專利名稱：一種干擾HBV基因的siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干擾HBV基因的siRNA分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝炎，即肝臟炎癥，有多種致病因素-如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、化學(xué)毒物、藥物和毒 物、酒精等，侵害肝臟，使得肝臟的細(xì)胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，它可以引起身體的 一系列不適癥狀，以及肝功能指標(biāo)的異常。肝炎多數(shù)情況下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、 戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染導(dǎo)致的乙型肝炎，是一種嚴(yán)重威脅 全球人類健康的的傳染性疾病，也是最嚴(yán)重類型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死 于肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)極高。HBV屬嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，全基因組長(zhǎng)約3. 2kb，為部分雙鏈環(huán)狀 DNA。其基因組共有四個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼蛋白包括表面抗原 (S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全世界估計(jì)有20億人感染HBV，其中有3. 5億以上的人為慢 性乙肝感染者，估計(jì)每年有60萬人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，癥狀可 持續(xù)數(shù)周，包括皮膚和眼睛發(fā)黃(黃疸)，尿色深，極度疲勞，惡心，嘔吐和腹痛?；颊呖赡苄?要數(shù)月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也會(huì)造成慢性肝臟感染，以后可能發(fā)展成肝硬化 或肝癌。乙型肝炎病毒通過與受感染者的血液或其他體液(比如，精液和陰道分泌物)接 觸而在人與人之間傳播，傳播途徑與人類免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒 的傳染性比艾滋病毒強(qiáng)50-100倍，乙型肝炎病毒在體外可存活至少7天以上。在此期間， 如果病毒進(jìn)入未感染者的身體，它依然可造成感染。病毒潛伏期平均達(dá)90天，但也可能為 大約30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可發(fā)現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間差別很大。目前主要是通過嬰兒接種乙型肝炎疫苗來預(yù)防乙型肝炎的發(fā)生，但盡管如此，人 群HBV流行率仍然很高。目前主要治療慢性乙型肝炎的方法僅局限于抑制患者體內(nèi)病毒基 因的表達(dá)和復(fù)制。如口服核苷類抗病毒藥-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的復(fù)制，但是停 藥后復(fù)發(fā)率高，長(zhǎng)期應(yīng)用則可導(dǎo)致病毒變異，在用藥6個(gè)月后發(fā)生由病毒聚合酶基因發(fā)生 變異引起的耐藥性，使得臨床抗病毒治療面臨極大的挑戰(zhàn)。近幾年來，隨著RNA干擾(RNAi)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為疾病尤其是癌癥開辟了 全新的治療途徑，為科研工作者提供了一個(gè)全新的基因治療方法。該技術(shù)通過用小 干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾特定靶基因的表達(dá)，來達(dá)到治療疾病 的目的，是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。其作用機(jī)制是核糖核 酸酶III家族的Dicer酶，與dsRNA結(jié)合，將其剪切成21_23nt及3’端突出的siRNA，隨后 siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合到靶信使RNA(mRNA)上并將其切 斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)。RNAi已作為一種簡(jiǎn)單有效的基因 敲除的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。本發(fā)明提供了一種用RNAi技術(shù)來抗HBV的方法。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，用靶向至 HBV基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行干擾，從而有效抑制HBV的蛋白表達(dá) 和病毒復(fù)制，具有特異性強(qiáng)、高效、副作用小、可持續(xù)用藥的優(yōu)勢(shì)，且能彌補(bǔ)目前治療乙型肝 炎藥物的不足，在不久的將來可能成為一種新的治療乙型肝炎的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)技術(shù)篩選出的高效靶向HBV 基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成正義鏈5，-⑶UGGAGGACAGGAGGUUGGNN-3，(SEQID NO 3)反義鏈5，-CCAACCUCCU⑶CCUCCAACNN-3，(SEQID NO 4)其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。換言之，該雙鏈siRNA分子的主干序列為正義鏈5，-⑶UGGAGGACAGGAGGUUGG-3，(SEQID NO 5)反義鏈5，-CCAACCUCCU⑶CCUCCAAC-3，(SEQID NO 6)在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述序列中3，端的“NN”是兩個(gè)脫氧胸腺嘧啶dTdT。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗HBV藥物中的應(yīng)用。體外實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的 mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，抑制HBV蛋白質(zhì)翻譯和病毒復(fù)制，達(dá)到抗 HBV的治療目的。


