專利名稱：奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，特別是含奶牛乳房炎5、 8、336型金黃色葡萄球菌、無乳、停乳、乳房型鏈球菌和大腸桿菌三聯(lián)滅活疫苗及其制備方 法，其疫苗類型包括滅活全菌疫苗、滅活全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗注射 劑型、微針透皮劑型，可安全、穩(wěn)定、全面有效預(yù)防金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌感染 性奶牛乳房炎的發(fā)生。屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧業(yè)發(fā)展、食品安全、人類健康的重大傳 染病，特別是近年氣候環(huán)境改變、抗生素濫用耐藥，超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)，細(xì)菌感染奶牛乳房炎發(fā) 病率和死亡率逐年攀升，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展、食品安全和人類健康，由此再次給人們敲響 警鐘，奶牛乳房炎已成為國計(jì)民生的頭等大事，采用免疫疫苗防控勢(shì)在必行。據(jù)國際奶牛聯(lián)合會(huì)報(bào)告，全球有2. 2億頭奶牛，因理化所致奶牛乳房炎發(fā)病率明 顯下降，而微生物感染奶牛乳房炎呈顯著上升，其發(fā)病率高達(dá)60%以上。引發(fā)奶牛乳房炎 的病原達(dá)140余種，主要是細(xì)菌類占主流，其中金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)、鏈球菌和 大腸桿菌感染占90%以上，且可多種病原菌共同或單獨(dú)感染引起。據(jù)臨床流行病學(xué)資料顯 示，我國奶牛乳房炎以金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌病原菌為主，占91. 4%，其中金葡菌以5、 8和336型、鏈球菌以無乳、停乳和乳房型、大腸桿菌0型為主，與當(dāng)前國際報(bào)道感染菌種、血 清型及流行趨勢(shì)相一致。奶牛乳房炎不但影響奶牛生活質(zhì)量和產(chǎn)量，而且經(jīng)濟(jì)損失也明顯 突出，如發(fā)達(dá)美國每年達(dá)30億美元、英國4億美元，我國35億元以上，特別是我國奶制品及 肉食品抗菌素及細(xì)菌產(chǎn)物嚴(yán)重超標(biāo)，已成為國計(jì)民生的社會(huì)重大問題。目前奶牛乳房炎治療是以抗生素為首選，但大量抗生素使用造成耐藥，而得不到 有效控制，已嚴(yán)重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展。人們最大愿望就是通過接種疫苗有效控制奶牛乳 房炎，其目的就是增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是乳腺組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)來阻止、中和、 殺滅外界進(jìn)入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特點(diǎn)給有效免疫力的產(chǎn)生帶來了了一 系列特殊的挑戰(zhàn)。第一，乳房炎是乳腺組織的炎癥，然而免疫應(yīng)答增強(qiáng)在奶牛患乳房炎的情 況下并不總是有益的。免疫反應(yīng)的一個(gè)重要組成部分是大量的嗜中性粒白細(xì)胞從血液遷移 到感染的乳腺來發(fā)揮作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，牛奶中出現(xiàn)大量體細(xì)胞并不認(rèn)為是好事，因?yàn)轶w 細(xì)胞數(shù)量增加說明奶牛已患乳房炎，并且此時(shí)牛奶品質(zhì)、產(chǎn)量會(huì)明顯下降。第二，乳腺中的 牛奶會(huì)稀釋抗感染的嗜中性粒細(xì)胞的濃度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降 低抗感染嗜中性粒細(xì)胞的殺菌能力。第三，奶牛飼養(yǎng)有大量可引起乳房炎的微生物的環(huán)境 中，而且奶汁本身給病原菌生長(zhǎng)提供了溫床。因此，使奶牛乳腺產(chǎn)生有效的免疫力，降低乳 房炎的發(fā)生率，需要攻克的難題較多，給奶牛乳房炎疫苗研發(fā)提出比其它傳染病疫苗更高 的要求。細(xì)菌感染奶牛乳房炎菌多而復(fù)雜，主要是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鏈球菌(Streptococcus)禾口大腸桿菌(Escherichia coli),與宿主交互作用免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)復(fù)雜性，疫苗佐劑在疫苗中發(fā)揮的重要作用更佳凸現(xiàn)，它決定免疫抗原 走向及免疫應(yīng)答特征，已成為奶牛乳房炎疫苗研發(fā)的重要內(nèi)容。目前動(dòng)物疫苗使用的多 為白花油佐劑，能產(chǎn)生高滴度血清抗體，但沒有黏膜和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是副作用大，而 影響奶牛質(zhì)量和奶產(chǎn)量及生活質(zhì)量。近些年，以色列Gabriel Leitner等研制的奶牛乳 房炎金黃色葡萄球菌苗“MASTIVACS I”，曾與 FIA(freund，s incomplete adjuvant)和 ISA206 (vaccine adjuvantfor w/o/w emu si on based onmineral oil)佐齊 Ll 效果比較，發(fā) 現(xiàn)FIA對(duì)小鼠的刺激性較大，認(rèn)為ISA206佐劑比較適合。我國羅金印等曾研制的氫氧化鋁 佐劑滅活苗、靳亞平等研制的葡聚糖、油佐劑和弗氏不完全佐劑奶牛乳房炎疫苗結(jié)果表明， 3種以FIA佐劑效果最好，但存在副作用大。本發(fā)明者采用SPOl佐劑(角鯊烯、聚氧乙烯蓖 麻油和聚醚水包油佐劑)、SP02佐劑(角鯊烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油佐劑并加入重 組細(xì)菌鞭毛)作為奶牛乳房炎滅活疫苗佐劑。結(jié)果顯示SP01、SP02佐劑具有全面免疫應(yīng)答 效果，且副作用顯著低于白花油和FIA佐劑，成為新一代有發(fā)展前途的疫苗新佐劑。金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌是最常見奶牛乳房炎的病原菌之一，其致病 復(fù)雜與其莢膜多糖(Capsular polysaccharides, CPs)和外毒素、黏附素等緊密相關(guān)，對(duì)奶 牛危害最大，是最頑固的一種乳腺炎病原菌。大部分金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌感染會(huì)造成 隱性乳腺炎，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，繼而轉(zhuǎn)變成慢性感染，主要的經(jīng)濟(jì)損失來自牛奶產(chǎn)量下降及牛奶 品質(zhì)降低。疫苗是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能從而使機(jī)體獲得抗病能力，因此研制安全、 全面有效的奶牛乳腺炎疫苗成為防控乳腺炎的必由選擇。奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的主 要有5、8、336、化膿、肺炎等血清型金葡菌，其中5、8和336型占金葡菌感染的93%以上； 鏈球菌乳房炎的主要有無乳、停乳、乳房、化膿、肺炎等血清型鏈球菌，其中最為重要的是停 乳、無乳和乳房鏈球菌三個(gè)血清型，占鏈球菌感染的92%以上；大腸桿菌按0抗原分有130 多個(gè)型。疫苗是預(yù)防傳染病最有效的手段，針對(duì)奶牛5、8和336型金葡菌乳房炎三價(jià)滅活 全菌疫苗已在美國及歐洲一些國家使用，從已使用結(jié)果看免疫保護(hù)效果不全面，國內(nèi)至今 沒有批準(zhǔn)奶牛金葡菌乳房炎疫苗上市或成功的報(bào)道；針對(duì)奶牛無乳、停乳和乳房鏈球菌性 乳房炎三價(jià)滅活疫苗至今國內(nèi)外還沒有商品化疫苗面市和成功的研究報(bào)道；針對(duì)奶牛大腸 桿菌乳房炎滅活疫苗，美國研發(fā)的J-5大腸桿菌滅活疫苗已在本國和歐洲等地得到了廣泛 應(yīng)用，隨后美國加州大學(xué)進(jìn)入中國推廣沒有得到認(rèn)可，國內(nèi)處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。由此從已 有的奶牛金葡菌乳房炎疫苗結(jié)果看，滅活全菌疫苗保護(hù)效果不全面，與沒有足夠莢膜多糖 保護(hù)性抗原有關(guān)，且使用白花油佐劑副作用大而影響疫苗效果，因此迫切需要改變思路發(fā) 展優(yōu)勢(shì)流行菌株和適應(yīng)環(huán)境的疫苗迫在眉睫。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明目的在于公開一種奶牛金黃色葡萄球5、8、336血清型、鏈球菌無乳、停乳 和乳房血清型、基因定點(diǎn)缺失大腸桿菌重組工程菌乳房炎三聯(lián)滅活(全菌、全菌+莢膜多 糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白)疫苗；本發(fā)明目的還在于公開該疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的還 在于公開該疫苗可安全、穩(wěn)定、全面有效預(yù)防金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌感染性奶 牛乳房炎的發(fā)生。本發(fā)明目的是通過如下方案及制備方法和應(yīng)用實(shí)現(xiàn)的1、通過對(duì)我國內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等東西南北中30個(gè)省市90個(gè)大中型奶牛場(chǎng)、近3萬頭奶牛乳腺炎奶樣金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌分離、鑒定，篩選 并確定金葡菌流行優(yōu)勢(shì)株是5、8和336血清型、鏈球菌流行優(yōu)勢(shì)株是無乳、停乳和乳房血清 型、大腸桿菌0008、01216、02138、02555等為我國奶牛乳腺炎感染流行優(yōu)勢(shì)菌株，三種細(xì)菌 占感染菌的92%以上。在本發(fā)明的方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球 菌、0008、01216、02138和02555型大腸桿菌作為奶牛乳腺炎優(yōu)勢(shì)流行菌株；包括任何適宜 于當(dāng)前和今后廣泛流行金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌野生株、突變株。2、通過構(gòu)建自殺性致死質(zhì)粒pCVD442_galE系統(tǒng)，運(yùn)用同源重組常規(guī)方法敲除 0008、01216、02138和02555大腸桿菌候選優(yōu)勢(shì)菌株的LPS編碼基因galE以暴露其核心 抗原，而不影響除0抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選并命名為X-10、X-89、X-326、 X-2138和X-2555大腸桿菌重組工程菌(簡(jiǎn)稱X-大腸桿菌)株，在體外普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 良好，傳代穩(wěn)定、免疫原性良好的奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優(yōu)勢(shì)候選菌株。在本發(fā)明的方法中，包括但不局限X-10、X-89、x-326、X_2138和X-2555大腸桿菌 重組工程菌株作為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株；包括通過該方法制備的奶牛大腸桿菌基 因工程菌(稱奶牛大腸桿菌，又稱X-大腸桿菌)株均可用作為候選疫苗株。