專利名稱：一種多肽復合物、藥物組合物、其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及糖尿病相關的藥物領域，具體而言，本發(fā)明涉及一種多肽復合物，該復合物具有延長的胰高血糖素樣肽類的體內半衰期。本發(fā)明還涉及該多肽復合物的制備方法及其應用。
背景技術：
本發(fā)明涉及的GLP-I (glucagon-lik印印tide-Ι，以下簡稱GLP_1)是主要由小腸 L細胞分泌的一種37個氨基酸組成的多肽，其活性形式為GLP-I (7-37) OH和GLP-I (7-36) NH2 (Mojsov S, J Clin Invest. 1987Feb ；79 (2) :616-9)。GLP-I 明顯減低人用餐后的血糖， 能刺激胰島素的產生，同時還能起到一定減肥效應，并且不會引起低血糖癥(Drucker D J， Diabetes. 1998Feb ；47 (2) :159-69)。近期研究還表明 GLP-1 有胰腺再生作用(Drucker D J,2003Dec ； 144 (12) :5145-8)。此外，因為GLP-I為完全人源化多肽，作為臨床藥物在安全上具有較大優(yōu)勢。然而，GLP-I (7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘，每天多次注射給藥在臨床使用中非常不方便。目前已經有不少研究采用GLP-I類似物融合蛋白技術解決GLP-I類似物在體內的存留時間(CN90101167. 3、CN200710018734. 2、CN200410054397. 9、CN01820232. 2、 CN200380110152. 7、CN200510039265. 3、CN200610127237. 1、CN200910009642. 7)，然而，現(xiàn)
有的技術與臨床理想的目標還有很大距離，普遍都還沒有達到臨床標準，最近Novo Norisk 生產的利拉魯肽為GLP-I類似物，其對GLP-I進行了棕櫚酸的修飾，并于2009年于美國上市。但是利拉魯肽也存在半衰期短的問題，其劑型仍需每日注射。因此，目前存在對解決GLP-I體內半衰期短的方法的需求。
發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是針對臨床上GLP-I類似物在體內存留時間較短，需要每天注射給藥的缺限，提供了一種半衰期較長的包含載體多肽與GLP-I的多肽復合物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述多肽復合物的制備方法，此外，還提供上述多肽復合物在制備治療糖尿病和肥胖癥的藥物中的應用。本發(fā)明的又一個目的是提供一種以GLP-I與載體多肽的多肽復合物作為有效成分的藥用組合物。用于實現(xiàn)上述目的的技術方案如下一方面，本發(fā)明提供一種多肽復合物，其包含GLP-I和載體多肽。其中，所述載體多肽優(yōu)選為如序列SEQ ID NO 1所示的載體多肽A或如序列SEQ ID NO 2所示的載體多肽B。在所述多肽復合物中，GLP-I和載體多肽的摩爾比為10 1-1 50，優(yōu)選 1:1-1: 50，進一步優(yōu)選 1 2.5-1 25，更優(yōu)選 1 10-1 25。另一方面，本發(fā)明提供上述多肽復合物的制備方法，該方法包括按照摩爾比例，分別稱取GLP-I和載體多肽A或B，溶于適量的生理鹽水、純水或PBS緩沖液中，在0_5°C溫度下，超聲混合1-15分鐘，或者攪拌1-3小時，或者放置過夜。再一方面，本發(fā)明還提供上述多肽復合物在制備治療糖尿病的藥物中的應用，以及該多肽復合物在制備治療和/或預防肥胖癥的藥物中的應用。又一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含上述多肽復合物。其中，所述的藥物組合物還包含一種或多種藥學上可接受的輔料，并且，所述藥物組合物優(yōu)選為注射劑，進一步優(yōu)選為凍干粉針或溶液注射劑。現(xiàn)結合本發(fā)明的目的對本發(fā)明逐一加以描述。⑴載體多肽本發(fā)明所述的載體多肽的序列如下序列A或B :序列A (SEQ ID NO 1) GLffffKAffffKAffffKSLffffRKRKRKA序列B (SEQ ID NO 2) GLffffKVffffKLffffKSLffffRKRLRKA(2) GLP-IGLP-I為天然產物，序列為SEQ ID NO 9 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR(3) GLP-I與載體多肽的復合物GLP-I與載體多肽的比例GLP-1(MW 3299)能與載體多肽A (MW :3329)或載體多肽B(MW :3384)形成的不同比例的復合物，以摩爾計算，從10 1到1 100，不同的比例得到的復合物具有不同的釋放特性，從1 1到1 50之間的比例形成的復合物具有更強的作為藥用的實用性，更優(yōu)先的范圍為1 2.5到1 25。