專利名稱：miR-494抑制劑在制備抗骨鈣丟失、促骨生成制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種小RNA分子miR-494抑制劑在制備抗 骨鈣丟失、促骨生成制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)是生物體內(nèi)源長度約為18_25個核苷酸的非編碼 小RNA，通過與靶mRNA的互補配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA 的降解或翻譯抑制。到目前為止，已報道有幾千種miRNA存在于動物、植物、真菌等多細胞 真核生物中，進化上高度保守。miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達，miRNA組織特異 性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過 程中起多種作用(Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004 S印 16 ; 431(7006) :350-5.)。與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(哺乳動物中比 較普遍)。然而，最近也有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種 機制的miRNA結(jié)合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點完全互補(或 者幾乎完全互補)，那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。 通過這種機制作用的miRNAs的結(jié)合位點通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。每個 miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既 可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調(diào)控某 個基因的表達。隨著miRNA調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生 物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前只有一小部分miRNAs生物學(xué)功能得到闡明。這些miRNAs調(diào)節(jié)了細胞生長，組 織分化，因而與生命過程中發(fā)育、疾病有關(guān)。通過對基因組上miRNA的位點分析，顯示其在 發(fā)育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明miRNAs在細胞生長和凋亡，血細 胞分化，同源異形盒基因調(diào)節(jié)，神經(jīng)元的極性，胰島素分泌，大腦形態(tài)形成，心臟發(fā)生，胚胎 后期發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。例如，miR-273和lys-6編碼的miRNA，參與線蟲的神經(jīng) 系統(tǒng)發(fā)育過程；miR-430參與斑馬魚的大腦發(fā)育；miR-181控制哺乳動物血細胞分化為B細 胞；miR-375調(diào)節(jié)哺乳動物胰島細胞發(fā)育和胰島素分泌；miR-143在脂肪細胞分化起作用； miR-196參與了哺乳動物四肢形成，miR-1與心臟發(fā)育有關(guān)。另有研究人員發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)系 統(tǒng)的miRNAs在大腦皮層培養(yǎng)中受到時序調(diào)節(jié)，表明其可能控制著區(qū)域化的mRNA翻譯。對 于新的miRNA基因的分析，可能發(fā)現(xiàn)新的參與器官形成、胚胎發(fā)育和生長的調(diào)節(jié)因子，促進 對癌癥等人類疾病發(fā)病機制的理解。但是目前尚未見關(guān)于miR-494抑制劑用于制備抗骨鈣丟失、促骨生成制劑的任何 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供miR-494抑制劑用于抑制骨鈣丟失、促骨生成的新用途。本發(fā)明為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，以模擬失重條件下成骨細胞出現(xiàn)骨分化障礙作為骨 鈣丟失的實驗?zāi)Ｐ?，首先采用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測了模擬失重環(huán)境下小鼠MC3T3-E1 細胞miR-494的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在模擬失重24h后miR-494的表達量顯著上調(diào)。進一 步的研究結(jié)果表明，在正常環(huán)境下通過BMP2誘導(dǎo)具有成骨細胞分化潛能的小鼠C2C12細胞 的過程中，miR-494的表達豐度明顯下降。上述結(jié)果提示miR-494可能參與了對成骨細胞 分化的抑制。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將miR-494 mimics (miR-494模擬物)和 miR-494inhibitor (miR-494抑制劑)轉(zhuǎn)染入C2C12細胞后通過BMP2誘導(dǎo)成骨分化，通過檢 測成骨細胞分化的指標(biāo)判斷miR-494對細胞成骨分化的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-494 模擬物實驗組，標(biāo)志成骨分化的ALP表達量和活性均下調(diào)，0C、OPG、Runx2等分化指標(biāo)也有 明顯下調(diào)；而轉(zhuǎn)染miR-494抑制劑實驗組，ALP、0C、Runx2表達上調(diào)，OPG無明顯變化。上述 研究結(jié)果表明miR-494可以抑制成骨細胞分化，引起骨鈣丟失，而miR-494抑制劑則能促進 成骨分化。為了探討miR-494抑制成骨細胞分化的可能分子機制，本發(fā)明結(jié)合國際上通用的 3種miRNA靶基因預(yù)測軟件(pictar，miRanda，Targetscan)對miR-494的潛在靶基因進行 了預(yù)測，并從預(yù)測結(jié)果種篩選出了可能與miR-494抑制成骨細胞分化功能相關(guān)的候選靶基 因——Runx20之后本發(fā)明設(shè)計了相應(yīng)的實驗來驗證Runx2是否是miR-494的靶基因。瞬時 轉(zhuǎn)染miR-494模擬物后發(fā)現(xiàn)Runx2在mRNA和蛋白水平均發(fā)生了顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-494 抑制劑后，Runx2的表達水平有所升高，說明miR-494通過下調(diào)Rimx2抑制成骨細胞分化， 而其抑制劑可以促進成骨細胞分化、抑制骨鈣丟失。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:miR-494抑制劑在制備抗骨鈣丟失、促骨生成制劑中 的應(yīng)用


