專利名稱：一種具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮制備方法及其含量測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物藥提取的具有抗腫瘤活性的總黃酮，具體涉及翠綠針毛蕨總 黃酮及其制備方法，以及該總黃酮的含量測定方法。
背景技術：
黃酮類化合物廣泛存在于自然界，是一類重要的天然有機化合物，一般分為黃 酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、花色素、查耳酮、雙黃酮、異黃酮等。黃酮類化合物生物 活性多種多樣，如對心血管的作用，抗病毒作用，抗炎作用等，其中黃酮類化合物的抗腫瘤 作用日益受到廣泛關注。惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，藥物治療在惡 性腫瘤療法中占有重要的地位，其中從中草藥中發(fā)現(xiàn)新的具有抗腫瘤活性的物質是一個重 要的研究方向。翠綠針毛蕨(Macrothelypteris viridifrons (Tagawa) Ching)為金星蕨科 (Thelypteridaceae)針毛蕨屬(Macrothelypteris)植物，又名假普通針毛蕨。植株高60 1 IOcm,根狀莖短而直立，先端被紅棕色，具毛的披針形鱗片。葉簇生；葉柄長30 50cm，禾 稈色，基部被灰白色的短針毛，向上光滑；葉片幾與葉柄等長或略長，四回羽裂；羽片10 12對，互生或近對生，斜上，柄長11. 5 5cm，基部一對最大，長圓批針形，漸尖頭，基部略變 狹，圓截形，第二對起向上的羽片和基部一對同行，但基部不變狹，漸次縮小，具短柄，三回 羽裂；一回小羽片10 15對，互生，平展，二回羽裂；葉脈可見，側脈單一，斜上，每裂片2 3對。葉為薄草質，干后草綠色，下面被較多的、長約1mm，開展的針狀毛，上面沿小羽軸有較 多的短針毛，葉軸禾稈色，下面光滑，有光澤。孢子囊群小，圓形，每裂片1 2枚，生于基部 側脈的近頂端；囊群蓋小，圓腎形，綠色，膜質，背面略有1 2根長柔毛，成熟后不見。孢子 圓腎形，周壁表面具較烯的小刺狀和小穴狀紋飾。廣泛分布于長江以南各省，常見。本課題 組通過對翠綠針毛蕨的化學成分進行研究得知該植物中含有大量類黃酮化合物，由于該類 黃酮化合物有著非苯環(huán)的特殊B環(huán)結構，常用的的亞硝酸鈉_硝酸鋁等比色法不適用于該 類黃酮的含量測定。本發(fā)明涉及的翠綠針毛蕨總黃酮是從金星蕨科針毛蕨屬植物翠綠針毛蕨 (Macrothelypteris viridifrons (Tagawa) Ching)的干燥全草中提取純化得到的抗腫瘤有 效部位，試驗證明該有效部位對各種腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用，體現(xiàn)了明顯的抗腫瘤 作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤作用的翠綠針毛蕨總黃酮及其制備方法；本發(fā)明的另一個目的是提供準確簡便的翠綠針毛蕨總黃酮含量測定方法。實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮，是以翠綠針毛蕨干燥全草為
4原料，按以下方法提取得到的產(chǎn)物a.以翠綠針毛蕨干燥全草為原料，將其洗凈，晾干，粉碎，過40目篩，得翠綠針毛 蕨原料粗粉；b.將翠綠針毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇、60 90%含水甲醇 為提取溶劑，加熱至70 90°C提取，所用有機溶劑量與翠綠針毛蕨原料粗粉重量比為6 15 1，重復提取1 3次，除去藥渣，濾液在減壓條件下濃縮干燥得翠綠針毛蕨浸膏；C.將所得翠綠針毛蕨浸膏超聲溶解于蒸餾水中，用3 5倍量的石油醚萃取2 3次，合并水層，水層以堿溶液調PH值至5 7，優(yōu)選PH值為6，過濾，得翠綠針毛蕨濾液；d.將所得翠綠針毛蕨濾液以酸溶液調PH值至1 2，放置于4°C冰箱下過夜，次 日過濾，濾液放置待用，所得沉淀用蒸餾水洗至中性，真空干燥即得翠綠針毛蕨堿提酸沉黃 酮；e.將上述步驟d中所述的濾液用大孔樹脂吸附，以蒸餾水洗脫水溶性物質，再以 50 70%的含水乙醇進行洗脫，洗脫液在減壓條件下回收溶劑，濃縮干燥，即得翠綠針毛 蕨大孔樹脂黃酮；f.