專利名稱：細(xì)菌遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性劑的體內(nèi)遞送。具體而言，本發(fā)明涉及使用用于將生物活性 劑直接體內(nèi)遞送到解剖位點(diǎn)的細(xì)菌遞送系統(tǒng)來治療，減輕或預(yù)防疾病。在一個實(shí)施方案中， 細(xì)菌遞送系統(tǒng)包括螺桿菌屬(Helicobacter)或顯示將異源核酸遞送到表達(dá)所述異源核酸 的動物或動物細(xì)胞中的螺桿菌特征的細(xì)菌。在另一個實(shí)施方案中，對所述螺桿菌進(jìn)行改造 以包含編碼異源核酸的DNA載體，其中在感染后，所述核酸載體表達(dá)從而將生物活性劑遞 送到動物體，尤其是在黏膜上。
背景技術(shù)：
存在向患有先天的和獲得性疾病的個體長期遞送藥劑和免疫試劑的持續(xù)的需要。 在大多數(shù)情形中，這包括每天數(shù)次，每日一次或以一定間隔重復(fù)施用治療性化合物。然而， 要理解的是，任何長期治療或預(yù)防性方案具有這樣的問題諸如順應(yīng)性，副作用和藥物抗性。 因此存在鑒定治療的持續(xù)需要，所述治療通常是100%有效的，無副作用并且是廉價的。近年來研究的用于各種治療和預(yù)防性藥劑的一種遞送形式是微生物的使用。出于 指導(dǎo)(directing)這些微生物表達(dá)外源蛋白質(zhì)或賦予某些理想的性質(zhì)的目的，已經(jīng)將來自 包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲以及哺乳動物的各種生物的目標(biāo)基因克隆到多種細(xì)菌，病毒和分枝 桿菌中。已經(jīng)將這些微生物用在接種疫苗的程序，基因替代治療和治療性組合物遞送中。使用微生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化動物(宿主)細(xì)胞?？梢允褂冒豢蓮?fù)制的病毒的基因遞 送載體(見，例如美國專利號5，824，544)，裸DNA,(見例如美國專利號6，261，834)，包含重 組表達(dá)盒的脂質(zhì)體(見例如美國專利號6，271，207)來完成宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。其它的基于 分子的治療性組合物遞送方法包括使用被設(shè)計(jì)來表達(dá)異源表面蛋白質(zhì)的不可復(fù)制的重組 病毒(見，例如美國專利號6，376，236)。最近，藥物研究者還已經(jīng)嘗試使用基于重組生物的載體，無生命的載體和裸 DNA，開發(fā)用于體內(nèi)治療性組合物表達(dá)的方法?；谥亟M生物的載體實(shí)例包括重組細(xì)菌 (見例如美國專利號5，547，664)和病毒諸如甲病毒屬(alphavirus)(見例如美國專利 號6，391，632)，牛痘病毒(vaccinia viruses)(見例如美國專利號6，267，965)，腺病毒 (adenovirus)(見例如美國專利號5，698，202)和腺病毒相關(guān)病毒(AAV)(見例如美國專利 號6，171，597)。無生命載體包括脂質(zhì)基因遞送載體構(gòu)建體諸如DNA/陽離子脂質(zhì)體復(fù)合 物，包封在中性或陰離子脂質(zhì)體中的DNA和脂質(zhì)體-包埋的，聚陽離子濃縮的DNA(LPDI和 LPDII)(見，Ropert，1999，Braz J Med Biol Res, 32 (2) 163-9) 已經(jīng)由各種細(xì)菌遞送的其它基因的實(shí)例包括將志賀氏菌(shigella)的侵入基 因克隆到正常情況下非侵入的大腸桿菌(E.coli)中，使大腸桿菌具有侵入性并因此更 適合于用作疫苗菌株，或?qū)lasmodium falciparum的瘧疾基因克隆到鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)中，其隨后表達(dá)這些瘧疾蛋白質(zhì)并且在口服施用所述細(xì)菌后，在小鼠中針對瘧疾激發(fā)誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫性和保護(hù)(見，例如Hone等， 1991，Vaccine,9 :810_816 ；Tacket 等，1992，Infect. Immun. ,60 :536_541 ；Hone 等，1992， J. Clin. Invest. ,90 412-420 ；Chatfield 等，1992，Vaccine, 10 :8_11 ；Tacket 等，1992， Vaccine, 10 443-446 ；禾口 Mims 等，1993，In =Medical Microbiology,Eds. ，Mosby-YearBook Europe Ltd. , London ；Sadoff 等，1988, Science, 240 :336_338 ；Aggrawal 等，1990, J. Exp. Med.，172 1083-1090)。已經(jīng)將減毒的或毒性更少的志賀氏菌(見，例如Noriega等，1994，Infect. Immun. ,62 :5168_5172 ；美國專利申請?zhí)?20020176848)，沙門氏菌(Salmonella)(見例如 美國專利號6，531，313 ；美國專利申請?zhí)?0030170211)，利斯特氏菌(Listeria)(見例 如，Schafer 等，1992，J. Immunol.，149 :53_59 ；美國專利申請?zhí)?20030008839)，和其它的 細(xì)菌口服給藥以針對隨后用這些細(xì)菌的更具毒性的形式進(jìn)行的感染產(chǎn)生免疫性。同樣，減 毒的細(xì)菌和分枝桿菌生物諸如 Bacille Calmette-Guerin(BCG) (Lagranderie 等，1993， Vaccine, 11 :1283_1290 ；Flynn, 1994, Cell. Molec. Biol.，40(Suppl. 1) :31_36)已經(jīng)進(jìn)行 腸胃外給藥以針對相關(guān)生物諸如M. tuberculosis給出保護(hù)。已經(jīng)被用作載體的一些其它細(xì)菌種類包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)(van Damme 等，1992， Gastroenterol. ，103 :520_531)禾口 霍舌L 弧 菌(Vibrio cholerae) (Levine 等，1994, In :Vibrio cholerae, Molecular toGlobal Perspective' s, Wachsmuth 等，Eds, ASM Press, Washington, D. C. , 395-414 頁)。盡管所有的研究，所有的上述細(xì)菌遞送系統(tǒng)具有技術(shù)難度，需要在這些可以體內(nèi) 應(yīng)用前克服這些困難。實(shí)際上，大多數(shù)細(xì)菌系統(tǒng)需要細(xì)菌本身產(chǎn)生功能性分子并且取決于 充分減毒從而對于在人中使用是安全但是仍然能夠產(chǎn)生生物活性劑的細(xì)菌。然而以前使用 的所有的減毒細(xì)菌菌株不能夠在不導(dǎo)致副作用的前提下，在體內(nèi)存活過長的時期。更重要 的是，許多這些細(xì)菌物種不能將治療性或預(yù)防性藥劑遞送到動物的黏膜上皮細(xì)胞。然而，許 多最重要的治療性藥劑通過黏膜進(jìn)行吸收；因此，存在對于能夠直接將生物活性劑遞送到 黏膜的細(xì)菌遞送系統(tǒng)的需要。授權(quán)給Powell等的美國專利號5，877，159，描述了可以在不建立產(chǎn)毒性感染或?qū)?致疾病的情況下侵入黏膜細(xì)胞的活細(xì)菌由此引入能夠由動物細(xì)胞表達(dá)的編碼抗原的真核 表達(dá)盒。盡管該方法容許將DNA疫苗遞送到黏膜表面，包括易于給藥，涉及在發(fā)展中國家中 的疫苗遞送，其不具有提供可擴(kuò)增的編碼目標(biāo)基因的mRNA的優(yōu)勢。此外，在Powell等中公 開的細(xì)菌不能持續(xù)遞送。在過去，將非致病性的，非建群性的(non-colonising)，非侵入性的食品等級 的細(xì)菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)用于將藥劑遞送到黏膜(見例如英國專利 GB-2278358B)。然而，盡管乳酸乳球菌是非侵入性的，其不能建立能直接將治療性藥劑持續(xù) 遞送到黏膜上皮細(xì)胞的慢性感染。因此，存在對于這樣的遞送系統(tǒng)的持續(xù)需要，其能夠在緊鄰動物的黏膜上皮細(xì)胞 處建立非侵入性的慢性感染，從而可以將生物活性劑遞送到其中。而且，存在對于足以激發(fā) 有效和有益免疫應(yīng)答的在黏膜表面上的藥理學(xué)活性分子的改進(jìn)遞送機(jī)制的持續(xù)需要。這將 提供用于藥物活性劑的有效的體內(nèi)遞送系統(tǒng)，以及用于免疫的有效方法，即足以激發(fā)一般 體液和黏膜免疫應(yīng)答的在黏膜表面上的抗原暴露。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及克服上述難題并且以許多實(shí)施和應(yīng)用進(jìn)行例示，其中一些在下面進(jìn)行 歸納。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)能夠形成慢性感染的螺桿菌，特別是幽門螺桿菌 (helicobacter pylori)，可以用于產(chǎn)生持續(xù)的藥物遞送。而且，可以在不同的時間激活或 滅活本發(fā)明的螺桿菌，并且因?yàn)槠溟L期性，可以將螺桿菌用于通過胃黏膜遞送藥物。幽門螺桿菌是一種幾乎僅在人的胃黏膜中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性的螺旋形狀的細(xì)菌。 人胃中的酸性是對于幾乎所有細(xì)菌建群的有效屏障，但是對于螺桿菌屬物種是個例外。幽門螺桿菌具有在人的胃黏膜中建群(colonize)并持續(xù)數(shù)十年的獨(dú)特能力，盡 管會形成黏膜炎癥和免疫應(yīng)答。這種特征使得幽門螺桿菌成為用于通過黏膜遞送選定的藥 劑的令人感興趣的候選物。按照一些方面，提供組合物，方法和系統(tǒng)用于制備和使用包含螺桿菌序列的基于 螺桿菌的構(gòu)建體，所述螺桿菌的序列具有啟動子區(qū)域和編碼非螺桿菌的藥理學(xué)活性分子的 非螺桿菌序列。將在一些實(shí)施方案中的這種構(gòu)建體描述為載體或質(zhì)粒載體，其中所述啟動 子序列能夠控制非螺桿菌的目標(biāo)藥理學(xué)活性分子的表達(dá)。因此，在第一個方面中，本發(fā)明提供將一種或多種生物活性劑遞送給受試者的方 法，所述方法包括給受試者施用有效量的，優(yōu)選地治療或預(yù)防有效量的螺桿菌細(xì)胞或具有 螺桿菌特征的細(xì)菌細(xì)胞的步驟，所述細(xì)胞表達(dá)所述一種或多種生物活性劑。在第二個方面，本發(fā)明提供表達(dá)一種或多種異源生物活性劑的非侵入性或非致病 性的螺桿菌細(xì)胞。優(yōu)選地，所述螺桿菌是幽門螺桿菌物種。生物活性劑可以與螺桿菌屬同源或與該屬細(xì)胞或用于遞送的螺桿菌細(xì)胞物種異 源。異源藥劑可以來自真核或原核來源。在一些方面，基于螺桿菌的載體和載體質(zhì)粒構(gòu)建體包括生物活性劑諸如抗原，有 機(jī)或無機(jī)分子或物質(zhì)，藥劑例如治療性藥劑或預(yù)防性藥劑，諸如基因產(chǎn)物或基因序列(分 離的核酸)。作為實(shí)例，這些藥劑可以包括免疫調(diào)節(jié)劑，激素，配體，酶或反義RNA，催化RNA， 蛋白質(zhì)，肽或可以存在于細(xì)菌細(xì)胞上或由其釋放從而可以將其遞送給動物或動物細(xì)胞的任 何其它分子。在一些實(shí)施方案中，生物活性劑由核酸分子編碼，所述核酸分子優(yōu)選地以分離形 式獲得并隨后將其插入本發(fā)明的細(xì)菌遞送載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，本發(fā)明的 分離的核酸分子可以是cDNA，基因組DNA，RNA,或其雜交分子。優(yōu)選地，所述核酸是cDNA。作為實(shí)例，目標(biāo)蛋白質(zhì)和/或肽可以包括生長素釋放肽(ghrelin)，支鏈淀粉，胰 島素，促胃動素(motilin)，β-葡糖苷酶，化學(xué)蛋白伴侶(chemicalchaperone)，或用在戈 謝病(Gauchers disease)、細(xì)胞萎縮(cell wasting)、人免疫缺陷疾病(AIDS)的治療中的 其它分子，食欲抑制劑，在糖尿病治療中有用的制劑等。優(yōu)選地將分離的核酸結(jié)合到表達(dá)載體中，可以將所述載體轉(zhuǎn)化到螺桿菌屬細(xì)胞中 并在其中維持。因此，在第三個方面，本發(fā)明提供直接將生物活性劑遞送到需要其的解剖位點(diǎn)的 重組載體。本發(fā)明的螺桿菌屬細(xì)胞優(yōu)選地適應(yīng)于在其表面上分泌和/或表達(dá)所述生物活性劑。在第四個方面，本發(fā)明提供用于體內(nèi)遞送有效量的生物活性劑的載體或構(gòu)建體， 其包括a)編碼生物活性劑的核苷酸序列；b)可操縱地與其連接的控制或調(diào)節(jié)序列，所述控制或調(diào)節(jié)序列能夠控制(a)的核 苷酸序列的表達(dá)從而當(dāng)將包含所述載體的遞送載體遞送到受試者時，使生物活性劑在體內(nèi)產(chǎn)生。所述載體可以通過化學(xué)或酶促處理的方式進(jìn)行化學(xué)修飾，或通過重組DNA技術(shù)的 方式進(jìn)行體內(nèi)修飾從而產(chǎn)生修飾的或變體載體。按照本發(fā)明，這樣的構(gòu)建體可以不同于公開的那些，例如通過一種或多種核苷酸 置換，缺失或插入的方式產(chǎn)生但基本上(substantially)保留了構(gòu)建體或核酸分子，或其 編碼產(chǎn)物的所需要的生物活性的那些。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，提供具有報告基因的螺桿菌屬載體或構(gòu)建體，所 述報告基因通過被克隆到表達(dá)載體中的組成型啟動子進(jìn)行表達(dá)并被用作篩選工具。適合于 用于本文的報告基因的非限制性實(shí)例包括綠色熒光蛋白(GFP)，半乳糖苷酶，淀粉酶和 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用螺桿菌屬細(xì)胞來將目標(biāo)異源基因遞送給需要 其的受試者。所述目標(biāo)基因可以編碼治療產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物)，包括但不限于肽激素(諸 如但不限于 α -促黑激素(α -melanocyte-stimulatinghormone) ( α -MSH)，胰島素，生長 激素和甲狀旁腺激素)，細(xì)胞因子，包括，但不限于干擾素，白介素(IL)_2，IL-4，IL-10, IL-12，粒細(xì)胞集落形成刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成刺激因子(GM-CSF) 和促紅細(xì)胞生成素(EPO)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療、減輕或預(yù)防受試者中疾病的方法。通 過使用治療性或預(yù)防性組合物來促進(jìn)這些方法。因此，在第五個方面，本發(fā)明提供一種藥物 組合物，其包括(a)表達(dá)和/或分泌生物活性劑的活的非致病性螺桿菌細(xì)胞以及(b)治療 有效的載體。在第六個方面，本發(fā)明提供治療，預(yù)防或減輕疾病的方法，其包括向需要其的受試 者施用有效量的表達(dá)所述生物活性劑的本發(fā)明的螺桿菌細(xì)胞。其中可以應(yīng)用本發(fā)明的受試者的非限制性的實(shí)例包括哺乳動物諸如靈長類的動 物，馬，牛，豬，綿羊和嚙齒動物。還意欲包括魚和鳥。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，進(jìn)行治療、預(yù)防或減輕的疾病是癌癥，免疫/造血系 統(tǒng)的疾病或病癥，生殖系統(tǒng)的疾病或病癥，肌與骨骼系統(tǒng)的疾病或病癥，心血管系統(tǒng)的疾病 或病癥，被描述為混合胎(mixed fetal)的疾病或病癥，排泄系統(tǒng)的疾病或病癥，神經(jīng)/感 覺系統(tǒng)的疾病或病癥，內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病或病癥，呼吸系統(tǒng)的疾病或病癥，消化系統(tǒng)的疾病 或病癥和與結(jié)締/上皮組織相關(guān)的疾病或病癥或由細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染導(dǎo)致的疾病或 病癥。本發(fā)明提供多種藥用制劑，其被配制從而諸如通過胃腸道，口服或鼻內(nèi)遞送給患 者。在具體的實(shí)施方案中，所述組合物適合于在黏膜表面進(jìn)行遞送。在具體的實(shí)施方案中， 所述組合物適合于遞送到消化道(gut)的黏膜表面。
