專利名稱：獸用狂犬病病毒與疫苗及二者的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獸用狂犬病病毒與疫苗及二者的生產(chǎn)方法，屬于生物制品技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)感染引起的一種病癥嚴重、病死率極 高的自然疫源性人獸共患傳染病，死亡率幾乎100%，目前尚無有效的治療措施。野生動物 是RV的主要儲存宿主，人一旦被攜帶狂犬病毒的此類動物咬傷，就會感染發(fā)病，其病死率 為100%。根據(jù)衛(wèi)生部最新公布的傳染病疫情統(tǒng)計數(shù)據(jù)，顯示近年來狂犬病繼續(xù)呈現(xiàn)兇險的 跡象。但是狂犬病沒有特殊有效的治療手段，注射狂犬病抗原是唯一有效手段。目前市場上的狂犬病疫苗基本都是采用轉(zhuǎn)瓶工藝傳代細胞培養(yǎng)的，大規(guī)模生產(chǎn)需 要大量的物力人力資源，成本較高，并且批間差異大，質(zhì)量不穩(wěn)定。高效的疫苗生產(chǎn)需要大量的以高產(chǎn)量從宿主系統(tǒng)中生產(chǎn)出病毒。病毒株生長的培 養(yǎng)條件對于獲得該株系的可接受的高產(chǎn)量來說具有重大意義。因此，為了最大化所想要的 病毒的產(chǎn)量，系統(tǒng)和培養(yǎng)條件都必須特定地適合于提供對于產(chǎn)生所想要的病毒來說有利的 環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是提供一種狂犬病病毒及疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如 下步驟1)微載體生物反應(yīng)器中，微載體密度為40 80g/L，加入2. OX 107 5. 0X 107cellS/g微載體的傳代細胞及細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細 胞充分結(jié)合后，啟動細胞培養(yǎng)程序，培養(yǎng)傳代細胞；2)上述傳代細胞培養(yǎng)至4. 0X109cells/L 8X10lclcells/L時換用細胞維持液， 按照感染復數(shù)為M. 0. I. = 0. 001 1接種狂犬病病毒，啟動病毒吸附程序，使病毒與微載 體上的細胞吸附完全后，換用病毒培養(yǎng)程序，擴增狂犬病病毒；3)采用半量換液連續(xù)收毒工藝，病毒培養(yǎng)2 5天后，第一次收獲病毒液，收獲比 例為總培養(yǎng)體積的50%，繼續(xù)培養(yǎng)9 11天后，每24h收獲換液一次，收獲比例為總培養(yǎng)體 積的50%，收獲狂犬病病毒；4)收獲的病毒液，凍融，滅活純化制得狂犬病毒抗原；5)加入佐劑混合后制得狂犬病滅活疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明所述生物反應(yīng)器為微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述生物反應(yīng)器為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器。優(yōu)選地，本發(fā)明所述微載體為網(wǎng)狀、球形或片狀。優(yōu)選地，本發(fā)明所述微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述微載體為網(wǎng)狀的聚酯纖維。
3
優(yōu)選地，本發(fā)明所述細胞生長液為含5% 10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述細胞維持液為含 5%牛血清的DMEM培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明所述微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)條件為溫度36°C 37°C， C02濃度為2. 5 % 5 %，培養(yǎng)液pH值為7. 0 7. 4。優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟3)中所述狂犬病病毒液的體積為2. 5L 1000L。優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟3)中所述的收獲的次數(shù)為10 12次。本發(fā)明的另一方面為使用本發(fā)明方法制備的狂犬病病毒。本發(fā)明的另一方面為提供一種獸用狂犬病抗原的生產(chǎn)方法，即由本發(fā)明方法制備 狂犬病病毒后，收獲病毒液，凍融，滅活純化制得狂犬病毒抗原。本發(fā)明的又一方面為使用上述方法制備的狂犬病病毒抗原。