專利名稱：一種白術(shù)多糖及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白術(shù)多糖的制備方法與其在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人體消化道內(nèi)經(jīng)常有一層微生物或微生物層存在，它們對宿主不但無害，而且 是有益和必需的，這一微生物層即稱為正常微生物群(normal microbiota)或正常菌群 (normal bacteria flora)。這些微生物群(數(shù)百億，占人體重量的1/50-1/60)在人體腸道 內(nèi)進(jìn)行活躍的生長代謝活動，有著極為重要的生理作用。與人體消化、吸收、免疫、抗腫瘤、 抗衰老、抵抗外來菌群侵襲等方面密切相關(guān)。眾多研究結(jié)果表明，年齡、人種、膳食結(jié)構(gòu)、生 活習(xí)慣、環(huán)境、疾病、抗生素治療等會影響人腸道微生態(tài)系統(tǒng)及其群落結(jié)構(gòu)。雙歧桿菌和乳 桿菌是兩種最重要的腸道益生菌，其數(shù)量和組成對維持健康腸道環(huán)境和提高免疫系統(tǒng)功能 起著關(guān)鍵作用。雙歧桿菌能維持宿主腸道的微生態(tài)平衡，提高人體對乳糖的耐受性；具有抑制腸 道病原菌生長，改善蛋白質(zhì)代謝并能合成多種維生素，促進(jìn)機(jī)體免疫機(jī)能等。雙歧桿菌在時(shí) 空、種類和數(shù)量上產(chǎn)生相應(yīng)的動態(tài)變化，隨著年齡增長而減少，從而直接影響人體的健康。 近年來，國內(nèi)外出現(xiàn)了研究開發(fā)雙歧桿菌產(chǎn)品的熱潮，目前主要的產(chǎn)品有酸乳制品、膠囊 等，但該類活菌制劑保存有效性較差及活菌攝入機(jī)體后受到胃酸影響的條件限制，使向機(jī) 體補(bǔ)充雙歧桿菌的效果降低。因而，向體內(nèi)補(bǔ)充雙歧生長因子，采用促進(jìn)雙歧桿菌增殖的物 質(zhì)來補(bǔ)充體內(nèi)有益菌群將是一條更易被接受的途徑。在雙歧生長因子中，低聚糖類研究最 多，如果糖低聚糖、大豆低聚糖、異麥芽寡糖等都具有促進(jìn)雙歧桿菌的增殖作用。經(jīng)查證，目前消費(fèi)市場上的益生元產(chǎn)品主要有英吉利益生元鐵鋅鈣葡萄糖、多美 滋嬰幼兒奶粉、貝因美牛初乳益生元奶粉、多維益生元豆?jié){粉、亨氏清兒潤、雀巢力多精等 等，這些產(chǎn)品在治療腸道菌群失調(diào)引起的腹瀉、慢性腹瀉、抗生素治療無效的腹瀉及便秘的 等方面發(fā)揮了很大的作用，同時(shí)也是某些臨床疾病的良好的輔助藥物。它們大多為添加低 聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、褐藻膠低聚糖、菊糖等各類功能性低聚糖的產(chǎn)品，以乳制品 居多。通過對國內(nèi)外專利文獻(xiàn)、期刊雜志及其它公開發(fā)表的文獻(xiàn)(如互聯(lián)網(wǎng))進(jìn)行檢索， 多糖研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等，并未有多糖類化合物作為益生 元開發(fā)利用。白 $ (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)力胃禾斗(Compositae)才直·白 * Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根莖。白術(shù)為多年生草本，栽培歷史悠久，主產(chǎn) 中國浙江省東陽、磐安一帶，是著名的道地中藥材“浙八味”之一，分布于浙江、江西、湖南、 湖北、陜西，亦多栽培。白術(shù)多糖，也僅限于在免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤、降血脂上有良好作用，沒 有對益生菌和腸道菌群作用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種白術(shù)多糖的制備方法與其在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的白術(shù)多糖的制備方法，包括下述步驟1)將白術(shù)用水浸泡，然后煎煮，收集濾液，濃縮得到白術(shù)浸提液；2)在步驟1)獲得的白術(shù)浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，調(diào)節(jié)乙醇最終體積百分 濃度為70% -75% (如71. 