作為實(shí)例，黏膜可以是胃、陰道、鼻、口腔或眼睛表面的黏膜或可以是身體任何其 它部分的黏膜，所述身體的任何其它部分的特征在于存在可滲透的黏膜表面或內(nèi)層。在一 些實(shí)施方案中，所述黏膜表面是胃黏膜表面。考慮到具體的螺桿菌屬的菌，螺桿菌構(gòu)建體和本文所述的其它遞送載體的具體 類型和比率，以及配方領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的那些配制技術(shù)，諸如在被具體結(jié)合在本文中 作為參考的 Remington’ s Pharmaceutical Sciences，20th edition，Mack Publishing Company中所述的那些，容易地配制各種遞送形式的組合物以用在本發(fā)明的實(shí)踐中。預(yù)期所述遞送系統(tǒng)可以用在動物，特別是靈長類的動物中，包括人、馬、牛、綿羊和 嚙齒動物、魚和鳥。還預(yù)期所述制劑可以用在嬰兒和成人上，以及通過親本，腸胃外使用，或 用于施用于懷孕或哺乳期動物。還可以將所述制劑和方法描述為適合于雄性和雌性動物。在另一個方面，提供給動物接種疫苗的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括施 用包含疫苗的組合物，所述疫苗包含用基于螺桿菌_的質(zhì)粒載體和/或本文所述的質(zhì)粒載 體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，所述方法提供足以消除或抑制動物中的疾病或生理 狀況，或足以激發(fā)特異于藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的免疫應(yīng)答的有效量的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子 的遞送。作為實(shí)例，用在所述疫苗中的非螺桿菌藥理學(xué)活性目標(biāo)分子可以包括哺乳動物的 蛋白質(zhì)，肽，酶，激素或這些的任意的組合。在具體的實(shí)施方案中，還將藥理學(xué)活性目標(biāo)分子 定義為人藥理學(xué)活性目標(biāo)分子。在一些實(shí)施方案中，藥理學(xué)活性目標(biāo)分子是人病原體分子/ 抗原，人蛋白質(zhì)抗原諸如支鏈淀粉或其類似物或衍生物，或生長素釋放肽，或其類似物或衍 生物。在具體的實(shí)施方案中，疫苗傳遞針對人病原體，歐鮑拉病毒(Ebolavirus)，HIV病 毒，馬堡病毒(Marburg virus)，流感病毒(influenza virus)等的免疫性。Jones等(2005， Nat. Med. 11 :786_90)描述了基于減毒的重組皰疹性口腔炎病毒(vesicular stomatitis virus)載體的可復(fù)制的疫苗，其包括歐鮑拉病毒糖蛋白和馬堡病毒糖蛋白。因此，預(yù)期還可 以按照本發(fā)明以及本文提供的公開內(nèi)容提供使用基于螺桿菌的載體系統(tǒng)和具有這些以及 其它與人病原體相關(guān)的糖蛋白的質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建體。本發(fā)明涉及1.組合物，其包括具有螺桿菌屬序列和編碼非螺桿菌的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的非 螺桿菌序列的螺桿菌屬分子構(gòu)建體。2.按照項(xiàng)1的組合物，其中所述螺桿菌屬的細(xì)菌是幽門螺桿菌。3.按照項(xiàng)1或項(xiàng)2的組合物，其中所述藥理學(xué)活性目標(biāo)分子對于所述幽門螺桿菌 菌種是異源的。4.按照項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的組合物，其還包括啟動子序列。5.按照項(xiàng)1-4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述藥理學(xué)活性目標(biāo)分子是生長素釋放 肽，支鏈淀粉或其類似物。6.按照項(xiàng)2-5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述幽門螺桿菌是減毒的幽門螺桿菌。7.按照項(xiàng)2-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述藥理學(xué)活性目標(biāo)分子包括蛋白質(zhì)，肽 或核酸分子。8. 一種疫苗，其包括按照項(xiàng)4的組合物和可藥用的載體溶液。
9. 一種載體質(zhì)粒，其包括按照項(xiàng)4的組合物。10. 一種包括疫苗的組合物，其中所述疫苗包括螺桿菌屬載體質(zhì)粒，其包括(a)螺桿菌屬核苷酸序列，所述螺桿菌屬核苷酸序列包括啟動子序列，所述啟動子 序列能夠控制編碼非螺桿菌的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的序列的表達(dá)；和(b)編碼非螺桿菌的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的序列。11.按照項(xiàng)10的組合物，其還包括佐劑。12.按照項(xiàng)10或項(xiàng)11的組合物，還將其描述為適合于遞送到粘膜。13.按照項(xiàng)10到12中任一項(xiàng)的組合物，其中所述非螺桿菌藥理學(xué)活性目標(biāo)分子是 蛋白質(zhì)，肽或核酸分子。14.按照項(xiàng)10到12中任一項(xiàng)的組合物，其中所述非螺桿菌藥理學(xué)活性目標(biāo)分子是 生長素釋放肽，支鏈淀粉或拮抗劑或其類似物。15. 一種制備包括非螺桿菌免疫原的免疫原性組合物的方法，其包括(a)提供包含可用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的幽門螺桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)物；(b)在適合的條件下，將包含啟動子序列和編碼非螺桿菌免疫原的序列的質(zhì)粒載 體引入所述培養(yǎng)物中以提供轉(zhuǎn)化的幽門螺桿菌細(xì)胞，和(c)選擇表達(dá)所述非螺桿菌免疫原的轉(zhuǎn)化細(xì)胞來提供免疫原性的組合物，其中所述啟動子序列能夠控制編碼所述非螺桿菌免疫原的序列的表達(dá)。16.按照項(xiàng)15的方法，其中所述啟動子序列包含可誘導(dǎo)的啟動子。17.按照項(xiàng)15或項(xiàng)16的方法，其還包括非抗生素抗性的基因標(biāo)記。18.按照項(xiàng)15的方法，其中所述啟動子在幽門螺桿菌中組成型地表達(dá)。19.按照項(xiàng)15的方法，所述啟動子是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動子。20.按照項(xiàng)15-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述幽門螺桿菌是菌株26695。21.按照項(xiàng)15-20中任一項(xiàng)的方法，其中還將所述質(zhì)粒載體限定為包括操縱子構(gòu) 建體。22. 一種治療動物的方法，其包括下列步驟(a)提供按照項(xiàng)10-14中任一項(xiàng)的組合物；和(b)向所述動物施用有效量的所述組合物。23.按照項(xiàng)22的方法，其中所述動物是人。24.按照項(xiàng)22的方法，其中所述被治療的動物具有增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。25.按照項(xiàng)22到24中任一項(xiàng)的方法，其中將所述組合物施用在所述動物的黏膜表26.按照項(xiàng)22到25中任一項(xiàng)的方法，其中將一種或多種有效量的所述組合物施用 于所述動物。27. 一種包括重組細(xì)胞的組合物，所述重組細(xì)胞包括編碼非幽門螺桿菌的藥理學(xué) 活性目標(biāo)分子的序列，所述序列包括(a)至少一種編碼藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的非螺桿菌序列；和(b)具有能夠控制所述非螺桿菌序列表達(dá)的啟動子序列的螺桿菌屬序列，其中所 述重組細(xì)胞能夠在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)所述核酸或?qū)е滤龊怂岱肿拥谋磉_(dá)。28.按照項(xiàng)27的組合物，其中編碼重組細(xì)胞的核苷酸序列還包括分泌的信號多肽。29.按照項(xiàng)27的組合物，其中所述重組細(xì)胞是重組幽門螺桿菌。30.按照項(xiàng)29的組合物，其中所述重組幽門螺桿菌是PTM103-8。31. 一種包括重組幽門螺桿菌的組合物，所述重組幽門螺桿菌包括(a)編碼包括非螺桿菌的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子和螺桿菌屬序列的融合蛋白的序 列；和(b)可誘導(dǎo)的幽門螺桿菌啟動子序列。32. 一種質(zhì)粒載體，其包括按照項(xiàng)31的組合物。33. 一種藥物組合物，其包括作為活性成分的項(xiàng)32的質(zhì)粒載體，以及可藥用的稀 釋劑，載體，佐劑或其組合。34. 一種制備重組幽門螺桿菌的方法，其包括(a)提供幽門螺桿菌的培養(yǎng)物；和(b)將按照項(xiàng)32的質(zhì)粒載體提供到所述培養(yǎng)物中以提供重組幽門螺桿菌，其中所述重組幽門螺桿菌能夠在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)所述非螺桿菌藥理學(xué)活性分子 或?qū)е略摲肿拥谋磉_(dá)。35.按照項(xiàng)31的組合物，其中所述重組螺桿菌還包括編碼免疫調(diào)節(jié)多肽的第二核 酸分子，其中所述重組螺桿菌能夠在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)所述第二核酸分子。附圖簡述

圖1是質(zhì)粒構(gòu)建體pHPAl (2. 8kb)的示意圖。圖2是質(zhì)粒構(gòu)建體pHP3 (3. 4kb)的示意圖。圖3是質(zhì)粒載體PTMI03. 8的示意圖。圖4顯示柳氮磺胺吡啶(SSN)的結(jié)構(gòu)。圖5是顯示使用與染料(Azure-A)綴合的離子交換樹脂(AmberliteXE-96)的示 意圖。序列簡述在本發(fā)明的整個描述中提及下列核酸和氨基酸序列SEQ ID NO 質(zhì)粒pHPl的核苷酸序列(2796核苷酸)；SEQ ID NO :2_ρΗΡ1的核苷酸序列(2796核苷酸)；SEQ ID NO :3_質(zhì)粒ρΗΡ3的核苷酸序列(3444核苷酸)；SEQ ID NO :4_丙型肝炎病毒是抗原(HCV)核苷酸序列；SEQ ID NO :5_來自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的免疫原性編碼序列的核苷酸 序列135bp(45個氨基酸)；SEQ ID NO :6_幽門螺桿菌的HopE基因的外露表面環(huán)的核苷酸序列(在核苷酸 504，氨基酸位點(diǎn)168)SEQ ID NO -J-上游引物(29核苷酸)；SEQ ID NO :8_下游引物(28核苷酸)；SEQ ID NO :9_寡核苷酸引物(15核苷酸)。術(shù)語的定義在提出本發(fā)明之前，提出將在下文使用的某些術(shù)語的定義可以有助于對其的理
本文定義的“抗生素抗性基因”包括特意提供給載體并被用作選擇系統(tǒng)的異源核 酸序列。術(shù)語“抗生素抗性基因”不包括將抗生素抗性賦予天然存在的微生物區(qū)系生物的 其它機(jī)制或基因。將本文所用的例如用于描述細(xì)菌菌株，特別是大腸桿菌或螺桿菌屬菌株諸如幽門 螺桿菌的術(shù)語“減毒的”定義為與天然的，野生型細(xì)菌菌株相比較少毒力和/或毒性(侵入 性)的菌株。本文所用的術(shù)語“生物活性”指進(jìn)行生物功能的能力，并且關(guān)于多肽指多肽采取與 其天然構(gòu)象相同或非常類似的穩(wěn)定構(gòu)象(折疊形式)。當(dāng)正確或基本正確折疊，例如形成正 確折疊的單位α "螺旋，β _折疊，結(jié)構(gòu)域，二硫鍵等時，多肽應(yīng)該具有進(jìn)行其天然功能的能 力。多肽中的功能單位一般是結(jié)構(gòu)域。在激發(fā)或不激發(fā)免疫應(yīng)答的情況下，由抗體或其它受體結(jié)合的僅有的能力是被動 的或不構(gòu)成“生物活性”。任何抗原都具有被抗體結(jié)合的能力但是不一定具有生物活性。本文所用的“臨床級別的載體”指能夠在螺桿菌或進(jìn)行改造而具有螺桿菌特征的 非致病性細(xì)菌中表達(dá)的質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)載體。本發(fā)明的臨床級別的載體不使用用于選擇 的抗生素抗性標(biāo)記物和/或已經(jīng)進(jìn)行了修飾從而防止在宿主外進(jìn)行復(fù)制，例如諸如自殺載 體。Panthel等2003已經(jīng)描述了在幽門螺桿菌中的自殺系統(tǒng)的實(shí)例(Infection & Immunity, 71 =109-116) 0這種系統(tǒng)將包含PhiX174裂解基因E的質(zhì)粒引入幽門螺桿菌中。 為了消除所述菌株，使用了在42°C溫育5小時。在體內(nèi)，這意味著動物將飲用45-50°C的飲 料從而將胃(gastric)環(huán)境的溫度升高到超過42°C。第二個實(shí)例是L-Dap選擇系統(tǒng)，其常用于使細(xì)菌突變體在補(bǔ)加平板上存活(見例 如 Kirata 等 1997 (Infection & Immunity，65 :4158_4164)。在該系統(tǒng)中，為了使 DapE 缺 陷型幽門螺桿菌突變體存活，動物受試者必須用失去的底物即二氨基庚二酸(DAP)補(bǔ)充它 們的飲食。為了消除它們，接著停止DAP的消耗。第三種可能的系統(tǒng)涉及幽門螺桿菌的甲硝唑敏感性，因?yàn)槠渚哂衦dxA基因。rdxA 基因的過度復(fù)制對于哺乳動物細(xì)胞和大腸桿菌是有害的。然而，細(xì)菌可以耐受這種復(fù)制。因 此，可以改造本發(fā)明的螺桿菌物種以包含兩個拷貝的rdxA，其阻止正常的突變-依賴型的 rdxA失去。將至少兩個功能性rdxA基因引入螺桿菌基因組應(yīng)導(dǎo)致對甲硝唑永久敏感的螺 桿菌菌株。Jeong等2000 (J. Bacteriol.，182 =5082-5090)顯示通過功能性rdxA基因產(chǎn)生 的硝基還原酶將甲硝唑從前藥轉(zhuǎn)化為殺菌化合物?；钚曰衔锏淖饔梅绞綄?dǎo)致螺桿菌基因 組的DNA斷裂。用于本文時，“可檢測的免疫應(yīng)答”是在動物中響應(yīng)于可以通過使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室 方法進(jìn)行測量的抗原形成的抗體(體液)或細(xì)胞毒性(細(xì)胞的)反應(yīng)，所述方法包括，但不 限于酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)，酶聯(lián)免疫SPOT (ELISPOT)，免疫 熒光測定法(IFA)，補(bǔ)體激活測定法(CF) ,Western Blot印跡法(WB)或其等價物。用于本文時，“目標(biāo)基因”指編碼需要其表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的任何核酸序列。目 標(biāo)基因可以包括或可以不包括啟動子或其它調(diào)節(jié)成分。目標(biāo)基因還包括能夠產(chǎn)生反義RNA 的構(gòu)建體。