本發(fā)明的另一方面為提供一種獸用狂犬病疫苗的生產(chǎn)方法，即由本發(fā)明方法制備 狂犬病病毒后，收獲病毒液，凍融，滅活純化制得狂犬病毒抗原，加入佐劑即可制得獸用狂 犬病滅活疫苗。本發(fā)明的又一方面為使用本發(fā)明方法制備的狂犬病滅活疫苗。技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的狂犬病病毒的生產(chǎn)方法，具有以下有益效果1.采用本發(fā)明方法，解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模生產(chǎn)時單批產(chǎn)量不高、批間差異大、產(chǎn) 品質(zhì)量不穩(wěn)定、勞動強度大、生產(chǎn)成本高等問題。本發(fā)明之方法生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高。 目前國內(nèi)采用攪拌式懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)動物細胞，單臺生物反應(yīng)器最大規(guī)模不超過100L ； 而本發(fā)明采用新的技術(shù)參數(shù)，運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)動物細胞，單臺生物反 應(yīng)器規(guī)模達500L，最大可達1000L，單臺規(guī)模提高5 10倍。本發(fā)明之方法為連續(xù)式封閉式 生產(chǎn)、半連續(xù)式收獲病毒本發(fā)明的方法可以全封閉生產(chǎn)，自動換液，半連續(xù)收獲方式收集 病毒液，減少了污染的機率，產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定，批間差異小。本發(fā)明方法制備的細胞接種 量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。 本發(fā)明方法解決了傳統(tǒng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異大、批間差異大的問 題。本發(fā)明方法，可直接線性放大用于生產(chǎn)。2.本發(fā)明方法中采用的載體為網(wǎng)狀的聚酯纖維，具有親水性和生物無害性，lg微 載體可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內(nèi)極大的增大了細胞的貼壁面積，增加了細 胞生長的密度，細胞數(shù)可達到1.0X109cellS/g微載體以上，其效能為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)的 數(shù)十倍，可以節(jié)省許多成本及人力。3.本發(fā)明方法制備的細胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度 的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。本發(fā)明提供一種新的工藝技術(shù)，能夠極大的滿足病 毒大量繁殖所需要的條件，并且能夠制備高滴度的抗原，極大的滿足疫苗制備所需，顯著提 高了疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。4.工藝參數(shù)控制精確本發(fā)明運用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)時可控參數(shù) 有溫度、PH值、溶氧量、二氧化碳濃度、載體濃度，可實現(xiàn)在線監(jiān)測的參數(shù)有葡萄糖、乳酸和 銨離子濃度，批次質(zhì)量穩(wěn)定，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異 大。本發(fā)明方法利用生物反應(yīng)器，解決抗原濃度低、生產(chǎn)成本高、勞動強度大的問題，而且能 連續(xù)培養(yǎng)、占地小、生產(chǎn)規(guī)模大、無攪拌式懸浮培養(yǎng)時對細胞形成的剪切力、無氣泡產(chǎn)生、對細胞傷害小。


