專利名稱：一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸用生物制品制備領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性鼻炎是由副雞嗜血桿菌引起的一種急性上呼吸道傳染病，主要特征為面部腫脹、鼻腔有漿液性或粘液性分泌物、結(jié)膜炎，發(fā)病率很高，可以引起育成雞生長(zhǎng)停滯和蛋雞產(chǎn)蛋量顯著下降(產(chǎn)蛋減少10 40% )，8 12周齡的雞和蛋雞最常發(fā)生。此病分布于全世界，使育成雞生長(zhǎng)發(fā)育受阻和淘汰率增加，蛋雞產(chǎn)蛋量明顯減少，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此病可采用敏感藥物治療，但極易產(chǎn)生耐藥性，病情常反復(fù)發(fā)作，無(wú)法從根本上消除帶菌狀態(tài)。據(jù)調(diào)查，選用免疫原性較好的菌株制作疫苗進(jìn)行積極預(yù)防是控制本病的有效途徑。目前，國(guó)內(nèi)外生物制品廠家生產(chǎn)的雞傳染性鼻炎疫苗均為油乳劑滅活疫苗，但油乳劑滅活疫苗存在粘度大難注射、礦物油難吸收、注射局部易發(fā)生腫脹、免疫產(chǎn)生時(shí)間長(zhǎng)、 免疫持續(xù)期短等缺點(diǎn)，亟待需要尋求一種易吸收、無(wú)毒副作用、效果好的新型佐劑疫苗來(lái)防治該病。楊樹(shù)皮類脂系從楊樹(shù)皮中提取的一種橙黃色脂溶性物質(zhì)，具有高度的天然生物學(xué)活性，富含大量的磷脂、留醇、不飽和脂肪酸、糖脂以及多種常量、微量元素、多種維生素、18 種必需氨基酸等。其中楊樹(shù)皮類脂中含有的多糖類、有機(jī)酸、留醇、甙類、黃酮類物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)協(xié)調(diào)統(tǒng)一，可以大大提高動(dòng)物體的免疫機(jī)能。多糖類具有促胸腺體液反應(yīng)、刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，提高機(jī)體特異性免疫反應(yīng)能力；有機(jī)酸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，能夠刺激和促進(jìn)單核吞噬細(xì)胞功能，對(duì)抗免疫抑制對(duì)免疫器官的抑制作用；甙類能夠加速抗體的產(chǎn)生、 促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能等作用。國(guó)內(nèi)也有用類脂做為佐劑制備疫苗的報(bào)道，其中，專利號(hào)為ZL03142556. 9的發(fā)明專利公開(kāi)了楊樹(shù)皮類脂做為疫苗佐劑的使用方法，(1) 500 1000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰环N抗原和/或抗原組合物，同時(shí)緩緩加入楊樹(shù)皮類脂佐劑， 使楊樹(shù)皮類脂佐劑在混合物中的終濃度達(dá)到4 6% (W/V) ； ( 將上述混合物通過(guò)乳化壓力為10 15MPa，剪切壓力為45 60MPa的均質(zhì)機(jī)內(nèi)乳化，乳化溫度在20 30°C之間，制得含楊樹(shù)皮類脂佐劑的疫苗。使用該方法制得的疫苗效果好，但類脂含量高、制造成本高， 且免疫持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有滅活疫苗的缺陷，提供一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法，采用本發(fā)明所制備的疫苗容易吸收、無(wú)毒副作用、免疫產(chǎn)生時(shí)間短、免疫持續(xù)期長(zhǎng)、免疫效果好，能有效防控雞傳染性鼻炎，且制造成本低。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟
(I)A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備，包括如下步驟一級(jí)菌種制備取A型副雞嗜血桿菌菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在(X)2體積含量為5%、溫度為37°C環(huán)境中培養(yǎng)16 18h，挑選符合菌株特性的直徑為Imm的3 5個(gè)典型菌落用IOml滅菌雞肉湯稀釋后接種到6 7日齡SPF雞胚卵黃囊內(nèi)，每胚接種 0. anl，在37°C條件下繼續(xù)孵化，收集30h內(nèi)死亡胚的卵黃液，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)雜菌后，作為一級(jí)菌種，置于-20°C以下保存，不得超過(guò)30天；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種，按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/200的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在溫度為37°C條件下培養(yǎng)17 18h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)雜菌后，即為二級(jí)菌種，并置于2-8°C保存，不得超過(guò)6 他；制苗用菌液的制備將二級(jí)菌種按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/40的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在37-38°C溫室中靜止培養(yǎng)18 20h，期間每隔6 他搖晃一次，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)雜菌污染，加入體積為半合成培養(yǎng)基體積1/2000的甲醛滅活Mh，得到制苗用菌液；菌液的濃縮與滅活將純粹檢驗(yàn)合格的制苗用菌液進(jìn)行濃縮，濃縮后含菌量不少于50億cfu/ml，再分別加入體積為濃縮菌液體積1/1000的甲醛和體積為濃縮菌液體積 