圖1是抽提的HBV基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。M為lkb plus DNA Ladder (標(biāo) 準(zhǔn)參照)。圖2A HBV聚合酶片段1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖，制備得到的DNA片段大小為 1625bp。圖2B是HBV聚合酶片段2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖，制備得到的DNA片段大小為 874bp。M 為 lkb plus DNA Ladder (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖3是siRNA分子庫(kù)構(gòu)建流程示意圖。圖4是TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板_H1表達(dá)框結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是PCR制備的TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-HI表達(dá)框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。 圖中，M 為 lkb plus DNA Ladder (標(biāo)準(zhǔn)參照)；1 為 HBV-22 ；2 為 HBV-676 ；3 為 HBV-877 ；4 為 HBV-638 ；5 為 HBV-1003 ；6 為 HBV-748 ；7 為 HBV-182 ；8 為 HBV-261 ；9 為陰性對(duì)照。圖6是表達(dá)框轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)量柱形圖， 縱坐標(biāo)表示HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示處理實(shí)驗(yàn)組，"Negative Control” 為陰性對(duì)照組。圖7是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBV聚合酶基因mRNA 表達(dá)量柱形圖，縱坐標(biāo)表示HBV聚合酶基因mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示處理實(shí)驗(yàn)組，
4“NegativeContro 1 ”為陰性對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中諸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等術(shù)語可以互換，其表示的 意思和范圍相同。其中，siRNA序列可以是單鏈結(jié)構(gòu)，也可以是雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的siRNA分子來源于針對(duì)HBV聚合酶基因的功能保守區(qū)而制備的siRNA分 子庫(kù)，本發(fā)明所用siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)技術(shù)是百奧邁科生物技術(shù)有限公司的專利技術(shù)(中 國(guó)發(fā)明專利號(hào)為ZL 200710024217. 6，專利名稱PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)制備 方法)，其優(yōu)點(diǎn)在于所制備得到的siRNA隨機(jī)分布于HBV聚合酶基因區(qū)段，長(zhǎng)度可控性分布 于18-25bp，可以提高有效靶位點(diǎn)的命中率。siRNA的制備可采用多種方法，比如化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長(zhǎng)鏈dsRNA、載 體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間， 可以更好地獲得基因沉默效率。本發(fā)明的siRNA分子可以作為抗HBV藥物的有效成分。作為該siRNA分子的另一種表達(dá)形式，可將其制備成DNA表達(dá)框形式，比如:U6啟 動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-HI啟動(dòng)子。簡(jiǎn)言之，在下文中將“TO啟動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-HI啟動(dòng)子”簡(jiǎn)寫為“U6_siRNA 轉(zhuǎn)錄模板-HI ”或“U6-siRNA-Hl ”，它們表示的意思和范圍相同。出于應(yīng)用目的，可將siRNA分子、表達(dá)siRNA分子的DNA表達(dá)框、或者包含siRNA 分子表達(dá)框的質(zhì)粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如病灶組織。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)?保持siRNA分子的活性。比如，對(duì)于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng) 的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想并驗(yàn)證篩選得到的siRNA的抗HBV效果，設(shè)計(jì)了如下
實(shí)驗(yàn)方案(1)構(gòu)建HBV聚合酶基因的siRNA分子庫(kù)，該分子庫(kù)中包含靶向至HBV聚合酶基因 的siRNA效應(yīng)分子，長(zhǎng)度分布于18-25bp。(2)制備具有相應(yīng)效應(yīng)的siRNA表達(dá)框，其結(jié)構(gòu)為U6啟動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板_H1 啟動(dòng)子，使其更易于體外篩選。(3)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)上述siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的效應(yīng)siRNA 分子對(duì)HBV聚合酶基因的抑制作用。(4)化學(xué)合成上述方法篩選得到的最優(yōu)靶點(diǎn)siRNA，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步運(yùn) 用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)HBV聚合酶基因的mRNA表達(dá)水平。下述實(shí)施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例1siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)的制備1.主要儀器、試劑和材料
