專利名稱：蠟梅屬植物抑制乙酰膽堿酯酶活性部位的制備及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥制藥領域，涉及從蠟梅屬植物中分離提取活性部位，特別涉及乙 酰膽堿酯酶抑制活性部位的制備方法，所得活性部位具有較強的抑制乙酰膽堿酯酶活性作 用，該活性部位物質可預期作為防治老年性癡呆藥物的用途。
背景技術：
Chimonanthus praecox (L. ) LinkCalycanthaceae ·，^^JTISc 國華中、華南、華東以及云貴高原地區(qū)，其花、葉均有散發(fā)香氣的芳香油，具有極高的藥用和 食用價值。當前對蠟梅屬植物的研究重點是葉的揮發(fā)油成分，包括桉葉素、芳樟醇、α-菔 烯、菔烯、莰烯、樟腦和龍腦等主要成分；而對非揮發(fā)油成分的研究近年也呈上升趨勢， 主要集中在蠟梅葉生物堿、黃酮及香豆素類物質的研究上，該類物質被證明具有抑菌、抗 炎、解熱、鎮(zhèn)咳及增強免疫力等功效。鑒于此，開發(fā)蠟梅屬植物的非揮發(fā)性生物活性成分就 顯得尤為重要。老年癡呆癥是嚴重危害人類健康的神經退行性疾病。Alzheimer disease(簡稱 AD)是一種主要老年癡呆癥，隨著社會老齡化的加速，AD已成為人類繼冠心病、癌癥之后第 三大死因。迄今尚未有治愈老年癡呆癥的有效手段，但服用乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI) 是目前治療老年癡呆癥最有效的治療方式。根據抗炎藥物可以影響老年性癡呆疾病發(fā)展的 思路，我們從蠟梅屬植物的根、莖、葉、花各部位提取物中，用乙酰膽堿酯酶抑制作用為篩選 指標，追蹤其有效抑制乙酰膽堿酯酶的活性部位，并從中得到抑制乙酰膽堿酯酶作用較強 的黃酮、生物堿和香豆素類活性部位。此類活性部位的發(fā)現(xiàn)為制備與乙酰膽堿缺失相關疾 病的治療藥物及預防保健品提供了充足的原材料。目前蠟梅屬植物的藥效研究主要集中在抑菌、抗病毒、預防流感等方面，關于其提 取成分抑制乙酰膽堿酯酶活性的文獻和專利尚未見報道，本發(fā)明是首次從蠟梅屬植物中分 離到具有抑制乙酰膽堿酯酶活性部位的報道，也為從傳統(tǒng)中藥資源中開發(fā)新的老年性癡呆 藥物尤其是乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物提供新的發(fā)展思路。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供從蠟梅屬植物中分離提取乙酰膽堿酯酶抑制活性部位及其 制備方法，該活性部位物質可預期作為防治老年性癡呆藥物的用途。本發(fā)明所述的從蠟梅屬植物中分離提取乙酰膽堿酯酶抑制活性部位的制備及其 應用，具體工藝步驟如下a.稱取蠟梅葉為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度為50 80%的乙醇溶液提取 3次，各次所用乙醇溶液的質量依次為蠟梅葉原料質量的10倍、8倍和8倍，每次提取8 12小時，將三次的提取液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在低于80°C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得 乙醇提取物，將其30 60°C烘干成浸膏備用；
c.稱取蠟梅葉浸膏200 300克，用5 15%的醋酸水溶液將其分散后，用乙酸 乙酯萃取，每次500mL，萃取5 15次，收集酸水相和乙酸乙酯相以及不溶的沉淀；d.步驟c所得酸水相用碳酸鈉堿化至溶液PH為8. 0 10. 0，得堿水相，堿水相用 氯仿萃取，每次500mL，萃取5 10次，收集氯仿相，所得的氯仿相經過碘化鉍鉀顯色，確定 其主活性部位為生物堿類物質；e.步驟c所得乙酸乙酯相用5 10%的碳酸鈉水溶液萃取，每次500mL，萃取8 15次，得到乙酸乙酯層和堿水層；隨后收集堿水層用鹽酸酸化至溶液pH為5.0 6.0，酸化 后有大量的沉淀析出，離心并分別收集沉淀和上清，所得沉淀通過三氯化鋁顯色，確定其主 活性成分為黃酮類物質；f.步驟e離心所得上清用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取6 10次，收集乙酸乙 酯相，采用氫氧化鉀檢識方法確定其主成分為香豆素類物質。本發(fā)明得到的活性部位，即生物堿類、黃酮類及香豆素類具有抑制乙酰膽堿酯酶 的作用，提供了可用于制備與乙酰膽堿缺失引起的相關疾病的治療藥物或保健品，包括但 不限于防治老年性癡呆癥的醫(yī)藥或保健品用途。