專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗阿片肽的拮抗肽與該拮抗肽的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽段及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種具有拮抗嗎啡抗傷害作用 的抗阿片肽及其拮抗肽，與該拮抗肽在制備增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受和/或減弱或消 除戒斷癥狀作用的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，在世界范圍內(nèi)猖獗的販毒吸毒活動(dòng)已成為危害社會(huì)的一個(gè)毒瘤，嚴(yán)重 干擾了有序的經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)安定，此外，靜脈吸毒還造成了艾滋病人群感染率的攀升。目 前，各國(guó)政府雖都加大聯(lián)合打擊毒品走私的力度，但吸毒、販毒活動(dòng)仍屢禁不止，其中一個(gè) 重要的原因就是嗎啡耐受及依賴(lài)的原理尚未真正或完全被闡明，國(guó)際上尚無(wú)有效的戒毒手 段。國(guó)外最先采用的”替代療法”是在戒毒過(guò)程中用美沙酮一類(lèi)的藥代替阿片，這種療法將 導(dǎo)致病人對(duì)美沙酮類(lèi)藥物的耐受和依賴(lài)。在國(guó)內(nèi)，寧波戒毒所楊國(guó)棟先生采用東莨菪鹼配 合其它藥物戒毒，也未完全解決心癮問(wèn)題。韓濟(jì)生教授采用針灸治療儀治療戒斷癥狀，試圖 通過(guò)特定頻率的電脈沖刺激提高體內(nèi)內(nèi)源性阿片的合成來(lái)減輕癥狀，但它的最大缺陷是人 群中針刺鎮(zhèn)痛的有效率有限而且持續(xù)地針刺也存在耐受問(wèn)題。近來(lái)，石家莊中醫(yī)藥專(zhuān)家王 巖對(duì)阿片戒斷癥狀進(jìn)行辯癥施治，采用“金甲丸”治療戒斷綜合癥，正在經(jīng)臨床進(jìn)一步檢驗(yàn) 和完善。因此，迫切需要一種可從源頭上徹底消除嗎啡耐受及依賴(lài)，以及減弱或消除戒斷癥 狀的戒毒藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有拮抗嗎啡抗傷害作用的抗阿片肽。本發(fā)明所提供的抗阿片肽，命名為99A，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)將序列表中SEQ ID NO=I的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加，具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。序列表中的SEQ ID NO :1由86個(gè)氨基酸殘基組成。編碼本發(fā)明抗阿片肽99A的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中 SEQ ID NO 11 的 DNA 序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 11限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有拮抗 嗎啡抗傷害作用的核苷酸序列；
4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 11限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條 件為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液，在65°C下雜
交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO :11由258個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO 1的
氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述抗阿片肽99A的活性片段，可為下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)序列表中的 SEQ ID NO 3 ；3)序列表中的 SEQ ID NO 4 ；4)將序列表中SEQ ID NO :2_4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取 代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。序列表中的SEQ ID NO :2由14個(gè)氨基酸殘基組成，將具有SEQ ID NO 2氨基酸 殘基序列的抗阿片肽命名為99A-16 ；序列表中的SEQ ID NO 3由19個(gè)氨基酸殘基組成，將 具有SEQ ID N0:3氨基酸殘基序列的抗阿片肽命名為99A-19 ；序列表中的SEQ ID NO :4由 14個(gè)氨基酸殘基組成，將具有SEQ ID N0:4氨基酸殘基序列的抗阿片肽命名為DBI-16。編碼上述抗阿片肽活性片段的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中 SEQ ID NO 12 的 DNA 序列；2)序列表中 SEQ ID NO 13 的 DNA 序列；3)序列表中 SEQ ID NO 14 的 DNA 序列；4)編碼序列表中SEQ ID NO 2~4的DNA序列；5)與序列表中SEQ ID NO :12_14限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有 拮抗嗎啡抗傷害作用中起重要作用的核苷酸序列；6)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 12-14限定的DNA序列雜交的核 苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液，在65°C下雜
