專利名稱：一種利用細(xì)胞工廠生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)雞馬立克氏病液氮苗(814株) 的方法，尤其是公開了一種利用細(xì)胞工廠制備雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)的方法。
背景技術(shù)：
雞馬立克病是由細(xì)胞結(jié)合性皰疹病毒(MDV)引起的雞的一種高度傳染的淋巴組 織增生性疾病，雞群感染馬立克病毒后危害較大，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的危害。隨著疫苗的廣 泛應(yīng)用和雞品系的不斷選育，MDV在自然選擇和免疫壓力的雙重作用下，其毒力不斷增強(qiáng)， 一次次地突破了疫苗所能提供的保護(hù)力。20世紀(jì)70年代所分離到的為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒(VMDV)，70年代末到80年代MDV發(fā)生了很 大變化，毒力增強(qiáng)，成為超強(qiáng)毒；90年代出現(xiàn)了更強(qiáng)的超強(qiáng)毒(VV+MDV)。因此HVT凍干苗對 MD強(qiáng)毒和VV+MDV免疫效果差，可以說血清III型HVT疫苗的歷史使命基本完成。目前，普遍使用的能夠抵御超強(qiáng)毒和超超強(qiáng)毒的疫苗毒株主要有814株和 CVI988。814株是我國哈爾濱獸醫(yī)生物藥品研究所的童昆周先生從沒有免疫過馬立克疫苗 的健康雞群分離出的一株沒有致瘤性的馬立克病毒，與CVI988同屬于血清I型毒株。但 814株屬于自然弱毒株，無致瘤性，是我國惟一沒有致瘤性的血清I型疫苗株，因此，不存在 毒力返強(qiáng)的問題。本毒株遺傳性能好，具有良好的免疫原性，不受母源抗體影響。傳統(tǒng)的病毒性疫苗制備，關(guān)鍵是為病毒提供適宜其增殖的細(xì)胞基質(zhì)，通常采用貼 壁培養(yǎng)的生長方式。貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)是小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過度方式，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞的準(zhǔn)備途徑。轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)是目前國內(nèi)疫苗生產(chǎn)廠家普遍采用的細(xì)胞培養(yǎng)方式，具有結(jié)構(gòu)簡單、投資少、技術(shù)成熟、 重復(fù)性好、容易擴(kuò)大等優(yōu)點(diǎn)，同時也存在著細(xì)胞生長密度低、轉(zhuǎn)瓶間細(xì)胞生長差異大、勞動 強(qiáng)度大、占用空間大、能耗高、水耗量大等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用細(xì)胞工廠生產(chǎn)的雞馬立克氏病液氮疫苗，包括如下組分每支成品(2mL)含以下組分及含量199綜合營養(yǎng)液1. 4 1. 7mL犢牛血清0. 2 0. 4mL冷凍保護(hù)液 0. 1 0. 2mL病毒量所含病毒蝕斑數(shù)不低于6X IO6PFU的馬立克氏病814株病毒。其中所述的199綜合營養(yǎng)液購自美國Invitrogen公司。本發(fā)明還提供制備上述疫苗的方法，包括如下步驟1)、制備雞成纖維細(xì)胞懸浮液選擇9-10日齡發(fā)育良好的無特定病原體(SPF)雞胚，先用4%碘酒消毒氣室部位， 用75%酒精脫碘，無菌取出雞胚，用Hank’ s液洗滌胚體，用無菌剪刀將胚體剪成米粒大小的組織塊，用Hank’ s液洗滌3次后；按每個雞胚4 6mL的比例加入0. 25%的胰酶(DE)， 在38°C消化20 30min后，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌3次；加入營養(yǎng)液，分散細(xì)胞，靜置 后用10 15層紗布過濾，再次加入乳漢液，反復(fù)分散細(xì)胞，確認(rèn)組織塊被分散成單個細(xì)胞， 制成每一毫升含活細(xì)胞數(shù)80 120萬的雞成纖維細(xì)胞懸浮液，混合均勻后備用；2)接種及更換維持液往制備的雞成纖維細(xì)胞懸浮液中加入工作毒種，分裝在細(xì)胞工廠中，每層150 250mL，蓋好進(jìn)液口蓋，放38°C的溫室內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24 