專利名稱：一種蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿及其制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用止血材料領(lǐng)域，涉及一種蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿及其制備方 法，尤其是涉及一種能快速止血、止血機制多樣、可用于術(shù)中植入性止血并可預防創(chuàng)面?zhèn)?感染、促進創(chuàng)面愈合的蠅蛆殼來源殼聚糖及其止血海綿和其制備方法。
背景技術(shù)：
出血是引起各種創(chuàng)傷死亡的主要原因?？焖僦寡歉鞣N手術(shù)及創(chuàng)傷急救的重要環(huán) 節(jié)。局部止血材料由于在對手術(shù)及突發(fā)性事故的急救治療中有著簡便、迅速等特點，是院前 及術(shù)中急救止血的首選措施。對理想局部止血材料的研發(fā)一直是國內(nèi)外關(guān)注的熱點。殼聚糖是一種自然界含量豐富的天然高分子線性多糖。早期大量研究已證明殼 聚糖無毒性、無免疫原性，且具有良好的生物降解性、抗菌活性及促進創(chuàng)傷愈合等生物學優(yōu) 勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖還具備獨特的止血活性。迄今為止，越來越多的研究開始關(guān)注 這種生物學特性良好的新型止血材料。如美國HemCon Medical Technologies公司生產(chǎn)的 HemCon止血繃帶，已于2002年9月由美國FDA批準生產(chǎn)，用于中重度大出血救治。迄今美 國FDA已批準數(shù)種殼聚糖類止血產(chǎn)品用于暫時性外用止血急救，國內(nèi)目前類似產(chǎn)品較少?，F(xiàn)有研究表明，殼聚糖的各種生物學活性，包括止血活性與其提取制備工藝及原 料來源密切相關(guān)。目前，殼聚糖的制備原料多采用天然收集的蝦蟹殼經(jīng)高濃度酸堿高溫長 時間提取制備，在原料的質(zhì)量控制以及生產(chǎn)工藝的重現(xiàn)性方面存在較大隱患。此外，由于環(huán) 境污染等造成的國內(nèi)天然殼聚糖生產(chǎn)原料不足問題日益明顯，開發(fā)新資源、降低生產(chǎn)成本 也是目前的迫切任務。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能快速止血、止血機制多樣、可用于術(shù)中植入性止血并可預防 創(chuàng)面?zhèn)诟腥?、促進創(chuàng)面愈合的殼聚糖止血海綿。本發(fā)明所提供的殼聚糖止血海綿，是以蠅蛆殼為來源提取制備的。所述蠅蛆殼的來源是廣泛的，如一種人工繁殖的食草蠅的蠅蛆殼。本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述殼聚糖止血海綿的制備方法。本發(fā)明所提供的制備方法，可包括以下步驟1)將清潔干燥后的蠅蛆殼粉碎，用鹽酸溶液除金屬離子，用氫氧化鈉溶液脫蛋白 質(zhì)，用過氧化氫溶液脫色，用氫氧化鈉溶液梯度脫乙?；?，干燥后成粉劑；2)將步驟1)獲得的殼聚糖粉劑溶解于稀乙酸溶液中，冷凍干燥，滅菌，得到蠅蛆 殼來源殼聚糖止血海綿。在上述蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿的制備方法中，所述步驟1)中鹽酸溶液的濃 度優(yōu)選為0. 5-lOmol/L，氫氧化鈉溶液的重量濃度優(yōu)選為1_20 %，過氧化氫溶液的重量濃 度優(yōu)選為1_20%，氫氧化鈉溶液重量濃度梯度優(yōu)選為30-60% ；其中，脫乙酰化次數(shù)為2-6 次，反應時間為4-18小時，溫度40-90°C。