交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO 12由48個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO 2的 氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；序列表中的SEQ ID NO :13由57個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中 SEQ ID NO :3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；序列表中的SEQ ID NO 14由48個(gè)堿基組成，編 碼具有序列表中SEQ ID NO 4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述抗阿片肽99A的拮抗肽也是本發(fā)明要保護(hù)的，可為下述氨基酸殘基序列之1)序列表中的 SEQID NO 5 ；2)序列表中的 SEQID NO 6 ；3)序列表中的 SEQID NO 7 ；4)將序列表中SEQID NO 5~7的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。序列表中的SEQ ID NO 5由21個(gè)氨基酸殘基組成，將具有SEQ ID NO :5氨基酸殘 基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名為CP-99A-16+5 ；序列表中的SEQ ID NO 6由19個(gè)氨基酸 殘基組成，將具有SEQ ID N0:6氨基酸殘基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名為CP-99A-19;序 列表中的SEQ ID NO :7由19個(gè)氨基酸殘基組成，將具有SEQ ID NO :7氨基酸殘基序列的抗 阿片肽的拮抗肽命名為CP-DBI-16+5。編碼本發(fā)明抗阿片肽99A拮抗肽的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 8的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO 9的DNA序列；3)序列表中 SEQ ID NO 10 的 DNA 序列；4)編碼序列表中SEQ ID NO :5_7的DNA序列；5)與序列表中SEQ ID NO :8_10限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且在增強(qiáng) 嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀中起重要作用的核苷酸序列；6)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO :8_10限定的DNA序列雜交的核苷 酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液，在65°C下雜
交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO 8由63個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO 5的 氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；序列表中的SEQ ID NO 9由57個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中 SEQ ID NO :6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；序列表中的SEQ ID NO 10由63個(gè)堿基組成，編 碼具有序列表中SEQ ID NO 7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有上述抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌以及擴(kuò) 增該基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗阿片肽99A的拮抗肽可采用常規(guī)的人工合成方法直接獲得，如可用fmoc保 護(hù)的固相合成法等方法人工合成，或可委托美聯(lián)(西安)生物科技有限公司或上海閃晶生 物多肽合成有限公司等生物公司合成，此外，也可用利用微生物發(fā)酵表達(dá)的方法獲得。