圖1熒光實時定量PCR檢測模擬失重C2C12細胞miR-494表達豐度圖。圖2瞬時轉(zhuǎn)染miR-494模擬物抑制成骨分化相關(guān)指標(biāo)結(jié)果圖。圖3miR_494抑制劑能增強成骨相關(guān)基因ALP活性的檢測結(jié)果圖。圖4miR-494抑制劑能增強成骨相關(guān)基因OC表達的ELISA檢測結(jié)果圖。圖5雙熒光報告系統(tǒng)檢測Runx2是miR-494靶基因結(jié)果圖。圖6Westen blot驗證Runx2是miR-494靶基因結(jié)果圖。
具體實施例方式1.回轉(zhuǎn)器模擬失重條件下的細胞培養(yǎng)本發(fā)明中采用的細胞回轉(zhuǎn)器具有兩組不同方向的轉(zhuǎn)臺——水平轉(zhuǎn)臺和垂直轉(zhuǎn)臺， 兩組轉(zhuǎn)臺通過傳動裝置連接于同一個電機上實現(xiàn)同速旋轉(zhuǎn)。水平轉(zhuǎn)臺在水平方向上旋轉(zhuǎn)以 模擬微重力，而垂直轉(zhuǎn)臺圍繞與地面垂直的軸向旋轉(zhuǎn)以在相同動力環(huán)境中作為IG對照，同 時可以排除如振動等動力學(xué)因素的影響，本實驗同時在37°C培養(yǎng)箱中設(shè)靜止對照。含培養(yǎng)細胞的回轉(zhuǎn)艙可以固定在轉(zhuǎn)臺上從而給予細胞模擬失重刺激或IG對照。C2C12細胞在25cm2培養(yǎng)瓶中，采用含10% FBS DMEM培養(yǎng)液，在含5% C02的37°C 恒溫培養(yǎng)箱中按常規(guī)培養(yǎng)。在進行模擬失重實驗前一天，將細胞以每片IXIO5個細胞的密 度接種于2. 5cmX 3cm的蓋玻片上(蓋玻片預(yù)先經(jīng)過多聚賴氨酸包被及滅菌處理)，將蓋玻 片置于六孔板中在5% C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。之后將接種有細胞的蓋玻片插 在固定架上，置于裝滿10% FBS DMEM培養(yǎng)液的回轉(zhuǎn)艙中，排除氣泡，密封艙口，回轉(zhuǎn)器置于 37°C恒溫培養(yǎng)箱以30rpm旋轉(zhuǎn)。細胞在不同重力環(huán)境培養(yǎng)48_72h后，進行后續(xù)實驗。2.細胞總RNA的提取收獲對數(shù)生長期的C2C12細胞約107，加入Iml TRIZOL裂解細胞并用吸管反復(fù)吹 吸，室溫作用5min。將細胞轉(zhuǎn)至1. 5ml離心管中，加入0. 2ml氯仿，蓋緊離心管蓋，漩渦振蕩 器上用力震搖15sec，室溫放置3min，4°C以12，000Xg的轉(zhuǎn)速離心15min。將占總體積約 60%的無色的上層水相轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml管中，加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫作用lOmin， 12, OOOXg 4°C離心lOmin。棄去上清，加入Iml 75%乙醇洗滌(DEPC水配置)沉淀，震蕩， 40C 7，500\8離心511^11，棄去上清，沉淀在371干燥5-101^11，加入3(^1 DEPC水重新溶 解，貯存于_70°C或直接使用。3.miR_494表達豐度的檢測使用 Applied Biosystem 公司的小 RNA 試齊[J 盒(Taqman MicroRNA Assay HumanPanel-Early Access Kit, Ρ/Ν :4365409)，根據(jù)試劑盒操作手冊的標(biāo)準(zhǔn)操作流程， 使用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測模擬失重不同時間點miR-494的表達豐度值(Ct)，用 miRNA-494的表達豐度值減去18sRNA(—種作為內(nèi)參照的RNA)的表達豐度值得到標(biāo)準(zhǔn)化 的表達豐度值(Δ Ct)，之后使用GraphPad統(tǒng)計制圖軟件繪制圖1所示的熒光實時定量PCR 檢測模擬失重C2C12細胞miR-494表達豐度圖。4. miR-494模擬物和miR-494抑制劑的體外合成miR-494模擬物和miR-494抑制劑的體外合成由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司完 成，miR-494模擬物、miR-494抑制劑及其相應(yīng)對照序列如下
權(quán)利要求
miR 494抑制劑在制備抗骨鈣丟失、促骨生成制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種小RNA分子miR-494抑制劑在制備抗骨質(zhì)丟失、促骨生成制劑中的應(yīng)用。經(jīng)實驗證實，miR-494通過作用于成骨細胞分化相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因，抑制該基因不能表達相應(yīng)蛋白，從而抑制成骨細胞的分化，引起成骨分化障礙，導(dǎo)致骨質(zhì)丟失和骨質(zhì)疏松的發(fā)生。miR-494的抑制劑能下調(diào)miR-494的表達豐度，解除miR-494對成骨分化的抑制作用、促進成骨，因而可將mir-494抑制劑用于制備抗骨質(zhì)丟失、促骨生成制劑。
文檔編號A61P19/08GK101991852SQ201010535658
公開日2011年3月30日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者孟艷玲, 張瑞, 楊安鋼, 王濤, 白久旭, 秦?zé)槦? 賈林濤, 趙智凝, 閆博 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)