本發(fā)明所述活性部位的制備原來其主要來源于任意一種中國產的蠟梅屬植物，包 括蠟梅、突托蠟梅、山蠟梅、柳葉蠟梅等；可以是干品或鮮品；可以是蠟梅屬植物的根、莖、 葉、花、種子、皮、果實，也可以是它們的混合物。本發(fā)明的有益成果(1)本發(fā)明提供了一種新的乙酰膽堿酯酶抑制劑的藥源途徑和制備方法，蠟梅屬 植物活性部位黃酮、生物堿和香豆素類首次被發(fā)現(xiàn)具有乙酰膽堿酯酶抑制活性功效。該藥 源原料來源豐富，制備工藝合理、可行，易于實現(xiàn)產業(yè)化；(2)本發(fā)明提供的活性部位具有顯著的乙酰膽堿酯酶抑制活性，此研究結果在此 前尚未見報道；所得活性部位物質可以用在制備與乙酰膽堿缺失相關疾病(如老年性癡呆 癥、血管性癡呆、中風、學習記憶功能障礙等疾病)的藥物中。
具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例進行進一步闡明，但并不限于本發(fā)明的內容。實施例11、蠟梅屬植物活性部位生物堿的制備a.稱取蠟梅葉為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度60%的乙醇溶液提取3次，各 次所用乙醇溶液的質量依次為蠟梅葉原料質量的10倍、8倍和8倍，每次提取10小時，將三 次的提取液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在45°C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇 提取物，將其40°C烘干成浸膏備用；c.稱取蠟梅浸膏250克，用10%的醋酸水溶液將其分散后，用乙酸乙酯萃取，每次 500mL，萃取10次，收集酸水相和乙酸乙酯相以及不溶的沉淀。d.將上述酸水相用碳酸鈉堿化至溶液pH為10.0，得堿水相，堿水相用氯仿萃取， 每次500mL，萃取6次，收集氯仿相；e.取ImL氯仿相溶液加入小試管，向試管中加入幾滴碘化鉍鉀溶液，出現(xiàn)橘紅色沉淀，根據顏色初步確定氯仿相中活性成分為生物堿類物質；2、活性部位生物堿乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定(1)方法a.藥品與試劑碘化硫代乙酰膽堿(acetylthiocholine iodide，ATCI)、5， 5- 二硫代-2-硝基苯甲酸(dithiobis-nitrobenzoic acid, DTNB)和乙酰膽堿酯酶 (Acetylcholinesterase,AChE)純品均購自 Sigma 公司；石杉堿甲(Huperzine A，HupA)購 自中國藥品生物制品檢定所，其他試劑均為分析純；b.在EP管中加入氯仿相樣品或HupA標準品40 μ L，30 μ L 0. 22U · ml/1 AChE, 30 μ L 15mM ATCI，磷酸緩沖液補平體系至終體積為190 μ L，混和37°C孵育30min，加10 μ L 4% SDS室溫下終止反應20min，移入96孔板上，加3mM DTNB顯色劑125 μ L顯色5min，4IOnm 處酶標儀檢測，試驗同時設有空白對照、標準對照、陽性對照、樣品顏色對照。按如下公式計算抑制率 1(% ) = [ (OD^-OD+) -(0D樣品—0D本底)]/ (0D:0D+) X 100%(2)抑制率測定結果通過對乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究發(fā)現(xiàn)，依據本發(fā)明提供的制備方法獲得的生 物堿具有顯著的活性(結果見表1)。表1不同濃度生物堿類物質對乙酰膽堿酯酶的抑制效果(3次重復)
權利要求
1.蠟梅屬植物抑制乙酰膽堿酯酶活性部位的制備及其應用，其特征在于具有抑制乙酰 膽堿酯酶活性提取物含有3個活性部位生物堿類，其質量分數(shù)1. 27 1. 8% ；黃酮類，質 量分數(shù)5. 7 13. 6%;香豆素類，質量分數(shù)0. 8 1. 5%。所得活性部位均有較強抑制乙酰 膽堿酯酶活性的作用。