3、制備了奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、X_10、X-89、 X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌優(yōu)勢(shì)流行菌株兔抗血清，分別與已有國內(nèi)外臨床分離奶 牛乳房炎金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌菌代表株進(jìn)行中和試驗(yàn)，其免疫交叉保護(hù)達(dá)96%以上， 由此選用的5、8、336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和 Χ-2555等大腸桿菌感染奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株具有代表國內(nèi)外流行株。4、選用5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、Χ_10、Χ-89、Χ-326、 Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌感染奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗株，通過培養(yǎng)傳代、建立了 5、8和336 型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555等大腸桿菌奶牛 乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批和工作種子批庫，進(jìn)一步通過理化性質(zhì)、基因特征、 毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗菌株三級(jí)種子批庫符合 疫苗生產(chǎn)用要求。在本發(fā)明專利中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、 Χ-10、Χ-89、Χ-326、Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌重組工程菌株作為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì) 菌株建立種子批庫；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行的金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌野生株、 突變株建立疫苗株種子批庫。5、通過奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、Χ_10、Χ_89、 X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌三聯(lián)滅活菌苗工作種子批株，從IOL到1000L發(fā)酵放大 培養(yǎng)，制備了奶牛乳房炎三聯(lián)滅活菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備純化5、8 和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌 血清型滅活全菌、莢膜多糖抗原，抗原純度達(dá)95% ；通過對(duì)溫度、時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件的 優(yōu)化，獲得了規(guī)模化生產(chǎn)滅活全菌、莢膜多糖疫苗抗原原液；進(jìn)一步進(jìn)行血清型別、理化性 質(zhì)、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鑒定。在本發(fā)明專利中，包括不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、 X-10、x-89、x-326、Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌菌苗工作種子批株、BHI、TSB培養(yǎng)基用于疫苗原液規(guī)?；a(chǎn)；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行的候選金葡菌新優(yōu)勢(shì)疫苗菌株及LB
等培養(yǎng)基介質(zhì)。6、純化的奶牛5、8和336血清型金黃色葡萄球菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌乳房 炎滅活莢膜多糖疫苗原液，用偶聯(lián)劑與破傷風(fēng)毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、無毒力 白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合適的載體蛋白分子。依Pr-L-Ps結(jié)構(gòu)式偶聯(lián)，其中，Pr 是載體蛋白，Ps是奶牛金葡菌莢膜多糖，L是共價(jià)鍵、或連接基團(tuán)，且Ps Pr的質(zhì)量比為 0.5-3.5 1。先采用溴化氫活化多糖，然后再采用碳二亞胺將活化的多糖與蛋白共價(jià)偶 聯(lián)。制備出奶牛金葡菌、鏈球菌乳房炎莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197載 體蛋白與各血清型莢膜多糖結(jié)合蛋白都有好的交聯(lián)效果，交聯(lián)率達(dá)85%以上，由此TT或DT 或CRM197均可作為該疫苗載體結(jié)合蛋白。在本發(fā)明專利中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌 滅活莢膜多糖和TT、DT、CRM197交聯(lián)載體蛋白；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行金葡菌、鏈 球菌株莢膜多糖及其他載體蛋白。7、制備的有效劑量純化奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌乳房 炎滅活全菌(比如1 10 X IOltlCFU)、全菌(比如1 10 X IOltlCFU) +莢膜多糖(比如10 60Ug)抗原、莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197)、 X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌(比如1 10X101(ICFU)，與常規(guī)用量的白花油、FIA、鋁鹽、 MF59.SP01和SP02等疫苗佐劑均勻，制備奶牛乳房炎三聯(lián)(金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌)滅 活全菌、全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛動(dòng)物，間 隔28天，皮下或肌肉或乳頭管或微針透皮免疫2次，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞， 觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體重、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及ELISA、ELISP0T測(cè)定抗體效 價(jià)、細(xì)胞免疫水平及死亡情況。試驗(yàn)結(jié)果可見，這幾種佐劑均能提高奶牛乳房炎滅活疫苗抗 體滴度、依次是FIA、白花油、SP01、MF59和鋁鹽佐劑，且在不同動(dòng)物呈現(xiàn)一致性趨勢(shì)。由此 SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽均可有效的作為奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗的佐劑。
在本發(fā)明專利中，包括但不限于SPO1、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一 種或幾種用于奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗的制備；包括免疫刺激復(fù)合物、細(xì)胞因子、脂質(zhì)體等 佐劑。 8、本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗可不含有佐劑，也可以含有SP01、SP02、 MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一種或幾種，①制備有效劑量的有或無佐劑的奶牛乳房 炎單聯(lián)滅活(比如1 10 X IOiciCFU金葡菌或1 10 X IOiciCFU鏈球菌或1 10 X IOiciCFU X-大腸桿菌)全菌疫苗注射劑型、三聯(lián)滅活(比如1 IOX IOltlCFU金葡菌+1 IOX IOltlCFU 鏈球菌+1 IOXIOiciCFU χ-大腸桿菌)全菌疫苗注射劑型；②制備有或無佐劑的奶牛乳 房炎單聯(lián)滅活(比如1 10 X IO10CFU全菌+莢膜多糖10 60Ug金葡菌、1 10 X IO10CFU 全菌+莢膜多糖10 60Ug鏈球菌)疫苗注射劑型、三聯(lián)滅活(比如1 10 X IOltlCFU全菌 +莢膜多糖10 60Ug金葡菌+1 IOX IOltlCFU全菌+莢膜多糖10 60Ug鏈球菌+1 IOXIO10CFU Χ-大腸桿菌)全菌+莢膜多糖疫苗注射劑型；③制備有或無佐劑的奶牛單聯(lián) 滅活(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197金葡菌或鏈球菌)莢膜多糖結(jié) 合蛋白疫苗注射劑型、三聯(lián)滅活(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197金葡 菌 +40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT 或 DT 或 CRM197 鏈球菌 +1 10 X IO10CFU X-大腸桿菌)
8莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗注射劑型、微針透皮劑型。9、本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗注射劑型可皮下注射，也可以肌肉、乳頭管 注射，也可以微針透皮，也可以一種或幾種途徑聯(lián)合免疫，制備有或無佐劑的奶牛乳房炎不 同劑量單聯(lián)、三聯(lián)滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫 BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛動(dòng)物，觀察過敏性反應(yīng)、異常毒性、熱源質(zhì)反應(yīng)、一般毒性。結(jié)果表 明奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗制品接種動(dòng)物是安全的。