本發(fā)明的復合物的制備方法按照摩爾比例，稱取適量的GLP-I凍干粉，溶于適量的生理鹽水、純水或PBS緩沖液中，稱取適量的載體多肽A或B，溶于適量的生理鹽水(或 PBSdK)中，在0-5°C溫度下，超聲混合1-15分鐘，或者攪拌1-3小時，或者放置過夜。所制備得到的溶液可以直接加輔料做成制劑，也可以冷凍干燥后再與其他輔料一起制成制劑。 注PBS為磷酸鹽。(4)本發(fā)明的藥用組合物本發(fā)明的含有GLP-I及載體多肽的復合物可以與一種或多種藥學上可接受的輔料共同制成藥用組合物，這些輔料包括水溶性填充劑、PH調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水、滲透壓調節(jié)劑等等。本發(fā)明所述的水溶性填充劑輔料為選自以下的一種或幾種甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。PH調節(jié)劑為選自以下的一種或幾種枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮發(fā)性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀或氫氧化銨、碳酸鈉或碳酸鉀或碳酸銨鹽、碳酸氫鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫銨鹽等生理可接受的有機或無機酸和堿及鹽等。穩(wěn)定劑為選自以下的一種或幾種EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、 磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等。優(yōu)選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷。滲透壓調節(jié)劑是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。
(5)注射劑的制備方法本發(fā)明的藥用組合物可以通過肌肉、靜脈內、皮下注射途經進行給藥，優(yōu)選的劑型為凍干粉或溶液注射劑。冷凍干燥注射劑的制備方法取GLP-I和載體多肽溶液適量，加入水溶性填充劑、 穩(wěn)定劑、滲透壓調節(jié)劑等，加入注射用水適量，調節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在0-10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌， 濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物，封口即得，每個規(guī)格含有GLP-I在 5μ g至Ij Img之間。注射液的制備方法取GLP-I和載體多肽溶液或凍干粉適量，加入水溶性填充劑、 穩(wěn)定劑、滲透壓調節(jié)劑等，加入注射用水適量，調節(jié)PH值至4-8使其溶解，加水稀釋至適當濃度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在0-10°C下攪拌10-20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌， 濾液進行分裝，封口即得，每個規(guī)格含有GLP-I在5 μ g到Img之間。(6)藥用組合物的用途本發(fā)明的藥用組合物可以用在制備糖尿病治療藥物方面。具體地，本發(fā)明的組合物可以靜脈、肌肉或皮下注射劑形式給藥。雖然劑量依治療對象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變，本發(fā)明的組合物在相當寬的劑量范圍內是有效的。在成人的治療中，劑量范圍在 5μ g/人一Img/人，每日一次或每幾日一次給藥。實際劑量應該由醫(yī)生根據有關的情況來決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)、給藥途徑、年齡、體重、患者對藥物的個體反應， 患者癥狀的嚴重程度等等，因此上述劑量范圍并不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明采用多肽組合藥物技術克服了 GLP-I半衰期短的問題，所提供的多肽復合物中，由于載體多肽的存在使得GLP-I在體內的半衰期可達到34小時以上，較單獨給藥的 GLP-I的半衰期(半衰期僅為3-5分鐘)明顯延長，極大地便利了 GLP-I的臨床推廣和應用。