用于本文時，將“基因治療”定義為使用重組載體將目標(biāo)基因遞送給需要其的動 物。目標(biāo)基因可以是編碼治療性或預(yù)防性的蛋白質(zhì)或多肽，包括，但不限于細(xì)胞因子，抗炎 藥(anti-inflammatories)，抗增殖藥，抗生素，代謝抑制劑/激活劑和免疫活性抗原及其 片段的轉(zhuǎn)基因。此外，用于本文時，“基因治療”還包括定向在遺傳和非遺傳疾病上的基因替 代技術(shù)。術(shù)語螺桿菌(Helicobacter)包括螺桿菌屬的所有細(xì)菌，包括幽門螺桿菌和鼬鼠 螺桿菌OLmustelae)。所述術(shù)語還包括與幽門螺桿菌具有類似生物學(xué)的細(xì)菌，所述生物 學(xué)在于它們能夠建群在靈長類動物的胃黏膜上和/或能夠建立慢性，但是分離的黏膜感 染。所述術(shù)語還包括已經(jīng)進(jìn)行了修飾從而使所述細(xì)菌具有幽門螺桿菌的特征諸如建群 (reside)在胃黏膜上的能力的細(xì)菌。“異源”多肽是對于螺桿菌而言非天然的多肽，即所述生物活性劑的編碼核酸天然 地或在引入螺桿菌之前不由螺桿菌所表達(dá)，或者是其祖先。用于本文時，“宿主”定義本發(fā)明的治療性組合物的傾向受體。宿主包括所有的動 物。具體而言，宿主包括，但不限于，靈長類動物(包括人)，牛，馬，犬，貓，豬，綿羊，兔，嚙齒 動物，鳥和魚。用于本文時，“免疫惰性的(inert) ”意味著任何物質(zhì)，包括微生物諸如在其宿主中 不激發(fā)顯著免疫應(yīng)答的微生物區(qū)系。用于本文時，免疫惰性物質(zhì)的實(shí)例包括不銹鋼，生物相 容性聚合物諸如聚-L-丙交酯，醫(yī)療級別的塑料和本發(fā)明的微生物區(qū)系生物?！帮@著的免疫” 應(yīng)答是將限制或局限按照本發(fā)明的教導(dǎo)使用的物質(zhì)或生物的體內(nèi)效用的任何免疫應(yīng)答?？?檢測的免疫應(yīng)答不一定是“顯著的免疫應(yīng)答”?！胺蛛x的核酸”是這樣的核酸，其結(jié)構(gòu)與任何天然存在的核酸的結(jié)構(gòu)或與跨越超過 三個單獨(dú)的基因的天然存在的基因組核酸的任何片段的結(jié)構(gòu)不相同。因此所述術(shù)語包括， 例如(a)DNA分子，其具有天然存在的基因組DNA分子的部分的序列，但是在其兩側(cè)沒有側(cè) 接這樣的編碼序列，所述編碼序列側(cè)接其中其天然存在的生物的基因組中所述分子的部 分；(b)以這樣的方式結(jié)合到載體或原核生物或真核生物的基因組DNA中的核酸從而使得 到的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA都不相同；(c)分離的分子諸如cDNA，基因組 片段，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段，或限制片段；和(d)作為雜交基因，即編碼融 合蛋白的基因的部分的重組核苷酸序列。特別由此定義中排除出去的是存在于(i)DNA分 子，(ii)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(iii)細(xì)胞克隆的混合物中的核酸，例如存在于諸如cDNA或基因 組DNA文庫中的核酸。利用Karlin和 Altschul，1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 =2264-2268,1990 的 算法來測定兩條氨基酸序列或兩條核酸的“百分比同一性(同源性)”，所述算法Karlin和 Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)中得以改進(jìn)。將這種算法整合 Λ Altschul 等(J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990)的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。用 NBLAST 程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，分值(score) = 100，詞長(wordlength) = 12，以獲得與本發(fā) 明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，分值=50，詞長= 3，以獲得與參照多肽(例如，SEQ ID NO 2)同源的氨基酸序列。用了獲得帶缺口(gapped) 的比對來進(jìn)行比較,利用在Altschul等(Nucleic AcidsRes. 25 :3389_3402，1997)中介紹 的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。這些可以在國際互聯(lián)網(wǎng)URL "ncbi. nim. nih. gov. ”上找到。術(shù)語“報告基因”用于本文時是并入(或鄰接)編碼目標(biāo)基因的異源核酸中的核 酸序列，其為表達(dá)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化載體提供可識別的表型。報告基因的非限制性例子包括 GFP, β -半乳糖苷酶，淀粉酶，和CAT。“篩選標(biāo)記”用于本文時指對根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)制備的轉(zhuǎn)化載體提供的鑒定特征 (表型)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述篩選標(biāo)記是報告基因?！翱蛇x擇標(biāo)記，” “可選擇基因，” “報告基因”和“報告標(biāo)記”(本文稱作“可選擇標(biāo) 記”)用于本文時指編碼表型性狀的核酸序列，所述表型性狀允許快速鑒定和分離轉(zhuǎn)化的細(xì) 菌載體。一般，認(rèn)為是“臨床級別”和根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)制備的細(xì)菌載體是具有并不編碼抗 生素抗性的可選擇標(biāo)記的載體?！稗D(zhuǎn)基因”用于本文時指利用cDNA技術(shù)插入細(xì)胞中的基因，所述插入是以確保其作 為正?；虻墓δ?，復(fù)制和傳遞的方式而進(jìn)行的。“轉(zhuǎn)化性核酸序列(transforming nucleic acid sequence) ”用于本文時意指包 含編碼目標(biāo)基因的核酸序列的質(zhì)粒，或其它的表達(dá)盒。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述核 酸序列可以編碼一種或多種治療劑。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，“轉(zhuǎn)化性核酸序列”還可 以用來意指“轉(zhuǎn)基因”。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化性核酸序列包括編碼啟動子和/ 或其它調(diào)控元件的核酸序列。術(shù)語“癌癥”用于本文時指瘤性(neoplastic)疾病(例如，白血病，癌和“過度增 生性病癥(hyperproliferative disorders)”)。腫瘤可以位于選自下列的組織中結(jié)腸， 腹部，骨，乳房，消化系統(tǒng)，肝，胰，前列腺，腹膜，肺，血液(例如，白血病)，內(nèi)分泌腺(腎，副 甲狀腺，垂體，睪丸，卵巢，胸腺，甲狀腺)，子宮，眼，頭和頸，神經(jīng)(中樞和外周)，淋巴系統(tǒng)， 骨盆，皮膚，軟組織，脾，胸(thoracic)，和泌尿生殖器。在一個實(shí)施方案中術(shù)語“癌癥”還包括腫瘤前的病癥，其選自增生(例如，子宮內(nèi) 膜增生)，組織變形(例如，結(jié)締組織變形)和/或發(fā)育不良(例如，子宮頸發(fā)育不良，和支 氣管肺發(fā)育不良)。在其它的實(shí)施方案中，術(shù)語“癌癥”還包括選自良性腫瘤，纖維囊性病癥和組織肥 大的良性增生異常型癥癥。術(shù)語“免疫/造血系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥貧血 癥、全血細(xì)胞減少癥、白血球減少癥、血小板減少癥、白血病、霍金斯(Hodgkin’ s)病、非霍 金斯淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞貧血癥(ALL)、漿細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特氏(Burkitt’ s) 淋巴瘤、關(guān)節(jié)炎、哮喘、愛滋病(AIDS)、自體免疫疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肉芽腫疾病、免疫缺 陷、炎癥性腸病、膿毒病、中性白細(xì)胞減少癥、中性白細(xì)胞增多癥、銀屑病(psoriasis)、對于 移植器官和組織的免疫反應(yīng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血友病、高凝性(hypercoagulation)、糖尿 病、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、萊姆病、乳糜瀉和變應(yīng)性(allergies)。術(shù)語“生殖系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥隱睪病、 前列腺炎、腹股溝疝、精索靜脈曲張、間質(zhì)細(xì)胞瘤(leydig cell tumor)、疣狀癌、前列腺 炎、軟化斑、佩羅尼氏病(Peyronie’ s disease)、陰莖癌、扁平細(xì)胞增生、痛經(jīng)、卵巢腺癌、 特納(Turner’ s)綜合征、粘液膿性宮頸炎、Sertoli-Ieydig瘤、卵巢癌、子宮癌、骨盆炎 癥性疾病、睪丸癌(testicular cancer)、前列腺癌、格來弗德氏(Klinefelter’ s)綜合征、Young' s綜合癥、早泄、糖尿病、囊性纖維化、Kartagener' s綜合癥、睪丸萎縮、睪 丸雌化、無睪、睪丸異位、附睪炎、睪丸炎、淋病、梅毒、睪丸扭轉(zhuǎn)(testicular torsion), vasitisnodosa、生殖細(xì)胞瘤、基質(zhì)瘤、痛經(jīng)、子宮后傾(retroverted uterus)、子宮內(nèi)膜 異位、纖維瘤、子宮內(nèi)膜異位、無排卵出血、閉經(jīng)、垂體嗜堿細(xì)胞增殖、葡萄胎、阿謝曼氏 (Asherman' s)綜合征、早熟絕經(jīng)、青春期早熟、子宮息肉、功能性月經(jīng)失調(diào)(dysfunctional uterine bleeding)、宮頸炎、慢性子宮頸炎、粘液濃性宮頸炎、子宮頸非典型增生、宮頸息 肉、Nabothian cysts、子宮頸糜爛、宮頸功能不全、頸贅生物、假兩性畸形，和經(jīng)前期綜合 征。術(shù)語“肌肉骨骼系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥骨癌 (例如，軟骨骨瘤、良性軟骨瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、骨樣骨瘤、巨細(xì)胞瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、骨肉瘤)，畸形性骨炎(Paget’ sDisease)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼 瘡、骨髓炎、萊姆病、痛風(fēng)、粘液囊炎、肌腱炎、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮(muscular dystrophy)、線粒體肌病、惡病質(zhì)，和多發(fā)性硬化。術(shù)語“心血管系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥粘液瘤、 纖維瘤、橫紋肌瘤、心血管異常(例如，先天性心臟病、大腦動靜脈畸形、中隔缺損)，心臟病 (例如，心力衰竭、充血性心臟病、心律不齊、心動過速、纖維性顫動、心包疾病、心內(nèi)膜炎)， 心動停止、心瓣膜疾病(例如，狹窄、回流、脫垂)，血管病(例如，高血壓、冠狀動脈病、心絞 痛、動脈瘤、動脈硬化、外周血管疾病)，低血鈉、hypematremia、低血鉀，和高血鉀癥。術(shù)語“混合胎兒的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥脊柱裂、積 水性無腦畸形、神經(jīng)纖維瘤、胎兒乙醇綜合征、糖尿病、PKU、唐氏(Down's)綜合癥、Patau綜 合征、愛德華(Edwards)綜合癥、特納綜合征、阿佩爾(Apere)綜合征、卡彭特(Carpenter) 綜合征、Conradi綜合征，Crouzon綜合征，皮膚松弛癥，Cornelia de Lange綜合征， Ellis-van Creveld 綜合征，Holt-Oram 綜合征，Kartagener 綜合征，Meckel-Gruber 綜合 征，Noonan 綜合征，Pallister-Hall 綜合征，Rubinstein-Taybi 綜合征，Scimitar 綜合 征，Smith-Lemli-Opitz 綜合征，thromocytopenia-absent radius (TAR)綜合征，Treacher Collins綜合征，Williams綜合征，Hirschsprung病，麥克爾憩室，多囊腎疾病，特納綜合 征，和性腺發(fā)育不全，Klippel-Feil綜合征，ostogenesisimperfecta、肌肉萎縮、臺-薩二 氏(Tay-Sachs)病、維爾姆斯(Wilm’ s)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤，和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。術(shù)語“分泌系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥膀胱癌、前 列腺癌、良性前列腺增生、膀胱病癥(例如，尿失禁、尿潴留、尿路梗阻、尿路感染、間質(zhì)性膀 胱炎、前列腺炎、神經(jīng)原膀胱、血尿癥)，腎病癥(例如，腎積水、蛋白尿、腎衰竭、腎盂腎炎、 尿石病、逆流腎病，和單側(cè)梗阻性尿路病)。