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述抗阿片肽99A的拮抗肽的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)上述拮抗肽的方法，是將含有上述抗阿片肽99A的拮抗肽基 因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到抗阿片肽99A的拮抗肽。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為 大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5 α 或 Ε. coli ToplO 等。用于構(gòu)建所述含有抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任 意一種可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的原核表達(dá)載體，如pET-22b、pET- 11c、pET_30a、 pET-28a、pET-28b 或 pET_28c 等。以pET_22b為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表達(dá)載體為 PET-CP-99A-16、pET-CP_99A_19 或 pET_CP-DBI_16。
上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌的方法可為生物工程領(lǐng)域中常用的轉(zhuǎn)化方法，如 熱激法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法或PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等。培養(yǎng)含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為 培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時(shí)需加入誘導(dǎo)劑， 如IPTG等，所加入IPTG的濃度可為0. 1-1. Ommol/L,優(yōu)選為0. 2mmol/L,誘導(dǎo)溫度可為 14-37°C，優(yōu)選為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間可為2-4小時(shí)，優(yōu)選為3小時(shí)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受或/和減弱或消除 戒斷癥狀的藥物。本發(fā)明所提供的藥物的活性成分為上述抗阿片肽99A的拮抗肽；其中，所述抗阿 片肽的拮抗肽選自以下氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 5 ；2)序列表中的 SEQ ID NO 6 ；3)序列表中的 SEQ ID NO 7 ；4)將序列表中SEQ ID NO :5_7的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取 代、缺失或添加具有增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受或/和減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料，所述輔 料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、 潤(rùn)滑劑和穩(wěn)定劑等。本發(fā)明的藥物可以制成注射液、干粉針劑、片劑或粒劑等多種形式。上述各種劑型 的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述藥物的成人用量一般為0. 01-0. 5mg/kg體重/次，可以一次或多次使用，療程 一般為10至20天。本發(fā)明提供從豬腦中分離純化出一種抗阿片肽99A及其活性片段，它具有拮抗嗎 啡抗傷害作用，吸毒過(guò)程伴隨著毒品劑量的增加可促使該蛋白的合成增加，導(dǎo)致嗎啡耐受 及依賴(lài)的形成。本發(fā)明是利用蛋白質(zhì)分子之間存在相互作用的原理，依照三個(gè)活性片段的 序列，設(shè)計(jì)出了它們的拮抗肽。由于這些拮抗肽的分子量小于2000道爾頓，較容易通過(guò)血 腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)部位起到抵消內(nèi)源性抗阿片肽效應(yīng)的作用。實(shí)驗(yàn)證明人工 合成的拮抗肽可作為內(nèi)源性抗阿片肽的抑制劑，通過(guò)靜脈注射三個(gè)活性片段的拮抗肽，可 達(dá)到增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受和減弱或消除戒斷癥狀作用。該藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1) 療效顯著活性成分拮抗肽是通過(guò)消除吸毒者體內(nèi)多余的內(nèi)源性抗阿片肽及其效應(yīng)來(lái)達(dá)到 增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受和消除或減弱吸毒者戒斷癥狀的目的，可從源頭上消除戒斷 癥狀；2)獲得的拮抗肽都是一些氨基酸殘基殘基數(shù)量不超過(guò)25個(gè)的短肽，容易合成，便于 開(kāi)發(fā)研究；幻這些短肽進(jìn)入體內(nèi)容易被降解，不具備產(chǎn)生抗體的副作用，安全性高；4)用藥 方便，可通過(guò)靜脈注射方式或舌下含片等多種方式給藥，以消除或減弱嗎啡戒斷的癥狀；本 發(fā)明的抗阿片肽99A活性片段的拮抗肽將在醫(yī)學(xué)及戒毒藥物領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景 廣闊。