圖1為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中使用了潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，其他類型的微載體懸 浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，如攪拌式、旋轉(zhuǎn)式或灌注式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，均可以使用 本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病病毒或疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明使用潮汐式微載體懸浮培養(yǎng) 生物反應(yīng)器，可以提高培養(yǎng)時的培養(yǎng)基和溶解氧的供應(yīng)，無氣泡并且剪切力小，對細胞傷害本發(fā)明實施例中采用的生物反應(yīng)器為潮汐式生物反應(yīng)器。結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所 示。其中，各個標記分別為恒溫攪拌系統(tǒng)1，培養(yǎng)基恒溫備料槽體2，自動饋料系統(tǒng)3，恒溫 培養(yǎng)箱4，載體瓶5，微載體6，DO檢測器及pH控制器7，收集器8。較優(yōu)地，本發(fā)明實施例中 采用了依據(jù)潮汐原理而設(shè)計的微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，培養(yǎng)系統(tǒng)分為兩部份；一個是 載體瓶5，另一個是培養(yǎng)基恒溫備料槽2。細胞固定在載體瓶，培養(yǎng)基流動于載體瓶與培養(yǎng) 基恒溫備料槽之間，造成間歇性的暴露與淹沒載體。本發(fā)明試驗了反應(yīng)器的載體瓶5體積 為0. 5L、2. 5L、5L、10L、20L、50L、100L，均能對溫度、pH值、溶解氧、二氧化碳濃度自動控制。 本發(fā)明的實施例中載體瓶5體積為20L，培養(yǎng)基恒溫備料槽2體積為500L。本發(fā)明實施例的微載體為網(wǎng)狀纖維——聚酯纖維，本領(lǐng)域其他類型的微載體—— 球形、網(wǎng)狀或片狀的聚酯、明膠或多糖微載體，也可以起到固定細胞的作用，也能用于本發(fā) 明之方法大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病病毒或疫苗。本發(fā)明實施例中，傳代細胞使用了倉鼠腎細胞(BHK21)，其他本領(lǐng)域常用的傳代細 胞如Vero細胞、Hamster Kidney細胞，CEF細胞，也可用于本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病
病毒及疫苗。本發(fā)明實施例中，病毒株為Flury-LEP毒株(菌種號CVCCAV2012)，其他本領(lǐng)域常 用的病毒如Flury-HEP毒株(菌種號CVCCAV2013) .ERA毒株(菌種號CVCC AV61)、巴黎株 狂犬固定毒(菌種號CVCC AV2011)和CTN-1毒株(購于中國藥品生物制品鑒定所)、和aG 毒株等也可用于本發(fā)明之方法大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病病毒及疫苗。本發(fā)明所述方法中，在細胞吸附微載體階段與細胞培養(yǎng)階段，啟動了細胞吸附程 序與細胞培養(yǎng)程序，本發(fā)明實施例中優(yōu)化了反應(yīng)器的控制參數(shù)，但本發(fā)明方法不僅限于實 施例中的參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)啟示，根據(jù)不同的生物反應(yīng)器， 調(diào)整相應(yīng)的參數(shù)，達到微載體與細胞充分結(jié)合后，大量擴增細胞的目的。本發(fā)明所述方法中，在病毒吸附細胞階段與病毒培養(yǎng)階段，啟動了病毒吸附程序 與病毒培養(yǎng)程序，本發(fā)明實施例中優(yōu)化了反應(yīng)器的控制參數(shù)，但本發(fā)明方法不僅限于實施 例中的參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)啟示，根據(jù)不同的生物反應(yīng)器，調(diào) 整相應(yīng)的參數(shù)，達到病毒與細胞及微載體充分結(jié)合后，大量擴增病毒的目的。本發(fā)明試驗了微載體密度為40 80g/L，加入2. 0X 107 5. 0X 107cells/g微 載體的傳代細胞，更優(yōu)地，本發(fā)明實施例中使用的微載體密度為60g/L，加入2. 0X107 5.0X107cells/g微載體的傳代細胞，當傳代細胞的密度達到4. OX 109cells/L 8X1010cells/L時，即密度達到初始密度的5 20倍時，換用細胞維持液，起始病毒吸附與