術(shù)語“神經(jīng)/感覺系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥腦 癌(例如，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原發(fā)性)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴 瘤、小腦星形細(xì)胞瘤，和大腦星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)變性疾病(例如，阿爾茨海默氏病、克-雅 病(Creutzfeldt-Jakob Disease) Λ Parkinson‘ sDisease, 禾口 Idiopathic Presenile Dementia)，腦脊髓炎、腦型瘧、腦膜炎、新陳代謝型腦病(例如，苯酮尿和丙酮酸羧化酶缺 陷)，小腦共濟(jì)失調(diào)、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張，和愛滋病癡呆混合癥、精神分裂癥、注意力 缺損病、亢進(jìn)性注意力缺損病(hyperactive attention deficit disorder)、孤獨(dú)癥，和強(qiáng)制性障石導(dǎo)(obsessive compulsive disorders)。術(shù)語“呼吸系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥呼吸系統(tǒng)癌 癥如喉癌、咽癌、氣管癌、會厭癌、肺癌，鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞(燕麥形細(xì)胞)癌，大細(xì)胞癌，和 腺癌。過敏反應(yīng)、囊性纖維化、結(jié)節(jié)病、組織細(xì)胞增多病X、浸潤型肺病(例如，肺纖維化和淋 巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎)，阻塞性氣道病(例如，哮喘、肺氣腫、慢性或急性支氣管炎)，職業(yè)性 肺病(例如，硅肺和石棉肺)，肺炎和胸膜炎。術(shù)語“內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥內(nèi)分 泌組織和器官的癌癥(例如，下丘腦、腦下垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、胰腺、腎上腺、卵巢， 和睪丸的癌癥)，糖尿病(例如，尿崩癥、I型和II型糖尿病)，肥胖癥，涉及垂體腺的病 癥(例如，垂體機(jī)能亢進(jìn)、垂體機(jī)能減退，和垂體性矮小癥(pituitary dwarfism))，甲狀 腺機(jī)能減退、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺腫、生殖疾病(例如，男性和女性不育)，涉及腎上 腺的病癥(例如，Addison病，皮質(zhì)類固醇缺陷癥，和Cushing' s綜合征)，腎癌(例如， hypem印hroma，移行細(xì)胞癌，和威爾姆斯瘤)，糖尿病型腎病、間質(zhì)性腎炎、多囊腎疾病、腎 小球腎炎(例如，IgM腎小球系膜增生性腎小球腎炎和由自身免疫病癥引發(fā)的腎小球腎炎 (glomerulonephritis) JnGoodpasture' s 綜合征)，禾口腎 丐沉著癥。術(shù)語“消化系統(tǒng)的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥潰瘍性結(jié)腸 炎、闌尾炎、克羅恩氏病(Crohn’ s)、肝炎、肝性腦病、門靜脈高壓癥、膽石病、消化系統(tǒng)癌癥 (例如，膽道癌、胃癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰癌、膽管癌、結(jié)腸腫瘤(例如，息肉或癌癥)，和硬化 癥)，胰腺炎、潰瘍疾病、幽門狹窄、腸胃炎、胃炎、胃萎縮、良性十二指腸瘤、膨脹、過敏性腸 綜合征、吸收障礙、先天性小腸病、細(xì)菌和寄生蟲傳染、赫希施普龍氏病(megacolon)、赫希^ R>Hirschprung' sdisease>aganglionic megacolon、—lit生、結(jié) 腸炎、肛門直腸病癥(例如，肛瘺、痔)，先天性肝病(例如，威爾遜病、血色素沉著病、囊性纖 維化、膽道閉鎖，和阿爾法1-抗胰蛋白酶缺陷癥)，門靜脈高壓癥、膽石病，和黃疸。術(shù)語“結(jié)締/上皮的疾病或病癥”用于本文時指選自下列的疾病或病癥結(jié)締組 織變形、混合結(jié)締組織病、局灶性上皮增生、上皮化生、粘膜上皮發(fā)育異常、移植物對抗宿 主的疾病、多肌炎、囊性增生、大腦發(fā)育異常、組織肥大(hypertrophy)、阿爾茨海默氏病、 淋巴組織增生病癥、Waldenstron' s巨球蛋白血癥、克羅恩氏病、惡性貧血、突發(fā)性阿狄 森氏病(idiopathicAddison，s disease)、腎小球腎炎、大皰性類天皰瘡、Sjogren ‘ s 綜合征、糖尿病、囊性纖維化、骨母細(xì)胞瘤、破骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、骨質(zhì)疏松癥、 osteocarthritis、牙周病、傷口愈合、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、脈管炎、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動脈炎、 Wegener肉芽腫病、蜂窩織炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、盤狀紅斑狼瘡、全身性紅斑狼 瘡、硬皮病、CREST綜合征、Sjogren' s綜合征、多肌炎、皮膚肌炎、混合結(jié)締組織病、復(fù)發(fā) 性多軟骨炎、脈管炎、Henoch-Schonlein綜合征、結(jié)節(jié)性紅斑、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動脈炎、暫時性 (巨細(xì)胞)動脈炎、Takayasu動脈炎、Wegener肉芽腫病、Reiter' s綜合征、Behcet' s綜 合征、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、蜂窩織炎、瘢痕瘤、EhlerDanlos綜合 征、Marfan綜合征、彈性假黃色瘤、成骨不全、軟骨發(fā)育不良、大皰性表皮松解、Alport綜合 征，和皮膚松弛癥。本說明書中的術(shù)語“a”和“the”意欲包括一個(單數(shù))和多個(復(fù)數(shù))。本文所述的活性劑或活性劑的組合的“治療有效量”可以理解為包含這樣的有效量，其引起所需的反應(yīng)但不足以引發(fā)毒性反應(yīng)。所需的反應(yīng)，例如，可以在血液樣品中形成 足夠和/或可接受的可檢測抗體滴定水平。施用給受試者的劑量和持續(xù)時間將由需要治療 的受試者的主治醫(yī)生來確定，并且將考慮年齡、性別、體重、現(xiàn)有患病狀態(tài)和/或受試者組 織損傷程度，將螺桿菌和目標(biāo)基因產(chǎn)品的特定制劑用作受試者的治療。短語“有效水平”指所需分子活性的水平并且不一定限于分子數(shù)。例如，可以通過 支鏈淀粉(amylin)拮抗劑降低支鏈淀粉的有效水平來刺激生長素釋放肽分泌，而不必伴 隨著受試者體內(nèi)游離支鏈淀粉量的減少。短語“生長素釋放肽相關(guān)的疾病和病癥”指任何能夠通過調(diào)節(jié)生長素釋放肽活 性來預(yù)防或減輕的病癥。這些包括由生長素釋放肽加劇或刺激的病癥，例如，生長激素釋 放或drive to eat。生長素釋放肽的生理作用被認(rèn)為包括，例如，刺激生長激素釋放，刺 激泌乳細(xì)胞和促腎上腺皮質(zhì)素細(xì)胞分泌激素，orexigenic和心血管作用，抗甲狀腺和乳 腺癌(breast tumor)增生作用，以及通過迷走神經(jīng)介導(dǎo)調(diào)節(jié)胃活動性和酸分泌。(見WO 2005021026)。在整個說明書中，除非上下文另外要求，單詞“包含(comprise)”或其變體“包含 (comprises) ”或“包含(comprising) ”將理解為意味著包括指定的事物或事物組合，但不 排除任何其它的事物或事物組合。當(dāng)術(shù)語的定義背離通常所用的術(shù)語意義時，申請人意在采用本文提供的定義，除 非明確指出。發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，要理解的是本發(fā)明不受限制于具體舉例的方法并且當(dāng)然 可以變化。還要理解是本文所用的術(shù)語僅出于描述本發(fā)明的具體的實(shí)施方案的目的，并且 不傾向于限制僅由后附的權(quán)利要求所限制的本發(fā)明。本文所引用的所有的出版物，專利和專利申請，不管是在上文還是下文，特此將其 全部內(nèi)容并入作為參考。然而，出于描述和公開在所述出版物中報道并且可以與本發(fā)明結(jié) 合使用的方法，試劑和載體的目的，引用本文提及的出版物。本文的任何內(nèi)容都不應(yīng)被視為 承認(rèn)本發(fā)明不可以根據(jù)在先發(fā)明而早于這些公開(本發(fā)明可以早于這些公開)。此外，除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)免疫和分子生物學(xué) 技術(shù)和藥理學(xué)。這些技術(shù)是技術(shù)人員所熟知的，并且在文獻(xiàn)中進(jìn)行了充分的解釋。見，例 如 Coligan 等"Current protocols in ProteinScience，，(1999) Volume I and II (John Wiley & Sons Inc.) ；Sambrook 等，(Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd & 3rd Editions，Cold SpringHarbor Laboratory press (1989) (2001)；禾口Bailey，J. E.禾口Ollis， D. F. , Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company，NY，1986。必須注意，用于本文和后附的權(quán)利要求時，除非文中另外清楚指出，單數(shù)形式 “一，” “一種，”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如，在提到“核酸”時包括多種這樣的核 酸，并且提到“分離的肽”時，是指一種或多種肽等。除非另外定義，本文所用的所有的技術(shù) 和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管可以使 用與本文所述的那些相似的或等價的任何材料和方法來實(shí)踐或測試本發(fā)明，優(yōu)選本文所述 的材料和方法。將治療性組合物和核酸遞送到動物體的特異性目標(biāo)位點(diǎn)是藥物開發(fā)工業(yè)正在面臨的挑戰(zhàn)。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)能夠攜帶編碼生物活性劑的載體的基于螺桿菌的細(xì)菌遞送系 統(tǒng)，其中這些藥劑在細(xì)菌的表面上表達(dá)或從其中分泌。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是螺桿 菌物種，更優(yōu)選地，是幽門螺桿菌。在一些實(shí)施方案中，幽門螺桿菌的菌株可以是本領(lǐng)域已 知的任何菌株。在一些實(shí)施方案中，所述幽門螺桿菌菌株是非致病性菌株諸如基因組菌株 26695。在另一個實(shí)施方案中，使用除了螺桿菌之外的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)行了遺 傳改造從而使其具有螺桿菌或幽門螺桿菌特征，所述特征包括慢性建群在胃黏膜或胃腸 道，泌尿道，支氣管的上皮或其它黏膜器官的其它區(qū)域，而不會對宿主造成明顯的毒性的能 力。在一個實(shí)施方案中，已經(jīng)對幽門螺桿菌進(jìn)行了操控從而去除和/或減弱一些致病 性特征。例如，可以去除空泡細(xì)胞毒素和cag致病島基因從而使所述幽門螺桿菌的致病性 降低。在一個實(shí)施方案中，已經(jīng)對幽門螺桿菌進(jìn)行了操控從而去除和/或減弱一些致病性 特征。例如，可以去除空泡細(xì)胞毒素和cag致病島基因從而使所述幽門螺桿菌的致病性降 低?？梢允褂脩?yīng)用N-甲基-N-硝基-N-nitrosoquanidine進(jìn)行的化學(xué)非特異性誘變或應(yīng) 用重組DNA技術(shù)的非特異性誘變來將減毒突變引入螺桿菌中。技術(shù)人員將理解本發(fā)明的方法能夠用于遞送廣泛的生物活性劑。適合的藥劑的實(shí) 例包括能夠在局部或全身發(fā)揮功能的藥劑，例如能夠發(fā)揮內(nèi)分泌活性影響局部或全身代謝 的藥劑和/或能夠調(diào)節(jié)屬于免疫/造血系統(tǒng)的細(xì)胞的活性的藥劑，和/或能夠影響身體的 多種正?；蛸樕约?xì)胞的生存，生長和分化或影響對于傷口和感染的急性期炎癥反應(yīng)的免 疫調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)的藥劑和/或能夠增加或誘導(dǎo)針對由作用在它們的靶細(xì)胞受體上的趨化因 子，或上皮細(xì)胞的增殖或傷口愈合的促進(jìn)所介導(dǎo)的細(xì)胞和組織的感染的抗性的藥劑和/或 調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)或產(chǎn)生物質(zhì)的藥劑。這樣的生物活性劑的具體實(shí)例包括胰島素，生長激素，促乳素，降鈣素，黃體生成 素，甲狀旁腺激素，生長激素抑制素，甲狀腺刺激激素，血管活性腸肽，采取反平行的4 α螺 旋狀束結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組1細(xì)胞因子諸如IL-2, IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-9，IL-10， IL-11，IL-12, IL-13, GM-CSF，M-CSF, SCF，IFN- γ，ΕΡ0, G-CSF, LIF, OSM, CNTF，GH, PRL 或 IFNa/β,通常是細(xì)胞表面相關(guān)的，形成對稱同源三聚體并且亞基采取對于某些病毒包被 蛋白質(zhì)所述的β-膠凍卷(jelly roll)構(gòu)象的結(jié)構(gòu)組2細(xì)胞因子諸如細(xì)胞因子的腫瘤壞死 因子(TNF)家族，例如TNF a，TNF β，CD40，CD27或FAS配體，細(xì)胞因子的IL-1家族，成纖維 細(xì)胞生長因子家族，血小板衍生生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子β和神經(jīng)生長因子，包含短鏈a/ β分子的結(jié)構(gòu)組3細(xì)胞因子，其作為大的跨膜前體分子產(chǎn)生，所述前體分子每個在細(xì)胞外 區(qū)域中包含至少一個表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)胞因子的EGF家族，特征在于它們 在氨基酸序列周圍存在保守的半胱氨酸殘基(C-C或C-X-C趨化因子亞基)的趨化因子 或胰島素相關(guān)趨化因子，顯示嵌合結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組4細(xì)胞因子諸如由不同結(jié)構(gòu)域，例如EGF， 免疫球蛋白樣和三環(huán)結(jié)構(gòu)域組成的調(diào)蛋白(heregulins)或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。