以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施例，其中圖1為實施例18中含GLP-I和載體多肽的多肽復合物的降血糖實驗，其中GLP-I 天然 GLP-I ；GLP-1+2. 5A =GLP-I與載體多肽A以摩爾比例1 2. 5的復合物；GLP-1+5A =GLP-I與載體多肽A以摩爾比例1 5的復合物；GLP-1+10A =GLP-I與載體多肽A以摩爾比例1 10的復合物；GLP-1+25A =GLP-I與載體多肽A以摩爾比例1 25的復合物；GLP-1+2. 5B =GLP-I與載體多肽B以摩爾比例1 2. 5的復合物；GLP-1+5B :GLP_1與載體多肽B以摩爾比例1 5的復合物；GLP-1+10B :GLP_1與載體多肽B以摩爾比例1 10的復合物;GLP-1+25B =GLP-I與載體多肽B以摩爾比例1 25的復合物。圖2為GLP-I與不同比例的載體多肽復合物的液相分離結果，其中圖2A為GLP-I，圖2B為載體多肽A，圖2C為載體多肽B，圖2D為GLP-I+載體多肽 A，圖2E為GLP-I+載體多肽B。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。實施例1 載體多肽A的制備按照大腸桿菌的優(yōu)選密碼子(但不限于優(yōu)選密碼子)，利用全基因合成的方法合成含有多肽A的堿基序列，DNA序列如下SEQ ID NO 3 5tatgattgaaggccgtggcctgtggtggaaagcgtggtggaaagcgtggtggaaatccctgtggtggc gtaaacgtaaacgtaaagcgtaataag3SEQ ID NO 4 5gatccttattacgctttacgtttacgtttacgccaccacagggatttccaccacgctttccaccacgc
tttccaccacaggccacggccttcaat3將DNA序列3及序列4進行粘合，分別加入同等摩爾量的SEQ ID N03及SEQ ID NO 4，95°C水浴孵育5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫。此雙鏈DNA可以與被Ndel/BamHI雙酶切后的大腸桿菌表達載體PETMb進行連接。如下所示，上述方法合成的雙鏈DNA含有5’ NdeI 及3’ BamHI的尖性末端，另含有factor fe的酶切位點用于去除N端的氨基酸殘基。
Fa ctor XaBamhI
TATCiVTTt^ GGC CGTlSGCC TGT GGT GGAAftGCGTGGTGGAAA GCGTGGTGGAAATCCCTGTGGTGGCGTAAACGT AAACGT AAAGCGT AAT AAG ^ f TAACTTCCGGCi CCGGACACCACCT TTCGCACCACCTTTCGCACCACCTTTAGGGACACCACCGCATTTGCTVTTTGCATTTCGCATTATTCCTAG NdeI本發(fā)明中的酶切技術及連接技術均為本領域內大家熟知的技術。將構建所得質粒轉化B121 (DE3)感受態(tài)細胞，質粒轉化及感受態(tài)細胞的制備均為本領域眾所周知的技術。采用通用的大腸桿菌蛋白表達方法(IPTG引導)對本發(fā)明中涉及的多肽進行表達，菌液經離心后收集沉降物。將沉降物用超聲波細胞破碎法進行破碎，離心后收集上清液并使用鎳柱對本發(fā)明中的多肽進行純化。上述方法純化后的多肽進Si^ctor Xa酶切用于除去6XHisTag及其他氨基酸殘基。純化后的多肽經過紫外滅菌、DNA去除這些領域內熟知的技術進行再次純化以滿足藥用需求。本發(fā)明中所述的蛋白純化，酶切及冷凍干燥的方法為本領域眾所周知的知識及技術。本專利同樣適用于使用其它的多肽制備方法，例如多肽化學合成，酵母表達體系及哺乳動物表達體系。實施例2 載體多肽B的制備按照大腸桿菌的優(yōu)選密碼子(但不限于優(yōu)選密碼子)，利用全基因合成的方法合成多肽B的DNA序列如下SEQ ID NO 5 5tatgattgaaggccgtggcctgtggtggaaagtgtggtggaaactgtggtggaaaagcctgtggtggc gcaaacgcctgcgcaaagcgtaataag3SEQ ID NO 6 5gatccttattacgctttgcgcaggcgtttgcgccaccacaggcttttccaccacagtttccaccacac
tttccaccacaggccacggccttcaat3
將DNA序列5及序列6進行粘合，分別加入同等摩爾量的SEQ ID N03及SEQ ID NO 4，95°C水浴5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫。此雙鏈DNA可以與被Ndel/BamHI雙酶切后的大腸桿菌表達載體PETMb進行連接。如下所示，上述方法合成的雙鏈DNA含有5’ NdeI 及3’ BamHI的尖性末端，另含有factor fe的酶切位點用于去除N端的氨基酸殘基。
Factor XaBamhI