合并上述翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮和大孔樹脂黃酮，即得翠綠針毛蕨總黃酮。上述步驟c中所述的用以調PH值的堿溶液是氫氧化鈉或氨水。上述步驟d中所述的用以調PH值的酸溶液是濃鹽酸或濃硫酸。本發(fā)明制備翠綠針毛蕨總黃酮的方法簡便，且重現(xiàn)性好，產(chǎn)品得率高。本發(fā)明提供的具有抗腫瘤作用的翠綠針毛蕨總黃酮的藥效如下(1)體外抗腫瘤活性將本發(fā)明提取純化所得翠綠針毛蕨提取物配制成四個濃度 梯度的含藥培養(yǎng)基，以相同的方法配制陽性對照藥五氟尿嘧啶，選用傳代后處于對數(shù)生長 期的H印G2、Tca-8113、MCF-7、M5、K562腫瘤細胞株，采用MTT法對翠綠針毛蕨總黃酮進 行體外抗腫瘤活性研究，結果顯示翠綠針毛蕨提取物對各種腫瘤細胞均顯示較強的細胞毒 性，且毒性與劑量成正比，IC50值均與五氟尿嘧啶相當。(2)體內抗腫瘤活性采用移植腫瘤S18tl荷瘤小鼠，以本發(fā)明提取純化所得翠綠針 毛蕨總黃酮按一定劑量灌胃給藥，陽性對照組為五氟尿嘧啶，陰性對照組為生理鹽水等容 量給藥，每日2次，連用10天，結果顯示翠綠針毛蕨提取物具有明顯的抑制腫瘤作用，且抑 瘤率與給藥劑量成正比。實驗證明本發(fā)明提供的翠綠針毛蕨總黃酮具有較強的體內外抗腫瘤作用。因翠綠針毛蕨中所含黃酮有著非苯環(huán)的特殊B環(huán)結構(類黃酮)，不具有黃酮的特 征顯色反應，本發(fā)明提供的翠綠針毛蕨總黃酮含量測定方法由以下方式來實現(xiàn)(1)將純度大于98%的原芹菜素(該化合物有著非苯環(huán)的特殊B環(huán)結構)做為對 照品，用甲醇配制成梯度的標準溶液，在262nm波長下，分別測定標準溶液的吸光度值，根 據(jù)吸光度值和對應的濃度建立標準曲線；(2)將翠綠針毛蕨提取物用甲醇溶解配制成待測溶液，在262nm波長下測吸光度， 根據(jù)所得吸光度值由標準曲線計算出待測溶液濃度，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)換算成翠綠針毛蕨 提取物中總黃酮的含量。本發(fā)明操作簡單，穩(wěn)定性、重復性好，易于控制。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮的制備(1)原料的制備以翠綠針毛蕨(2009年10月采白江西九江，經(jīng)九江森林植物標本 館譚策銘研究員鑒定為蕨類植物門金星蕨科針毛蕨屬植物翠綠針毛蕨(Macrothelypteris viridifrons(Tagawa)Ching)的干燥全草為原料，將其洗凈，晾干，粉碎，過40目篩，得翠綠 針毛蕨原料粗粉待用；(2)溶劑提取將翠綠針毛蕨原料粗粉用有機溶劑乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇 或60 90%含水甲醇為提取，加熱至70 90°C提取，所用溶劑量與翠綠針毛蕨粗粉重量 比為6 15 1，重復提取1 3次，合并濾液，除去藥渣，濾液在減壓條件下濃縮干燥得翠 綠針毛蕨浸膏；(3)堿溶將上述翠綠針毛蕨浸膏，超聲溶解于蒸餾水中，用3 5倍量的石油醚 萃取2 3次，合并水層，水層以堿溶液(如氫氧化鈉，氨水)調PH值至5 7，以6最佳， 沉淀濾除，得翠綠針毛蕨濾液；(5)酸沉將上述翠綠針毛蕨濾液以酸溶液(如濃鹽酸)調PH值至1 2，放置于 4°C冰箱下過夜，次日過濾，濾液留著待用，沉淀用蒸餾水洗至中性，真空干燥即得翠綠針毛 蕨堿提酸沉黃酮；(6)將上述酸沉后濾液選取幾種不同極性的大孔樹脂做靜態(tài)吸附實驗，得到純化 翠綠針毛蕨黃酮的最優(yōu)樹脂，以最優(yōu)樹脂做動態(tài)吸附試驗，單獨考察乙醇洗脫劑濃度，上樣 液PH值，上樣液濃度，飽和上樣量，并正交設計考察吸附流速，水洗體積，洗脫劑體積和洗 脫流速，根據(jù)本發(fā)明的總黃酮含量測定方法計算得率和純度，得出最佳翠綠針毛蕨黃酮純 化工藝；(7)依據(jù)上述翠綠針毛蕨黃酮大孔樹脂純化工藝將翠綠針毛蕨酸沉后濾液進行 大孔樹脂交換，洗脫液在減壓條件下回收乙醇溶劑，濃縮干燥即得翠綠針毛蕨大孔樹脂黃 酮；(8)合并上述所得翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮和大孔樹脂黃酮，即得翠綠針毛蕨總 黃酮，含量為50 60% ；實施例2取翠綠針毛蕨干燥全草，粉碎，過蹄，加入10倍體積的70 %乙醇，90°C回流提取 60min。