或者，所述生物活性劑可以是如上定義的生物活性劑的受體或拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，使用基于幽門螺桿菌的載體和/或載體質(zhì)粒構(gòu)建體來產(chǎn)生轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞(諸如大腸桿菌或螺桿菌細(xì)胞)，其容許來自被包含在其中的分離的核酸分子的 生物活性劑在宿主的黏膜表面上的表達(dá)和/或分泌，所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞制劑被施用于所述宿主。被包含在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(或載體)中的分離的核酸可以包含一種或多種核酸構(gòu)建體，其 中編碼所述生物活性劑的核酸在用于在幽門螺桿菌中表達(dá)的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下。可以選擇或構(gòu)建包含用于介入幽門螺桿菌的核酸的適合的載體和穿梭載體序列， 以包含適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列，終止子片段，增強(qiáng)子序列，標(biāo)記基因和適合的其 它序列。如果合適，載體可以是質(zhì)粒，病毒，例如噬菌體或噬菌粒。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，見 例如 Sambrook 等，上文。在 Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel等eds. ,Johnffiley & Sons，1992中詳細(xì)描述了操控核酸，例如在制備核酸構(gòu)建體， 誘變，測序，將DNA引入細(xì)胞和基因表達(dá)中的許多已知的技術(shù)和方法。將Sambrook等上文 和Ausubel等的公開內(nèi)容結(jié)合在本文作為參考。在一些實(shí)施方案中，將生物活性劑的編碼序列包含在操縱子中，即進(jìn)行多順反子 表達(dá)的核酸構(gòu)建體。在操縱子中，自啟動子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致包含超過一個的編碼序列的mRNA，所 述編碼序列的每個具有其本身適當(dāng)定位的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游。因此，超過一種藥劑可以 從單一的mRNA進(jìn)行翻譯。使用操縱子能夠使生物活性劑協(xié)同表達(dá)。包含本發(fā)明的生物活性劑的編碼序列的核酸構(gòu)建體或載體優(yōu)選地在用于在幽門 螺桿菌的表達(dá)的啟動子的控制下。在一個實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的所用的啟動子在幽門螺桿菌中組成性地表達(dá)。 組成型啟動子的應(yīng)用避免提供用于表達(dá)發(fā)生的誘導(dǎo)物或其它調(diào)節(jié)信號的需要。優(yōu)選地，啟 動子在幽門螺桿菌宿主細(xì)胞保持有生活力，即保持一些代謝活性，甚至即使生長沒有被減 少的水平上指導(dǎo)表達(dá)。那么有利的是，這樣的表達(dá)可以在低水平上進(jìn)行。例如，當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物 在細(xì)胞內(nèi)積累時，表達(dá)水平可以導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物在少于細(xì)胞蛋白質(zhì)的約10%，優(yōu)選地約或少 于約5%例如約1-3%的積累。啟動子可以與所用的幽門螺桿菌菌株同源，即在天然存在的幽門螺桿菌菌株中發(fā) 現(xiàn)的啟動子。在一些實(shí)施方案中，所述啟動子是阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子。其它的啟動子包 括FlaB sigma 54 啟動子(Josenhans 等，1998，F(xiàn)EMS Microbiol Lett, 161 (2) :263_73)，T7 啟動子，和沙門氏菌的nir B 啟動子(Chatfield等，1992，Biotechnology，10 (8) :888_92)。在另一個實(shí)施方案中，所述啟動子是可誘導(dǎo)的?？梢耘c臨床級別的載體一起使用 的可誘導(dǎo)的啟動子包括，但不限于，如在授權(quán)給Kullen等的美國專利號6，242，194中所述 的PH誘導(dǎo)型啟動子，乳糖誘導(dǎo)型啟動子諸如在大腸桿菌質(zhì)粒(例如，來自Stratagene的 pBluescript )中所用的啟動子，或在乳酸菌(Lactobacillus)中的內(nèi)源乳糖啟動子；在厭 氧生長過程中誘導(dǎo)的啟動子諸如在Aristarkhov等，1999，J. Bacteriology, Vol. 178 (14)， 4327-4332中所述的醇脫氫酶(adhE)的啟動子。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體還包括毒性基因。這些毒性基因優(yōu)選地在可 誘導(dǎo)的啟動子的控制下，從而在處理結(jié)束后，本發(fā)明的螺桿菌可以容易地通過誘導(dǎo)毒性基 因的表達(dá)而進(jìn)行去除。毒性基因的非限制性實(shí)例包括在可誘導(dǎo)啟動子控制下的細(xì)菌自溶 素。接著，所述自溶基因可以在適合的時間和在胃腸道中的適合位置，通過使用剛在前面描 述的一種或多種可誘導(dǎo)的啟動子進(jìn)行引發(fā)。在一些實(shí)施方案中，被改造的螺桿菌載體和質(zhì)粒載體構(gòu)建體對于氧敏感。這種氧 敏感性是限制本發(fā)明的臨床級別的載體的傳播的另一種方法。人消化道的環(huán)境中氧含量是 非常低的，適合于包括螺桿菌的厭氧和微量需氧的微生物的生長。因此，一旦在腸內(nèi)廢物排泄到富氧的外部環(huán)境后，它們已經(jīng)離開人體時，消除螺桿菌遞送載體的有效方式是將賦予 氧敏感性的基因改造到被轉(zhuǎn)化的微生物中。本發(fā)明的一種或多種核酸構(gòu)建體可以包括分泌信號序列。因此，在一些實(shí)施方案 中，編碼生物活性劑例如非螺桿菌多肽的核酸可以通過將編碼分泌信號序列的核酸序列與 編碼分子(多肽)的核酸序列進(jìn)行適當(dāng)偶聯(lián)在細(xì)胞膜上提供所述藥劑的分泌?？梢栽诰S持 螺桿菌生存力的培養(yǎng)條件下，體外測試具有分泌多肽的核酸的螺桿菌的能力。適合的分泌信號序列包括具有在革蘭氏陰性生物諸如埃希氏菌屬(Escherichia) 細(xì)菌，克雷伯氏菌(Klebsiella)，和沙門氏菌(Salmonella)中活性的那些中的任何。分 泌信號序列可以包括由一些葡萄球菌(Staphylococcus)菌株分泌的葡萄球菌激酶的分泌 前導(dǎo)序列，這是在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性宿主中都發(fā)現(xiàn)的功能(見“Gene Expression Using Bacillus，，，Rapoport (1990) Curr Opin Biotech 1 :21_27)。可以使用的其它的分泌信號序列包括，例如β-內(nèi)酰胺酶基因(Talmadge等， 1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3369-3373)或腸侵染性大腸桿菌溶血素 A(hlyA) (Su 等，1992，Microbial Pathogen，13 :465_476)。在 Pugsley，1988，Protein secretion across the outer membrane of gram-negative bacteria. In Protein Transfer and organelle Biogenesis, R. C. Dand and P. W. Robbins(eds), Academic Press, Inc. , San Diego, pp 607-652中列舉了分泌信號序列的舉例性列表。可選擇的標(biāo)記給研究者和技術(shù)人員提供了在混合的群體中，區(qū)分轉(zhuǎn)化的微生物和 未轉(zhuǎn)化的微生物的方便的方法。鑒定轉(zhuǎn)化的生物的一種方式是將可選擇的標(biāo)記核酸序列結(jié) 合到包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒中。通常將可選擇的標(biāo)記序列插入目標(biāo)基因的下游并且用相同的 啟動子進(jìn)行驅(qū)動。結(jié)果，成功用目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還將用可選擇的標(biāo)記核酸序列轉(zhuǎn)化。 當(dāng)將抗生素抗性用作可選擇標(biāo)記時，僅有被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將在包含抗生素的培養(yǎng)基上生存和 /或生長。因此，當(dāng)開發(fā)轉(zhuǎn)化體時，抗生素抗性是方便的并且是大量使用的表型。然而，具有 抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記的載體會發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移，這可以導(dǎo)致其它的生物具有抗 生素抗性表型。當(dāng)將螺桿菌用作治療性載體的部分時，這種風(fēng)險是尤其尖銳的。為了將螺桿菌用作針對動物的基因遞送系統(tǒng)，本發(fā)明公開內(nèi)容在一些實(shí)施方案中 提出了不使用抗生素選擇標(biāo)記的臨床級別的載體系統(tǒng)。本發(fā)明提供的使用抗生素抗性基因 的備選之一包括在必要的“持家”基因中具有染色體缺失或具有致死突變的臨床級別的載 體。接下來，將在功能上類似的持家基因插入編碼目標(biāo)基因的質(zhì)粒中。結(jié)果，“持家”基因成 為容許快速分離和鑒定轉(zhuǎn)化體的可選擇的標(biāo)記。必要的“持家”基因的實(shí)例包括編碼許多代謝調(diào)節(jié)物和/或酶的基因，所述酶包括 但不限于激酶，蛋白酶，合成酶，脫氫酶及其它。由本發(fā)明提供的對于抗生素抗性基因的另 一個備選包括具有報告基因的臨床級別的載體，所述報告基因被結(jié)合到包含目標(biāo)基因的質(zhì) 粒中。按照本發(fā)明的教導(dǎo)使用的報告基因的其它的非限制性實(shí)例包括綠色熒光蛋白(GFP)， β-半乳糖苷酶和淀粉酶。在一個實(shí)施方案中，生物活性多肽優(yōu)選地具有細(xì)胞因子活性。細(xì)胞因子在“The Cytokine Facts Book，，，Callard 禾口 Gearing(1994) ,Academic Press 中進(jìn) 亍了討論。具有 細(xì)胞因子活性的優(yōu)選的多肽是白介素，包括白介素_2(IL-2)和白介素-6(IL-6)。
在一些實(shí)施方案中，將包括如上所述的核酸構(gòu)建體的螺桿菌遞送系統(tǒng)，載體或載 體質(zhì)粒系統(tǒng)引入螺桿菌或其它的適合的宿主細(xì)胞中以提供被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的 另一個方面提供包括將公開的核酸引入非致病性螺桿菌中的方法。轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，諸如螺 桿菌的培養(yǎng)物可以使用任何可獲得的技術(shù)。對于幽門螺桿菌細(xì)胞而言，適合的技術(shù)可以包 括氯化鈣轉(zhuǎn)化，電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。將載體質(zhì)粒引入螺桿菌細(xì)胞后，可以例如通過在表達(dá)所述基因的條件下培養(yǎng)幽門 螺桿菌來導(dǎo)致或容許所述核酸的表達(dá)。在表達(dá)生物活性多肽的條件下，在培養(yǎng)物中培養(yǎng)所 述螺桿菌可以用于證實(shí)所述螺桿菌包含編碼核酸并且能夠產(chǎn)生被編碼的物質(zhì)。在另一個方面，本發(fā)明提供體內(nèi)遞送治療性或預(yù)防性劑量的生物活性劑的方法， 所述方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的幽門螺桿菌組合物和疫苗的非致病性的制 劑。要理解的是，本發(fā)明的方法和使用本文所述的非侵入性和非致病性螺桿菌提供廣 泛種類的治療性方法，所述方法將使技術(shù)人員能夠操縱，例如受試者的免疫應(yīng)答。因此，在 一個方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)存活、生長、分化、效應(yīng)子功能或?qū)τ诩?xì)胞或組織的感染的易感 性的方法，所述方法包括向受試者施用本文定義的非侵入性或非致病性螺桿菌。在另一個方面，提供加強(qiáng)針對建群在黏膜表面或在臨近或遠(yuǎn)端組織上的腫瘤細(xì)胞 或感染的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向受試者施用本文定義的非侵入性或非致病性螺 桿菌。在另一個方面中，提供調(diào)節(jié)針對致病性傳染物的免疫應(yīng)答的類型(抗體對細(xì)胞介 導(dǎo)的)的方法，所述方法包括向受試者施用本文定義的非侵入性或非致病性螺桿菌。在另一個方面中，提供用炎癥或腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)正常組織的滲透的方法，所述方法 包括向受試者施用本文定義的非侵入性或非致病性螺桿菌。在一些方面中，提供控制腫瘤細(xì)胞的生長速率，侵入速率或存活的方法，所述方法 包括向受試者施用本文定義的非侵入性或非致病性螺桿菌。在另一個方面中，提供在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)調(diào)亡的方法，所述方法包括向受試者施 用本文定義的非侵入性或非致病性螺桿菌。其它的方面提供下調(diào)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向受試者施用表達(dá)生物活性 劑的非侵入性或非致病性細(xì)菌。在另一個方面中，提供治療變應(yīng)性自體免疫的或其它的免疫調(diào)節(jié)異常的疾病狀態(tài) 的方法，所述方法包括向受試者施用表達(dá)生物活性劑的非侵入性或非致病性螺桿菌。所述受試者可以是任何靈長類動物，馬，牛，豬，綿羊，嚙齒動物，魚或鳥。在一個實(shí) 施方案中，所述受試者是人。施用可以方便地是通過鼻或口進(jìn)行。在治療的情況中，即當(dāng)生物活性劑向受試者的遞送的生物效果有益于該受試者 時，施用優(yōu)選地以“治療有效量”進(jìn)行，這足以向受試者顯示益處。這樣的益處可以是至少 緩和或減少至少一種癥狀的嚴(yán)重性或發(fā)生。在預(yù)防的情況中，該量可以例如通過增加免疫 應(yīng)答減少對隨后受到致病性刺激的受試者的不利影響。所用實(shí)際的量，和施用的速率和時 間進(jìn)程將取決于施用的目的，例如鑒于所述刺激的性質(zhì)和嚴(yán)重性所尋求的生物效果，并且 是通常優(yōu)化的目標(biāo)。治療的處方，包括預(yù)防性接種疫苗，例如在劑量等上的決定，在一般的 執(zhí)業(yè)者和其它的醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)。