TATGfcTTGAAGGCCGTCGCCTGTGGTGGAAAGTGTGGTGGAAACTGTGGTGGAAAAGCCTGTGGTGGCGCAAACGCTGCGCAAAGCGTAATAAG | 個 TAACTTCCGGCaCCGGACACCACCTTTCACACCACCTTTGACACCACCTTTTCGGACACCACCGCGTTTGCGACGCGTTTCGCATTATTCCTAG NdeI將構建所得質粒轉化B121 (DE3)感受態(tài)細胞，質粒轉化及感受態(tài)細胞的制備均為本領域眾所周知的技術。采用通用的大腸桿菌蛋白表達方法(IPTG引導)對本發(fā)明中涉及的多肽進行表達，菌液經離心后收集沉降物。將沉降物用超聲波細胞破碎法進行破碎，離心后收集上清液并使用M-NTA鎳柱對本發(fā)明中的多肽進行純化。上述方法純化后的多肽進 Ri^ctor fe酶切用于除去6XHis Tag及其他氨基酸殘基。純化后的多肽經過紫外滅菌、 DNA去除這些領域內熟知的技術進行再次純化以滿足藥用需求。本發(fā)明中所述的蛋白純化， 酶切及冷凍干燥的方法為本領域眾所周知的知識及技術。本專利同樣適用于使用其它多肽制備方法，例如多肽化學合成，酵母表達體系及哺乳動物表達體系。實施例3 重組glp-i的制備及純化技術GLP-I為天然產物，不存在專利限制。本發(fā)明中采用生物方法進行GLP-I的制備， 本專利同樣適用于使用其它多肽制備方法，例如多肽化學合成。SEQ ID NO 9 =HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR根據GLP-I的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)進行編碼DNA的合成及制備，兩條互補的DNA單鏈由上海生工進行合成，見序列7，序列8。并參照實施例1所述，制備編碼GLP-I 的雙鏈DNA，此雙鏈DNA具有與載體(pET15b)連接的酶切位點(NdeI/BamHI)。參照實施例 1的內容，構建GLP-I的表達質粒。重組GLP-I參照實施例1中描述的蛋白表達、純化、干燥方法進行制備。純化后的多肽經過紫外滅菌、去除DNA這些領域內熟知的技術進行再次純化以滿足藥用需求。seq id no 7 5tatgattgaaggccgtcatgcggaaggcacctttaccagcgatgtgagcagctatctggaaggccagg
cggcgaaagaatttattgcgtggctggtgaaaggccgctaataag3SEQ ID NO 8 5gatccttattagcggcctttcaccagccacgcaataaattctttcgccgcctggccttccagaiagct
gctcacatcgctggtaaaggtgccttccgcatgacggccttcaat3實施例4 =GLP-I與載體多肽A的1 10復合物按照GLP-I與載體多肽A摩爾比例(以下比例沒有注明同為摩爾比)1 10，稱取Img的GLP-I (MW 3299)凍干粉，溶于Iml生理鹽水，充分混勻后，稱取10. Img載體多肽 A(MW 3329)溶于上述含GLP-I的生理鹽水中，充分混勻后，在0_10°C溫度下，得到復合物溶液，如果立即制備制劑，可以直接往下操作不需要凍干。實施例5 =GLP-I與載體多肽A的10 1復合物稱取4. 2mg的GLP-1凍干粉，溶于Iml生理鹽水，充分混勻后，稱取0. 41mg載體多肽A凍干粉溶于上述GLP-I生理鹽水中，充分混勻后，在0-10°C溫度下，攪拌3小時，冷凍干CN 102532323 A燥得到復合物固體粉末。實施例6 =GLP-I與載體多肽A的1 2. 5復合物稱取2. Img的GLP-1凍干粉，溶于Iml純水，充分混勻后，稱取5. 24mg載體多肽A 凍干粉溶于上述GLP-I水溶液中，充分混勻后，在0-5°C溫度下，攪拌3小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例7 =GLP-I與載體多肽A的1 25復合物稱取0. 2Img的GLP-1凍干粉，溶于Iml純水，充分混勻后，稱取5. 24mg載體多肽 A凍干粉溶于上述GLP-I水溶液中，充分混勻后，在0-5°C溫度下，攪拌3小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。t施例8:GLP_1與載體多fltB的1 1復合物稱取0. 42mg的GLP-1凍干粉，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取0. 43mg載體多肽B (MW 3384)凍干粉溶于上述含GLP-I的PBS緩沖液中，充分混勻后，在0_5°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例9 :GLP_1與載體多肽B的1 10復合物稱取0. 42mg的GLP-1凍干粉，溶于Iml純水中，充分混勻后，稱取4. 3mg載體多肽 B凍干粉溶于上述含GLP-I的溶液中，充分混勻后，在0-5°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例10 =GLP-I與載體多肽B的1 25復合物稱取0. 2Img的GLP-1凍干粉，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取5. 38mg載體多肽B凍干粉溶于上述含GLP-I的PBS緩沖液中，充分混勻后，在0-10°C溫度下，攪拌1 小時，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例11 =GLP-I與載體多肽B的1 50復合物稱取0. 