1/10000的硫柳汞，混勻后在4°C條件下滅活2天，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格得到A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液；( C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備，其制備方法與A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備方法相同；(3)疫苗的制備取上述制備的A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液按體積比為1 1的比例混合后倒入乳化罐內(nèi)，用混合機(jī)以750 850r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，同時(shí)再加入楊樹(shù)皮類脂，加入楊樹(shù)皮類脂速度不能快，使楊樹(shù)皮類脂液在混合物中的最終體積百分比濃度為2. 0 3. 8%，然后將混合機(jī)的轉(zhuǎn)速提高到2500 3000r/min繼續(xù)乳化30 60分鐘，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最終含菌量均為 10 億 cfu/ml ；上述雞肉湯瓊脂板是這樣制備的取雞肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化鈉0. 5g、瓊脂粉1. 5g混合，用4mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液的PH至7. 4，116°C滅菌30分鐘，倒板前加入輔酶I (NADH)和過(guò)濾除菌的健康雞血清混勻，使得混合溶液中輔酶I(NADH)的質(zhì)量濃度為0. 05%、過(guò)濾除菌的健康雞血清的體積百分比濃度為10%，然后將混合溶液倒入直徑為90mm的平皿中，放平冷卻即得到雞肉湯瓊脂板；所述雞肉汁是取雞胸脯肉泥1重量份加入蒸餾水4重量份，4°C浸泡過(guò)夜，煮沸30分鐘，除去肉渣，澄清過(guò)濾得到的；上述半合成培養(yǎng)基是這樣制備的取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸鈉15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化鈉15g，放入IOOOml純化水中攪均，調(diào)節(jié)所得溶液的PH至7. 2 7. 4，116°C滅菌40分鐘，臨用前加入60ml的滅活健康雞血清和IOml的濃度為0. 5%的輔酶 I (NADH)水溶液。在上述的菌液的濃縮與滅活中，濃縮采用高速離心方法、中空纖維過(guò)濾方法或超濾濃縮方法中的任意一種。本發(fā)明優(yōu)選的濃縮采用超濾濃縮方法。上述副雞嗜血桿菌菌株為A型C-Hpg-8株(編號(hào)為CVCC 254)和C型Hpg-668株(編號(hào)為CVCC 256)，均來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；上述佐劑楊樹(shù)皮類脂來(lái)源于美科爾 (河北)生物技術(shù)有限公司。用比濁法測(cè)定含菌量。純粹檢驗(yàn)，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行，純粹、無(wú)雜菌生長(zhǎng)為合格。無(wú)菌檢驗(yàn)，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行，無(wú)雜菌生長(zhǎng)為合格。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明將具有高度生物學(xué)活性的楊樹(shù)皮類脂作為佐劑制備雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗，給雞注射后在機(jī)體內(nèi)能夠被很好的吸收，無(wú)殘留，對(duì)注射局部無(wú)任何不良反應(yīng)。因注射應(yīng)激小，產(chǎn)蛋高峰期注射不會(huì)影響產(chǎn)蛋率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的雞傳染性鼻炎制備疫苗時(shí)減少了楊樹(shù)皮類脂的用量，降低了疫苗生產(chǎn)成本，采用混合機(jī)制備疫苗，減化了生產(chǎn)工藝流程，提高了疫苗的物理穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了疫苗的保存期。另外由于本疫苗中含有大量的Ve等可提高產(chǎn)蛋率的營(yíng)養(yǎng)成分，注射后會(huì)不同程度地提高產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率。與傳統(tǒng)的油乳劑疫苗相比，用本發(fā)明所制備的疫苗的免疫持續(xù)期由原來(lái)的120 天左右延長(zhǎng)到180天左右，免疫持續(xù)期延長(zhǎng)了 50% ；與依照Z(yǔ)L03142556. 9的發(fā)明公開(kāi)的類脂使方法制備的疫苗相比，本發(fā)明所制備的疫苗的免疫持續(xù)期延長(zhǎng)了 80天，免疫持續(xù)期延長(zhǎng)了 80%，使用本發(fā)明所制備的雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗可以減少疫苗接種次數(shù)，拉長(zhǎng)接種時(shí)間間距，減少了接種疫苗的開(kāi)支，可大大節(jié)約養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)成本。采有超濾濃縮方法可最大程度的降低對(duì)菌體的損傷和減少菌體的損失。以礦物油為佐劑加入雞傳染性鼻炎抗原按常規(guī)方法制備油乳劑疫苗、依照 ZL03142556. 