25% )，置于4°C靜置24小時(shí)，離心收集沉淀，將沉淀用水溶解， 然后在水中透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)和鹽；濃縮透析液，真空冷凍干燥，得到白術(shù) 粗多糖；3)將步驟2)獲得的白術(shù)粗多糖用水溶解，添加2倍體積的Saveg液，混合搖勻， 離心收集上清液，重復(fù)此步驟，直到上清液經(jīng)紫外測定在260、280nm波長處無蛋白質(zhì)和核 酸的吸收峰，此上清液為脫蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，濃縮透析 液，真空冷凍干燥，得到不含蛋白質(zhì)的白術(shù)多糖；所述Saveg液為氯仿和正丁醇按體積比為 41混合后的混合液；所述方法中還包括將步驟3)獲得的不含蛋白質(zhì)的白術(shù)多糖用水溶解，進(jìn)行 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化，用50mM Tris-HCl收集含多糖的洗脫液； 將洗脫液置于水中透析去除Tris-HCl組分濃縮后冷凍干燥，得到白術(shù)多糖。為了加快溶解的速度，所述溶解用水的溫度為40_80°C，如60°C。所述步驟2)和步驟3)中，所述透析的截留分子量為5000Da以下，優(yōu)選為3500Da。所述步驟2)和步驟3)中，所述透析的時(shí)間為24-72小時(shí)，優(yōu)選為48小時(shí)。所述步驟1)中，所述浸泡的時(shí)間為12-36小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)；所述浸泡用蒸餾 水為10ml/g白術(shù)；所述煎煮為將浸泡后的白術(shù)用其浸泡液直接煎煮30分鐘，過濾收集濾 液，將濾渣在用于浸泡液相同體積的水煎煮30分鐘，收集濾液，合并兩次收集獲得的濾液。所述方法中，所用的水均為蒸餾水或去離子水。比如，上述步驟1)中的浸泡白術(shù) 用水、步驟2)中溶解沉淀用水、步驟3)中的溶解白術(shù)粗多糖用水均可以為蒸餾水，上述方 法中的透析用水，DEAE-Si^pharose Fast Flow陰離子柱層析純化前溶解白術(shù)多糖用水可以 為去離子水。上述方法制備的白術(shù)多糖即本發(fā)明所要保護(hù)的白術(shù)多糖。本發(fā)明還提供白術(shù)多糖在促進(jìn)腸道有益菌的增殖或者調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡中的 應(yīng)用。所述腸道有益菌為嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌或植物乳桿菌。 所述腸道有益菌優(yōu)選為嬰兒雙歧桿菌CICC6069、青春雙歧桿菌CICC6070、兩歧雙歧桿菌 1. 1852、動物雙歧桿菌1. 2268或植物乳桿菌1. 124。白術(shù)多糖可在體外促進(jìn)腸道有益菌的 增殖，并在一定程度上可以調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。本發(fā)明的白術(shù)多糖的提取方法，經(jīng)醇沉淀、Saveg法除蛋白、透析、陰離子柱層析， 提取的白術(shù)多糖純度極高，純度達(dá)色譜純，分子量為5527Da，主要由阿拉伯糖，半乳糖，葡萄 糖和甘露糖組成。我們采用的方法提取的白術(shù)多糖的鑒定方法和儀器均屬于最新的科研成果，檢測 靈敏準(zhǔn)確，可信度高。多糖分子量測定主要采用高效液相色譜及凝膠滲透色譜，本方法利用 激光檢測器，靈敏度高，且不需標(biāo)曲。單糖組成大都采用液相色譜或氣相色譜，采用的檢測
4器為脈沖安培檢測，不需樣品柱前或柱后衍生，分辨率高，獲得的結(jié)果更可靠。本發(fā)明首次通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了白術(shù)多糖對腸道有益菌的增殖具有促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)證 明，該白術(shù)多糖可在體外促進(jìn)嬰兒、青春、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌等益生菌的增殖?？?以作為一種益生元生產(chǎn)利用，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用，可以作為新型功能性益生元 開發(fā)。我們將白術(shù)多糖對微生態(tài)方面進(jìn)行研究，彌補(bǔ)了這一方面的空白，并有希望添加至產(chǎn) 品中，開發(fā)新型功能性益生元產(chǎn)品。