2Img的GLP-1凍干粉，溶于Iml PBS緩沖液，充分混勻后，稱取10. 75mg載體多肽B凍干粉溶于上述含GLP-I的PBS緩沖液中，充分混勻后，在0°C左右超聲混合5分鐘，0°C左右放置，備用，1-3小時內用于制備注射劑。實施例12 =GLP-I與載體多肽BWl: 100復合物稱取0. 2Img的GLP-I凍干粉，溶于2ml生理鹽水，充分混勻后，稱取21. 5mg載體多肽B凍干粉溶于上述含GLP-I的生理鹽水中，充分混勻后，在0-10°C溫度下，放置過夜，冷凍干燥得到復合物固體粉末。實施例13 凍干粉型藥物組合物的制備取適量的容器加泊洛沙姆0.05g、甘露醇0.2g、乳糖0. lg、注射用水:3ml，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節(jié)PH至6. 0，冷卻至5°C，取實施例4方法制備的復合物溶液5ml (含GLP-15mg+50. 5mg載體多肽A)加入其中，繼續(xù)調補PH至6. 0，加水至IOml。 加入20mg活性碳，在5°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支0. 2ml 進行分裝，預凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥2小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得GLP-I多肽復合物的藥物組合物，置于預充式的注射器中，規(guī)格為100 μ g/支，4°C以下保存，注射前以200 μ 1注射用水溶解后給藥。實施例14 溶液注射劑型藥物組合物的制備取適量的容器加山梨醇0. lg、乳糖0. lg、NaCl 20mg，枸櫞酸10mg、注射用水7ml，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節(jié)PH至6. 5，冷卻至0°C，取以實施例6的方法制得的復合物粉末適量(含GLP-15mg+12. 48mg載體多肽Α)加入其中，繼續(xù)攪拌溶解， 調補PH至6. 5，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在0_4°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支100 μ 1分裝入預充式注射器，樣品溫度到5°C以下保存，規(guī)格為 50 μ g/支。實施例15 凍干粉型藥物組合物的制備取適量的容器加山梨醇0.05g、乳糖0.06g和注射用水5ml，攪拌使溶解，加lmol/L 的鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)PH至7. 5，冷卻至5°C，取實施例7方法制備的復合物適量(含GLP-I 5mg+124. 8mg載體多肽Α)加入其中，繼續(xù)調補PH至6. 0，加水至10ml。加入IOmg活性碳， 在5°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支Iml進行分裝，預凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥5小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得GLP-I多肽藥物復合物凍干粉針，規(guī)格為500 μ g/支。實施例16 溶液灃射劑型藥物組合物的制備取適量的容器加NaCl 40mg,注射用水7ml，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節(jié)PH至6. 5，冷卻至0°C，取以實施例9的方法制得的復合物粉末適量(含GLP-I 5mg+51. 2mg載體多肽B)加入其中，繼續(xù)攪拌溶解，調補PH至6. 5，加水至10ml。加入IOmg 活性碳，在0-4°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支200 μ 1分裝入預充式注射器，樣品溫度到5°C以下保存，規(guī)格為100 μ g/支。實施例17 凍干粉型藥物組合物的制備取適量的容器加NaCl 20mg和注射用水5ml，攪拌使溶解，加lmol/L的鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)PH至7. 5，冷卻至5°C，取實施例10方法制備的復合物適量(以GLP-I重量計算為5mg)(含GLP-I 5mg+128. Img載體多肽B)加入其中，繼續(xù)調補PH至6. 0，加水至10ml。 加入IOmg活性碳，在5°C下攪拌20分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支0. 5ml 進行分裝，預凍2小時后，冷凍下減壓干燥12小時，至樣品溫度到5°C后，再干燥5小時，制得白色疏松塊狀物，封口即得GLP-I多肽藥物復合物凍干粉針，規(guī)格為250 μ g/支。