10、本發(fā)明的奶乳房炎三聯(lián)滅活疫苗有或無佐劑的滅活單、三聯(lián)不同劑量滅活全 菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c、家兔和奶牛動(dòng) 物，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì)量、體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、 細(xì)菌數(shù)、抗體效價(jià)、脾細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子變化，通過量效、時(shí)效、次效測(cè)定抗體和細(xì)胞免 疫水平以評(píng)價(jià)免疫原性；進(jìn)一步在2-3歲即將進(jìn)入泌乳期(即產(chǎn)前25d，懷孕8個(gè)月20d) 健康奶牛，有效免疫劑量是滅活全菌疫苗(比如5X IOltlCFU)、滅活全菌+莢膜多糖(比如 5X101QCFU+50UgCPs)、莢膜多糖結(jié)合蛋白(比如 50UgCPs+20UgTT 或 DT 或 CRM197)疫苗，0， 28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)，末次免疫后14天用1500CFU (5、8、 336型金葡菌、無乳、停乳、乳房型鏈球菌、01111、0157型大腸桿菌)野生菌株乳頭管內(nèi)注 射攻毒，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì)量、體溫、體細(xì)胞計(jì) 數(shù)、細(xì)菌數(shù)、抗體效價(jià)、脾細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子等指標(biāo)評(píng)價(jià)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，制備的不 管是皮下或是以肌肉或是乳頭管注射、不管是有佐劑或是無佐劑奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗 都有產(chǎn)生高效價(jià)抗體滴度，與劑量呈相關(guān)，且5X 101(lCFU、50UgCPS、20Ug TT或DT或CRM197 達(dá)到平臺(tái)期，加佐劑好于無佐劑組，三聯(lián)聯(lián)好于單聯(lián)、且有疊加效應(yīng)，莢膜多糖好于滅活全 菌疫苗，在不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)，加莢膜多糖可提高免疫保護(hù)率，在奶牛體內(nèi)免疫 保護(hù)率90%以上。9、本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗有或無佐劑的滅活單價(jià)、多價(jià)不同劑量 滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗制品，分別置于4°C、室溫 (20-25) °C和37°C，從外觀、pH、蛋白含量、動(dòng)物免疫原性等指標(biāo)觀察疫苗穩(wěn)定性。結(jié)果表明， 奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良好，有效期2年以上。10、在本發(fā)明的方法中，可以采用任何適宜于制備滅活全菌體、全菌+莢膜多糖、 莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗的奶牛乳房炎金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌各血清型株進(jìn)行疫苗生產(chǎn)， 但疫苗株的選擇應(yīng)具有代表性，依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料選擇的、當(dāng)前和今后廣泛流行的野 生株。另外，菌株產(chǎn)量高、誘導(dǎo)免疫保護(hù)的能力強(qiáng)、交叉保護(hù)譜廣、穩(wěn)定。11、本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗用于不同品種、不同年齡奶牛乳房炎的免 疫預(yù)防。綜上所述該疫苗主要含有含奶牛乳房炎5、8、336型金黃色葡萄球菌、無乳、停乳、乳房型鏈 球菌、0008、01216、02138和02555等大腸桿菌株，具有代表我國金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌 感染所致奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)流行菌株；敲除0008、01216、02138和02555等大腸桿菌LPS編 碼基因galE，篩選大腸桿菌缺乏鳥苷二磷酸半乳糖異構(gòu)酶突變菌株，命名為X-IO大腸桿菌 菌株，具有G-廣譜性。優(yōu)勢(shì)野菌株、突變株，制備的5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-IO大腸桿菌菌兔抗血清，與現(xiàn)有國內(nèi)外臨床分離奶牛乳房炎金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌代 表株免疫交叉中和達(dá)97%以上，由此選擇5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、 X-IO大腸桿菌菌具有代表國內(nèi)外奶牛乳房炎流行株和疫苗株特征。建立符合疫苗生產(chǎn)要求的5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-IO 大腸桿菌菌及各突變株的奶牛乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批和工作種子批庫。通過BHI、BST、LB培養(yǎng)基放大培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)，制備奶牛乳房炎5、8和336型金葡 菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-IO大腸桿菌菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取 制備了純化5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-IO大腸桿菌菌滅活全菌。通過BHI、TSB、LB等培養(yǎng)基放大培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)，制備奶牛乳房炎5、8和336型金 葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備了純化5、 8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖抗原。制備的5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖抗原用溴化氫、 碳二亞胺偶聯(lián)劑與TT、DT、CRM197或其他合適的載體蛋白共價(jià)偶聯(lián)出奶牛乳房炎5、8和336 型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖結(jié)合蛋白。任一所述的奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X_10大腸桿菌 乳房炎滅活全菌疫苗、滅活全菌+莢膜多糖疫苗、滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗。疫苗中不含有佐劑，制備無佐劑奶牛乳房炎三聯(lián)滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖 疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗。該疫苗中含有佐劑，佐劑為如下的一種①白花油，為商品化佐劑；②FIA，為商 品化佐劑；③鋁鹽，為氫氧化鋁或磷酸鋁；④MF59，為商品化佐劑；⑤SP01，為2%角鯊烯、 0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚混勻水包油樣；⑥SP02，為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖 麻油、0. 聚醚、IOug細(xì)菌鞭毛混勻水包油樣。佐劑也可如上的兩種或多種組合或其它佐 劑。制備有佐劑的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白 疫苗。該疫苗制備成臨床適用的注射劑型包括皮下注射劑型、肌肉注射劑型、乳頭管注 射劑型、微針透皮劑型。該疫苗有或無佐劑奶牛乳房炎三聯(lián)滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多 糖結(jié)合蛋白疫苗通過皮下或肌肉或乳頭管注射，表明該疫苗都能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，皮 下注射高于肌肉、乳頭管途徑；免疫加佐劑好于無佐劑組；有莢膜多糖好于滅活全菌疫苗； 在不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在奶牛體內(nèi)免疫保護(hù)率90%以 上。該疫苗制品在動(dòng)物體內(nèi)使用安全，無不良反應(yīng)。該疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良好，有效期在2年以上。該疫苗制品通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮用于不同品種、不同 年齡奶牛免疫接種，可安全、穩(wěn)定、全面有效預(yù)防金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌感染性奶牛乳房 炎的發(fā)生。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是選擇我國奶牛乳房炎金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌優(yōu)勢(shì)流行菌株 作為疫苗株、通過滅活全菌、滅活全菌+莢膜多糖及莢膜多糖結(jié)合蛋白為疫苗靶抗原、加入 或不加入佐劑，制備奶牛乳房炎三聯(lián)(金葡菌+鏈球菌+大腸桿菌)滅活疫苗(滅活全菌
10疫苗、滅活全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗)注射劑型、微針透皮劑型，為安全、穩(wěn) 定、全面有效預(yù)防金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的發(fā)生提供了有力保證，將 是奶牛乳房炎疫苗發(fā)展的新里程碑。下面參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。給出這些實(shí)施例只是為了舉例說明，它 們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 篩選并確定奶牛金葡菌乳房炎流行優(yōu)勢(shì)菌株作為疫苗菌株從覆蓋我國東西南北中的內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等30個(gè)省 市地90個(gè)中大型奶牛場(chǎng)采集近3萬份臨床奶牛乳房炎奶汁樣品，分離檢定、篩選并確定金 葡菌、鏈球菌、大腸桿菌各血清型奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)菌株；1.奶牛乳樣的采集選取出現(xiàn)臨床癥狀(或者懷疑為亞臨床型乳房炎)乳房炎奶 牛，先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時(shí)進(jìn) 行手指擦拭消毒。每個(gè)乳室先擠去頭2 3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣至少 5mL于無菌乳樣杯中，待檢。2.將乳樣搖勻，分別取適量接種于營養(yǎng)肉湯(10%血清)、普通瓊脂平板、TSA平 板、BHI培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、TSA平板、新鮮脫纖維綿羊血平板、麥康凱瓊脂平板后，置于 37°C溫箱培養(yǎng)24 48h。觀察每個(gè)平板中細(xì)菌生長(zhǎng)的情況，記錄菌落生長(zhǎng)表現(xiàn)。普通瓊脂平板上，37°C，24 72h培養(yǎng)后，可見到濕潤、光滑、隆起的圓形金黃色菌 落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢呈葡萄狀排列，革蘭氏染色陽性，并挑取單個(gè)可疑菌落移 植于肉湯和斜面培養(yǎng)基，經(jīng)37°C培養(yǎng)24 48h。營養(yǎng)肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，管底有少量灰白 色沉淀；新鮮脫纖維綿羊血平板中菌落較大，呈金黃色、圓形，周圍出現(xiàn)明顯的溶血。