專利名稱：一種通過組織工程構(gòu)建的瓣膜組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過組織工程構(gòu)建的瓣膜組織。
背景技術(shù)：
心臟瓣膜置換術(shù)是心外科常用手術(shù)，目前臨床上所用的人工瓣膜有機(jī)械瓣、生物瓣兩類。接受機(jī)械瓣者需終生抗凝以減少血栓栓塞并發(fā)癥，近期有統(tǒng)計(jì)顯示其10年生存率僅60 %，主要死因是瓣膜脫離、卡阻和抗凝引起凝血功能障礙導(dǎo)致的并發(fā)癥。生物瓣無須終生抗凝，五年生存率高達(dá)100 %，但其耐久性差，易于發(fā)生鈣化，8 - 10年后因退行性變需再次手術(shù)。目前隨著微創(chuàng)手術(shù)技術(shù)的發(fā)展及組織工程概念的提出，新型的組織工程化生物瓣成為各國研究的重點(diǎn)。組織工程學(xué)應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，研究、開發(fā)用于修復(fù)、增進(jìn)或改善人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的生物替代品。所述生物替代品的基本制備方法是將細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與可降解生物材料相結(jié)合形成細(xì)胞一可降解生物材料復(fù)合體，用以替代受損組織器官。它具有形成具有生命力的活體組織，少量細(xì)胞修復(fù)大塊缺損，并可按組織、器官缺損情況任意塑型等特點(diǎn)。就組織工程化心瓣膜而言，目前尚存在血管內(nèi)皮細(xì)胞來源及尋找合適的可降解支架材料兩大技術(shù)難點(diǎn)。組織工程化瓣膜包含血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞兩類種子細(xì)胞，目前重建瓣膜實(shí)驗(yàn)需取患者大段血管，再通過復(fù)雜的技術(shù)分離成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，故無法擺脫以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷的模式。此外眾所周知體細(xì)胞體外培養(yǎng)難度極大，一般傳幾代即發(fā)生變性，而構(gòu)建瓣膜需要大量血管內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)此，既往研究重點(diǎn)大多放在胚胎干細(xì)胞與端粒酶上，但前者面臨倫理學(xué)的異議，后者因其可能誘發(fā)腫瘤而鮮有問津。目前認(rèn)為，組織工程支架材料有如下作用1 )維持組織結(jié)構(gòu)的完整性并防止變形，2 )作為屏障抑制周圍組織的過度再生，3 )作為細(xì)胞遷移和增殖的支架，4 )通過與細(xì)胞表面細(xì)胞受體的相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。理想的支架材料應(yīng)具備良好的細(xì)胞相容性、組織相容性、與細(xì)胞生長速率相匹配的降解速率及一定的強(qiáng)度和可塑性。既往多利用聚羥基乙酸(PGA )等合成高分子降解材料，但其生物相容性和細(xì)胞親和性不甚理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過組織工程構(gòu)建的瓣膜組織。本發(fā)明通過多種途徑提取種子細(xì)胞，將所得種子細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代和增殖后，分步種植于脫細(xì)胞基質(zhì)，構(gòu)建成組織工程化瓣膜。本發(fā)明采用脫細(xì)胞基質(zhì)作為可降解支架材料。其生物相容性好、易于種植細(xì)胞，并能保存正常組織的天然結(jié)構(gòu)和組織強(qiáng)度。本發(fā)明通過多種途徑提取種子細(xì)胞。所述種子細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。本發(fā)明通過提取骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞，靜脈、動(dòng)脈血管血管內(nèi)皮細(xì)胞，脂肪組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞得到內(nèi)皮細(xì)胞種子細(xì)胞；通過提取骨髓成纖維細(xì)胞，皮下結(jié)締組織成纖維細(xì)胞得到成纖維細(xì)胞種子細(xì)胞。將所得種子細(xì)胞體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，達(dá)到所需數(shù)量后， 分步接種于可降解支架材料，先接種成纖維細(xì)胞制成成纖維細(xì)胞一支架材料復(fù)合物，再于復(fù)合物表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建成本發(fā)明組織工程化瓣膜。本發(fā)明所述脫細(xì)胞基質(zhì)可以是同種異體和異種瓣膜組織脫細(xì)胞基質(zhì)，心包組織脫細(xì)胞基質(zhì)和血管組織脫細(xì)胞基質(zhì)。本發(fā)明所述血管內(nèi)皮細(xì)胞可來源于骨髓，靜脈血管、動(dòng)脈血管和脂肪組織。還可以是經(jīng)過基因修飾、改造的血管內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞可來源于骨髓和皮下結(jié)締組織。還可以是經(jīng)過基因修飾、改造的成纖維細(xì)胞。本發(fā)明組織工程化瓣膜，具有以下特點(diǎn)具有正常瓣膜組織的組織結(jié)構(gòu)，表面為血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，中間是以成纖維細(xì)胞為主要成分的結(jié)締組織，是具有新陳代謝功能的活組織。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例提取種子細(xì)胞(下述各方法可單獨(dú)或聯(lián)合采用) 血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取