^MM 18 多jfeg合4勿在小薩/本內的降血能實騎給小鼠靜脈注射不同比例的復合物(以GLP-I計算劑量為100 μ g/kg，混合比例分別為1 2.5，1 5，1 10，1 25，以上混合比例均為GLP-I與載體多肽的比例)，分別于給藥后0. 5、4、6、8、12、對和48小時注射葡萄糖(3g/kg)，測定注射后半小時的血糖含量， 結果表明GLP-I在半小時后完全喪失其降血糖功能，但是復合物卻在給藥48小時后依然存在降血糖功能，結果顯示GLP-I與載體多肽形成復合物后不僅有效保持了天然GLP-I的降血糖功能，而且這些復合物的形成能夠大大有效的提高了 GLP-I降血糖功能的時間，結果見圖1。圖2顯示了 GLP-I與不同比例的載體多肽混合的液相色譜結果，結果顯示了 GLP-I 與載體多肽復合物在液相中被確定為復合物(20分鐘的峰)。 ^mm 19 大鼠注射GLP-I及其分別與多肽A、多肽B的復合物(折合GLP-I為1000 μ g/kg， 混合比例分別為1 2.5，1 5，1 10，1 25，以上混合比例均為GLP-I與載體多肽的摩爾比例)，分別于注射前及注射后0. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小時后于眼叢靜脈取血約 ο. ani，制備血清備用。
GLP-I濃度測定方法采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測大鼠血清中多肽復合物的濃度，操作如下4°C離心分離血漿。用GLP-IEIA試劑盒(Phoenix Pharmaceuticals, INC)對鼠血漿中的GLP-I的濃度進行測定。將稀釋后的鼠血漿樣品加入96孔板(50 μ 1)， 加入25μ1 GLP-I的羊抗鼠一抗后，37°C孵育2小時。使用洗液清洗96孔板4次，加入 100 μ 1 SA-HRP后孵育1小時。同樣的方法對96孔板進行清洗，然后加入100 μ 1 TMB, 37°C 孵育1小時。用2Ν鹽酸中止反應后20分鐘內測定0D450值，并與標準濃度的GLP-I進行比對及根據ELISA結果計算藥代動力學參數(shù)。GLP-I及其復合物的體內藥代動力學結果見表1，結果顯示本發(fā)明的GLP-I復合物在體內的半衰期較單獨的GLP-I明顯延長，具有長效特性。表1GLP-1及其復合物在大鼠體內的半衰期
樣品來源半衰期(小時)
GLP-I< 0. 5
GLP-1+多肽 A(1 2.5) < 0. 5 GLP-1+多肽 A(1 5)IH
GLP-1+多肽 A(1 10) 2l~5 GLP-1+多肽 A(1 25) 34~0 GLP-1+多肽 B(1 2.5) < 0. 5 GLP-1+多肽 B(1 5) Γ8
GLP-1+多肽 B(1 10) 208 GLP-1+多肽 B(1 25) 3 Τ權利要求
1.一種多肽復合物，其中，所述多肽復合物包含GLP-I和載體多肽。
2.如權利要求1所述的多肽復合物，其中，所述載體多肽為如序列SEQIDNO 1所示的載體多肽A或如序列SEQ ID NO 2所示的載體多肽B。
3.如權利要求1或2所述的多肽復合物，其中，所述GLP-I和載體多肽的摩爾比為 10 1-1 50，優(yōu)選 1 1-1 50，進一步優(yōu)選 1 2.5-1 25，更優(yōu)選 1 10-1 25。
4.如權利要求1-3任一項所述的多肽復合物的制備方法，其中，所述方法包括按照摩爾比例，分別稱取GLP-I和載體多肽A或B，溶于適量的生理鹽水、純水或PBS緩沖液中，在 0_5°C溫度下，超聲混合1-15分鐘，或者攪拌1-3小時，或者放置過夜。
5.如權利要求1-3任一項所述的多肽復合物在制備治療糖尿病的藥物中的應用。
6.如權利要求1-3任一項所述的多肽復合物在制備治療和/或預防肥胖癥的藥物中的應用。
7.—種藥物組合物，其包含如權利要求1-3任一項所述的多肽復合物。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物還包含一種或多種藥學上可接受的輔料。
9.如權利要求7或8所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射劑。
10.如權利要求7-9中任一項所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為凍干粉針或溶液注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽復合物，其包含GLP-1和載體多肽。所述載體多肽能夠有效延長GLP-1的血液半衰期，克服其因為半衰期短而無法在臨床上使用的現(xiàn)狀，在糖尿病、肥胖癥治療藥物領域較有應用前景。本發(fā)明還公開了所述多肽復合物的制備方法及其應用。此外，本發(fā)明進一步公開了包含所述多肽復合物的藥物組合物。
文檔編號A61K38/17GK102532323SQ20101058132
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權日2010年12月9日
發(fā)明者付剛, 任曉文, 徐為人, 李心, 湯立達, 王玉麗, 鄭學敏, 龔珉 申請人:天津藥物研究院