所述步驟2)中優(yōu)選為按重量體積比濃度0. 5-20%將殼聚糖粉劑溶解于0. 5-10% 的稀乙酸溶液中。此外，步驟2)中將殼聚糖粉劑溶解于稀乙酸溶液后，可倒入模具中自流平并 預冷，再將模具冷凍干燥，使模具中物質(zhì)呈微多孔狀結(jié)構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑優(yōu)選為 0.5-20 μ m0將海綿體取出即為蠅蛆殼來源殼聚糖海綿；再經(jīng)密封包裝、滅菌得到蠅蛆殼來源 殼聚糖止血海綿成品。本發(fā)明的另一目的是提供以上所述蠅蛆殼來源殼聚糖海綿的新用途。該蠅蛆殼來 源殼聚糖海綿可以在制備創(chuàng)傷性出血的外用急救止血材料和/或術(shù)中植入性止血材料中 的應用；還可以在制備兼具止血、防創(chuàng)面?zhèn)诟腥竞痛龠M創(chuàng)面愈合的功能材料中的應用。本發(fā)明提供了一種蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿、其制備方法及應用。該蠅蛆殼來 源殼聚糖止血海綿的止血機制和特點如下1)該止血海綿呈微多孔狀結(jié)構(gòu)，孔腔隙直徑0. 5-20 μ m,利于血細胞的吸附和聚 集，是其物理機械性止血基礎(chǔ)；2)該止血海綿與抗凝全血共孵育兩分鐘即可大量吸附局部紅細胞并引起紅細胞 形態(tài)學的顯著變化，呈明顯多角狀或有偽足形成；3)該止血海綿與富含血小板血漿共孵育兩分鐘即可引起局部血小板的明顯激 活；4)該止血海綿可在不依賴紅細胞及血小板存在的前提下明顯促進局部凝血酶生 成。本發(fā)明蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿的生物學活性如下1)該止血海綿可抑制大腸桿菌及多種金黃色葡萄球菌的生長；2)該止血海綿可促進成纖維細胞及原代肝細胞的增殖；3)該止血海綿在體內(nèi)可吸收降解，具備良好的血液、細胞以及組織相容性。實驗證明，該殼聚糖止血海綿能有效激活局部血小板、吸附紅細胞并促進局部凝 血酶生成，有效粘合局部組織傷口而發(fā)揮迅速、穩(wěn)定的止血活性，同時有選擇性抗菌及促進 細胞增殖作用。本發(fā)明對控制中度創(chuàng)傷性出血及組織臟器彌漫面出血效果良好，不僅可適 用于創(chuàng)傷性出血的外用急救，尤其適用于術(shù)中植入性止血。此外，它還具有預防創(chuàng)面?zhèn)诟?染、促進創(chuàng)面愈合的功能。本發(fā)明殼聚糖止血海綿的提取原料可來源于人工繁殖食草蠅的 蠅蛆殼，來源廣泛，成本低，適合大面積推廣和應用。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為不同濃度CS浸提液對L929細胞的體外細胞毒性實驗結(jié)果圖2為1. 0%、0. 5%和0. 25%組CS、GS和OC體外原代肝細胞孵育結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別 明均為常規(guī)方法。所述百分比濃度如無特別說 明均為質(zhì)量百分比濃度。
本發(fā)明蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿的制備方法，可包括以下步驟1)將清潔干燥后的人工養(yǎng)殖蠅蛆殼粉碎(過100目篩網(wǎng))，用0. 5-lOmol/L鹽酸溶 液除金屬離子，用1-20%氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用1-20%過氧化氫溶液脫色，用30-60% 氫氧化鈉溶液梯度浸泡脫乙?；?脫乙酰化次數(shù)為2-6次，反應時間為4-18小時，制備溫 度40-90°C )，干燥后成粉劑。2)將上述殼聚糖粉劑按重量體積比濃度0. 5-20%溶解于0. 5_10%稀乙酸溶液， 倒入模具中自流平并-20°C預冷。3)將步驟2)中模具放入冷凍干燥機中冷凍干燥(_50°C，48-72h)，使模具內(nèi)物質(zhì) 呈微多孔狀結(jié)構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑0. 5-20 μ m。4)取出模具內(nèi)的海綿體，即為蠅蛆殼來源殼聚糖海綿。再經(jīng)密封包裝，滅菌，得到 蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿成品。實施例1、蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿的制備用本發(fā)明的方法制備蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿，具體方法包括以下步驟1)將清潔干燥后的人工養(yǎng)殖蠅蛆殼粉碎，用0.5mol/L鹽酸溶液除金屬離子，用 1 %氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用1 %過氧化氫溶液脫色，分別用30%、60%氫氧化鈉溶液2次 梯度脫乙?；?