張道華, 熊祺琰, 邵國青 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院