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下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為檢測(cè)狗腦提取物對(duì)電脈沖引起小鼠輸精管收縮效應(yīng)的影響圖2為檢測(cè)側(cè)腦室內(nèi)注入狗腦粗提物(A0Q對(duì)大鼠針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響圖3A和圖;3B為抗阿片肽99A對(duì)嗎啡抗傷害作用的抑制效應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果圖4為嗎啡耐受小鼠側(cè)腦室內(nèi)注入抗阿片肽99A的抗血清使對(duì)嗎啡的耐受被逆轉(zhuǎn) 的檢測(cè)結(jié)果。圖5為免疫組化檢測(cè)小鼠腦片上抗阿片肽99A免疫陽(yáng)性部位圖6為在大鼠韁核微量注射99A對(duì)由同側(cè)大腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)微量注射嗎啡所引 起的嗎啡抗傷害作用影響的檢測(cè)結(jié)果圖 7A-圖 7D 為抗阿片活性肽段 99A_14、99A-19、DBI_16 和 DBI-19 對(duì)嗎啡(20mg/ kgi. P.)抗傷害作用影響的檢測(cè)結(jié)果圖8A和圖8B為99A_14、99A_19和DBI-16拮抗嗎啡抗傷害作用及DBI-19增強(qiáng)嗎 啡抗傷害作用分別通過(guò)不同類(lèi)型受體介導(dǎo)的鑒定結(jié)果圖9為NMDA受體和NOS在抗阿片肽99A及其活性片段拮抗嗎啡抗傷害作用中的 影響的檢測(cè)結(jié)果圖IOA-圖IOC為拮抗肽CP-99A-16、CP-99A-19和CP-DBI-16對(duì)嗎啡抗傷害作用 影響的檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn) 《Molecular Cloning :A Laboratory Manual》(Sambrook，J. ,Russell,DavidW.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。下述實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)小鼠均為8-10周齡、體重20_22g的雄性昆明小鼠(購(gòu)自 科學(xué)院動(dòng)物所)實(shí)施例1、抗阿片肽99A的獲得及其功能驗(yàn)證一、豬腦抗阿片肽99A的獲得及其劑量依賴(lài)效應(yīng)檢測(cè)1、抗阿片肽的發(fā)現(xiàn)在離體的小鼠輸精管標(biāo)本，給以方波脈沖(0. IMS波寬，1次/秒)刺激 可引起收縮(具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)J. Hughes et al (1975) Effect of morphine on adrenergictransmission in the Mouse Vas deferens. Assessment of agonist and antagonistpotencies of Narcotic analgesics 53, 371-381),然后，先后在灌流液中力卩 入鹽酸嗎啡(3. 2nM)或狗腦提取物(A0S，200l·! g/mL)(為狗腦提取濃縮液先后經(jīng)kphadex G-50凝膠(購(gòu)自Pharmacia公司)過(guò)濾，羧甲基-纖維素(CM-C購(gòu)自H. Reeve-Angel&. Co. Ltd公司)陽(yáng)離子交換層析后，得到樣品)，觀察對(duì)電刺激小鼠輸精管引起收縮效應(yīng)的影 響。如圖1所示(M代表給嗎啡，MAP代表給狗腦提取物)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在狗腦粗提物中，存在 著可增強(qiáng)電刺激小鼠輸精管收縮的成分，且該樣品的增強(qiáng)收縮效應(yīng)與嗎啡抑制電刺激小鼠輸精管收縮的效應(yīng)恰恰相反，因此，將該狗腦粗提物注入小鼠側(cè)腦室內(nèi)后，可觀察到嗎啡的 抗傷害作用被顯著地抑制。此外，將上述狗腦粗提物注入針刺鎮(zhèn)痛有效大鼠(6只)的側(cè)腦室g/20y 1/ 只)，以生理鹽水(Saline)為對(duì)照(6只)，10分鐘后開(kāi)始電針誘導(dǎo)，30分鐘后每間隔10分 鐘觀察大鼠對(duì)傷害刺激的嘶叫反應(yīng)。結(jié)果如圖2所示(I. C. V.