包括螺桿菌的組合物可以按照本發(fā)明單獨(dú)施用或組合以其它的治療同時或順序 地進(jìn)行施用。本發(fā)明還提供包含公開的螺桿菌的藥物組合物。這樣的藥物組合物在優(yōu)選地適合 應(yīng)用于黏膜上的一個實(shí)施方案中。按照本發(fā)明并且按照本發(fā)明應(yīng)用的藥物組合物除了螺桿菌之外，可以包含藥用賦 形劑，載體，緩沖劑，穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)該是無毒的并 且應(yīng)該不會干擾活性成分的功效。載體或其它物質(zhì)的精確的性質(zhì)可以取決于施用的路徑。 對于口服施用而言，可以應(yīng)用腸胃外可接受的水溶液，所述水溶液無致熱原并且具有適合 的PH，等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員完全能夠制備適合的溶液。如果需要，可以 包括防腐劑，穩(wěn)定劑，緩沖劑，抗氧化劑和/或其它的添加劑。如所討論的，用于按照本發(fā)明 施用的包含螺桿菌的藥物可以包括一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)，例如能源諸如葡萄糖，氨基酸等。在另一個方面中，本發(fā)明提供制備藥物制劑的方法，所述藥物制劑包含公開的配 制的螺桿菌以及適合于施用給個體的適合的載體介質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，所述藥物適合 應(yīng)用于個體的黏膜。在另一個方面，本發(fā)明提供表達(dá)異源生物活性多肽的非致病性螺桿菌，所述生物 活性多肽用于藥用，例如用在通過外科手術(shù)或療法，包括預(yù)防(“接種疫苗”)治療人或動物 體的方法中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用于治療，預(yù)防或減輕疾病諸如癌癥。所 述方法和遞送系統(tǒng)還可以用于治療或預(yù)防免疫/造血系統(tǒng)的疾病或病癥，生殖系統(tǒng)的疾病 或病癥，肌與骨骼系統(tǒng)的疾病或病癥，心血管系統(tǒng)的疾病或病癥，被描述為混合胎(mixed fetal)的疾病或病癥，排泄系統(tǒng)的疾病或病癥，神經(jīng)/感覺系統(tǒng)的疾病或病癥，內(nèi)分泌系統(tǒng) 的疾病或病癥，呼吸系統(tǒng)的疾病或病癥，消化系統(tǒng)的疾病或病癥和與結(jié)締/上皮組織相關(guān) 的疾病或病癥或由細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染導(dǎo)致的疾病或病癥。在另一個實(shí)施方案中，本文所述的螺桿菌遞送系統(tǒng)能夠同時或順序遞送許多不同 的核酸分子，所述核酸分子編碼能夠治療本文所述的許多病癥或疾病的產(chǎn)物。而且，優(yōu)選的 遞送系統(tǒng)還將遞送能夠產(chǎn)生另外的理想生理作用諸如食欲抑制或增加的組合物。Panthel 等 2003 (Infection & Immunity, 71 :109_116)已經(jīng)描述了在幽門螺桿菌 中的自殺系統(tǒng)的實(shí)例。這種系統(tǒng)將包含PhiX174裂解基因E的質(zhì)粒引入幽門螺桿菌中。為 了消除所述菌株，應(yīng)用在42°C進(jìn)行5小時的溫育。在體內(nèi)，這意味著動物將飲用45-50°C的 飲料從而將胃環(huán)境的溫度升高到超過42°C。第二個實(shí)例是L-Dap選擇系統(tǒng)，其常用于使細(xì)菌突變體在補(bǔ)加平板上存活(見例 如 Kirata 等 1997 (Infection & Immunity，65 :4158_4164)。在該系統(tǒng)中，為了使 DapE 缺 陷型幽門螺桿菌突變體存活，動物受試者必須用失去的底物即二氨基庚二酸(DAP)補(bǔ)充它 們的飲食。為了消除突變體，接著停止DAP的消耗。因?yàn)槠渚哂衦dxA基因，第三種可能的系統(tǒng)涉及幽門螺桿菌的甲硝唑敏感性。rdxA 基因的過度復(fù)制對于哺乳動物細(xì)胞和大腸桿菌是有害的。然而，復(fù)制可以被細(xì)菌所耐受。因 此，可以改造本發(fā)明的螺桿菌物種以包含兩個拷貝的rdxA，其阻止正常的突變-依賴型的 rdxA失去。將至少兩個功能性rdxA基因引入螺桿菌基因組中導(dǎo)致形成對甲硝唑永久敏感 的螺桿菌菌株。Jeong等2000 (J. Bacteriol.，182 =5082-5090)顯示通過功能性rdxA基因產(chǎn)生的硝基還原酶將甲硝唑從前藥轉(zhuǎn)化為殺菌化合物。活性化合物的作用方式導(dǎo)致螺桿菌 基因組的DNA斷裂?，F(xiàn)在本發(fā)明將僅參考下面的非限制性實(shí)施例來進(jìn)一步進(jìn)行描述。然而，應(yīng)該理解 的是，下面的實(shí)施例是舉例說明性的并且決不應(yīng)該將其視為對本文所述發(fā)明的共性的限 制。具體而言，盡管本發(fā)明詳細(xì)描述了具體的幽門螺桿菌菌株的應(yīng)用，顯而易見的是本文的 發(fā)現(xiàn)不受限于該菌株。棚列1講#夕卜滅__棘汰薩本禾口·_1丨、舊描物對幽門螺桿菌的遺傳操縱是不常見的。本實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明提供遺傳轉(zhuǎn)化的螺 桿菌，特別是轉(zhuǎn)化的幽門螺桿菌的應(yīng)用性。使用質(zhì)粒和來自螺桿菌的質(zhì)粒載體制備轉(zhuǎn)化的 細(xì)菌，以前在非螺桿菌生物諸如大腸桿菌的操作中，已經(jīng)將這作為了研究的對象?？梢詫⒃谖墨I(xiàn)中所述的一些幽門螺桿菌質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)化到幽門螺桿菌/大腸桿 菌穿梭載體中。已經(jīng)報道了許多大腸桿菌菌株對于DNA吸收天然是有活性的。還已經(jīng)將對 于鏈霉素，利福平和甲硝唑的抗性標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化到大多數(shù)幽門螺桿菌的菌株中。然而，盡管 可以將來自大腸桿菌和其它生物的質(zhì)粒DNA引入幽門螺桿菌中，但是不能穩(wěn)定地維持這些 質(zhì)粒。而且，不能將幽門螺桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或螺桿菌物種中。因此，必須構(gòu)建幽門 螺桿菌穿梭載體。在圖1和2中所顯示的示意圖中舉例說明了來自幽門螺桿菌的兩個質(zhì)粒。已經(jīng) 對載體PHPAI (2. 8kb)(圖1)和pHP3 (3. 4kb)(圖2)進(jìn)行了測序并且揭示了 pHPAl通過θ 質(zhì)粒復(fù)制模式進(jìn)行復(fù)制。與滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒相反，在復(fù)制過程中，θ (theta)質(zhì)粒不產(chǎn)生單 鏈DNA中間體，并且因此是更穩(wěn)定的載體候選物，因?yàn)樗鼈儾灰装l(fā)生不正常的重組。此外， pHPAl的復(fù)制起點(diǎn)(ori)包含一系列的涉及復(fù)制控制和維持穩(wěn)定的拷貝數(shù)的定向重復(fù)序列 (稱為“重復(fù)區(qū)”)。載體PHP623共享許多這樣的特征。在下面顯示了這兩個載體的核苷酸 序列。(1)以雙鏈形式顯示的質(zhì)粒pHPl (上面的鏈?zhǔn)荢EQ ID NO :1 ；下面的鏈?zhǔn)荢EQ ID NO 2)GTCATGCGCGTTGTTTTTMTTACATTTTAMCMCTTGTTGTTGTTTTTACATGTTTTACTCGC 65CAGTACGCGCAACAAAAATTAATGTAAAATTTGTTGAACAACAACAAAAATGTACAAAATGAGCGATGCGCGCGCGTGAGGGATTGGGGGTTGCMCCCCCTAMTMCGMGCTGTAGGGTTTCTCATT 130TACGCGCGCGCACTCCCTAACCCCCAACGTTGGGGGATTTATTGCTTCGACATCCCAAAGAGTAA
TTTGTGGTGAAMTGMTAAMCAGMCTTCTTGCCMCACTMCAGMCTTCTTGCCMCACTA 195AAACACCACTTTTACTTATTTTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATACAGMCTTCTTGCCMCACTMCAGMCTTCTTGCCMCACTMCAGMCTTCTTTATTTTAM 260TGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAACGGTTGTGATTGTCTTGAAGAAATAAAATTTGTTATGATTATTMCMTTTTTAGACATMTMCAGCGTGTGMGATACTTTTGTAGCGGTATTT 325CAATACTAATAATTGTTAAAAATCTGTATTATTGTCGCACACTTCTATGAAAACATCGCCATAAACCTATGTGCGGCAAMTTTGGAGCMTTAGCTTGACTTGGTTGAGTTAGTGGGTTGGAGGATAGA 390GGATACACGCCGTTTTAAACCTCGTTAATCGAACTGAACCAACTCAATCACCCAACCTCCTATCTGAGGGCGACACCTCGTTAGGAGGTATCMTGTGAMGTATTTGTCGTATTAGTTCTAGTATTAGT 455CTCCCGCTGTGGAGCAATCCTCCATAGTTACACTTTCATAAACAGCATAATCAAGATCATAATCA
MTTCTCGCACMTTGCTATATTAGGCTTATTCGTGGTCTMCCCCTTGTTTATGGGGGTTGGCT 520TTAAGAGCGTGTTAACGATATAATCCGAATAAGCACCAGATTGGGGAACAAATACCCCCAACCGACGTTATMGCATACTGATACGATCACACTTATTATACACCAAMGATMGGAGTATAGAGTGGM 585GCAATATTCGTATGACTATGCTAGTGTGAATAATATGTGGTTTTCTATTCCTCATATCTCACCTTTTTGATCMTCAGATTTACAAAMGCGTTGAAMTATTAGATACACTCCCACAMCCCCACAMT 650AAACTAGTTAGTCTAAATGTTTTTCGCAACTTTTATAATCTATGTGAGGGTGTTTGGGGTGTTTATGAGCTACAAAMCMGAMTACAAMCCGCATCMCAAMTMCAGAGACMTCATTAMGMT 715ACTCGATGTTTTTGTTCTTTATGTTTTGGCGTAGTTGTTTTATTGTCTCTGTTAGTAATTTCTTATACTATCAMGCATGAMTCMGAMGMGMCTAGMCCCACTCTMCCCCAAMCCCACACCA 780ATGATAGTTTCGTACTTTAGTTCTTTCTTCTTGATCTTGGGTGAGATTGGGGTTTTGGGTGTGGT
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CCGATAGTCAAGTCCTTGTTACTGTCATCCTTGTTTAATTTCTAACTGTTGTGGTGAAAACTTTCAATCAAATGTATTTACATGTATCTTAACCCTAAAAATAAGCATAACCCCCAAAAATTCCTTGTAT 1820TTAGTTTACATAAATGTACATAGAATTGGGATTTTTATTCGTATTGGGGGTTTTTAAGGAACATACCAACAAGACATTCGCATTGGAACTACTATATATCAATAGATACAGCCTAAAAAAAAGACAACTT 1885GGTTGTTCTGTAAGCGTAACCTTGATGATATATAGTTATCTATGTCGGATTTTTTTTCTGTTGAAGCTAGAAGAATTTAACCCCCCAAAATCCACCCTATCACCAACGAACCTATCAAGGAATTTGCAGA 1950CGATCTTCTTAAATTGGGGGGTTTTAGGTGGGATAGTGGTTGCTTGGATAGTTCCTTAAACGTCTATACATCGGCAAAACGATTAACATCACCAACTTCAATGTGGATCAATGCCATGAGGGAATCAGCA 2015TATGTAGCCGTTTTGCTAATTGTAGTGGTTGAAGTTACACCTAGTTACGGTACTCCCTTAGTCGTACTACCTGACAATCACTAGGATCGTGAACTGGACGTAATCGGATCTGTATTTGGTCCAGATGTGG 2080TGATGGACTGTTAGTGATCCTAGCACTTGACCTGCATTAGCCTAGACATAAACCAGGTCTACACCATAAGCCTGGGACTTCTCAAGCCTTTCATTGCTAAAGTGAGAAAATTTGGGGATTGGTTCAAGAA 2145TATTCGGACCCTGAAGAGTTCGGAAAGTAACGATTTCACTCTTTTAAACCCCTAACCAAGTTCTTCACTACAGGTGAAAAGACAGATGCATGCTGACTAAACTCATAGAAAAACTGAATCACGAAAGAAA 2210GTGATGTCCACTTTTCTGTCTACGTACGACTGATTTGAGTATCTTTTTGACTTAGTGCTTTCTTTGAATGCAAGCAGAAAACAAACACCTAAAAGAACAAGGACTAGAAAAAATCTACACTCAAAAAGAC 2275CTTACGTTCGTCTTTTGTTTGTGGATTTTCTTGTTCCTGATCTTTTTTAGATGTGAGTTTTTCTGTACGAGCAGTTAAAAGAACAGCATTTGAAAGAAATTGAAGCACTCAAAAAAGAAATCCAAAAAAC 2340ATGCTCGTCAATTTTCTTGTCGTAAACTTTCTTTAACTTCGTGAGTTTTTTCTTTAGGTTTTTTGCAAGCAAGAAACATACACGCAACCAAAAGAATGTAGCCATTTAGCGCATTCTTTTAGCCCTAATT 2405GTTCGTTCTTTGTATGTGCGTTGGTTTTCTTACATCGGTAAATCGCGTAAGAAAATCGGGATTAACATTCTTTCAATCAAAATCCGACTAATTCATCGGCTAAACGCTAAAAATCGCTTAAAACGAAAAA 2470GTAAGAAAGTTAGTTTTAGGCTGATTAAGTAGCCGATTTGCGATTTTTAGCGAATTTTGCTTTTTTACAAAGCAAAAAACTTCATTCCCCTTTTAGTCGTTAACCATTTAGCCAATCTAACTAGTTTAGC 2535ATGTTTCGTTTTTTGAAGTAAGGGGAAAATCAGCAATTGGTAAATCGGTTAGATTGATCAAATCGATCTAAAGGCGAATCTATCTTGTGTTAGACATCCAACCTTACCAAAACCGCAGAGCGAGCTTAAG 2600TAGATTTCCGCTTAGATAGAACACAATCTGTAGGTTGGAATGGTTTTGGCGTCTCGCTCGAATTCAGAGATTCAAGCGGTTTTGCACGATTGTTTGCTGCCAAGAAAACCAACAAGCGAAGTAAGGCGCA 2665TCTCTAAGTTCGCCAAAACGTGCTAACAAACGACGGTTCTTTTGGTTGTTCGCTTCATTCCGCGTTAGACAAMGCGCATCGCAGTTTGAMGCGTAGGCGTCAGMGTGGTTTGCGTTAGMTCAMCA 2730ATCTGTTTTCGCGTAGCGTCAAACTTTCGCATCCGCAGTCTTCACCAAACGCAATCTTAGTTTGTAGATAGCGCAMCCTGGCGTTAGGCTAAAAMCCCCTAAAMCTAAMCCCCAAMTATGTAGTGC 2796TCTATCGCGTTTGGACCGCAATCCGATTTTTTGGGGATTTTTGATTTTGGGGTTTTATACATCACG(2)以單鏈形式顯示的質(zhì)粒pHP3 (SEQ ID NO 3)TCTACACAATTAACAATCTTTAGCTACAATAACAGCGTGTGAAGATGCTTTCACAGCGGT 60ATTTCCTATGTGCGGCAAAATTTGGAGCAATTAACTTGACTTGGTTGGGTTAGTGGGTTG 120GAGGATAGAGAGGGCGACACCTCGTTAGGAGGTATCAATGTGAAAGTATTTGTCGTATTA 180GTTCTAGTATTAGTAATTCTCGCACAATTGCTATATTAGGCTTATTTGTGGTCTAACCCC 240TTGTTTATGGGGGTTAGATCCTTATAAGCATACTGATACGATCACACTTATTATACACCA 300