1. 1儀器PCR儀(ABI公司)；電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司)；離心機(jī)(Eppendorf公司)， 長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈等。1. 2材料和試劑IfepG22. 2. 15細(xì)胞(百奧邁科公司保存)；lkb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；DNase I (Roche 公司)；MnCl2(BBI 公司)；磷酸接頭 (Sigma-aldrich 公司)；ATP (BBI 公司)；BSA (NEB 公司)；Bmsbl (NEB 公司)；T4DNA 連 接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生 工)；酚氯仿抽提試劑(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB公司)；EcoP15I (NEB公 司)；T4DNA聚合酶(NEB公司)；Fokl酶(NEB公司)；Sfil酶(NEB公司)；感受態(tài)細(xì)胞 (invitrogen公司)；pU6Hl_GFP表達(dá)載體(NT Oimcs公司)。凝膠抽提試劑盒QIAEX II Gel Extrati0nKit(QIAGEN公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(百奧邁科公司)。其他生化試劑均購(gòu) -f' Sigma-aldrich ^w]。2. siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)的構(gòu)建2. 1HBV聚合酶基因的獲得從細(xì)胞H印G22. 2. 15的基因組DNA(如圖1所示) 中PCR擴(kuò)增HBV聚合酶片段。IfepG22. 2. 15細(xì)胞含2個(gè)拷貝的HBV基因組，能穩(wěn)定分 泌HBsAg、HBeAg、HBcAg及Dane顆粒，并可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)HBV的DNA和RNA等中間復(fù)制 體(Sells etal.Proc Natl Acad Sci，1987 ;84 :1005_1009)，其含有 HBV 的血清亞型為 ayw(GenBankAccession number :U95551)，根據(jù) GenBank 報(bào)道的核酸序列設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引 物，分成兩個(gè)片段為HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，長(zhǎng)度分別為1625bp (如圖2A 所示)和874bp (如圖2B所示)。引物序列如下HBV聚合酶片段1上游引物5-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3’ ；
HBV聚合酶片段1下游引物5-TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3，；
HBV聚合酶片段2上游引物5-ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3，；
HBV聚合酶片段2下游引物5-CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3，。
1)HBV聚合酶片段1序列
1aattccacaacctttcaccaaactctgcaagatcccagagtgagaggcctgtatttccct
61gctggtggctccagttcaggagcagtaaaccctgttccgactactgcctctcccttatcg
121tcaatcttctcgaggattggggaccctgcgctgaacatggagaacatcacatcaggattc
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3. 4結(jié)果分析用實(shí)時(shí)定量PCR 2_AAet法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖6所 示，結(jié)果顯示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-676的沉默效果達(dá)到80%。
權(quán)利要求
一種干擾HBV基因的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列結(jié)構(gòu)正義鏈5’ GUUGGAGGACAGGAGGUUGGNN 3’SEQ ID NO3，反義鏈5’ CCAACCUCCUGUCCUCCAACNN 3’SEQ ID NO4，其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。
2.如權(quán)利要求1所述的一種干擾HBV基因的siRNA分子，其特征在于，所述N為T。
3.權(quán)利要求1 2中任一項(xiàng)所述的siRNA分子在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的病毒為乙型肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干擾HBV基因的siRNA分子及其應(yīng)用。該siRNA分子正義鏈為SEQ IDNO3，反義鏈為SEQ ID NO4，其中，反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，達(dá)到抗乙型肝炎病毒的目的。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101979554SQ20101052196
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者M·格拉漢姆, 付博峻, 唐小軍, 孫云成, 朱遠(yuǎn)源, 李鐵軍, 王晉康, 陸毅祥 申請(qǐng)人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司