培養(yǎng)程序為佳。本發(fā)明試驗了按照感染復數(shù)為M. 0. I. = 0. 001 1接種狂犬病病毒，收獲的狂犬 病病毒毒價最高，優(yōu)選地，本發(fā)明實施例中使用了 M. 0. I. = 0. 01接種病毒，啟動病毒吸附 程序與病毒培養(yǎng)程序，擴增狂犬病病毒。本發(fā)明收獲培養(yǎng)液，制備狂犬病病毒液，采用了從培養(yǎng)基恒溫備料槽2通過微電 腦控制直接收取培養(yǎng)液，反復凍融后冷凍保存?zhèn)溆谩?yōu)選地，本發(fā)明實施例中采用-20°C冷 凍、常溫融解反復兩次的方法，使病毒充分從細胞中釋放出來，從而獲得高含量病毒液。本發(fā)明生物反應(yīng)器單批次收獲的狂犬病病毒液的體積為2. 5L 1000L，本發(fā)明實 施例試驗了單批次收獲的狂犬病病毒液的體積為500L，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本發(fā)明之 方法對單批次收獲的病毒液體積進行線性放大，可以放大至1000L。本發(fā)明所述收獲病毒液為采用半量換液連續(xù)收毒工藝，優(yōu)選地，本發(fā)明所述的收 獲的次數(shù)為10 12次，更優(yōu)選地，本發(fā)明實施例中試驗了每隔24h收獲，連續(xù)收獲12次的 病毒與收獲病毒制備的疫苗，經(jīng)檢驗全部達到《中華人民共和國獸藥典》之要求。本發(fā)明實施例中疫苗的制備方法為，將多次收獲檢驗合格的病毒液混合后經(jīng)過濾 凈化系統(tǒng)除去細胞碎片等雜質(zhì)后經(jīng)滅活劑滅活后，加入佐劑混合制得狂犬病滅活疫苗。本 領(lǐng)域其他常用的狂犬病疫苗制備所用毒株，如Flury HEP、ERA、巴黎株狂犬固定毒、CTN-1毒 株和aG毒株等，多次收獲的病毒液混合后經(jīng)滅活也可用于制備本發(fā)明所述疫苗。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1狂犬病疫苗的生產(chǎn)方法1.病毒與細胞株用于制備狂犬病疫苗的病毒株為LEP-Flury毒株，經(jīng)過致病性測試，該毒株病毒 不具有致病性。以對該病毒株具有良好敏感性的細胞系倉鼠腎細胞(BHK21)，作為制苗用細 胞系，藉以感染并大量繁殖狂犬病毒。2.制備方法(1)將制備疫苗用細胞系倉鼠腎細胞(BHK21)接種到加有DMEM液體培養(yǎng)基(包括 5%牛血清、2. 2g/L NaHC03、50IU/ml 硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、100IU/ml 青霉素 G鈉鹽(Penicillin G Sodium)、pH值為7. 2)與聚酯纖維微載體的載體罐內(nèi)；微載體密度 為60g/L，細胞初始接種量為2. 7X107cellS/g微載體。(2)于37°C、5% C02培養(yǎng)環(huán)境下，細胞貼附4h，使上述制備疫苗用細胞與微載體混 合均勻，并使細胞貼附在微載體上。貼附程序參數(shù)為載體瓶中培養(yǎng)液上升速率為2400ml/ min，培養(yǎng)液在載體瓶頂部停留時間為lmin ；載體瓶中培養(yǎng)液下降速率為2400ml/min，培 養(yǎng)液在載體瓶底部停留時間為30s、設(shè)定最大換液量18500ml ；4h后切換為細胞培養(yǎng)程序， 細胞培養(yǎng)程序參數(shù)為載體瓶中培養(yǎng)液上升速率為1800ml/min，培養(yǎng)液在載體瓶頂部停留 時間為lmin ；載體瓶中培養(yǎng)液下降速率為ISOOml/min，培養(yǎng)液在載體瓶底部停留時間為 lmin、設(shè)定最大換液量18，500ml。
(3)于37°C、5% C02培養(yǎng)環(huán)境下，使細胞在上述微載體上生長，培養(yǎng)5日后，細胞 密度為3. 24X101(lcellS/L微載體，換用添加2%牛血清的DMEM細胞維持培養(yǎng)液，按病毒感 染復數(shù)(M. 0. I.)為0.01的比例接種狂犬病毒LEP-Flury毒株，并使之感染細胞，使病毒增 殖，病毒吸附程序為載體瓶中培養(yǎng)液上升速率為1500ml/min，培養(yǎng)液在載體瓶頂部停留 時間為lmin ；載體瓶中培養(yǎng)液下降速率為15000ml/min，培養(yǎng)液在載體瓶底部停留時間為 lmin、設(shè)定最大換液量18，500ml。(4)于37°C、5% C02培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)5日后，第一次收獲，采用半連續(xù) 工藝，換液比例為50% ；連續(xù)培養(yǎng)11天，每24h收獲一次，每次換液比例為50% ；(5)將半量換液連續(xù)收毒工藝收獲的病毒液與生物反應(yīng)器的病毒液于-20°C，常 溫凍融兩次后混合，并進行以下檢驗(a)純凈性檢驗按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄相關(guān)規(guī)定進行檢驗，結(jié)果 無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(b)病毒含量測定按照常規(guī)小鼠腦內(nèi)接種法進行。