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AAAGTGTTAAAAGAATTAGATACACTCCCAAAAACCCCACAAATTGAGCTACAAAAACAA420
GAAATACAAAACCGCATCAACAAAATAACAGACACAATCATTAAAGAATTACTATCAAAA480
CATGAAATCAAAAAAGAAGAACTAGAACCCACTCTAACCCCAAAACCCACACCAACAAAA540
GAGCCACAAACCACCCCCACACCATGCAAAAATTTAGTGGTTAGCACCCCTAAAGATAAA600
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CAAACAATTTGAAATCCGCATCCATAAGCCAACACAAACTATAGAATACTTAGATGTCCA960
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TTTCTTACAACTCCAATCGCATTGAAGGAAGCGGTTTGACTTATGAACAAACCGCTCATA1560
TTTTTGACAAATCCGTTCTCATAACTGAAAAAAACACCAATATCAAACTTGATGATATTT1620
TTGAAACTATCAATCATTTTGAATGCGTGAATTACTTGCTTGAAAGCTATAAAGAACCTT1680
TGAGTTTAGAATACTTTAAGAATTTACACAAAATCTTGAAAAAGAATTGTTCTGATGAAG1740
TTATTGGTGATTTTAAAAAACGCCCTAATTTTGTAGGCAATAGCGCCACAACAAGACCCA1800
AATTAGTTGAAAGCGAATTGACAAATCTTGTGAAAAATTATCAACGCAACCTTGAAGTGA1860
GTTTGAAAAACAATATCATGCCTTTCATCATAGAAAACGAACACAAAGCCTTTTACTACA1920
GGGGCATCAAAGAATATGACAACACAAAAGGCTACTTGAAAGACACCATTTTGCAAAGTC1980
AAGACAATTTCAATGAAATGGTTAGCTATTTCTTTTCTTGAGTGAAACCGCTTATTTTTG2040
CTTGTGTGCTTTTGTTTTTTGCGTTTTTAGTTGTAGGTGGTAAGAAATATCGGTTTTTTG2100
CTTTTCGTTGGTTGTAGGCGATTTTAGATAGCAAAAAACAGCTAAAAAATCCAAGCAACC2160
TAATTGATTTCAAACCAACTTCATTTCCCTTTTAGTCGTTAGCCATTTAGCCAATCTAAC2220
TAGTTTAGCATCTAAAAGCGCATATAACTTGAGTTAGCAATCCAACCAATACTAAAACCG2280
CCTAGCGAAGCGTTAGCGAGCAAAATAAGCGGTTTTAGACCGATTGTTTGCTGACAAGCA2340
AACACCAATAAGCGAGCGTTAGCGAGCATGGACAAAAGCGCATCGCAGTTTGAAAGCGTA2400
GGCGTTAGCCGAAGCTGTTTTGCGTAAGCAAATCAAACAAGATAGCGCAAGCCGAGGTGC2460
AGCCCAAGAATTTGAATTAATCCATGCGGTGTTTAGGGCGTTTTAGCGTGATCGCTTTAT2520
TACATGTTTTAAACAGCATGCTGTTTTTTACATGTTTTACTCGCATGCGCGCGCGCTAGG2580
TATTGGTGGTTGGAATAGCCTAAATAACGCAGCTGTATGGTTTCTCATTTTTCGGTGACA2640
ATGAATAAGGGGTAGTTCTTGCGAGTCATAAGTGTAGTTCTTGCGAGTCATAAGTGTAGT2700
TCTTGCGAGTCATAAGTGTAGTTCTTGCGAGTCATAAGTGTAGTTCTCTTCACAATATCT2760
ACACAATTCACAATCTCTAGCTACAATAACAGCGTGTGAAGATGCTTTCACAGCGGTATT2820
TCCTATGTGCGGCAAAATTTGGAGCAATTAGCTTTAAAAGCTAGTGGGTTGGGAGTTTGT2880
AGCGGGTATGCACTCCGTTAGGAGGCACACCATGAAAGCATTTTTGATAGTAGTGATTTT2940
AGTGGTAATCTTGACACAGCCACTATATTAAAACCTTAGCGTTTTAATAACCCTTATAAG3000
TCCGCCAAGACTTCTTAAGGGTTTCACTCCTGTTATTATATCGTCTTTTGAAAAATAAGC3060
ATTAAAAGGCGCTTAAATGCCCATGAATACGAATTTTGAACAGCTTAGAAAACAAGAATT3120
GGAATTACGAAAATTATTAGAAGAATTAGAAACGCTCCCACAAACCCCACAAATTAAACT3180
GCAAAAACAAAAAATACAAACTTACATAGACAAGATAACACCAAGTATTTTGAGCGGTTT3240
TGATCAAAAATTCAAAGAAATTATAGAAAATCTATCAAATGAATTTGAAAAAGAAAAATC3300
CACACCACTCAAAGAGCCACAAACCACCCCCACACCATGCAAAGATTTAGTGGTTAGCAC3360
CCCTAAAGATAACACCTATACCACCTACCACAATAACGCTAATAAGGTCAATCTAGGGAA3420
ATTGAGCGAAAGGGAAGCCAATCT3444
在SEQ ID NO :4中提供克隆的另外的核苷酸序列，其包括編碼45個氨基環(huán)_的肽的
135bp片段(SEQ ID NO :5)。這種更小的45個氨基酸的肽是丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原 的免疫原性多肽。在下面用指定的具有下劃線的135個核苷酸顯示編碼所述45個氨基酸 肽的核酸序列(SEQ ID NO 5)。CATGAGCAOG AATCCTAAAC CTCAAAGAAA AACCAAACGT AACACCAACC GTOGCCCACA GGA0GTCAAGTTCCOGGGTG GOGGTCAGAT OGTTGGTGGA GTTTACTTGT TGC0G0GCAG GGGCCCTAGA TTGGGTGTGCGCGCGAOGAG GAAGACTTCC GAGCGGTCGC AACCTCGAGG TAGACGTCAG CCTATCCCCA AGGCA0GTCGGCCCGAGGGC AGGACCTGGG CTCAGCCCGG GTACCCTTGG CCCCTCTATG GCAATGAGGG TTG0GGGTGGGCGGGATGGC TCCTGTCTCC CCGTGGCTCT CGGCCTAGCT GGGGCCCCAC AGACCCCCGG CGTAGGT0GCGCAATTTGGG TAAGGTCATC GATACCCTTA CGTGOGGCTT CGCOGACCTC ATGGGGTACA TAC0GCT0GTOGGCGCCCCT CTTGGAGGCG CTGCCAGGGC CCTGGCGCAT GGCGTCCGGG TTCTGGAAGA CGG0GTGAACTATGCAACAG GGAACCTTCC TGGTTGCTCT TTCTCTATCT TCCTTCTGGC CCTGCTCTCT TGCCTGACTGTGCCCGCTTC AGCCTACCAASEQ ID NO 4AATCCTAAAC CTCAAAGAAA AACCAAACGT AACACCAACC GTCGCCCACA GGACGTCAAG TTCCCGGGTGGCGGTCAGAT CGTTGGTGGA GTTTACTTGT TGCCGCGCAG GGGCCCTAGA TTGGGTGTGC GOGOGSEQ ID NO 5將SEQ ID NO 4的核酸在SEQ ID NO 4的nt504位置(以粗體/下劃線指出，對 應(yīng)于蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸殘基168)克隆到幽門螺桿菌26695的hopE基因(SEQ ID NO :6， 在下面顯示)中，從而使表達(dá)產(chǎn)物作為HopE基因產(chǎn)物的外露表面環(huán)的部分定位。這種構(gòu)建 體，被稱為載體pTMI03.8(圖3)，在大腸桿菌的表面上進(jìn)行表達(dá)。ATGCCATAGC ATTTTTATCC ATAAGATTAG CGGATCCTAC CTGACGCTTTTTATCGCAAC TCTCTACTGT TTCTCCATAC CCGTTTTTTG GGCTAACAGGAGGAATTAAC C1 ATGGAATTTA TGAAAAAGTT TGTAGCTTTA GGGCTTCTAT CCGCAGTTTT
51AAGCTCTTCGTTGTTAGCCGAAGGTGATGGTGTTTATATAGGGACTAATT
101ATCAGCTTGGACAAGCCCGTTTGAATAGTAATATTTATAATACAGGGGAT
151TGCACAGGGAGTGTTGTAGGTTGCCCCCCAGGTCTTACCGCTAATAAGCA
201TAATCCAGGAGGCACCAATATCAATTGGCATGCTAAATACGCTAATGGGG
251CTTTGAATGGTCTTGGGTTGAATGTGGGTTATAAGAAGTTCTTCCAGTTC
301AAGTCTTTTGATATGACAAGCAAGTGGTTTGGTTTTAGAGTGTATGGGCT
351TTTTGATTATGGGCATGCCACTTTAGGCAAGCAAGTTTATGCACCTAATA
401AAATCCAGTTGGATATGGTCTCTTGGGGTGTGGGGAGCGATTTGTTAGCT
451GATATTATTGATAACGATAACGCTTCTTTTGGTATTTTTGGTGGGGTCGC
501TATCGGCGGTAACACTTGGAAAAGCTCAGCGGCAAACTATTGGAAAGAGC
551AAATCATTGAAGCTAAGGGTCCTGATGTTTGTACCCCTACTTATTGTAAC
601CCTAACGCTCCTTATAGCACCAAAACTTCAACCGTCGCTTTTCAGGTATG
651GTTGAATTTTGGGGTGAGAGCCAATATTTACAAGCATAATGGCGTAGAGT
701TTGGCGTGAGAGTGCCGCTACTCATCAACAAGTTTTTGAGTGCGGGTCCT
751AACGCTACTAATCTTTATTACCATTTGAAACGGGATTATTCGCTTTATTT
801AGGGTATAACTACACTTTTTCTCGAGATCT GCAGCTGGTA CGATATGGGA ATTCGAAGCT TTCTAGAACAAAAACTCATC TCAGAAGAGG ATCTGAATAG CGCCGTCGAC CATCATCATCATCATTGAGT TTAACGGTCT CCAGCTTGGC TGTTTTGGCG GATGAGAGAAGATTTTCAGC CTGATACAGA TTAAATC (SEQ ID NO 6)簡而言之，成功分離hopE基因的一種方法是通過使用Taq DNA聚合酶從幽門螺桿 菌22695中進(jìn)行擴(kuò)增?？梢酝ㄟ^使用DNA合成儀諸如Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc. model 332 (ABI ；Mississauga, Ontario, Canada)，BamHI ^ ^ 白勺字弓L 5' AAGGATCCGATAGGAATGTAAAGGAATGG-3' (SEQ ID NO :7)和包含 EcoRI 位點(diǎn)的下游引物 5' CCGAATTCTAAAGGCATGAACGCTTGCA-3‘ (SEQ ID NO :8)?？梢砸耘c lac 啟動子相同的方 向?qū)⒌玫降腜CR片段平端克隆到pBluescript II KS(+)中的EcoRV位點(diǎn)。接著，可以設(shè)計(jì)PCR引物以將兩個獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)克隆到hopE基因中以插 入來自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的135bp的免疫原編碼序列?？梢允褂萌缦碌倪f降擴(kuò) 增程序來進(jìn)行使用TaqDNA聚合酶的PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)PCR熱循環(huán)儀的程序?yàn)殚_始在96°C變 性4分鐘，隨后在65°C的起始退火溫度上(達(dá)90s)進(jìn)行18個循環(huán)，每個連續(xù)的循環(huán)減少 0. 5°C，在72°C延伸6分鐘，并在96°C變性1分鐘。在完成開始的18個循環(huán)后，可以通過使 用72°C的延伸和96°C的變性步驟，和55°C的不變退火溫度來進(jìn)行另外的14個擴(kuò)增循環(huán)。 接著，通過柱純化得到的擴(kuò)增子，用乙醇沉淀，并通過用DNA聚合酶的Klenow片段消化制造 平端?？梢杂孟拗菩悦赶鯬CR產(chǎn)物以去除模板DNA，將其連接于適合的載體諸如在阿 拉伯糖誘導(dǎo)啟動子控制下的PTM103. 8，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM105中?？梢栽赑CR擴(kuò)增反應(yīng)中通過使用寡核苷酸引物5' -AGATCTAAGGACGTC-3‘ (SEQ ID NO 9)加反應(yīng)測序引物鑒定重組克隆。可以對鑒定的克隆進(jìn)行測序以證實(shí)插入的限制 性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)在框中并且在hopE基因中沒有引入錯誤。接著，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)插入 來自丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的135bp的免疫原性編碼序列。