麥 康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng)。金葡菌生化鑒定，觸酶試驗(yàn)陽性，血漿凝固酶反應(yīng)為陽性。糖發(fā)酵 試驗(yàn)?zāi)芊纸馄咸烟?、乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖發(fā)酵，不能利用阿拉伯糖、丙二酸鹽。氧化 酶陰性，V-P試驗(yàn)陽性，DNA酶試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，吲哚試驗(yàn)為陽性，明膠液 化反應(yīng)為陰性；分離菌株型鑒定將現(xiàn)場(chǎng)分離5、8、336型金葡菌奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)流行株，與從 ATCC購買的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集，結(jié)果顯示分離確定的疫苗株具有型特異性，而沒有交 叉反應(yīng)；將現(xiàn)場(chǎng)分離無乳、停乳、乳房型鏈球菌奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)流行株，與從ATCC購買的標(biāo) 準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集，結(jié)果顯示分離確定的疫苗株具有型特異性，而沒有交叉反應(yīng)；將重配 的0008、01216、02138和02555大腸桿菌疫苗株，與從ATCC購買的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集， 結(jié)果顯示分離確定的疫苗株具有型特異性，而沒有交叉反應(yīng)。3.質(zhì)粒圖譜分析將分離金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌血清型奶牛乳房炎菌株提取 質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA大小及酶切片斷符合奶牛乳房炎金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌各血清型特 征。4. SDS分析菌體蛋白組分將其分離5、8和336金葡菌、無乳、停乳和乳房、0008、 01216,02138和02555大腸桿菌株進(jìn)行SDS-PAGE，可見呈26-30余條大小不等蛋白條帶，進(jìn) 一步免疫印跡符合奶牛乳房炎金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌各血清型蛋白條帶特征。
5.致病性分析將其分離金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌主要血清型奶牛乳房炎菌株 在TSB、LB培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，分離純化各血清型金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌菌株分別注入 6-18周BALB/c鼠腹腔3 X IO8個(gè)活菌、1. 5-2歲家兔腹腔IX IO9個(gè)活菌數(shù)、3_4歲奶牛乳 管1200個(gè)活菌，可使小鼠、家兔動(dòng)物發(fā)病，甚至在1周內(nèi)死亡，對(duì)奶牛觀察產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體 溫、體重、體細(xì)胞數(shù)、細(xì)菌數(shù)等。對(duì)接種后發(fā)病、死亡動(dòng)物肝臟、奶牛乳房進(jìn)行病原菌重分離。 進(jìn)行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查，觀察所分離菌株為5、8和336型金葡菌、無乳、停 乳和乳房型鏈球菌、0008、01216、02138和02555大腸桿菌等血清型奶牛乳房炎主要的致病 菌。以上通過選擇性培養(yǎng)基上分離與篩選、生化鑒定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛動(dòng) 物的致病性等評(píng)價(jià)，確定了 5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、0008、01216、 02138和02555大腸桿菌株主要血清型為我國流行優(yōu)勢(shì)株，占奶牛乳房炎的93%，為候選奶 牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗株提供了依據(jù)。實(shí)施例2 構(gòu)建并篩選奶牛乳房炎大腸桿菌基因工程優(yōu)勢(shì)菌株作為疫苗菌株1.采用致死質(zhì)粒同源重組方法，通過構(gòu)建自殺性致死質(zhì)粒pCVD442_galE，運(yùn)用同 源重組常規(guī)方法敲除0008、01216、02138和02555等大腸桿菌候選優(yōu)勢(shì)菌株的LPS編碼基 因galE以暴露其核心抗原，影響脂多糖合成，而不影響除0抗原之外的其它抗原的免疫原 性，篩選大腸桿菌缺乏鳥苷二磷酸半乳糖異構(gòu)酶突變菌株；2.從中篩選到并命名為乂-10、乂-89、乂-326、乂-2138和乂-2555等大腸桿菌基因工 程菌株，在體外普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，該菌株免疫Balb/c小鼠、豚鼠具有良好免疫原性， 初步確定為奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優(yōu)勢(shì)候選菌株。進(jìn)一步檢定并篩選奶牛乳房炎大腸桿 菌基因工程優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)全面檢定把X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌基因工 程菌株(又稱X-大腸桿菌菌株)作為奶牛乳房炎滅活疫苗菌株。將重配的X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌疫苗株，與從ATCC購買 的J-5標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集，結(jié)果顯示重配疫苗株具有型特異性，而沒有交叉反應(yīng)。實(shí)施例3 制備奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株免疫血清及檢定從確定具有代表性5、8和336血清型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X_10、 X-89、X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌奶牛乳房炎流行優(yōu)勢(shì)株，制備5、8和336血清型金 葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-10、X-89、Χ-326、Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌主要血清 型菌株抗原，分別用3 5 X 107CFU/lml劑量皮下免疫家兔(抗原及抗體陰性)，免后21天 心臟放血，血清抗體效價(jià)達(dá)到1 1600以上，再分別與臨床分離奶牛金葡菌、鏈球菌、大腸 桿菌主要乳房炎毒株、購買美國ATCC和中國菌種庫主要奶牛乳房炎標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行免疫試驗(yàn)， 結(jié)果顯示免疫中和交叉率達(dá)95%以上，由此確定所選用奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無 乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌血清型優(yōu)勢(shì)疫苗株 具有廣泛的代表性。實(shí)施例4 建立奶牛乳房炎滅活疫苗株三級(jí)種子批庫及檢定從確定具有代表奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球 菌、X-IO型大腸桿菌疫苗優(yōu)勢(shì)株，分別接種于培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，收取菌液，建立 奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗三級(jí)種子批庫及全面檢定。1.原始種子批的建立選取奶牛乳房炎5、8和336血清型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-IO型大腸桿菌優(yōu)勢(shì)株菌落劃線接種5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置37°C 培養(yǎng)20-24小時(shí)培養(yǎng)，用脫脂牛奶沖下，第二代作為原始種子批庫，加入5%脫脂奶粉分裝 于凍存管，凍干后-70°C以下長(zhǎng)期保存。2.主種子批的建立取第二代5、8和336血清型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球 菌、X-IO型大腸桿菌疫苗原始種子批菌株接種于BHI或LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20-24小時(shí)， 第三代作為主種子批庫，加入5%脫脂奶粉分裝于凍存管，凍干后-70°C以下長(zhǎng)期保存。3.工作種子批的建立取第三代5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球 菌、X-IO型大腸桿菌疫苗主種子批菌株接種于BHI或LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，第四代 作為主種子批庫，加入20%的甘油分裝于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置_70°C保存。4.三級(jí)種子批的檢定通過對(duì)奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房 型鏈球菌、X-IO型大腸桿菌疫苗菌株原始種子批、主種子批、工作種子批菌株以及傳代30 代菌株的外觀、血清型別、PH值、溶解時(shí)間、水分含量、菌落變異率、形態(tài)與染色、菌株質(zhì)粒圖 譜、莢膜多糖、菌株毒性和免疫原性進(jìn)行了全面檢定。結(jié)果顯示，建立的奶牛5、8和336型金 葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-IO型大腸桿菌金葡菌乳房炎疫苗三級(jí)種子批庫安全、 穩(wěn)定，符合疫苗生產(chǎn)的要求。實(shí)施例5 規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)奶牛乳房炎滅活疫苗原液及滅活取奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X_10大腸桿菌乳房炎三 聯(lián)滅活疫苗工作種子批庫菌株，接種于IOL細(xì)菌培養(yǎng)罐的BHI或LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h ； 然后轉(zhuǎn)接于1000L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)約20h，收獲菌液，取樣作純檢并計(jì)算菌數(shù)； 隨后加入終濃度為0. 4%的甲醛溶液(v/v)，37°C，轉(zhuǎn)速150rpm，滅活36_48h。隨機(jī)取樣連 傳三代無細(xì)菌生長(zhǎng)，用無熱源的PBS洗菌三次，每次4°C，6500rpm離心15min，沉淀用于制備 滅活全菌疫苗抗原，金葡菌、鏈球菌培養(yǎng)液離心上清液用于制備莢膜多糖疫苗抗原。實(shí)施例6 純化奶牛乳房炎滅活全菌、莢膜多糖及檢定1.