36h后棄去細(xì)胞生長液，加入 含有2 5%血清的199營養(yǎng)液，將營養(yǎng)液分勻擰緊瓶口帽，放入38°C溫室培養(yǎng)；或者將制 備的雞胚成纖維細(xì)胞懸浮液分裝在細(xì)胞工廠中，每層150 250mL，蓋好進(jìn)液口蓋，放38°C 的溫室內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24 36h后棄去細(xì)胞生長液，加入含有工作毒種的199營養(yǎng)液， 將營養(yǎng)液分勻擰緊瓶口帽，放入38°C溫室培養(yǎng)48 72h ；其中，優(yōu)選的是，每平方厘米細(xì)胞工廠的平面上接種5-10萬個雞胚成纖維細(xì)胞。3)收獲培養(yǎng)至80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時，即可收獲，棄去營養(yǎng)液，加 入EDTA-胰酶混合消化液250 350mL/層，使消化液與細(xì)胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入 199營養(yǎng)液300 400mL/層，停止消化。收集，無菌檢驗后，分至離心瓶中；4)離心、提取細(xì)胞于2_8°C、1500r/min離心10 20分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞；5)配苗與分裝收集沉淀細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH值7. 0 7. 4，加入配苗體積70 85 %的199綜合營養(yǎng)液、 配苗體積10 20%的犢牛血清和配苗體積5 10%的冷凍保護(hù)劑，搖勻，取樣做收獲前無 菌檢驗，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)后，定量分裝到無菌安瓶中封口 ；其中，冷凍保護(hù)劑可選用任何本 領(lǐng)域超低溫保存的冷凍保護(hù)劑，優(yōu)選為二甲基亞砜(DMSO)。6)程序降溫利用程序降溫儀進(jìn)行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入 液氮中保存；7)清洗細(xì)胞工廠用消毒純化水反復(fù)清洗用過的細(xì)胞工廠3 4次，包裝好，進(jìn)行鈷源照射消毒后重 復(fù)使用。其中步驟2)中加入的工作毒種為血清I型的禽馬立克氏病毒814株，接種量為每 平方厘米接種1000 2000PFU含量的種毒，優(yōu)選為1500PFU。本發(fā)明通過細(xì)胞工廠生產(chǎn)的雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)的質(zhì)量優(yōu)良，免疫效 力高，免疫效果穩(wěn)定，與國外進(jìn)口同類疫苗相比具有相同的預(yù)防效果，除此之外，其還有代 次低、蝕斑小、PFU含量高，免疫原性好、成本低、在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生免疫保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。此外，在疫苗制劑中特別添加了犢牛血清，在解凍和使用過程中有助于提高細(xì)胞 存活率，減少病毒損失，提高免疫效力。本發(fā)明提供的利用細(xì)胞工廠生產(chǎn)雞馬立克氏病疫苗的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)在細(xì) 胞工廠中，細(xì)胞生長更接近自然狀態(tài)，可形成均一的細(xì)胞單層；由于材料對細(xì)胞的影響非常 小，細(xì)胞的活力更強(qiáng)，病毒在細(xì)胞內(nèi)生長更快，感染細(xì)胞率明顯提高；細(xì)胞與外界接觸的機(jī)會更少，人為污染的幾率就更低；此外還有體積小，節(jié)省空間，更容易操作等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1選用美國CORNING公司出品的Cell STACK 10層(636cm2/層)，采用同步感染法 制備雞馬立克氏病液氮苗的制備工藝。液氮疫苗制備工藝主要步驟如下(1)雞胚成纖維細(xì)胞單層的制備選擇10日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用4%碘酒消毒氣室部位，用75%酒精脫 碘，無菌取出雞胚，用Hank’ s液洗滌胚體，用無菌剪刀將胚體剪成米粒大小的組織塊，用 Hank's液洗滌3次后；按每個雞胚4mL的比例加入0. 