專利名稱：一種hiv免疫原及其制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種引起廣譜中和抗體的HIV免疫原及其制備的疫苗，特別涉及ー種具有廣譜保護作用的新型HIV疫苗。
背景技術：
艾滋病是全球所面臨的最重大挑戰(zhàn)之一，嚴重危害社會進步與經濟增長，已造成 6000多萬人被感染，其中3000萬人已經死亡，目前存活的感染者約為3320萬，其中90%以上的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。迄今為止，在各國政府與國際組織強有力的支持下，世界上先后開展了 100多個臨床試驗，但尚未有ー個成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困難的ー個主要原因是由于艾滋病病毒的特殊性，即HIV-I具有高度的變異性。以往的疫苗所選擇的抗原表位主要是自然感染中的優(yōu)勢抗原表位，而這些抗原表位是HIV-I中變異頻率最高的位點。因此， 以這些抗原構建的疫苗誘導出的抗體具有延遲性，無法中和已經發(fā)生突變的HIV-I。因此，在艾滋病疫苗研究中所存在的ー個重要問題是如何通過保守免疫原設計來誘導具有廣譜保護作用的新疫苗。
發(fā)明內容
為了解決現有技術中由于HIV變異頻率高而導致的抗體無法中和已經突變的HIV 的問題，本發(fā)明提供了ー種HIV免疫原，包括ー種肽序列，所述肽序列中包括HIV的4E10和 /或2F5和/或Z13抗原表位序列中的至少ー個，模擬HIV病毒gp41上MPER區(qū)融合前的天然狀態(tài)，從而使其產生特異性更強的抗體。4E10、2F5和Z13抗原表位序列分別為目前分離得到的廣泛中和抗體4E10抗體、2F5抗體和Z13抗體所識別的抗原表位序列，識別高度保守的 HIV-lgp41 近月吳端夕卜部區(qū)(membrane proximal external region, MPER)。不論 HIV 病毒如何變異，其gp41近膜端外部區(qū)MPER基本保持保守，所以針對該區(qū)域設計的免疫原產生的抗體能夠避免由于病毒的變異導致的無法中和的問題。其中4E 10能以較低的濃度中和 HIV-I原始病毒株在內22株病毒株的全部亞型病毒，2F5可中和大約67%左右的病毒。同時本發(fā)明的免疫原由于具有分枝肽結構，包含多個分枝，分子量較大，能夠增強該免疫原的免疫原性，而不需要另外的載體蛋白。本發(fā)明中，優(yōu)選4E10表位序列。更優(yōu)選所述分枝肽有3至4個分枝均包括4E10表位序列。在一個實施方式中，本發(fā)明所述HIV免疫原的上述肽序列可進ー步包括Th細胞表位序列。所述Th細胞表位序列包括PADRE。通過B、T細胞雙信號識別，有助于增強機體對抗原的免疫應答，并能產生廣譜的保護作用。在一個實施方式中，上述HIV免疫原的分枝肽序列也可進ー步包括破傷風毒素 830-843序列和/或ロ蹄疫病毒200-213序列，以增強其免疫原性。上述HIV免疫原，其中所述肽至少部分分枝被選自乙?；Ⅴ０坊?、烷基羰基和鏈烯基羰基組成的組中的至少ー種修飾基團修飾。優(yōu)選乙?；?或酰胺基。所述烷基羰基可用通式CH3 (CH2)nCO-表示，其中η可為1-16中的任意整數，優(yōu)選10、12、14和16。所述鏈烯基羰基可用通式R(CH2)mCO-表示，其中R為烯基、二烯基或三烯基，例如，CH3(CH2)m, CH = CH-XH3CH2CH = CHCH2CH = CH-XH3CH2CH = CHCH2CH = CHCH2CH = CH ;m 和 m，可為 1-10 中的任意整數，優(yōu)選7。上述修飾基團可與所述分枝肽的N末端α-氨基、C末端α-羧基或任一氨基酸的側鏈基團共價連接。優(yōu)選N末端α-氨基。在所述分枝肽的末端或側鏈添加修飾基團以保護所述分枝肽，防止過早被酶解而影響其免疫原性。上述HIV的4Ε10和/或2F5抗原表位序列、Th細胞表位序列、以及破傷風毒素 830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列優(yōu)選分別通過柔性序列互相連接，以增加各條鏈的自由度，協(xié)助其形成正確的構象。所述柔性序列包括甘氨酸組成的序列、賴氨酸組成的序列、6-氨基己?；?Ahx) 組成的序列或它們的組合。優(yōu)選KKKK-Ahx。優(yōu)選地，各抗原表位序列側翼還可加上其天然存在時的側翼序列。以4E10為例，可以加上其側翼序列YI，即NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。 優(yōu)選其N末端被修飾基團修飾，即乙?；?Ac) -NWFDITNWLffYI-KKKK-Ahx,或酰胺基-NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。本發(fā)明優(yōu)選的HIV免疫原包括N末端乙?；蝓０坊?E10抗原表位序列， 所述柔性序列為KKKK-6-氨基己?；騼蓚€相連的6-氨基己?；?。本發(fā)明還提供了一種HIV疫苗，包括上述任一種免疫原。該HIV疫苗，可進一步包括佐劑，例如包括氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、 細胞因子或明礬，或為油佐劑或水型佐劑。優(yōu)選油溶劑。本發(fā)明的HIV疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮內注射、腹腔注射、口服給藥、肺部給藥、鼻腔給藥、口腔給藥、陰道肛門給藥。本領域技術人員可利用本領域公知的技術對其進行配方，以使其適合相應給藥方式。本文中不再贅述。優(yōu)選本發(fā)明的HIV疫苗在初次免疫及加強免疫過程中可采用同種抗原核心表位-輔助T細胞表位，也可以同種抗原核心表位-不同輔助T細胞表位交替進行免疫；并可以同種抗原核心表位的多肽疫苗和病毒疫苗交替免疫。本發(fā)明的免疫原和疫苗能夠激發(fā)機體產生對HIV病毒具有廣譜中和活性的抗體， 從而克服了現有技術中因為HIV的頻繁突變而導致的疫苗產生的抗體無法與突變后的病毒中和的問題。