制備滅活全菌抗原取規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)的奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳 和乳房型鏈球菌、X-IO型大腸桿菌乳房炎疫苗滅活全菌，用PBS洗滌2次，6500rpm/min, 4°C 離心15min，要沉淀，用PBS溶解，測(cè)定含量，凍干或液體為純化的滅活全菌疫苗抗原。2.粗提莢膜多糖抗原取規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)的奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停 乳和乳房型鏈球菌乳房炎疫苗發(fā)酵上清液，加入終濃度為1 %的十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，連續(xù)攪拌后4°C靜置過夜，10000rpm/min離心收沉淀為復(fù)合多糖。將復(fù)合多糖溶入 2M氯化鈣溶液，使十六烷基三甲基溴化銨與多糖解離，加入終濃度為25 %的乙醇，4°C靜置 3h或過夜，5000rpm，4°C離心30min去核酸沉淀。收集澄清的上清液，中加入冷卻的終濃度 為80%的乙醇，4°C靜置3h或過夜沉淀多糖，IOOOOrpm, 4°C離心15min，收集沉淀為粗糖，用 無水乙醇及丙酮各洗2次，干燥，即為多糖粗制品，放置-20°C以下備用。3.純化莢膜多糖抗原將奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢 膜多糖粗制品溶解于10%飽和中性乙酸鈉中，按1 2容量用冷酚提取2-4次，lOOOOrpm， 4°C離心20min，收集上清液，用0. IM氯化鈣溶液透析過夜，再加無水乙醇至終濃度為75%， 充分振搖，4°C靜置3h或過夜沉淀多糖，lOOOOrpm，4°C離心20min，收集沉淀，用無水乙醇及 丙酮各洗2次，測(cè)含量，凍干或液體即得純化莢膜多糖抗原。4.莢膜多糖抗原的鑒定純化的奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌乳房炎疫苗莢膜多糖抗原，通過核酸、蛋白、總氮、總磷、分子大小、純度、糖醛酸、氨基 己糖和甲基戊糖等指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果顯示，制備的奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房 型鏈球菌乳房炎疫苗莢膜多糖抗原純度達(dá)到95%以上，呈單各血清型莢膜多糖抗原成分。實(shí)施例7 制備奶牛乳房炎莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原及檢定將純化奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖分別 加入溴化氫(多糖與溴化氫的重量比例為1 0.5)活化，再加入己二酰井處理，衍化率為 1-3%。再加入TT或DT蛋白或CRM197和碳二亞胺(19. 17mg/ml)，反應(yīng)得到金葡菌莢膜多 糖與TT或DT蛋白或CRM197的化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)物。采用DEAE離子交換柱進(jìn)行色譜分離，即 將莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原，懸浮于lOOmMTris，pH8. 6緩沖液中，再經(jīng)過分子篩柱層析進(jìn)行 分離，去除未結(jié)合的蛋白，分離后的溶液除菌過濾后，即為莢膜多糖結(jié)合TT或DT或CRM197 蛋白抗原。通過高壓液相純度、外源因子測(cè)定，結(jié)果顯示莢膜多糖結(jié)合蛋白純度達(dá)95%、偶 聯(lián)率達(dá)88%，呈單一結(jié)合物成分，無外源因子。實(shí)施例8 制備奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及檢定1.奶牛乳房炎三聯(lián)(5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X_10型 大腸桿菌)滅活(全菌)疫苗①將純化奶牛5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型 鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌抗原不加佐劑，配制1 X 1010CFU/lml,5X1010CFU/5ml 無佐劑注射劑型；②將純化奶牛5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO 型大腸桿菌滅活全菌抗原加入氫氧化鋁或磷酸鋁，配制1 X 101(lCFU/0. 5mg (鋁鹽)/1ml、 5X1010CFU/2. 5mg (鋁鹽)/5ml有鋁鹽佐劑注射劑型；③將純化奶牛5、8和336型金葡菌+ 無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌抗原加入等量SPOl佐劑(2%角鯊 烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、 0. 聚醚、IOug細(xì)菌鞭毛)混勻水包油樣，配制1 X 1010CFU+0. 5ml SPOl (或SP02)/lml、 5X1010+2. 5mlSP01 (或SP02CFU) /5ml有SPOl或SP02佐劑注射劑型；④將純化奶牛5、8和 336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌抗原加入等量白花 油佐劑混勻油包水樣，配制1X101qCFU+0. 5ml白花油(IFA)/lml、5X 10lclCFU/+2. 5ml白花油 (IFA)/5ml有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗劑型可用為皮下注射、肌肉注射、乳頭管 注射、微針透皮劑型，放置2-8 °C備用。2.奶牛乳房炎三聯(lián)(5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO 型大腸桿菌)滅活(全菌+莢膜多糖)疫苗①將純化奶牛5、8和336型金葡菌+無 乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌+莢膜多糖抗原不加佐劑，配制 5 X 10lclCFU+10ugCPs/lml、10 X 10lclCFU+100ugCPs/5ml 無佐劑注射劑型；②將純化奶牛 5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌+莢膜 多糖抗原加入氫氧化鋁或磷酸鋁，分別配制5 X 1010CFU+10ugCPs/0. 5mg (鋁鹽)/lml、 10X1010CFU+100ugCPs/2. 5mg(鋁鹽)/5ml有鋁鹽佐劑注射劑型；③將純化奶牛5、8和 336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌+莢膜多糖抗 原加入等量SPOl佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐劑 (2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細(xì)菌鞭毛)混勻水包油樣，配制 5X 10lclCFU+10ugCPs+0. 5ml SPOl (或 SP02) /lml, 10 X 10lclCFU+100ugCPs+2. 5ml SPOl (或 SP02)/5ml有SP01、SP02佐劑注射劑型；④將純化奶牛5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X-IO型大腸桿菌滅活全菌+莢膜多糖抗原加入等量白花油佐劑混勻油包水 樣，分別配制 5X10lclCFU+10ugCPs+0. 5ml 白花油(IFA)/lml, 10X 10lclCFU+100ugCPs+2. 5ml 白花油(IFA)/5ml有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗可作為皮下注射、肌肉注射、乳頭 管注射、微針透皮劑型，放置2-8 °C備用。3.奶牛乳房炎三聯(lián)(5、8和336型金葡菌+無乳、停乳和乳房型鏈球菌+X_10型大 腸桿菌)滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗①將純化奶牛5、8和336型金葡菌莢膜多糖結(jié)合蛋 白(載體蛋白TT或DT或CRM197) +無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋 白TT或DT或CRM197) +X-IO型大腸桿菌滅活全菌抗原不加佐劑，配制50ugCPs+20ugTT (或 DT 或 CRM197)+lX10lclCFU/lml、100ugCPs+50ugTT(或 DT 或 CRM197)+5 X 10lclCFU/5ml 無 佐劑注射劑型；②將純化奶牛5、8和336型金葡菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或 DT或CRM197)抗原+無乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或DT 或CRM197)抗原+X-IO型大腸桿菌滅活全菌抗原加入等量氫氧化鋁或磷酸鋁，分別配制 50ugCPs+20ugTT (或DT 或CRM197) +1 X 10lclCFU/0. 5mg (鋁鹽)/lml、100ugCPs+50ugTT (或DT 或CRM197) +5 X 1010CFU/2. 5mg (鋁鹽)/5ml有鋁鹽佐劑注射劑型；③將純化奶牛5、8和336 型金葡菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或DT或CRM197)抗原+無乳、停乳和乳房型鏈球 菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或DT或CRM197)抗原+X-IO型大腸桿菌抗原加入等量 SPOl佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)、SP02佐劑(2%角鯊烯、0. 1% 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細(xì)菌鞭毛)混勻水包油樣，分別配制50UgCPS+20UgTT (或 DT 或 CRM197) +1 X 10lclCFU+0. 5ml SPOl (或 SP02 或 CRM197)/lml、100ugCPs+50ugTT (或 DT
CRM197) +5 X 1010CFU+2. 5ml SPOl (或 SP02)/5ml 有 SPOl、SP02 佐劑注射劑型；④將純 化奶牛5、8和336型金葡菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或DT或CRM197)抗原+無 乳、停乳和乳房型鏈球菌莢膜多糖結(jié)合蛋白(載體蛋白TT或DT或CRM197)抗原+X-10型 大腸桿菌抗原加入等量白花油或IFA佐劑混勻油包水樣，分別配制50UgCPs+20UgTT(或 DT 或 CRM197)+lX10lclCFU+0. 5ml 白花油或 IFA/lml、100ugCPs+50ugTT (或 DT 或 CRM197)+5X1010CFU+2. 5ml白花油或IFA/5ml有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗可作 為皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮劑型，放置2-8°C備用。4.將本發(fā)明實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)(金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌)滅活 (全菌、全菌+莢膜多糖、全菌+莢膜多糖結(jié)合蛋白)疫苗有佐劑或無佐劑劑型進(jìn)行安全 性評(píng)價(jià)。結(jié)果可見，奶牛金葡菌乳房炎三聯(lián)滅活疫苗外觀見均一，無異味和染菌；PH7. 0 7. 2，通過豚鼠、家兔試驗(yàn)無熱原、異常毒性和急性毒性反應(yīng)；通過染色和鏡檢無雜菌污染、 熱源質(zhì)檢測(cè)在范圍內(nèi)；通過SDS-PAGE和WB檢測(cè)抗原蛋白成分存在；通過免疫Balb/C小鼠 1次血清中和抗體效價(jià)在1600以上。實(shí)施例9 本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的免疫效果評(píng)價(jià)1.將本發(fā)明實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)(金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌)滅活 (全菌、全菌+莢膜多糖、全菌+莢膜多糖結(jié)合蛋白)疫苗及金葡菌三價(jià)滅活莢膜多糖結(jié)合 蛋白、鏈球菌三價(jià)滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白、大腸桿菌滅活全菌加入或不加入相應(yīng)佐劑，制備 的皮下、肌肉、乳管注射疫苗劑型、微針透皮劑型，并用PBS、鋁鹽、SPOU SP02、白花油、IFA、 細(xì)菌鞭毛為對(duì)照組，分別免疫6-8周Balb/C小鼠、18月家兔，每組10只，其免疫劑量按實(shí) 施例8疫苗劑量組，免疫兩次(0，28天)；末次免疫后14天將各組小鼠、家兔取血、分離血