重復提取兩次，合并提取液，減壓濃縮回收溶劑，真空干燥得總浸膏。稱取一定量 總浸膏加蒸餾水超聲溶解，用三倍量的石油醚萃取2次，合并水層，水層用15%氫氧化鈉調 PH至6，過濾，沉淀濾除，濾液以濃鹽酸調PH值至1，放置于4°C冰箱過夜，次日過濾，所得沉 淀用蒸餾水洗至中性，真空干燥即得翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮。剩余濾液以氫氧化鈉調PH 至4后，進行大孔樹脂吸附。按照飽和吸附量140mg/g干樹脂，稱取一定量HPD500樹脂，以 上樣液濃度為3. 73mg/ml，吸附流速為lml/min，水洗體積為5倍柱體積，洗脫劑乙醇濃度為 50%，洗脫劑體積為3倍柱體積，洗脫流速為lml/min進行總黃酮的純化，合并洗脫液，減壓 濃縮，真空干燥即得翠綠針毛蕨大孔樹黃酮，合并翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮和大孔樹脂黃 酮，所得翠綠針毛蕨總黃酮純度為54%。實施例3
本發(fā)明方法翠綠針毛蕨總黃酮對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用傳代后處于對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF-7吹打分散于含10%滅活小牛血清 的培養(yǎng)基中，倒置顯微鏡下用細胞計數(shù)板測定濃度并調整到2X 105cellS/mL。在96孔板中 每孔加入該細胞懸液100μ L，于37°C 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入滅菌的含有樣品 的培養(yǎng)液溶液100 μ L，使樣品終濃度分別為0. 1，1. 0，10. 0，100. 0 μ g/mL。繼續(xù)于37°C 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。之后每孔加入10 μ L5mg/mL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸除 細胞液，每孔加入DMSO 200 μ L以溶解生成的甲臢，并在細胞板振蕩儀上振蕩IOmin后用酶 標儀在570nm處測定OD值，計算IC5tl值。結果顯示，抑制率與藥物濃度呈正比，總黃酮的 IC50值(3. 75士0. 23 μ g/mL)低于五氟尿嘧啶(6. 66士0. 16 μ g/mL)，表明翠綠針毛蕨總黃酮 對人乳腺癌細胞MCF-7有明顯的抑制作用。實施例3翠綠針毛蕨總黃酮對人肝癌細胞Hep G2的抑制作用采用同實施例2類似的方法，進行翠綠針毛蕨總黃酮對人肝癌細胞Hep G2的抑制 作用研究，結果顯示，總黃酮IC5tl值(4. 11 士 0. 14 μ g/mL)低于五氟尿嘧啶(6. 08 士 0. 27 μ g/ mL)，表明翠綠針毛蕨總黃酮對人肝癌細胞H印G2同樣具有很強的抑制作用。
權利要求
一種具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮的含量測定方法，包括以下步驟(1)將純度在98％以上的原芹菜素做為對照品，用甲醇配制成梯度的標準溶液，在262nm波長下，分別測定標準溶液的吸光度值，根據(jù)吸光度值和對應的濃度建立標準曲線；(2)將翠綠針毛蕨提取物用甲醇溶解配制成待測溶液，在262nm波長下測吸光度，根據(jù)所得吸光度值由標準曲線計算出待測溶液濃度，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)換算成翠綠針毛蕨提取物中總黃酮的含量。