25%的胰酶(DE)，在38°C消化30min 后，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌3次；按每個雞胚加入2mL的營養(yǎng)液，制成每一毫升含活細(xì) 胞數(shù)300萬的細(xì)胞懸液?；旌暇鶆蚝髠溆?。(2)接毒及更換維持液往細(xì)胞懸液中加入工作毒種，接種量為每平方厘米接種1500PFU含量的種毒，分 裝在細(xì)胞工廠中，每層150mL，蓋好進(jìn)液口蓋，放38°C的溫室內(nèi)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)36h后棄去 細(xì)胞生長液，加入含有血清的199營養(yǎng)液，細(xì)胞工廠每層150mL，將營養(yǎng)液分勻擰緊瓶口帽， 火焰消毒瓶口，用錫紙包好，放入37°C 士0.5°C溫室培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)與觀察接毒24h后每日觀察1 2次，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，即可收獲。(4)收獲棄去營養(yǎng)液，加入EDTA-胰酶混合消化液250mL/層，使消化液與細(xì)胞充分接觸一 段時間后，棄去胰酶液，立即加入199綜合營養(yǎng)液400mL/層，停止消化。收集，無菌檢驗后， 分至離心瓶中；(5)離心、提取細(xì)胞于2_8°C、1500r/min離心10分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞。(6)配苗與分裝收集沉淀細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH值7. 0，加入配苗體積10%的犢牛血清、配苗體積5%的冷 凍保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)和配苗體積的85%的199綜合營養(yǎng)液，搖勻，取樣做收獲前無 菌檢驗，進(jìn)行病毒計數(shù)，每毫升中所含病毒蝕斑數(shù)不低于3 X 106PFU。2mL分裝到無菌安瓶 中封口。(7)程序降溫利用程序降溫儀進(jìn)行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入 液氮中保存。(8)清洗細(xì)胞工廠用消毒純化水反復(fù)清洗用過的細(xì)胞工廠3次，包裝好，進(jìn)行鈷源照射消毒后重復(fù)使用。實(shí)施例2選用美國CORNING公司出品的Cell STACK 40層(636cm2/層)，采用單層感染法 制備雞馬立克氏病液氮苗的制備工藝。液氮疫苗制備工藝主要步驟如下(1)雞胚成纖維細(xì)胞單層的制備選擇9日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用4%碘酒消毒氣室部位，用75%酒精脫碘， 無菌取出雞胚，去除頭、內(nèi)臟，放入無菌的玻璃器皿內(nèi)，用Hank’ s液洗滌胚體，用無菌剪 刀將胚體剪成米粒大小的組織塊，用Hank’ s液洗滌3次后，按每個雞胚6mL的比例加入 0. 25%胰酶，在38°C消化20min后，棄去胰酶，用Hank’ s液洗滌3次；按每個雞胚加入4mL 的營養(yǎng)液，制成每一毫升含活細(xì)胞數(shù)約200萬的細(xì)胞懸液，放38°C的溫室內(nèi)靜置培養(yǎng)。將細(xì) 胞懸液分裝在細(xì)胞工廠中，每層250mL，蓋好進(jìn)液口蓋，形成單層后備用。(2)接毒及更換維持液棄去細(xì)胞生長液，加入含有工作毒種的199營養(yǎng)液，細(xì)胞工廠每層250mL，其中，接 種量為每平方厘米接種2000PFU含量的種毒。將營養(yǎng)液分勻擰緊瓶口帽，火焰消毒瓶口，用 錫紙包好，放入38°C溫室培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)與觀察接毒24h后每日觀察1 2次，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，即可收獲。(4)收獲棄去營養(yǎng)液，加入EDTA-胰酶混合消化液350mL/層，使消化液與細(xì)胞充分接觸一 段時間后，棄去胰酶液，立即加入199綜合營養(yǎng)液300mL/層，停止消化。收集，無菌檢驗后， 分至離心瓶中；(5)離心、提取細(xì)胞于2_8°C、1500r/min離心20分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞。(6)配苗與分裝收集沉淀細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH值7. 4，加入配苗體積20 %的犢牛血清、和配苗體積10 %的 冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)和配苗體積70%的199綜合營養(yǎng)液，搖勻，取樣做收獲前無 菌檢驗，進(jìn)行病毒計數(shù)，每毫升中所含病毒蝕斑數(shù)不低于3 X IO6PFU, 2mL分裝到無菌安瓶中 封口。(7)程序降溫利用程序降溫儀進(jìn)行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入 液氮中保存。(8)清洗細(xì)胞工廠用消毒純化水反復(fù)清洗用過的細(xì)胞工廠4次，包裝好，進(jìn)行鈷源照射消毒后重復(fù) 使用。實(shí)施例3設(shè)計實(shí)驗，比較利用實(shí)施例1生產(chǎn)的經(jīng)檢查合格的雞馬立克氏病液氮疫苗(814 株)與國外2個廠家生產(chǎn)的CVI988疫苗預(yù)防雞馬立克氏病的療效。一、將1齡SPF白來航雛雞(由北京梅里亞維通實(shí)驗技術(shù)有限公司提供)132只隨機(jī)分成6組，每組22只。免疫組共4組，分別接種814低代毒疫苗、814株疫苗、CVI988-A、 CVI988-B，每只頸背部皮下注射3000PFU。非免疫組2組，免疫后在隔離器中分別隔離飼養(yǎng) 21d。免疫后21d，將免疫組和陽性對照組的22只分別接種馬立克氏病(MD)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株 京-1株(購自由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)發(fā)放，批號980603， 2mL/支，攻毒時，用乳漢液稀釋10倍，每只雞腹腔注射0. 5mL)，連同陰性對照組22只，在進(jìn) 口隔離器中繼續(xù)隔離飼養(yǎng)。每天觀察、記錄發(fā)病和死亡情況，對死亡雞及時剖檢，觀察大體 病變。攻毒2個月后，對所有存活雞進(jìn)行解剖，觀察病變，計算病變指數(shù)和保護(hù)指數(shù)。試驗 結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗。通過實(shí)驗觀察和結(jié)合統(tǒng)計表1、2可知①陽性對照組雞攻毒后，最早發(fā)病日齡為15日齡，最早發(fā)生死亡的日齡為17日 齡，死亡時間集中在17 40日齡，死亡比例為72. 73%。剖檢死亡雞均為典型的內(nèi)臟型病 變，肌肉、皮膚和神經(jīng)型病變少見，至62日齡時，存活的6只中有3只雞呈陽性病變，脾臟病 變均明顯，有1只雞的卵巢有小雞蛋大小的病變，總陽性率為86.4%。陰性對照組到實(shí)驗結(jié) 束均表現(xiàn)健康生長，剖檢器官無異常，表明本次實(shí)驗陰陽性對照均成立，實(shí)驗結(jié)果可信。②814低代毒組和814疫苗組在整個攻毒過程中，均沒有死亡，62d的活雞中個別 雞睪丸和腎臟有淋巴瘤病變。③CVI988-A組在攻毒后60d時，有1只雞因極度消瘦死亡，解剖發(fā)現(xiàn)卵巢、腎腫 大?；铍u中有3只有淋巴瘤病變。④CVI988-B組在攻毒48d時有1只雞死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟上布滿星狀腫瘤，單側(cè) 睪丸極度腫大，心臟呈陽性病變。表1免疫組和對照組接種強(qiáng)毒后的保護(hù)指數(shù)和死亡情況表
組別攻毒死亡雞腫瘤陽存活雞腫瘤總陽性數(shù)保護(hù)指數(shù)只數(shù)性數(shù)(只)陽性數(shù)(只)(只)(%)0083]814低代毒2203384.3814疫苗2202289.4CVI988-A2213478.9CVI988-B2213478.9陽性對照組221631986.4陰性對照組0----注保護(hù)指數(shù)=(攻毒對照組陽性率-免疫組陽性率)/攻毒對照組陽性 率 X 100%表2免疫組和對照組接種強(qiáng)毒后病變分布情況
權(quán)利要求