即將收獲的狂犬病毒液用滅 菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，每個病毒液取10_3 10_6各4個稀釋度，每個稀釋度通過 腦內(nèi)接種注射4只11 13g的昆明系小鼠，0. 03ml/只，連續(xù)觀察14天，記錄14天后小鼠 死亡情況，并根據(jù)Reed-Muench法計算病毒含量，每1. 0ml含病毒為107 8LD5(1 ；(c)特異性將毒種用滅菌生理鹽水稀釋成為每1ml含有100個小鼠的最小感染 量的病毒懸液，與等量的抗狂犬病毒特異性血清充分混合，置15°C中和lh，其間振搖3次。 同時設(shè)立陽性對照組(病毒對照)和陰性對照組(生理鹽水)。中和結(jié)束后分別接種小鼠 2只，每只腦內(nèi)注射0. 03ml。除陽性對照組全部死亡外，其余兩組在接種后2周內(nèi)精神狀態(tài) 良好，無不良反應(yīng)。(6)經(jīng)檢驗合格的狂犬病毒原液經(jīng)0. 5 ii m濾芯過濾，除去細胞碎片。過濾后加入 1 40000-丙內(nèi)酯，置4°C滅活24h時間，然后置于37°C水浴中水解2h即為狂犬病毒抗 原。滅活后取樣腦內(nèi)接種體重為11 13g小白鼠20只，每只0. 03ml，觀察14d，應(yīng)全部健 存(3d死亡不計)。(7)取滅活檢驗合格的抗原與等體積含量為20%的滅菌氫氧化鋁膠鹽水稀釋液 均勻混合，在室溫下沉淀24小時，吸出2/5上清液，即按全量濃縮至3/5，加入終含量為 1/1. 5萬 1/3萬硫柳汞溶液，充分混合，即為制成的狂犬病毒滅活疫苗。(8)成品檢驗，按照以上方法制備的狂犬病毒滅活疫苗應(yīng)符合以下標準(a)物理性狀本疫苗為粉紅色均勻混懸液，靜置后上層為紅色澄清液體，下層為 淡灰色沉淀，經(jīng)振搖即恢復原狀。(b)純凈性檢驗按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄相關(guān)規(guī)定進行檢驗，結(jié)果 無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(c)小白鼠安全試驗取11 13g小白鼠8只，各腦內(nèi)接種0. 03ml疫苗，另取同 樣重量的8只各腹腔注射0. 5ml，觀察14d無疫苗本身所致的不良反應(yīng)。(d)犬安全試驗取3只易感犬，各肌肉注射10個使用劑量的疫苗，逐日觀察至21 日，無疫苗本身所致的不良反應(yīng)。(e)效力檢驗用NIH法按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行測定，成品效力 為2. 8IU/劑，高于現(xiàn)行標準2. 5IU/劑。
對比例懸浮培養(yǎng)工藝與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)比較。通過對潮汐式細胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)與常用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)在相同細胞貼壁面 積時相關(guān)生產(chǎn)性能指標進行對比，結(jié)果如表1所示。表1不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖狂犬病毒的相關(guān)比較
培養(yǎng)方式潮汐式微栽體懸浮培養(yǎng) 系統(tǒng)3000ml轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)細胞貼壁面 積2880000cm22880000cm2產(chǎn)量比值1個微載體培養(yǎng)系統(tǒng)2304個轉(zhuǎn)瓶占地面積20 m2150m2人工投入2個人x4 h30個人x8 h風險暴露點<20個2304 個耗材成本低高清洗成本低高收獲抗原3250 L2304x300ml=691.2L抗原效價1075LD50/ml1065LD50/ml操作工藝全自動微電腦控制程序繁瑣備注聚酯纖維載體貼壁面積lg = 2400cm2,1個潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)加入 載體1200g。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
8
權(quán)利要求