2.一種具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮提取工藝，包括如下步驟a.以翠綠針毛蕨干燥全草為原料，將其洗凈，晾干，粉碎，過40目篩，得翠綠針毛蕨原 料粗粉；b.將翠綠針毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇、60 90%含水甲醇為 提取溶劑，加熱至70 90°C提取，所用有機溶劑量與翠綠針毛蕨原料粗粉重量比為6 15 1，重復提取1 3次，除去藥渣，濾液在減壓條件下濃縮干燥得翠綠針毛蕨浸膏；c.將所得翠綠針毛蕨浸膏超聲溶解于蒸餾水中，用3 5倍量的石油醚萃取2 3次， 合并水層，水層以堿溶液調PH值至5 7，優(yōu)選PH值為6，過濾，得翠綠針毛蕨濾液；d.將所得翠綠針毛蕨濾液以酸溶液調PH值至1 2，放置于4°C冰箱下過夜，次日過 濾，濾液放置待用，所得沉淀用蒸餾水洗至中性，真空干燥即得翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮；e.將上述步驟d中所述的濾液用大孔樹脂吸附，以蒸餾水洗脫水溶性物質，再以50 70%的含水乙醇進行洗脫，洗脫液在減壓條件下回收溶劑，濃縮干燥，即得翠綠針毛蕨大孔 樹脂黃酮；f.合并上述翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮和大孔樹脂黃酮，即得翠綠針毛蕨總黃酮。
3.根據(jù)權利要求2所述的提取工藝，其特征在于，步驟c中所述的用以調PH值的堿溶 液是氫氧化鈉或氨水。
4.根據(jù)權利要求2所述的提取工藝，其特征在于，步驟d中所述的用以調PH值的酸溶 液是濃鹽酸或濃硫酸。
5.一種具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮，其特征在于，它是以翠綠針毛蕨干燥全 草為原料，按以下方法提取得到的產(chǎn)物a.以翠綠針毛蕨干燥全草為原料，將其洗凈，晾干，粉碎，過40目篩，得翠綠針毛蕨原 料粗粉；b.將翠綠針毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇、60 90%含水甲醇為 提取溶劑，加熱至70 90°C提取，所用有機溶劑量與翠綠針毛蕨原料粗粉重量比為6 15 1，重復提取1 3次，除去藥渣，濾液在減壓條件下濃縮干燥得翠綠針毛蕨浸膏；c.將所得翠綠針毛蕨浸膏超聲溶解于蒸餾水中，用3 5倍量的石油醚萃取2 3次， 合并水層，水層以堿溶液調PH值至5 7，優(yōu)選PH值為6，過濾，得翠綠針毛蕨濾液；d.將所得翠綠針毛蕨濾液以酸溶液調PH值至1 2，放置于4°C冰箱下過夜，次日過 濾，濾液放置待用，所得沉淀用蒸餾水洗至中性，真空干燥即得翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮；e.將上述步驟d中所述的濾液用大孔樹脂吸附，以蒸餾水洗脫水溶性物質，再以50 70%的含水乙醇進行洗脫，洗脫液在減壓條件下回收溶劑，濃縮干燥，即得翠綠針毛蕨大孔 樹脂黃酮；f.合并上述翠綠針毛蕨堿提酸沉黃酮和大孔樹脂黃酮，即得翠綠針毛蕨總黃酮。
6.根據(jù)權利要求5所述的具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮，其特征在于，步驟c中 所述的用以調ra值的堿溶液是氫氧化鈉或氨水。
7.根據(jù)權利要求5所述的具有抗腫瘤活性的翠綠針毛蕨總黃酮，其特征在于，步驟d中 所述的用以調ra值的酸溶液是濃鹽酸或濃硫酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤作用的翠綠針毛蕨總黃酮及其制備方法，同時還提供了翠綠針毛蕨總黃酮含量測定方法。本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性的總黃酮是從植物翠綠針毛蕨干燥全草經(jīng)溶劑提取、堿提酸沉處理及大孔樹脂純化得到，其主要成分是類黃酮化合物，有著非苯環(huán)的特殊B環(huán)結構，常規(guī)的總黃酮含量測定方法不適用，本發(fā)明制定了簡便易行的翠綠針毛蕨總黃酮含量測定方法，并優(yōu)化了翠綠針毛蕨總黃酮的提取純化工藝，最終得到的翠綠針毛蕨總黃酮具有明顯的抗腫瘤活性。本發(fā)明提供的翠綠針毛蕨總黃酮含量測定方法有利于翠綠針毛蕨資源的質量控制和有效利用，應用前景廣闊。
文檔編號A61P35/00GK101966207SQ201010518809
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權日2010年10月25日
發(fā)明者吳光華, 熊朝梅, 阮金蘭, 魏安華 申請人:華中科技大學