1.一種雞馬立克氏病疫苗，其特征在于，包括如下組分每支2mL成品含以下組分及含量199綜合營養(yǎng)液1.4 1. 7mL犢牛血清 0. 2 0. 4mL冷凍保護(hù)液0. 1 0. 2mL病毒含量所含病毒蝕斑數(shù)不低于6X IO6PFU的馬立克氏病814株病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為液氮苗。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述疫苗的方法，包括如下步驟1)制備雞胚成纖維細(xì)胞懸浮液將無特定病原體雞胚用胰酶消化后制成雞胚成纖維細(xì)胞懸浮液；2)接種及更換維持液往步驟1)制備的雞胚成纖維細(xì)胞懸浮液中加入工作毒種，分裝在細(xì)胞工廠中，每層 150 250mL，于38°C靜置培養(yǎng)24 36h后棄去細(xì)胞生長液，加入含有2 5%犢牛血清的 199營養(yǎng)液，每層150 250mL，于38°C靜置培養(yǎng)；或者將步驟1)制備的雞胚成纖維細(xì)胞懸 浮液分裝在細(xì)胞工廠中，每層150 250mL，蓋好進(jìn)液口蓋，于38°C靜置培養(yǎng)24 36h后棄 去細(xì)胞生長液，加入含有工作毒種的199營養(yǎng)液，于38°C靜置培養(yǎng)；3)收獲培養(yǎng)至80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)時，即可收獲，棄去營養(yǎng)液，加入EDTA-胰 酶混合消化液250 350mL/層，使消化液與細(xì)胞充分接觸后，棄去胰酶液，加入199營養(yǎng)液 300 400mL/層，停止消化，收集，無菌檢驗后，分至離心瓶中；4)離心、提取細(xì)胞于2 8°C、1500r/min離心10 20分鐘，離心后棄去上清，收集沉淀細(xì)胞；5)配苗與分裝收集沉淀細(xì)胞，調(diào)節(jié)pH值7. 0 7. 4，加入配苗體積70 85%的199綜合營養(yǎng)液、配 苗體積10 20%的犢牛血清，和配苗體積的5 10%的冷凍保護(hù)劑，搖勻，取樣做收獲前 無菌檢驗，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)后，定量分裝到無菌安瓶中封口 ；6)程序降溫利用程序降溫儀進(jìn)行程序降溫，待苗溫降至零下80°C 零下120°C時將疫苗放入液氮 中保存；7)清洗細(xì)胞工廠用消毒純化水反復(fù)清洗用過的細(xì)胞工廠3 4次，包裝好，進(jìn)行鈷源照射消毒后重復(fù)使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述工作毒種為血清I型的禽馬立克 氏病病毒814株。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述冷凍保護(hù)劑為二甲基亞砜。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟2)中工作毒種的接種量為 每平方厘米接種1000 2000PFU含量的種毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟2)中的工作毒種接種量為 每平方厘米接種1500PFU含量的種毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中胰酶的用量為每個雞胚加 入4 6mL的0. 25%的胰酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中的雞胚成纖維細(xì)胞懸浮液 的活細(xì)胞數(shù)為每一毫升200 300萬。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種利用細(xì)胞工廠制備雞馬立克氏病液氮疫苗814株的方法及其利用這種方法制備的雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)。本發(fā)明通過細(xì)胞工廠生產(chǎn)的雞馬立克氏病液氮疫苗(814株)的質(zhì)量優(yōu)良，免疫效力高，免疫效果穩(wěn)定；除此之外，其還有代次低、蝕斑小、PFU含量高，免疫原性好、成本低、在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生免疫保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K39/255GK102000328SQ20101056226
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者周海琴, 常如軍, 張發(fā)明, 張洪, 張紅, 張連祥, 曹寧, 朱秀芝, 李然, 李靜, 王文泉, 袁芳, 賈桂珍, 車競, 邢雪蓮, 郎立群, 鄭杰, 金劍, 陳玲, 馬力 申請人:北京市獸醫(yī)生物藥品廠