圖1為為本發(fā)明優(yōu)選實施方式的免疫原以及對照肽與抗體結合的Western blot 圖。其中左圖為電泳之后染色的圖，右圖為經一抗和二抗結合之后顯色的圖。其中第1道NK-284E10和2F5雙表位線性肽 Ac-NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-NH2第2 道Ac-NK-174E10 表位四分枝肽Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4
第3 道Ac-NK-Acp-16第二批次4E10表位四分枝肽Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4第4 道Ac-NK-16-Ahx-3 對照四分枝肽Ac-NGSGSGKWEGGPSKKK-Ahx-MAP4第5道Ac-NK-16-Ahx-24E 10 表位線性肽Ac-NWFDITNWLffYIKKKK-Ahx-OHー抗B為4E10單克隆抗體
具體實施例方式高度保守的HIV_lgp41近膜端外部區(qū)被認為是最具潛力的中和抗體設計靶點。目前為止分離得到的七個廣泛中和抗體有三個(2F5，4E10和Z13抗體)是識別該區(qū)域的，其中4E10能以較低的濃度中和HIV-I原始病毒株在內22株病毒株的全部亞型病毒，2F5可中和大約67%左右的病毒。這三個抗體QF5，4E10和Z13抗體)所識別的表位分別稱為 2F5，4E10和Z13表位。具體而言，2F5表位的氨基酸序列包括下列序列QELLELDKWASLW或其變異序列；4E10表位的氨基酸序列包括下列序列NWFDITNWLW或NWFNITNWLW或此二者的變異序列；Z13表位的氨基酸序列包括下列序列WASLWNWFDITN或其變異序列。下文中結合具體實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)勢和技術效果。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書限定的為準，實施例僅僅是示例性地說明本發(fā)明的理念和原則。實施例1抗原表位的設計選取HIV_lgp41MPER上的4E10和/或2F5識別表位作為抗原表位。合成下列氨
基酸序列
權利要求
1.ー種HIV免疫原，包括ー種肽序列，所述肽序列包括HIV的4E10和/或2F5和/或 Z13抗原表位序列中的至少ー個。
2.如權利要求1所述的HIV免疫原，其中所述肽序列進ー步包括Th細胞表位序列和/ 或破傷風毒素830-843序列和/或ロ蹄疫病毒200-213序列。
3.如權利要求1-2中任一項所述的HIV免疫原，其中所述肽序列至少部分被選自乙酰基、酰胺基、烷基羰基和鏈烯基羰基組成的組中的至少ー種修飾基團修飾。
4.如權利要求2或3所述的HIV免疫原，其中所述HIV的4E10和/或2F5和/或Z13 抗原表位序列、Th細胞表位序列、以及破傷風毒素830-843序列和/或ロ蹄疫病毒200-213 序列分別通過柔性序列互相連接。
5.如權利要求4所述的HIV免疫原，其中所述柔性序列包括甘氨酸組成的序列、賴氨酸組成的序列、6-氨基己?；M成的序列或它們的組合。
6.如權利要求5所述的HIV免疫原，所述免疫原包括N末端乙?；蝓０坊?E10 抗原表位序列，所述柔性序列為KKKK-6-氨基己?；騼蓚€相連的6-氨基己?；?br>
7.ー種HIV疫苗，包括如權利要求1-6中任一項所述的免疫原。
8.如權利要求7所述的HIV疫苗，進ー步包括佐劑，所述佐劑包括氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、細胞因子或明礬，或為油佐劑或水型佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種引起廣譜中和抗體的HIV免疫原及其制備的疫苗。該HIV免疫原包括一種肽序列，該肽序列中包括HIV的4E10和/或2F5和/或Z13抗原表位序列。本發(fā)明的免疫原能夠激發(fā)針對HIV病毒的廣譜中和抗體，克服了現有技術中因為HIV高變異性導致的現有疫苗誘發(fā)抗體的延遲性的問題。在動物免疫實驗表明，本發(fā)明的肽免疫原輔以佐劑可誘導免疫動物血清產生特異性抗體，且所誘導抗體具有廣泛中和代表型HIV侵染細胞能力，具有開發(fā)成為臨床抗HIV疫苗和輔助增強HIV疫苗的潛力。
文檔編號A61K39/21GK102558314SQ20101057831
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權日2010年12月8日
發(fā)明者單亞明, 孔維, 張麗雙 申請人:吉林大學