圖1為本發(fā)明方法制得白術(shù)粗多糖的樣品照片。圖2為本發(fā)明方法制得白術(shù)精多糖的樣品照片。圖3為實(shí)施例1制得白術(shù)精多糖的S印harose CL-6B凝膠層析洗脫曲線圖4為實(shí)施例1制得白術(shù)精多糖的紫外掃描5不同添加量白術(shù)精多糖對雙歧桿菌生長的影響圖6不同添加量白術(shù)多糖(AMP)對乳桿菌生長的影響圖7白術(shù)多糖(AMP)的FT-IR譜8中A為單糖標(biāo)品(1. 0 μ g/mL)HPAEC-PAD色譜圖；B為實(shí)施例1制得白術(shù)精多 糖的HPAEC-PAD色譜圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、白術(shù)多糖的提取方法1、白術(shù)多糖的提取方法取20g白術(shù)(購自北京同仁堂百旺山藥店)，加入200mL蒸餾水浸泡24h，然后其 浸泡液直接煎煮30min后過濾，濾渣加同量蒸餾水(200mL)再煎煮30min，合并濾液蒸發(fā)濃 縮至IOOmL,得到白術(shù)浸提液。2)白術(shù)多糖的提取純化水提醇沉法制備白術(shù)粗多糖將白術(shù)浸提液濃縮后加入3倍體積乙醇溶液(體積 百分濃度為95%，乙醇的終體積百分比濃度為71. 25% )，置于4°C冰箱醇沉24h，SOOOrpm 離心IOmin收集沉淀，沉淀用熱蒸餾水(40-80°C，普通室溫水即可，溫度稍高的水可以加快 溶解速度)復(fù)溶后，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美國聯(lián)合碳化)中，將透析袋置 于去離子水中透析48h，除去乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)、鹽等。濃縮透析液，真空冷凍干燥，得 白術(shù)粗多糖，粗糖提取率為10% (制得粗糖質(zhì)量/白術(shù)干重)，樣品見圖1。Saveg法除蛋白將上述透析2)后獲得的白術(shù)粗多糖用熱蒸餾水(40-80°C，常溫 即可，溫度稍高的水可以加快溶解速度)復(fù)溶后得到白術(shù)粗多糖溶液，將Saveg液(氯仿 正丁醇(體積比)=4:1)與糖液以2 1(體積比)比例混合搖勻脫蛋白，SOOOrpm離心 IOmin收集上清液，重復(fù)4次，至紫外測定在260、280nm波長處無蛋白質(zhì)和核酸的吸收峰得 到脫蛋白后的糖液。將脫蛋白后的糖液置于透析袋(0SO-T8340，MD34(3500)，美國聯(lián)合碳 化)中，將透析袋置于去離子水中透析48h，除去氯仿和正丁醇，濃縮，冷凍干燥得到不含蛋 白質(zhì)的白術(shù)多糖。
DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化將除蛋白后的白術(shù)多糖用去離子 水配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后，用DEAE-S印harose Fast Flow陰離子柱 (玻璃離子交換柱2. 6 X 20em，填裝DEAE-S印harose Fast Flow，購自Pharmacia)純化，以 7mL上樣后，用50mM Tris-HCl溶液洗脫，流速4. OmL/min, 2min/管，收集40管，部分收集器 收集洗脫液。以苯酚-硫酸比色法(徐斌，董英，林琳，等.改良苯酚-硫酸法測定苦瓜多 糖含量[J].食品科學(xué)，2005，26 (7) =79-82.)跟蹤檢測每管多糖含量。結(jié)果表明白術(shù)多糖 在洗脫液體積為120mL時(shí)洗脫完全。收集含多糖的峰的流出液，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美國聯(lián)合碳化) 在去離子水中透析24h，去除Tris-HCl組分，濃縮后冷凍干燥，得到白術(shù)多糖純品并命名為 AMP (Atractylodes macrocephala polysaccharides)。該白術(shù)多糖純品照片如圖 2 所示。2、多糖純度鑒定1)常壓凝膠色譜層析(玻璃凝膠過濾柱1. 