，單次反應時間18小時，制備溫度90°C，干燥后成粉劑。2)將上述殼聚糖粉劑按重量體積比濃度0. 5%溶解于0. 5%稀乙酸溶液中，倒入 模具中自流平并-20°C預冷。3)將模具放入冷凍干燥機中冷凍干燥(-50°C，72h)，使模具內(nèi)物質(zhì)呈微多孔狀結(jié) 構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑0. 5-20 μ m。4)取出模具內(nèi)的海綿體，即為蠅蛆殼來源殼聚糖海綿。再經(jīng)密封包裝、滅菌得到蠅 蛆殼來源殼聚糖止血海綿成品。實施例2、蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿的制備用本發(fā)明的方法制備蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿，具體方法包括以下步驟1)將清潔干燥后的人工養(yǎng)殖蠅蛆殼粉碎，用5mol/L鹽酸溶液除金屬離子，用10% 氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用10%過氧化氫溶液脫色，分別用30%、40%、50%、60%氫氧化 鈉溶液4次梯度脫乙?；瑔未畏磻獣r間10小時，制備溫度60°C，干燥后成粉劑。2)將上述殼聚糖粉劑按重量體積比濃度10%溶解于5%稀乙酸溶液中，倒入模具 中自流平并預冷。3)將模具放入冷凍干燥機中冷凍干燥(-50°C，48h)，使模具內(nèi)物質(zhì)呈微多孔狀結(jié) 構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑0. 5-20 μ m。4)將海綿體密封包裝，滅菌，得到蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿。實施例3、蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿的制備用本發(fā)明的方法制備蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿，具體方法包括以下步驟1)將清潔干燥后的人工養(yǎng)殖蠅蛆殼粉碎，用lOmol/L鹽酸溶液除金屬離子，用 20%氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用20%過氧化氫溶液脫色，分別用35%、40%、45%、50%、 55%、60%氫氧化鈉溶液6次梯度脫乙?；?，單次反應時間4小時，制備溫度40°C，干燥后成 粉劑。2)將上述殼聚糖粉劑按重量體積比濃度20%溶解于10%稀乙酸溶液，倒入模具
5中自流平并預冷。3)將模具放入冷凍干燥機中冷凍干燥(-50°C，60h)，使模具內(nèi)物質(zhì)呈微多孔狀結(jié) 構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑0. 5-20 μ m。4)將海綿體密封包裝，滅菌，得到蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿。抗菌實騎采用抑菌圈法測定待測菌株(Ecoli. 25922、SA. 10442、SA. 25923、SA. 4744)常 規(guī)復蘇培養(yǎng)，取菌液適量分別接種于各瓊脂培養(yǎng)基表面后，均勻分布打孔，孔內(nèi)分別加入質(zhì) 量體積濃度為0. 01 %或0. 03 %的殼聚糖止血海綿-生理鹽水浸提溶液(浸提條件為37 °C， 24h)，置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-24小時。陰性對照為生理鹽水及乙酸溶液，培養(yǎng)結(jié)束 后取出，測量各孔周圍抑菌圈半徑值。實驗結(jié)果如表1所示，表明本發(fā)明的蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿對大腸桿菌及多 種金黃色葡萄球菌有抑制作用。表1殼聚糖海綿CS抑制細菌生長的抑菌圈半徑值
權(quán)利要求
一種殼聚糖海綿，是以蠅蛆殼為來源提取的殼聚糖制備得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖海綿，其特征在于所述蠅蛆殼為來源于一種人工繁 殖的食草蠅的蠅蛆殼。