代表通過(guò)預(yù)先埋藏于側(cè)腦室 內(nèi)的導(dǎo)管微量注射樣品，EA代表電針誘導(dǎo)針刺鎮(zhèn)痛；橫坐標(biāo)為狗腦粗提物注射后時(shí)間，縱 坐標(biāo)為嘶叫閾的變化)，以生理鹽水(Saline)為對(duì)照，經(jīng)針刺誘導(dǎo)后，大鼠出現(xiàn)針刺鎮(zhèn)痛效 應(yīng)；狗腦粗提物注射后，再進(jìn)行針刺誘導(dǎo)，大鼠的針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)則消失，對(duì)照組大鼠的針刺 鎮(zhèn)痛效應(yīng)仍存在，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦內(nèi)存在的抗阿片物質(zhì)可能是針麻鎮(zhèn)痛不全的內(nèi)在因素。2、豬腦抗阿片肽99A的獲得及其劑量依賴(lài)效應(yīng)檢測(cè)從豬腦中分離純化抗阿片肽-99A的方法，同樣是參考楊樹(shù)長(zhǎng)等人的方法并稍做 改進(jìn)(楊樹(shù)長(zhǎng)等人(1997)，豬腦抗嗎啡鎮(zhèn)痛肽的分離純化及其抗血清對(duì)嗎啡耐受影響的初 步研究，中國(guó)生物化學(xué)雜志11卷3期322-326)，具體方法為將新鮮豬全腦在0. InM乙酸中 勻漿提取，將豬腦提取物的濃縮液先后經(jīng)kphadeX-G50凝膠過(guò)濾，S-sepharoseFast Flow 離子交換層析(S-s印harose Fast Flow層析柱購(gòu)自Wiarmacia公司)分離后，取第1個(gè)洗 脫峰的樣品，經(jīng)Q-s印harose Fast Flow離子交換層析^hs印haroseFast Flow層析柱購(gòu) 自Wmrmacia公司)分離，最后用HPLC純化，得到經(jīng)純化的抗阿片肽物質(zhì)。檢測(cè)純化的抗阿片物質(zhì)對(duì)嗎啡的抗傷害作用的效應(yīng)，方法為在腹腔注入20mg/ kg嗎啡后lOmin，將純化的豬腦抗阿片物質(zhì)分別經(jīng)側(cè)腦室或尾靜脈途徑給小鼠進(jìn)行注射， 其中，側(cè)腦室的注射劑量分別為0. 5,1. 0,2. 0ηΜ/4μ 1，尾靜脈的注射劑量分別為1. 5,3. 0、 5.0mg/kg，以生理鹽水(Saline)為對(duì)照，然后檢測(cè)嗎啡的抗傷害作用。側(cè)腦室注射組的試 驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示(橫坐標(biāo)表示嗎啡注射后時(shí)間，縱坐標(biāo)表示嘶叫閾的變化(％)，n為每 組小鼠數(shù)量，i. P.表示腹腔注射，i.e. v.表示側(cè)腦室內(nèi)注射)，尾靜脈注射組的試驗(yàn)結(jié)果如 圖3B所示，與對(duì)照組相比，兩組小鼠的嗎啡抗傷害作用都顯著地被豬腦內(nèi)抗阿片物質(zhì)所抑 制，且這種抑制效應(yīng)與劑量密切相關(guān)。將該由豬腦內(nèi)提取的具有拮抗嗎啡抗傷害作用的蛋 白稱(chēng)為抗阿片肽99A(A0P-99A)，對(duì)該抗阿片肽進(jìn)行全序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明該抗阿片肽 具有序列表中SEQ ID NO :1的氨基酸殘基序列，由86個(gè)氨基酸殘基組成，該序列與豬腸DBI 的序列一致。編碼抗阿片肽99A的基因具有序列表中SEQ ID NO 11的核苷酸序列，由258 個(gè)堿基組成。二、抗阿片肽99A與嗎啡耐受及依賴(lài)關(guān)系的檢測(cè)1、制備抗阿片肽99A的單克隆抗體用步驟一提取并純化的抗阿片肽99A，按常規(guī)方法制備其單克隆抗體(制備方
:J. Μ. Davis, J. Ε. Pennington, A. M Kubler. , J. F. Consiene (1982) Asimple, single-step technique for selecting and cloning hybridomas forproduction of monoclonal antibodies.J Immunol Methods 50 ； 141- ；Teruko Tumura, Heins Buer, Chriatian Birr and Rudiger Pipkom. (1983)Antibodies againstsynthetic peptides as a tool for function analysis of the transforming proteinPP60src Cell 34587-596 Sep. 1983 ；Xi Gou. , Ai Wang. , Xi Li. , Zh. Q. Gou and Y. Zhang (1991) Studies onmonoclonal antibody against recombinant granulocytecolony-stimulating factor. Chinese Medical Sciences Journal (6) 5 :212-214)，但由于抗阿片肽 99A 的分子量約 為10Kd，屬于弱抗原，免疫原性較差，因此，在制備抗體前，需要先將其與鑰孔槭血藍(lán)蛋白 (KLH)載體偶聯(lián)作為抗原，然后，對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行免疫(進(jìn)行2次皮下多點(diǎn)注射免疫，中 間間隔兩周)，細(xì)胞融合前3天，脾內(nèi)注射13-20 μ g抗原加強(qiáng)免疫。