6 X 80cm,填裝S印harose CL-6B，購自 Pharmacia)將步驟1獲得的AMP凍干樣品用去離子水溶解，配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m 微孔濾膜過濾后上樣(IOmL)，0.05mol/L NaCl洗脫，流速30mL/h，12min/管，自動部分收集 器收集洗脫液。苯酚_硫酸比色法跟蹤檢測每管多糖含量，繪制曲線圖。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明白術(shù)多糖已達(dá)色譜純。2)紫外(UV)檢測將步驟1獲得的純品AMP用去離子水溶解制備成0. 5mg/mL樣 品待測液，以去離子水為空白對照，在波長220-580nm范圍內(nèi)利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫 外全波長掃描，以確定AMP中是否含有核酸和蛋白質(zhì)。結(jié)果表明步驟1獲得的純品AMP在260-280nm處無吸收，無蛋白質(zhì)和核酸，如圖4。3、白術(shù)多糖對腸道菌群體外促生長試驗(yàn)1)不同濃度白術(shù)多糖對雙歧桿菌體外生長的影響將活化好的5株雙歧桿菌(青 春雙歧桿菌CICC6070、嬰兒雙歧桿菌CICC6069、長雙歧桿菌CICC6068購于中國工業(yè)微生物 菌種保藏管理中心；兩歧雙歧桿菌1. 1852、動物雙歧桿菌1. 2268購自中國普通微生物菌種 保藏管理中心(CGMCC)，；分別以接種量(106CFU/mL)接種于步驟1制備的AMP添加的 終質(zhì)量百分濃度為0%、0. 1%,0. 5%U.0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培養(yǎng)基中，各濃度 重復(fù)三組，37°C培養(yǎng)24h后，于600nm波長下測定各培養(yǎng)液的OD值。結(jié)果表明白術(shù)多糖可在體外促進(jìn)嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌的 增殖，有良好的促生長作用，具體結(jié)果見圖5。2)不同濃度白術(shù)多糖對乳桿菌的體外生長影響將活化好的2株乳桿菌(嗜酸乳 桿菌1. 2686、植物乳桿菌1. 124購自CGMCC)分別以接種量(約106CFU/mL)接種于AMP 添加終質(zhì)量百分濃度為0%、0. 1%,0. 5%U. 0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培養(yǎng)基中，各 濃度重復(fù)三組，37°C培養(yǎng)24h后，測定600nm波長下測定各培養(yǎng)液的OD值。結(jié)果表明白術(shù)多糖可以促進(jìn)植物乳桿菌的增殖，見圖6。3)白術(shù)多糖對其余主要腸道菌群體外生長的影響將活化好的5大類腸道菌群代 表菌株(青春雙歧桿菌CICC6070、植物乳桿菌CGMCC1. 124、大腸桿菌ATCC83965、糞腸球菌 CGMCC1. 131、丁酸梭菌CGMCC1. 336)分別以接種量(約106CFU/mL)接種于AMP (步驟1 制備的白術(shù)多糖)添加終質(zhì)量百分濃度為0. 的各自適宜培養(yǎng)基及對照組(不加白術(shù)多 糖)中，各組重復(fù)3組，37°C培養(yǎng)24h后，測定600nm波長下測定各培養(yǎng)液的OD值。
結(jié)果(見表1)表明，白術(shù)多糖可以促進(jìn)青春雙歧桿菌、植物乳桿菌的生長，對其余 3類(大腸桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌)的促進(jìn)效果不明顯，或有抑制作用，有調(diào)節(jié)腸道菌群 平衡的作用。表1 白術(shù)多糖對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用
權(quán)利要求