一種獸用狂犬病病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟1)微載體生物反應(yīng)器中，微載體密度為40～80g/L，加入2.0×107～5.0×107cells/g微載體的傳代細胞及細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細胞充分結(jié)合后，啟動細胞培養(yǎng)程序，培養(yǎng)傳代細胞；2)上述傳代細胞培養(yǎng)至4.0×109cells/L～8×1010cells/L時換用細胞維持液，按照感染復數(shù)為M.O.I.＝0.001～1接種狂犬病病毒，啟動病毒吸附程序，使病毒與微載體上的細胞吸附完全后，換用病毒培養(yǎng)程序，擴增狂犬病病毒；3)采用半量換液連續(xù)收毒工藝，病毒培養(yǎng)2～5天后，第一次收獲病毒液，收獲比例為總培養(yǎng)體積的50％，繼續(xù)培養(yǎng)9～11天后，每24h收獲換液一次，收獲比例為總培養(yǎng)體積的50％，收獲狂犬病病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器為微載體懸浮培養(yǎng)生物 反應(yīng)器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器為潮汐式微載體懸浮培 養(yǎng)生物反應(yīng)器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體為網(wǎng)狀、球形或片狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述細胞生長液為含5% 10%牛血清的培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述細胞維持液為含 5% 牛血清的培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器的培養(yǎng) 條件為溫度36°C 37°C，C02濃度為2. 5% 5%，培養(yǎng)液pH值為7. 0 7. 4。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述狂犬病病毒液的體積為 2. 5L 1000L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的收獲的次數(shù)為10 12次。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 10任意一項方法制備的狂犬病病毒。
12.—種獸用狂犬病抗原的生產(chǎn)方法，其特征在于，由權(quán)利要求1 9任意一項方法制 備狂犬病病毒后，收獲病毒液，凍融，滅活純化制得狂犬病毒抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制備的狂犬病抗原。
14.一種獸用狂犬病疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于，由權(quán)利要求1 10任意一項方法制 備狂犬病病毒后，收獲病毒液，凍融，滅活純化制得狂犬病毒抗原，加入佐劑即可制得獸用 狂犬病滅活疫苗。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法制備的狂犬病滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大規(guī)模生產(chǎn)動物用狂犬病病毒及疫苗的方法，利用生物反應(yīng)器，以細胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)狂犬病病毒及疫苗將制備疫苗用細胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的載體罐中，使細胞貼附在微載體上；在適當培養(yǎng)環(huán)境下，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～20倍；將狂犬病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；換用細胞維持培養(yǎng)液，在適當培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)病毒；連續(xù)培養(yǎng)3～5日后，第一次收獲病毒液，采用半連續(xù)工藝，換液比例為50％；繼續(xù)培養(yǎng)9～11日，每24h收獲換液一次；將收獲的病毒液與生物反應(yīng)器的病毒液混合，于-20℃常溫反復凍融兩次，滅活純化后加入佐劑制備狂犬病疫苗。該方法生產(chǎn)規(guī)模大、單批次產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對較低。
文檔編號A61K39/205GK101979515SQ20101029495
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司