2.根據權利要求1所述的蠟梅屬植物提取生物堿類活性部位的制備方法，其特征在于 步驟為a.稱取蠟梅葉為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度為50 80%的乙醇溶液提取3次， 各次所用乙醇溶液的質量依次為蠟梅葉原料質量的10倍、8倍和8倍，每次提取8 12小 時，將三次的提取液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在低于80°C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇 提取物，將其30 60°C烘干成浸膏備用；c.稱取蠟梅葉浸膏200 300克，用5 15%的醋酸水溶液將其分散后，用乙酸乙酯 萃取，每次500mL，萃取5 15次，收集酸水相和乙酸乙酯相；d.將上述酸水相用碳酸鈉堿化至溶液pH為8 10，得堿水相，堿水相用氯仿萃取，每 次500mL，萃取5 10次，收集氯仿相；e.利用碘化鉍鉀顯色法確定氯仿相為生物堿類活性物質；
3.根據權利要求1所述的蠟梅屬植物提取黃酮類活性部位的制備方法，其特征在于步 驟為a.稱取蠟梅葉為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度為50 80%的乙醇溶液提取3次， 各次所用乙醇溶液的質量依次為蠟梅葉原料質量的10倍、8倍和8倍，每次提取8 12小 時，將三次的提取液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在低于80°C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇 提取物，將其30 60°C烘干成浸膏備用；c.稱取蠟梅浸膏200 300克，用5 15%的醋酸水溶液將其分散后，用乙酸乙酯萃 取，每次500mL，萃取5 15次，收集酸水相和乙酸乙酯相；d.將上述乙酸乙酯相用5 15%的碳酸鈉水溶液萃取，每次500mL，萃取5 10次，收 集堿水層；e.將收集的堿水層用鹽酸酸化至溶液pH為5.0 6. 0，酸化后有大量的沉淀析出，離 心并收集沉淀；f.將收集的沉淀取出部分用少量的水溶解后，采用三氯化鋁檢測法確定沉淀物為黃酮 類活性物質；
4.根據權利要求1所述的蠟梅屬植物提取香豆素類活性部位的制備方法，其特征在于 步驟為a.稱取蠟梅葉為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度為50 80%的乙醇溶液提取3次， 各次所用乙醇溶液的質量依次為蠟梅葉原料質量的10倍、8倍和8倍，每次提取8 12小 時，將三次的提取液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在低于80°C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇 提取物，將其30 60°C烘干成浸膏備用；c.稱取蠟梅浸膏200 300克，用5 15%的醋酸水溶液將其分散后，用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取5 15次，收集酸水相和乙酸乙酯相；d.將上述乙酸乙酯相用5 15%的碳酸鈉水溶液萃取，每次500mL，萃取5 10次，收 集堿水層；e.將收集的堿水層用鹽酸酸化至溶液pH為5.0 6. 0，酸化后有大量的沉淀析出，離 心收集上清，上清用乙酸乙酯萃取，每次500mL，萃取5 10次，收集乙酸乙酯相；f.將收集的乙酸乙酯相組合物采用氫氧化鉀檢識確定其為香豆素類活性物質；
5.根據權利要求1所述的蠟梅屬植物抑制乙酰膽堿酯酶活性的應用，其特征是在制 備預防和治療乙酰膽堿缺失導致的相關癥狀或疾病，尤其是防治老年性癡呆的藥物中的應 用。
6.根據權利要求1所述的活性部位的制備途徑，其主要來源于任意一種中國產的蠟梅 屬植物，包括蠟梅、突托蠟梅、山蠟梅、柳葉蠟梅等；可以是干品或鮮品；可以是蠟梅屬植物 的根、莖、葉、花、種子、皮、果實，也可以是它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥制藥領域，涉及蠟梅屬植物抑制乙酰膽堿酯酶活性部位的制備及其應用。蠟梅屬植物活性部位制備方法為乙醇浸提，低極性溶劑萃取，酸溶堿沉氯仿萃取或堿溶酸沉、離心和乙酸乙酯萃取，所提取的活性部位包括3類物質，分別是生物堿類、黃酮類和香豆素類。本發(fā)明所述的活性部位具有較強的抑制乙酰膽堿酯酶活性作用，在制備預防和治療乙酰膽堿缺失導致的相關癥狀或疾病，尤其是防治老年性癡呆的藥物中具有廣泛的用途。
文檔編號A61P25/28GK102000127SQ201010542318
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者劉易鑫, 張志斌, 朱篤, 王凌云, 鄒崢嶸, 顏日明 申請人:朱篤