一種白術(shù)多糖的制備方法，包括下述步驟1)將白術(shù)用水浸泡，然后煎煮，收集濾液，濃縮得到白術(shù)浸提液；2)在步驟1)獲得的白術(shù)浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，至乙醇終體積百分比濃度為70％ 75％，置于4℃靜置24小時(shí)，離心收集沉淀，將沉淀用水溶解，然后在水中透析去除乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)和鹽；濃縮透析液，真空冷凍干燥，得到白術(shù)粗多糖；3)將步驟2)獲得的白術(shù)粗多糖用水溶解，然后添加2倍體積的Saveg液，混合搖勻，離心收集上清液，重復(fù)此步驟，直到上清液經(jīng)紫外測定在260和280nm波長處無蛋白質(zhì)和核酸的吸收峰，此上清液為脫蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，濃縮透析液，真空冷凍干燥，得到不含蛋白質(zhì)的白術(shù)多糖；所述Saveg液為氯仿和正丁醇按體積比為4∶1混合后的混合液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將步驟3)獲得的不 含蛋白質(zhì)的白術(shù)多糖用水溶解，進(jìn)行DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化，用 50mM Tris-HCl洗脫，收集含多糖的洗脫液；將含多糖的洗脫液置于去離子水中透析去除 Tris-HCl組分濃縮后冷凍干燥，得到白術(shù)多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)和步驟3)中，所述透析 的截留分子量為5000Da以下，優(yōu)選為3500Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟2)和步驟3)中， 所述透析的時(shí)間為24-72小時(shí)，優(yōu)選為48小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述浸泡 的時(shí)間為12-36小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)；所述浸泡用水的用量為10ml/g白術(shù)；所述煎煮為將 浸泡后的白術(shù)用其浸泡液直接煎煮30分鐘，過濾收集濾液，將濾渣在用于浸泡液相同體積 的水煎煮30分鐘，收集濾液，合并兩次收集獲得的濾液。
6.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法中，所用的水均為蒸餾 水或去離子水。
7.權(quán)利要求1-6中任意所述的方法制備的白術(shù)多糖。
8.權(quán)利要求7所述的白術(shù)多糖在促進(jìn)腸道有益菌的增殖和/或調(diào)節(jié)腸道菌群平衡中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述腸道有益菌為嬰兒雙歧桿菌、青春雙 歧桿菌、動物雙歧桿菌或植物乳桿菌；所述腸道有益菌優(yōu)選為嬰兒雙歧桿菌CICC6069、青 春雙歧桿菌CICC6070、兩歧雙歧桿菌CGMCC1. 1852或植物乳桿菌CGMCC1. 124。
10.權(quán)利要求7所述的白術(shù)多糖在制備促進(jìn)腸道有益菌的增殖和/或調(diào)節(jié)腸道菌群平 衡產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白術(shù)多糖的制備方法與應(yīng)用。該白術(shù)多糖的制備方法，包括下述步驟1)將白術(shù)用水浸泡，然后煎煮，收集濾液，濃縮得到白術(shù)浸提液；2)加入乙醇，置于4℃靜置，離心收集沉淀，將沉淀溶解，然后在透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)和鹽；干燥，得到白術(shù)粗多糖；3)將白術(shù)粗多糖溶解，然后添加2倍體積的Saveg液，混合搖勻，離心收集上清液；然后在水中透析除去除去氯仿和正丁醇，干燥，得到不含蛋白質(zhì)的白術(shù)多糖。實(shí)驗(yàn)證明，該白術(shù)多糖可在體外促進(jìn)嬰兒、青春、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌等益生菌的增殖?？梢宰鳛橐环N益生元生產(chǎn)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用，可以作為新型功能性益生元開發(fā)。
文檔編號A61P1/00GK101955549SQ201010294879
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者劉麗莎, 尚楠, 李平蘭, 王洋, 王銳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)