15清和免疫細(xì)胞，及通過ELISA法測(cè)定血清、乳汁抗體效價(jià)都在1 6400以上，采用MTT法測(cè) 定中和抗體效價(jià)都在1 3200以上，采用流式細(xì)胞儀、ELISP0T儀測(cè)定免疫細(xì)胞與血清中 重要細(xì)胞因子、炎性分子、趨化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動(dòng)態(tài)變化使得TH2/Thl 應(yīng)答平衡，采用ELISA法測(cè)定乳汁slgA抗體效價(jià)都在1 120以上。說明制備的奶牛乳房 炎三聯(lián)滅活疫苗不管是加入佐劑或沒加入佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出 試驗(yàn)組有佐劑優(yōu)于無佐劑組、高劑量組高于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對(duì)陰性照組沒有產(chǎn) 生雙重免疫應(yīng)答；制備的奶牛乳房炎滅活疫苗不管是皮下注射還是肌肉、乳管注射劑型均 都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑血清抗體效價(jià)高于乳管內(nèi)注射劑型，乳管內(nèi)注射 的黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于肌肉和皮下免疫途徑；制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活全菌+莢膜 多糖結(jié)合蛋白疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于滅活全菌疫苗和全菌+莢膜多糖疫苗；制備的奶牛乳 房炎滅活三聯(lián)滅活疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于單聯(lián)滅活疫苗；由此制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活 疫苗在小鼠、家兔體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果；SPOl或SP02佐劑整體優(yōu)于鋁鹽、白花油和 IFA佐劑組，且在不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)。由此，研制的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在 小鼠、家兔體內(nèi)有很好的免疫原性。2.將本發(fā)明實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)(金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌)滅活 (全菌、全菌+莢膜多糖、全菌+莢膜多糖結(jié)合蛋白)疫苗及金葡菌三價(jià)滅活莢膜多糖結(jié)合 蛋白、鏈球菌三價(jià)滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白、大腸桿菌滅活全菌及金葡菌三價(jià)滅活莢膜多糖 結(jié)合蛋白、鏈球菌三價(jià)滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白、大腸桿菌滅活全菌加入或不加入相應(yīng)佐劑， 制備的皮下、肌肉、乳管注射疫苗劑型、微針透皮劑型，并用PBS、鋁鹽、SPOU SP02、白花油、 IFA、細(xì)菌鞭毛為對(duì)照組，分別按皮下、肌肉、乳管注射途徑選擇2-3歲即將進(jìn)入泌乳期(即 產(chǎn)前25d，懷孕8個(gè)月20d)健康(即疫苗抗體陰性，病原體陰性)奶牛，每組10頭；其免疫 劑量按實(shí)施例8疫苗劑量組，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、 31天)；末次免疫后14天取血、分離血清和免疫細(xì)胞，采集、乳汁，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、 體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及通過ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)25600以上、乳汁抗體效價(jià) 達(dá)到1 6400以上，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)都在1 12800以上，說明制備的奶牛乳 房炎三價(jià)滅活疫苗不管是加入佐劑與沒有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出 試驗(yàn)組有佐劑優(yōu)于無佐劑組、高劑量組高于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對(duì)陰性照組沒有產(chǎn) 生雙重免疫應(yīng)答；制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗不管是皮下注射還是肌肉、乳管注射劑 型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且皮下、肌肉注射劑血清抗體效價(jià)高于乳管內(nèi)注射劑 型，乳管內(nèi)注射的黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于肌肉和皮下免疫途徑；制備的奶牛乳房炎三聯(lián) 滅活莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于滅活全菌疫苗和全菌+莢膜多糖疫苗；制備 的奶牛乳房炎滅活三價(jià)滅活疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于單價(jià)滅活疫苗；由此制備的奶牛乳房炎 三聯(lián)滅活疫苗在奶牛體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果；SP01、SP02佐劑整體優(yōu)于鋁鹽、白花油、 FIA佐劑組，且與劑量呈正相關(guān)免疫應(yīng)答趨勢(shì)。依上末次免疫14天后，分別用臨床分離5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈 球菌、001111大腸桿菌野毒株進(jìn)行攻毒，通過導(dǎo)管奶頭注射將1200CFU(5、8、336型金葡菌、 無乳、停乳、乳房型鏈球菌、01111、0157型大腸桿菌)野生菌株注入乳區(qū)。攻毒后觀測(cè)臨床 癥狀(發(fā)燒、乳腺腫脹)，奶樣質(zhì)量(血奶、異常塊、奶量減少)、進(jìn)食情況(進(jìn)食減少)及發(fā) 病情況，通過奶樣細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、體細(xì)胞計(jì)數(shù)SCC和血清抗體ELISA分析指標(biāo)評(píng)價(jià)保護(hù)率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，研制的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在奶牛體內(nèi)有良好的保護(hù)率，且高于單用金 葡菌三價(jià)滅活疫苗、鏈球菌三價(jià)滅活疫苗、大腸桿菌滅活疫苗組的保護(hù)率，保護(hù)率達(dá)到90% 以上。實(shí)施例10 本發(fā)明奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在奶牛體內(nèi)的長(zhǎng)效免疫保護(hù)評(píng)價(jià)將本發(fā)明實(shí)施例8制備的奶牛金葡菌乳房炎三聯(lián)滅活疫苗頸部皮下注射免疫2-3 歲即將進(jìn)入泌乳期(即產(chǎn)前25d，懷孕8個(gè)月20d)健康(即疫苗抗體陰性，病原體陰性)奶 牛，每組 20 頭；免疫劑量在(抗原 100ugCPs+50ugTT (或 DT 或 CRM197)+5X101QCFU+2. 5ml SPOl (或SP02)/5m，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)， 第二年后加強(qiáng)免疫1次，觀察三年(1083天)，其間每隔3個(gè)月取血、奶汁，觀察奶牛產(chǎn)奶量 與質(zhì)量、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及通過ELISA、ELISP0T測(cè)定抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫的長(zhǎng)效免疫 應(yīng)答及保護(hù)效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，研制的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗具有長(zhǎng)效免疫應(yīng)答和免 疫保護(hù)，第一年免疫3次后，以后每年加強(qiáng)免疫一次，其保護(hù)率達(dá)90%以上。實(shí)施例11 本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗安全性試驗(yàn)(1)無菌、支原體試驗(yàn)將實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗接種硫乙醇 酸鹽培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無菌生理鹽水做陰性對(duì) 照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗未見細(xì)菌生長(zhǎng)。將奶牛乳 房炎三聯(lián)滅活疫苗分別用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天，無菌 生理鹽水做陰性對(duì)照，結(jié)果顯示奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗無支原體生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，奶牛乳 房炎三聯(lián)滅活疫苗無支原體生長(zhǎng)。(2)溶血性試驗(yàn)選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌 3次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。PBS稀釋奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗(由實(shí)施例8 制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時(shí)后，評(píng)價(jià)血球 溶解以目測(cè)或者上清濃度檢測(cè)為準(zhǔn)，并在570nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，沒有發(fā)生血球破 裂，無溶血現(xiàn)象。