骨髓來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取方法抽取受體自體骨髓5 - IOml，PBS清洗，離心速度 1500gX10min。Ficoll 分離(5ml 細(xì)胞懸液+ Ficoll sml，離心速度 200g X 25min )，提取有核細(xì)胞，PBS + EDTA清洗兩次。加入標(biāo)有磁珠的⑶31抗體6 - 12°C 放置15min ；每IO8細(xì)胞+ 5 - IOccPBS清洗兩次。MACS分離MS + / RS +柱預(yù)先500ul PBS浸潤，細(xì)胞懸液過柱后PBS 500ul清洗濾柱3次。Lml PBS沖洗濾柱得 CD31+細(xì)胞。靜脈血管、動(dòng)脈血管來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取方法取靜脈血管、動(dòng)脈血管5-IOCM，兩端結(jié)扎，管腔內(nèi)灌注經(jīng)0.25 — 0.5 %胰酶或0.5 %中性蛋白酶( Dispasell )，37°C，5 % CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置5 - 10分鐘，放開一端，倒出內(nèi)容物，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。PBS清洗兩次。脂肪組織來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取方法將抽取的脂肪組織移入離心管中， 1200r / min離心5分鐘。棄去上清液，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液IOml， 混勻。如此分離脂肪組織中毛細(xì)血管。0.25 — 0.5 %胰酶或0.5 %中性蛋白酶，37°C ，5 % CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘。加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。PBS清洗兩次。成纖維細(xì)胞的提取
骨髓來源成纖維細(xì)胞的提取方法將上述(Al . 1 )過柱細(xì)胞(⑶31陰性)另置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，DMED培養(yǎng)液，成纖維細(xì)胞較易生長，利用差速貼壁法可得到成纖維細(xì)胞。皮下結(jié)締組織來源成纖維細(xì)胞的提取方法將撕下表皮后的真皮剪成碎塊，用0.2 %的膠原酶在37 V消化2小時(shí)，經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，以1200r / min離心5分鐘，棄去上清，加入無鈣鎂PBS清洗3次。加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液IOml，混勻。
細(xì)胞培養(yǎng)和傳代將上述方法得到的細(xì)胞計(jì)數(shù)后制成單細(xì)胞懸液，按1-2X106 / 75cm2密度接種培養(yǎng)，含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 °C，5 % CO2, 100 %相對(duì)濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)液3天換一次。細(xì)胞融合到60 % - 75 %密度時(shí)，用IOml無鈣鎂PBS 沖洗，經(jīng)0.25 %胰酶37°C消化5分鐘，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1200r / min離心5分鐘。棄去上清液，加入含10 %胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液IOml，混勻，計(jì)數(shù)，按1 3的比例傳代培養(yǎng)。2 - 3日換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合至60 75 %密度，再傳代培養(yǎng)。制備脫細(xì)胞基質(zhì)
取供體瓣膜、心包或血管組織，順次放入下列溶液中處理
1、預(yù)冷的蒸餾水漂洗；
2、5%鹽酸-10 %氯化鈉溶液中持續(xù)攪拌，4°C ；
3、氯仿甲醇(1 1 )，25 °C ；
4、疊氮化鈉，250C ；
5、過氧化氫浸泡；
6、磷酸鹽緩沖液，250C ；
再經(jīng)冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后，備用。所述供體可以來源于同種異體或異種組織。制備組織工程化瓣膜
先收集成纖維細(xì)胞，將其接種于上述支架材料上，接種密度為1 X IO5 - IO5 / CM。 培養(yǎng)液3天換一次，培養(yǎng)7 - 10天，構(gòu)建得成纖維細(xì)胞一支架材料復(fù)合物。收集血管內(nèi)皮細(xì)胞，將其接種在成纖維細(xì)胞一支架材料復(fù)合物表面，制備血管內(nèi)皮細(xì)胞一成纖維細(xì)胞一支架材料復(fù)合物，再將其按瓣膜形狀縫合塑型，制成組織工程化瓣膜。本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化瓣膜組織具有正常瓣膜組織組織結(jié)構(gòu)，是可自我更新， 自我修復(fù)的活組織，并且無抗原性，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種通過組織工程構(gòu)建的瓣膜組織，其特征是按下述方法制備通過多種途徑提取種子細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代和增殖后，分步種植于可降解支架材料，構(gòu)建成組織工程化瓣膜；其中可降解支架材料是脫細(xì)胞基質(zhì)；種子細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，種子細(xì)胞接種密度為IXlO5-IO8 / CM;脫細(xì)胞基質(zhì)可以是同種異體和異種瓣膜組織脫細(xì)胞基質(zhì)，心包組織脫細(xì)胞基質(zhì)和血管組織脫細(xì)胞基質(zhì)；血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于骨髓，靜脈血管、動(dòng)脈血管和脂肪組織；成纖維細(xì)胞來源于骨髓和皮下結(jié)締組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過組織工程構(gòu)建的瓣膜組織，其特征是所述瓣膜制備方法是先接種成纖維細(xì)胞于支架材料上，制成成纖維細(xì)胞一支架材料復(fù)合物，再于復(fù)合物表面接種血管內(nèi)皮細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過組織工程構(gòu)建的瓣膜組織。本發(fā)明采用脫細(xì)胞基質(zhì)作為可降解支架材料，提取血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞，由經(jīng)培養(yǎng)和傳代，種植于可降解支架材料，制成組織工程化瓣膜。本發(fā)明的可降解支架材料其生物相容性好、易于種植細(xì)胞，并能保存正常組織的天然結(jié)構(gòu)和組織強(qiáng)度。本組織工程化瓣膜組織是一種具有正常瓣膜組織組織結(jié)構(gòu)，并可自我更新，自我修復(fù)的活組織。無抗原性，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102475913SQ201010553559
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
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