融合時(shí)，在無(wú)菌條件下， 取出免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠的SP^1細(xì)胞融合，應(yīng)用半固體培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)篩選、克隆得到能 產(chǎn)生A0P-99A抗體的雜交瘤細(xì)胞，最后從收集的腹水中純化出單克隆抗體。2、抗阿片肽99A與嗎啡耐受及依賴(lài)關(guān)系的檢測(cè)選取20只健康小鼠，每天三次，皮下注射遞增劑量的鹽酸嗎啡，注射劑量由IOmg/ kg遞增至60mg/kg，持續(xù)10天形成對(duì)嗎啡耐受的小鼠。在嗎啡耐受及依賴(lài)的小鼠，腹腔注射 嗎啡(50mg/kg)后，將步驟1獲得的含有抗阿片肽99A單克隆抗體的抗血清分別按1 100、 1 IOU 1的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e作側(cè)腦室內(nèi)注射，注射劑量為每只12μ1(約含13mg抗 體)，以非耐受小鼠作空白對(duì)照(Blank)，以未注射抗血清的嗎啡耐受鼠為對(duì)照(Control)， 檢測(cè)嗎啡耐受小鼠側(cè)腦室內(nèi)注入抗阿片肽99A抗血清對(duì)嗎啡耐受的逆轉(zhuǎn)作用。檢測(cè)結(jié)果如 圖4所示(橫坐標(biāo)為不同實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)為嗎啡抗傷害曲線下的面積(單位cm2) ；**代表 與耐受鼠對(duì)照組相比P < 0. 05，***代表與耐受鼠對(duì)照組相比P < 0. 01)，與耐受鼠對(duì)照組 相比，嗎啡耐受依抗阿片肽99A抗血清濃度的不同出現(xiàn)不同程度的逆轉(zhuǎn)，與非耐受的空白 對(duì)照組相比，側(cè)腦室內(nèi)注入99A的抗血清(1 1)可完全逆轉(zhuǎn)50毫克/公斤劑量嗎啡的耐 受?？梢?jiàn)只要抗阿片肽99A抗體的劑量足以與中樞內(nèi)源性抗阿片肽99A結(jié)合，降低抗阿片 肽99A水平，即可使嗎啡耐受得以逆轉(zhuǎn)。采用以下兩種方式檢測(cè)抗阿片肽99A的單克隆抗體對(duì)Naloxone (10mg/kg)誘發(fā)的 戒斷效應(yīng)-跳躍的治療作用。第一種方式是以遞增劑量嗎啡給小鼠做皮下注射，每天2次， 持續(xù)20天形成對(duì)嗎啡的耐受及依賴(lài)，在最后一次注射嗎啡后6-8小時(shí)，經(jīng)側(cè)腦室內(nèi)注射上 述獲得的抗阿片肽99A的單克隆抗體，注射劑量為每只12 μ 1 (約含13 μ g抗體)，然后腹 腔注射阿片拮抗劑Naloxone (10mg/kg)以誘發(fā)自發(fā)跳躍癥狀。結(jié)果如表1所示，在對(duì)照組 (側(cè)腦室內(nèi)注射12μ1 PBS)，5只小鼠都出現(xiàn)自發(fā)跳躍癥狀；在治療組，5只小鼠全都未出現(xiàn) 自發(fā)跳躍癥狀，說(shuō)明抗阿片肽99A的單克隆抗體可消除由阿片拮抗劑Naloxone誘發(fā)的自發(fā) 跳躍癥狀。表1抗阿片肽99A的單克隆抗體對(duì)Naloxone (10mg/kg)誘發(fā)戒斷效應(yīng)-跳躍的治 療作用的檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗阿片肽的拮抗肽，其氨基酸殘基序列為序列表中的SEQ ID NO :7。
2.編碼權(quán)利要求1所述的抗阿片肽拮抗肽的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID NO :10。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的宿主菌。
7.以權(quán)利要求1所述的抗阿片肽的拮抗肽為活性成分的增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受 和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗阿片肽及其拮抗肽與應(yīng)用。該抗阿片肽是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有拮抗嗎啡抗傷害作用的多肽。其拮抗肽是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO5-7；2)將序列表中SEQ ID NO5-7的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛、逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受和/或減弱或消除戒斷癥狀作用的多肽。本發(fā)明的抗阿片肽及其活性片段與拮抗肽將在醫(yī)學(xué)及戒毒藥物的制備領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P25/36GK102127152SQ20101058114
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2007年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月11日
發(fā)明者吳才宏, 曲紅, 陳玉珍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)