說明奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗中的成分不能使紅細(xì)胞裂解。因此，奶牛乳 房炎三聯(lián)滅活疫苗無溶血反應(yīng)。(3)急性毒性試驗(yàn)取實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗0. 5ml腹腔注射 體重為12 18g Balb/C小鼠，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察小鼠的 活動(dòng)狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，沒有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行 動(dòng)遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在試驗(yàn)的濃度下 對(duì)動(dòng)物是安全的，且14天后處死進(jìn)行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。在體重為8 IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果取實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗肌肉 注射15ML，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察行為、體重和存活率變化。結(jié) 果可見，Beagle狗未見毒性反應(yīng)，行為正常，沒有死亡，與對(duì)照組狗比較無差異，各狗體重有 所增加，并處死大體解剖未見臟器有明顯的病理改變。因此，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗無急 性毒性反應(yīng)，使用是安全的。(4)過敏試驗(yàn)研究取實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗皮下接種體重為 250 350g Hartley豚鼠，每個(gè)樣品接種豚鼠5只，每只接種0.5ml，隔日一次，共3次。第 3次注射后21天，耳靜脈給予相同奶牛奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗0. 5ml，并用人血白蛋白和 生理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽性、陰性對(duì)照。注射后30分鐘及3天觀察動(dòng)物，陽性、陰性對(duì)照均成立，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗組豚鼠無死亡，且無鼻癢、噴嚏、煩 躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏癥狀。因此，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗在動(dòng)物體內(nèi)無過 敏反應(yīng)。(5)兔熱源質(zhì)試驗(yàn)取預(yù)檢合格的體重為2 3kg家兔3只固定，30分鐘后測(cè) 量體溫，共測(cè)2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0. 2°C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 5°C。將實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗預(yù)熱至38°C，于第2次測(cè)溫后 15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈緩緩注入0. 5ml/只。注射后每隔30分鐘測(cè)量體溫1次，連測(cè)6 次。結(jié)果顯示奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗給予家兔個(gè)體升溫未超過0.2°C，3只家兔升溫總 和未超過0. 40C，沒有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗無熱源 質(zhì)。(6)免疫病理損傷試驗(yàn)由實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗通過小鼠、家 兔和奶牛外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞及 氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗免疫接種不 管在小動(dòng)物，或是在奶牛體內(nèi)Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒有免疫器官損傷的跡象，因此 具有安全性。實(shí)施例12 本發(fā)明奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)由實(shí)施例8制備的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗，分別置于2_8°C、室溫(20-25°C )、 37 °C 1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月和24個(gè)月，取樣觀察外觀、PH值、 無菌、電鏡觀察粒徑、免疫動(dòng)物觀察安全性。結(jié)果顯示奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗放置 2-80C 24個(gè)月內(nèi)均無變色分層等現(xiàn)象，PH值在7. 0-7. 2之間無變化，電鏡觀察粒徑大小保持 一致，且注射給Balb/c小鼠表現(xiàn)正常；奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗放置室溫25°C 3個(gè)月內(nèi)均 有好的穩(wěn)定性；奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗放置室溫37°C 1個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效果。由 結(jié)果說明，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗放置2-8°C理化性質(zhì)、生物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期至少48 個(gè)月。
權(quán)利要求
1. 一種奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，其特征是(1)通過對(duì)奶牛乳腺炎奶樣金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌分離、鑒定，篩選并確定金葡菌 流行優(yōu)勢(shì)株是5、8和336血清型、鏈球菌流行優(yōu)勢(shì)株是無乳、停乳和乳房血清型、大腸桿菌 0008、01216、02138、02555等為我國奶牛乳腺炎感染流行優(yōu)勢(shì)菌株，三種細(xì)菌占感染菌的 92%以上；在本方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、0008、 01216、02138和02555型大腸桿菌作為奶牛乳腺炎優(yōu)勢(shì)流行菌株；包括任何適宜于當(dāng)前和 今后廣泛流行金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌野生株、突變株；(2)通過構(gòu)建自殺性致死質(zhì)粒pCVD442-galE系統(tǒng)，運(yùn)用同源重組常規(guī)方法敲除0008、 01216,02138和02555大腸桿菌候選優(yōu)勢(shì)菌株的LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而 不影響除0抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選并命名為X-10、X-89、X-326、X-2138和 X-2555大腸桿菌重組工程菌(簡(jiǎn)稱X-大腸桿菌)株，在體外普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，傳代 穩(wěn)定、免疫原性良好的奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優(yōu)勢(shì)候選菌株；在本方法中，包括但不局限X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌重組工程 菌株作為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株；包括通過該方法制備的奶牛大腸桿菌基因工程菌 (稱奶牛大腸桿菌，又稱χ-大腸桿菌)株均可用作為候選疫苗株；(3)制備了奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、X-10、X_89、 X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌優(yōu)勢(shì)流行菌株兔抗血清，分別與已有國內(nèi)外臨床分離奶 牛乳房炎金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌菌代表株進(jìn)行中和試驗(yàn)，其免疫交叉保護(hù)達(dá)96%以上， 由此選用的5、8、336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和 Χ-2555等大腸桿菌感染奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株具有代表國內(nèi)外流行株；(4)選用5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、Χ-10、Χ-89、Χ-326、Χ-2138 和Χ-2555大腸桿菌感染奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗株，通過培養(yǎng)傳代、建立了 5、8和336型金葡 菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555等大腸桿菌奶牛乳房炎 滅活疫苗原始種子批、主種子批和工作種子批庫，進(jìn)一步通過理化性質(zhì)、基因特征、毒理和 免疫原性等全面分析。表明建立的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗菌株三級(jí)種子批庫符合疫苗生 產(chǎn)用要求；在本方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、Χ-10、 X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌重組工程菌株作為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株 建立種子批庫；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行的金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌野生株、突變 株建立疫苗株種子批庫；(5)通過奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、Χ-10、Χ-89、Χ-326、 Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌三聯(lián)滅活菌苗工作種子批株，從IOL到1000L發(fā)酵放大培養(yǎng)，制 備了奶牛乳房炎三聯(lián)滅活菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備純化5、8和336 型金葡菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌、X-10、X-89、X-326、Χ-2138和Χ-2555大腸桿菌血清型 滅活全菌、莢膜多糖抗原，抗原純度達(dá)95% ；通過對(duì)溫度、時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu)化， 獲得了規(guī)模化生產(chǎn)滅活全菌、莢膜多糖疫苗抗原原液；進(jìn)一步進(jìn)行血清型別、理化性質(zhì)、基 因特征、外源因子、免疫原性等全面鑒定；在本方法中，包括不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌、Χ-10、Χ-89、X-326、X-2138和X-2555大腸桿菌菌苗工作種子批株、BHI、TSB培養(yǎng)基用于疫苗原液規(guī)?