9的方法制備的雞傳染性鼻炎疫苗，與本發(fā)明制備的雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，對(duì)比項(xiàng)目及結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備，包括如下步驟一級(jí)菌種制備取A型副雞嗜血桿菌菌種劃線接種于雞肉湯瓊脂平板上，在C02體積含量為5%、溫度為37°C環(huán)境中培養(yǎng)16 18h，挑選符合菌株特性的直徑為Imm的3 5個(gè)典型菌落用IOml滅菌雞肉湯稀釋后接種到6 7日齡SPF雞胚卵黃囊內(nèi)，每胚接種0. ^iil，在 37°C條件下繼續(xù)孵化，收集30h內(nèi)死亡胚的卵黃液，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)雜菌后，作為一級(jí)菌種，置于-20°C以下保存，不得超過(guò)30天；二級(jí)菌種制備取一級(jí)菌種，按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/200的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在溫度為37°C條件下培養(yǎng)17 18h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)雜菌后，即為二級(jí)菌種，并置于2-8°C保存，不得超過(guò)6 8h ；制苗用菌液的制備將二級(jí)菌種按體積為半合成培養(yǎng)基體積1/40的量接種于半合成培養(yǎng)基中，在37-38°C溫室中靜止培養(yǎng)18 20h，期間每隔6 他搖晃一次，經(jīng)純粹檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)雜菌污染，加入體積為半合成培養(yǎng)基體積1/2000的甲醛滅活Mh，得到制苗用菌液；菌液的濃縮與滅活將純粹檢驗(yàn)合格的制苗用菌液進(jìn)行濃縮，濃縮后含菌量不少于50 億cfu/ml，再分別加入體積為濃縮菌液體積1/1000的甲醛和體積為濃縮菌液體積1/10000 的硫柳汞，混勻后在4°C條件下滅活2天，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格得到A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液；(2)C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備，其制備方法與A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液的制備方法相同；(3)疫苗的制備取上述制備的A型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液按體積比為1 1的比例混合后倒入乳化罐內(nèi)，用混合機(jī)以750 850r/min 的轉(zhuǎn)速攪拌，同時(shí)再加入楊樹(shù)皮類脂，加入楊樹(shù)皮類脂速度不能快，使楊樹(shù)皮類脂液在混合物中的最終體積百分比濃度為2. 0 3. 8%，然后將混合機(jī)的轉(zhuǎn)速提高到2500 3000r/ min繼續(xù)乳化30 60分鐘，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最終含菌量均為10億 cfu/ml ；所述雞肉湯瓊脂板是這樣制備的取雞肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化鈉0. 5g、瓊脂粉 1. 5g混合，用4mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液的PH至7. 4，116°C滅菌30分鐘，倒板前加入輔酶I (NADH)和過(guò)濾除菌的健康雞血清混勻，使得混合溶液中輔酶I(NADH)的質(zhì)量濃度為0. 05%、過(guò)濾除菌的健康雞血清的體積百分比濃度為10%，然后將混合溶液倒入直徑為 90mm的平皿中，放平冷卻即得到雞肉湯瓊脂板；所述雞肉汁是取雞胸脯肉泥1重量份加入蒸餾水4重量份，4°C浸泡過(guò)夜，煮沸30分鐘，除去肉渣，澄清過(guò)濾得到的；所述半合成培養(yǎng)基是這樣制備的取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸鈉15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化鈉15g，放入IOOOml純化水中攪均，調(diào)節(jié)所得溶液的PH至7. 2 7. 4，116°C滅菌40分鐘，臨用前加入60ml的滅活健康雞血清和IOml的濃度為0. 5%的輔酶 I (NADH)水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于， 在所述的菌液的濃縮與滅活過(guò)程中，濃縮采用高速離心方法、中空纖維過(guò)濾方法或超濾濃縮方法中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法，其特征在于，濃縮采用超濾濃縮方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞傳染性鼻炎類脂滅活疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品制備領(lǐng)域。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，制備好A型和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液，取上述制備的A型和C型副雞嗜血桿菌滅活抗原菌液按體積比為1∶1的比例混合后倒入乳化罐內(nèi)，用混合機(jī)攪拌，同時(shí)再加入楊樹(shù)皮類脂，加入楊樹(shù)皮類脂速度不能快，使楊樹(shù)皮類脂液在混合物中的最終體積百分比濃度為2.0～3.8％，繼續(xù)攪拌、乳化30～60分鐘，即得到疫苗，A型、C型菌株在疫苗中的最終含菌量均為10億cfu/ml。疫苗容易吸收、無(wú)毒副作用、免疫產(chǎn)生時(shí)間短、免疫持續(xù)期長(zhǎng)，免疫效果好，能有效預(yù)防雞傳染性鼻炎和雞毒支原體病。
文檔編號(hào)A61P27/02GK102406934SQ20101028958
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月25日
發(fā)明者姚奮卯, 孟照潔, 楊靈芝, 王娟, 王秀云, 郝圣峰 申請(qǐng)人:山東濱州博萊威生物技術(shù)有限公司