一旦產(chǎn)生載體PTMI03.8，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在37°C培養(yǎng)所述大腸桿菌。接 著，收獲細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡證實(shí)HCV插入物的表達(dá)。簡而言之，如下進(jìn)行該程序。從約20個平板收集細(xì)胞，將其重懸在在IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)中具有 50mg 的 DNase I (Boehringer Mannheim)的 20 % 蔗糖中。接 著，用French pressure cell在15，0001b/in2破壞細(xì)胞。將破裂的細(xì)胞覆蓋在在IOmM Tris-HCl (pH8. 0)中的Iml的70%和6ml的70%蔗糖的蔗糖分級梯度上。收集外膜級分， 在150，OOOXg上沉淀，并將所述沉淀物重懸在100 μ 1的蒸餾水中。或者，可以將來自500ml的對數(shù)期培養(yǎng)物的外膜溶解在IOmM Tris-HCl (pH 8. 0)-3% η-辛基-聚氧化乙烯中，在23°C溫育1小時，并在173，000X g離心30分鐘。將 沉淀物重懸在IOmM Tris-HCl-3% η-辛基-聚氧化乙烯-5mMEDTA(pH8. 0)中，在23°C溫 育1小時，并在173，OOOXg離心30分鐘，收集上清液。蛋白質(zhì)免疫印跡法指示在第二個 溶解步驟的上清液中的HCV/hopE的存在。將包含HCV/hopE的上清液與等體積的0. 125M Tris-HCKpH 6. 8),4% (wt/vol)十二烷基硫酸鈉(SDS)，和 20% (vol/vol)甘油混合并 進(jìn)行SDS-12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。如果需要，可以將HCV/hopE條帶從凝膠的 未染色部分切除并在4°C過夜洗脫到IOmM Tris-HCl (pH8.0)，ImMEDTA(pH8.0)，和IOOmM NaCl中。接著，可以在SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行洗脫上清液以檢查純度，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn) 行蛋白質(zhì)免疫印跡法。例如，可以以15yg/泳道的濃度上載分離的外膜。接著，在不連續(xù) 的12%聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE進(jìn)行電泳。接著，用考馬斯亮藍(lán)對蛋白質(zhì)進(jìn)行染 色。對于蛋白質(zhì)免疫印跡法，可以將未染色的凝膠電印跡到Immobilon-P膜(Millipore， Bedford, Mass.)上。在23°C，用在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的3%牛血清白蛋白(BSA ； Boehringer Mannheim) -0. 1% Tween 20 (Sigma)封閉 2 小時后，接著，在 37°C，將所述膜與 在BSA-0. 05%吐溫20中的1/10，000稀釋的抗-HCV兔抗血清一起在PBS中溫育1小時。 接著，所述膜用PBS洗滌并與1/5，000稀釋的堿性磷酸酶綴合的二抗(Bio-Rad，Richmond， Calif.) 一起在37 °C溫育1小時。用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP, Calbiochem, LaJolla, Calif.)和氮藍(lán)四唑(NBT，Sigma)檢測結(jié)合的抗體。實(shí)施例2進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)的表達(dá)載體和抗原的選擇因?yàn)镠opE是幽門螺桿菌的天然蛋白質(zhì)并且為該生物所耐受，因此可以形成用于 在幽門螺桿菌中表達(dá)外源抗原或其它異源基因產(chǎn)物的構(gòu)建體。如上述可以容易開發(fā)的其它 的幽門螺桿菌/大腸桿菌穿梭載體包括，例如，包含兩個質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的載體和適合于每 個宿主的標(biāo)記。標(biāo)記可能包括氯霉素/卡那霉素抗性基因以及可以由大腸桿菌和幽門螺桿 菌轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)二者識別的啟動子?？梢酝ㄟ^使用許多大腸桿菌質(zhì)粒(例如pBR32》來滿足對于在大腸桿菌中復(fù)制的 要求。構(gòu)建的穿梭載體可以在大腸桿菌和幽門螺桿菌二者中進(jìn)行復(fù)制的體外測試，并且 與在文獻(xiàn)中所述的現(xiàn)存的穿梭質(zhì)粒進(jìn)行比較。理想地，待表達(dá)的抗原或其它異源基因產(chǎn)物的選擇將是對于幽門螺桿菌和大腸桿 菌無毒并且在遞送到哺乳動物的選定位點(diǎn)時，具有高度免疫原性(或具有另外的理想的性 質(zhì))的抗原和其它異源基因產(chǎn)物。在用于哺乳動物免疫的被表達(dá)抗原的情況中，這樣的位 點(diǎn)可以是黏膜位點(diǎn)。
如在實(shí)施例1中所述，可以在大腸桿菌的表面表達(dá)hopE/HCV核心抗原融合蛋白。 PTMI03. 8的產(chǎn)物(圖幻優(yōu)選地靶向幽門螺桿菌外膜，從而使其在黏膜環(huán)境中顯示HCV核心 抗原。已經(jīng)對作為人抗原的破傷風(fēng)類毒素(TT)進(jìn)行了廣泛的研究，并且對針對其的免 疫應(yīng)答進(jìn)行了特征鑒定。當(dāng)在細(xì)菌孢子的表面上顯示，通過口服或鼻內(nèi)施用時，TT激發(fā)良 好的黏膜免疫應(yīng)答(Due & Cutting, 2003, ExpertOpinion Biol Ther, 3 (8), 1263-70) 所 述破傷風(fēng)毒素C片段可以融合到上述的hopE基因產(chǎn)物中或被改造以包含膜固著點(diǎn)和細(xì)胞 表面靶序列。該系統(tǒng)的優(yōu)勢是存在充分表征的鼠模型來評價接種疫苗程序的有效性，而在 HCV的情況中，已知的鼠模型典型地依賴于免疫缺陷型小鼠。已經(jīng)顯示用巨細(xì)胞病毒(CMV) 的gB蛋白質(zhì)針對致死劑量的表達(dá)gB抗原的被改造的牛痘病毒來免疫小鼠。因此，可以使 用在實(shí)施例1中所述的方法構(gòu)建包含取代HCV抗原的gB抗原的穿梭載體諸如本文所述的 那些?？梢栽诖┧筝d體中使用許多啟動子。理想地，所用的啟動子可通過螺桿菌的天 然體內(nèi)建群機(jī)制或通過用無毒的食品或可以食用的化學(xué)品誘導(dǎo)來進(jìn)行誘導(dǎo)。例如來自幽 門螺桿菌組氨酸激酶HP165，被報道通過酸性pH進(jìn)行誘導(dǎo)，并且可以作為涉及胃黏膜建群 (colonization)的毒力因子的啟動子是一種這樣的啟動子。這種啟動子的益處是可以用僅 在暴露于胃黏膜的酸性環(huán)境時才表達(dá)的外源抗原來體外制備構(gòu)建體。其它的啟動子包括在pTMI03. 8中所用的啟動子和FlaB sigma M啟動子 (Josenhans 等，1998，F(xiàn)EMS Microbial Lett.，161 (2)，263-73)，在許多組成型和可誘導(dǎo)的 大腸桿菌系統(tǒng)中使用的廣泛研究的T7啟動子和在厭氧環(huán)境中誘導(dǎo)的沙門氏菌的nir B啟 動子(Chatfield 等，1992，Biotechnology，10(8) :888-92)?？梢岳?Angelini 等(2004) (Plasmid,51 :101-107)發(fā)展的系統(tǒng)測試這些啟動子的任一種在幽門螺桿菌中發(fā)揮作用的 能力，所述系統(tǒng)使用CAT和GFP報告基因作為幽門螺桿菌質(zhì)粒載體中啟動子活性的指示。表達(dá)的靶位點(diǎn)將依賴于所用的抗原或其它基因產(chǎn)物。最初的研究集中在HopE蛋 白和融合多肽上，其將表達(dá)的多肽(例如，抗原)靶向到幽門螺桿菌的細(xì)胞表面上。質(zhì)粒穩(wěn)定性也是非常重要的，盡管抗生素抗性基因作為質(zhì)粒維持的選擇性決定子 的用途可以用于體外，在體內(nèi)則實(shí)用性較弱。一種備選方案為平衡致死系統(tǒng)，例如，在沙門 氏菌屬中失活使用的asd基。天然存在于幽門螺桿菌中的asd基因編碼天冬氨酸酯-半醛 脫氫酶(diaminopimelic酸(DAP)的生物合成途徑中的酶，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁糖的基 本組分)。在DAP缺失的條件下，asd突變體進(jìn)行裂解。由于DAP并不存在于哺乳動物組織 中，這種平衡致死系統(tǒng)要求所有存活的幽門螺桿菌攜帶包含重組asd基因的質(zhì)粒。為了使用asd基因系統(tǒng)，利用標(biāo)準(zhǔn)基因敲除方案滅活asd基因的基因組拷貝。隨 后這種幽門螺桿菌菌株將只能在提供DAP或具有包含asd基因的質(zhì)粒時生長?？梢杂糜陬愃颇康牡钠渌到y(tǒng)包括大腸桿菌腸毒素(enterotoxin)或霍亂毒素 (cholera toxin) (CT)作為黏膜佐劑。還可以使用佐劑強(qiáng)化黏膜免疫反應(yīng)。兩種這類佐劑 為CT和大腸桿菌腸毒素(LT)，其中將表達(dá)的抗原融合到LTB和CTB突變體上，其保持它們 的強(qiáng)效黏膜佐劑特性但具有顯著減弱的毒性。實(shí)施例3毒力，LD^n如在實(shí)施例1和2中所述，基于螺桿菌的載體諸如pHP3和pHPl能夠提供針對在哺乳動物諸如小鼠或人中的感染的保護(hù)。在本實(shí)施例中，使用小鼠模型來證實(shí)使用基于螺 桿菌的系統(tǒng)將藥理學(xué)活性目標(biāo)分子遞送給哺乳動物包括人的應(yīng)用性。使用鼠模型來證實(shí)幽 門螺桿菌的轉(zhuǎn)基因菌株體內(nèi)激發(fā)針對表達(dá)的表面抗原的血清學(xué)反應(yīng)的活性。用野生型幽門螺桿菌來感染小鼠，同時如在實(shí)施例2中所述用溫度敏感性的幽門 螺桿菌管飼接種其它的小鼠。按照在表1中顯示的計(jì)劃表，對來自對照和測試動物的血清 測試抗體，并且在處死的動物上進(jìn)行胃組織學(xué)研究。還可以使用小鼠尿素呼吸測試。如在表2中顯示，觀察到毒力減少了 50% (從75%到40% )。特異性抗體滴度在 基線上增加4倍，顯示血清學(xué)反應(yīng)。在基線，12，M，48周采血清樣品。在這些時間，處死10， 10和20只動物并且進(jìn)行胃的組織學(xué)研究。^ 1體內(nèi)研究
權(quán)利要求
1.組合物，其包括含有核酸的螺桿菌屬細(xì)胞，所述核酸包含(a)至少一種編碼與分泌信號肽連接的非螺桿菌的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的非螺桿菌序 列；和(b)能控制所述非螺桿菌序列在所述螺桿菌屬細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列；其中所述螺桿 菌屬細(xì)胞不是DapE突變菌株。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述螺桿菌屬的細(xì)菌是幽門螺桿菌。
3.組合物，其包括含有核酸的幽門螺桿菌細(xì)胞，所述核酸包含(a)編碼包含非螺桿菌的藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的融合蛋白的序列，其可操作連接于(b)誘導(dǎo)型啟動子序列；其中所述幽門螺桿菌細(xì)胞不是DapE突變菌株。
4.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述序列在質(zhì)粒載體中。
5.藥物組合物，其包含作為活性成分的權(quán)利要求4的組合物，和可藥用的稀釋劑、載 體、佐劑或它們的組合。
6.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述幽門螺桿菌還包含編碼免疫調(diào)節(jié)多肽的第二核 酸分子。
7.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述幽門螺桿菌是菌株沈695。
8.按照權(quán)利要求1的組合物，其還包括佐劑。
9.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述螺桿菌屬細(xì)胞是減毒的螺桿菌屬細(xì)胞。
10.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述螺桿菌屬細(xì)胞是非侵入性的。
11.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述螺桿菌屬細(xì)胞是非致病性的。
12.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)序列是誘導(dǎo)型啟動子。
13.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)序列是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動子。
14.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)序列是來自幽門螺桿菌組氨酸激酶HP165 的啟動子。
15.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)序列是FlaBsigma討啟動子。
16.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)序列是T7啟動子。
17.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)序列是沙門氏菌的nir啟動子。
18.藥物組合物，其包含作為活性成分的權(quán)利要求27的組合物，和可藥用的稀釋劑、載 體、佐劑或它們的組合。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述幽門螺桿菌是菌株沈695。
20.按照權(quán)利要求1的組合物，其還包括佐劑。
21.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述幽門螺桿菌細(xì)胞是減毒的幽門螺桿菌細(xì)胞。
22.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述幽門螺桿菌細(xì)胞是非侵入性的。
23.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述幽門螺桿菌細(xì)胞是非致病性的。
24.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動子。
25.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是來自幽門螺桿菌組氨酸激酶 HP165的啟動子。
26.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是沙門氏菌nir啟動子。
27.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述融合蛋白包含螺桿菌屬序列。
28.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述融合蛋白包含表層蛋白質(zhì)序列。
29.按照權(quán)利要求28的組合物，其中所述表層蛋白質(zhì)是HopE。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌遞送系統(tǒng)，更具體地，本發(fā)明公開了包含藥理學(xué)活性目標(biāo)分子的基于螺桿菌的制劑，以及制備和使用所述制劑的方法。具體而言，提供了幽門螺桿菌載體，載體質(zhì)粒和重組細(xì)胞，其包括有效用于針對疾病的治療性處理和/或接種疫苗的藥理學(xué)目標(biāo)分子的序列。在黏膜表面諸如胃黏膜或鼻膜提供所述藥理學(xué)活性分子的遞送，從而提供藥理學(xué)活性劑的有效和持續(xù)的遞送。還提供載體和穿梭載體構(gòu)建體。
文檔編號A61K48/00GK102078622SQ20101051082
公開日2011年6月1日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者巴里·J·馬沙爾 申請人:巴里.J.馬沙爾