；?生產(chǎn)；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行的候選金葡菌新優(yōu)勢(shì)疫苗菌株及LB等培養(yǎng)基介質(zhì)；(6)純化的奶牛5、8和336血清型金黃色葡萄球菌、無乳、停乳和乳房鏈球菌乳房炎 滅活莢膜多糖疫苗原液，用偶聯(lián)劑與破傷風(fēng)毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、無毒力白 喉毒素蛋白(CRM197)或其他合適的載體蛋白分子；依Pr-L-Ps結(jié)構(gòu)式偶聯(lián)，其中，Pr是 載體蛋白，Ps是奶牛金葡菌莢膜多糖，L是共價(jià)鍵、或連接基團(tuán)，且Ps Pr的質(zhì)量比為 0.5-3.5 1 ；先采用溴化氫活化多糖，然后再采用碳二亞胺將活化的多糖與蛋白共價(jià)偶 聯(lián)；制備出奶牛金葡菌、鏈球菌乳房炎莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197載體 蛋白與各血清型莢膜多糖結(jié)合蛋白都有好的交聯(lián)效果，交聯(lián)率達(dá)85%以上，由此TT或DT或 CRM197均可作為該疫苗載體結(jié)合蛋白；在本方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌滅活莢膜 多糖和TT、DT、CRM197交聯(lián)載體蛋白；包括適用于當(dāng)前和今后廣泛流行金葡菌、鏈球菌株莢 膜多糖及其他載體蛋白；(7)制備的有效劑量純化奶牛5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌乳房炎 滅活全菌(比如1 IOX IOltlCFU)、全菌(比如1 10 X IOltlCFU)+莢膜多糖(比如10 60Ug)抗原、莢膜多糖結(jié)合蛋白抗原(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197)、 X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌(比如1 10X101(ICFU)，與常規(guī)用量的白花油、FIA、鋁鹽、 MF59.SP01和SP02等疫苗佐劑均勻，制備奶牛乳房炎三聯(lián)(金葡菌、鏈球菌、大腸桿菌)滅 活全菌、全菌+莢膜多糖、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛動(dòng)物，間 隔28天，皮下或肌肉或乳頭管或微針透皮免疫2次，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞， 觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體重、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及ELISA、ELISP0T測(cè)定抗體效 價(jià)、細(xì)胞免疫水平及死亡情況；試驗(yàn)結(jié)果可見，這幾種佐劑均能提高奶牛乳房炎滅活疫苗抗 體滴度、依次是FIA、白花油、SPOU MF59和鋁鹽佐劑，且在不同動(dòng)物呈現(xiàn)一致性趨勢(shì)；由此 SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽均可有效的作為奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗的佐劑；在本方法中，包括但不限于3 01、5 02、1^59、白花油4認(rèn)和鋁鹽佐劑中的一種或幾種 用于奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗的制備；包括免疫刺激復(fù)合物、細(xì)胞因子、脂質(zhì)體等佐劑；(8)、本發(fā)明的奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗可不含有佐劑，也可以含有SP01、SP02、MF59、 白花油、FIA和鋁鹽佐劑中的一種或幾種，①制備有效劑量的有或無佐劑的奶牛乳房炎單聯(lián) 滅活(比如1 IOX IOiciCFU金葡菌或1 IOX IOiciCFU鏈球菌或1 IOX IOiciCFU X-大 腸桿菌)全菌疫苗注射劑型、三聯(lián)滅活(比如1 10 X IOltlCFU金葡菌+1 10 X IOltlCFU鏈 球菌+1 10 X IO10CFU X-大腸桿菌)全菌疫苗注射劑型；②制備有或無佐劑的奶牛乳房炎 單聯(lián)滅活(比如1 IOX IOltlCFU全菌+莢膜多糖10 60Ug金葡菌、1 10 X IOltlCFU全 菌+莢膜多糖10 60Ug鏈球菌)疫苗注射劑型、三聯(lián)滅活(比如1 IOX IOltlCFU全菌 +莢膜多糖10 60Ug金葡菌+1 IOX IOltlCFU全菌+莢膜多糖10 60Ug鏈球菌+1 IOXIO10CFU Χ-大腸桿菌)全菌+莢膜多糖疫苗注射劑型；③制備有或無佐劑的奶牛單聯(lián) 滅活(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197金葡菌或鏈球菌)莢膜多糖結(jié) 合蛋白疫苗注射劑型、三聯(lián)滅活(比如40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT或DT或CRM197金葡 菌 +40 60Ug/CPs-10 20Ug/TT 或 DT 或 CRM197 鏈球菌 +1 10 X IO10CFU X-大腸桿菌) 莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗注射劑型、微針透皮劑型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，其特征是奶牛 乳房炎三聯(lián)滅活疫苗注射劑型可皮下注射，也可以肌肉、乳頭管注射，也可以微針透皮免 疫，也可以一種或幾種途徑聯(lián)合免疫，制備有或無佐劑的奶牛乳房炎不同劑量單聯(lián)、三聯(lián)滅 活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c、豚鼠、家兔和 奶牛動(dòng)物，觀察過敏性反應(yīng)、異常毒性、熱源質(zhì)反應(yīng)、一般毒性。結(jié)果表明奶牛乳房炎三聯(lián) 滅活疫苗制品接種動(dòng)物是安全的；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，其特征是奶乳 房炎三聯(lián)滅活疫苗有或無佐劑的滅活單、三聯(lián)不同劑量滅活全菌疫苗、全菌+莢膜多糖疫 苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗，分別免疫BALB/c、家兔和奶牛動(dòng)物，間斷采集奶汁、血清、血細(xì) 胞及脾細(xì)胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì)量、體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、排細(xì)菌數(shù)、抗體效價(jià)、脾細(xì)胞計(jì) 數(shù)及細(xì)胞因子變化，通過量效、時(shí)效、次效測(cè)定抗體和細(xì)胞免疫水平以評(píng)價(jià)免疫原性；進(jìn)一 步在2-3歲即將進(jìn)入泌乳期(即產(chǎn)前25d，懷孕8個(gè)月20d)健康奶牛，有效免疫劑量是滅活 全菌疫苗(比如5X IO10CFU)、滅活全菌+莢膜多糖(比如5X1010CFU+50UgCPs)、莢膜多糖 結(jié)合蛋白(比如50UgCPs+20UgTT或DT或CRM197)疫苗，0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前 25天，產(chǎn)后3天、31天)，末次免疫后14天用1500CFU(5、8、336型金葡菌、無乳、停乳、乳房 型鏈球菌、01111、0157型大腸桿菌)野生菌株乳頭管內(nèi)注射攻毒，間斷采集奶汁、血清、血 細(xì)胞及脾細(xì)胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì)量、體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌數(shù)、抗體效價(jià)、脾細(xì)胞計(jì) 數(shù)及細(xì)胞因子等指標(biāo)評(píng)價(jià)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，制備的不管是皮下或是以肌肉或是乳頭 管注射、不管是有佐劑或是無佐劑奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗都有產(chǎn)生高效價(jià)抗體滴度，與 劑量呈相關(guān)，且5 X 101(lCFU、50UgCPS、20Ug TT或DT或CRM197達(dá)到平臺(tái)期，加佐劑好于無佐 劑組，三聯(lián)聯(lián)好于單聯(lián)、且有疊加效應(yīng)，莢膜多糖好于滅活全菌疫苗，在不同動(dòng)物有一致免 疫應(yīng)答趨勢(shì)，加莢膜多糖可提高免疫保護(hù)率，在奶牛體內(nèi)免疫保護(hù)率90%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，其特征是奶牛 乳房炎三聯(lián)滅活疫苗有或無佐劑的滅活單價(jià)、多價(jià)不同劑量(藍(lán)字拆掉)滅活全菌疫苗、全 菌+莢膜多糖疫苗、莢膜多糖結(jié)合蛋白疫苗制品，分別置于4°C、室溫(20-25) °C和37°C，從 外觀、PH、蛋白含量、動(dòng)物免疫原性等指標(biāo)觀察疫苗穩(wěn)定性；結(jié)果表明，奶牛乳房炎三聯(lián)滅活 疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良好，有效期2年。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，主要包括5、8和336型金葡菌、無乳、停乳和乳房型鏈球菌及經(jīng)基因定點(diǎn)缺失鳥苷二磷酸半乳糖異構(gòu)酶突變菌株的X-10大腸桿菌主要優(yōu)勢(shì)疫苗菌株，通過發(fā)酵規(guī)?；a(chǎn)培養(yǎng)菌液、滅活、純化等工藝，經(jīng)此形成奶牛乳房炎三聯(lián)滅活抗原，不加或加入白花油、FIA、鋁鹽、MF59、SP01、SP02佐劑、免疫刺激復(fù)合物、免疫細(xì)胞因子等佐劑，制備奶牛乳房炎三聯(lián)滅活疫苗注射劑型、微針透皮劑型，通過皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮的一種或幾種聯(lián)合免疫接種奶牛后，可安全、穩(wěn)定、全面有效預(yù)防金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61K39/09GK101991847SQ201010544438
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者劉永存, 劉永祥, 孫藝萍, 李敏, 楊定興, 楊秀蘭, 王冬冬, 王鋮 申請(qǐng)人:赤峰博恩藥業(yè)有限公司