3.—種權(quán)利要求1或2所述殼聚糖海綿的制備方法，包括以下步驟1)將清潔干燥后的蠅蛆殼粉碎，用鹽酸溶液除金屬離子，用氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用 氫氧化鈉溶液梯度脫乙?；稍锖蟪煞蹌?；2)將步驟1)獲得的殼聚糖粉劑溶解于稀乙酸溶液中，經(jīng)冷凍干燥得到蠅蛆殼來源殼 聚糖海綿。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)用氫氧化鈉溶液脫蛋白 質(zhì)后，用過氧化氫溶液脫色。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中鹽酸溶液的濃度為 0. 5-lOmol/L，氫氧化鈉溶液的重量濃度為1_20%，過氧化氫溶液的重量濃度為1_20%，氫 氧化鈉溶液重量濃度梯度為30-60% ；其中，脫乙?；螖?shù)為2-6次，反應時間為4-18小時， 溫度 40-90°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中按重量體積比濃 度0. 5-20%將殼聚糖粉劑溶解于0. 5-10%的稀乙酸溶液中。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6任一所述的制備方法，其特征在于步驟2)中將殼聚糖粉劑溶 解于稀乙酸溶液后，倒入模具中自流平并預冷，再將模具冷凍干燥，使模具內(nèi)物質(zhì)呈微多孔 狀結(jié)構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑為0. 5-20 μ m。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于可包括以下步驟1)將清潔干燥后的人工養(yǎng)殖蠅蛆殼粉碎，分別用0.5-10mol/L鹽酸溶液除金屬離子， 用1-20%氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用1-20%過氧化氫溶液脫色，用30-60%氫氧化鈉溶液 梯度脫乙酰化；其中，脫乙酰度次數(shù)為2-6次，反應時間為4-18小時，制備溫度40-90°C，干 燥后成粉劑；2)將上述殼聚糖粉劑按重量體積比濃度0.5-20%溶解于0. 5-10%稀乙酸溶液，倒入 模具中自流平并于-20°C預冷；3)將步驟2)中模具放入冷凍干燥機中在-50°C下冷凍干燥48 72h，至其中物質(zhì)呈微 多孔狀結(jié)構(gòu)的海綿體，孔腔隙直徑0. 5-20 μ m ；4)將海綿體取出即為蠅蛆殼來源殼聚糖海綿；再經(jīng)密封包裝、滅菌得到蠅蛆殼來源殼 聚糖止血海綿成品。
9.權(quán)利要求1或2所述蠅蛆殼來源殼聚糖海綿、或權(quán)利要求3至8任一所述方法制備 得到的蠅蛆殼來源殼聚糖海綿在制備創(chuàng)傷性出血的外用急救止血材料和/或術(shù)中植入性 止血材料中的應用。
10.權(quán)利要求1或2所述蠅蛆殼來源殼聚糖海綿、或權(quán)利要求3至8任一所述方法制備 得到的蠅蛆殼來源殼聚糖海綿在制備兼具止血、防創(chuàng)面?zhèn)诟腥竞痛龠M創(chuàng)面愈合的功能材 料中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠅蛆殼來源殼聚糖止血海綿及其制備方法與應用。該殼聚糖止血海綿是將清潔干燥后的蠅蛆殼粉碎，用鹽酸溶液除金屬離子，用氫氧化鈉溶液脫蛋白質(zhì)，用過氧化氫溶液脫色，用氫氧化鈉溶液梯度脫乙?；稍锖蟪煞蹌?；再溶解于稀乙酸溶液中，冷凍干燥，滅菌得到。本發(fā)明產(chǎn)品能有效激活局部血小板、吸附紅細胞并促進局部凝血酶生成，粘合局部組織傷口而發(fā)揮迅速、穩(wěn)定的止血活性，同時有選擇性抗菌及促進細胞增殖作用，對控制中度創(chuàng)傷性出血及組織臟器彌漫面出血效果良好，不僅可適用于創(chuàng)傷性出血的外用急救，尤其適用于術(shù)中植入性止血，還具有預防創(chuàng)面?zhèn)诟腥?、促進創(chuàng)面愈合的功能。
文檔編號A61L15/42GK101974170SQ201010291789
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者吳卓娜, 孫文種, 孟志云, 朱曉霞, 王延琳, 甘慧, 竇桂芳, 顧若蘭 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所