專利名稱：一種ev71病毒樣顆粒及以其制備的手足口病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種EV71病毒樣顆粒及以其制備的手足口病疫苗。
背景技術(shù)：
自1957年以來(lái)，手足口病在世界多個(gè)國(guó)家爆發(fā)流行，特別是20世紀(jì)90年代以來(lái)， 在亞太地區(qū)流行日益猖獗。2007年以來(lái)中國(guó)大陸發(fā)生手足口病爆發(fā)流行，至2010年9月底，累計(jì)報(bào)告300多萬(wàn)兒童感染手足口病，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康和生命安全。手足口病的病原體主要是小RNA病毒，腸道病毒屬成員，主要是柯薩奇A組16型(Coxsakie A16， CoxA16)和腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)，其中EV71病毒是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和死亡病例的主要病原體。目前還沒(méi)有有效的疫苗用以預(yù)防EV71，但脊髓灰質(zhì)炎疫苗在控制全球脊髓灰質(zhì)炎病毒傳播中的成功實(shí)踐，給EV71疫苗的研制帶來(lái)了希望。不同形式的EV71疫苗都處于研發(fā)階段，研究發(fā)現(xiàn)福爾馬林滅活的EV71疫苗產(chǎn)生的中和抗體(1 64)比自然感染的中和抗體(1 128)低，可能是因?yàn)楦栺R林滅活的EV71疫苗在制備過(guò)程中破壞了 B細(xì)胞表位。 研究也發(fā)現(xiàn)熱滅活的全病毒疫苗誘導(dǎo)的中和抗體滴度比自然感染明顯低，可能也與破壞構(gòu)象表位有關(guān)；并且滅活疫苗存在滅活不完全的風(fēng)險(xiǎn)。減毒活疫苗可以保存構(gòu)象表位，但也存在毒力回復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)。病毒樣顆粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的發(fā)展為如何研發(fā)既保持構(gòu)象表位并且無(wú)毒力回復(fù)風(fēng)險(xiǎn)的疫苗提供了一種新的研究策略。VLP疫苗是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，表達(dá)病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白具有天然的自裝配能力，可形成與真正病毒顆粒相同或相似的空心顆粒，沒(méi)有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，沒(méi)有感染性，不存在滅活不完全或毒力回復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了構(gòu)象表位，可通過(guò)和全病毒疫苗一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外有多家研究組進(jìn)行EV71病毒顆粒疫苗的研制，發(fā)表的文獻(xiàn)(Chung YC, Huang JH, Lai Cff, et al. Expression, purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles. World J Gastroenterol 2006 ;12 :921-927 ；)主要用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)EV71的3⑶和Pl蛋白，3⑶蛋白酶能將Pl 前蛋白酶切為VP1，VP3和VPO三個(gè)蛋白，這三個(gè)蛋白能自動(dòng)組裝成VLPs，能誘導(dǎo)產(chǎn)生Thl 和Th2免疫反應(yīng)。用VLPs免疫的母鼠能給用EV71病毒致死攻擊的乳鼠提供免疫保護(hù)，表明EV71VLPS是一種有效的疫苗。但是，由于目前主要用昆蟲(chóng)細(xì)胞制備VLPs，培養(yǎng)條件要求較高；又由于是胞內(nèi)表達(dá)，VLP純化過(guò)程復(fù)雜，限制了大規(guī)模的生產(chǎn)需求；而且桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)另一個(gè)主要的缺陷是產(chǎn)生桿狀病毒顆粒及其他明顯影響疫苗效果的污染物，由于桿狀病毒顆粒很難和制備的VLP分離開(kāi)來(lái)，制備的VLP應(yīng)用于臨床需要進(jìn)行化學(xué)滅活處理等措施，這些處理可能會(huì)影響制備的VLP的質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從新的表達(dá)系統(tǒng)獲得的EV71病毒樣顆粒，該EV71病毒樣顆粒易于培養(yǎng)獲得，適合工業(yè)化生產(chǎn)，且便于純化。本發(fā)明的另一目的是提供以上述EV71病毒樣顆粒制備的手足口病疫苗。本發(fā)明提供的一種EV71病毒樣顆粒，其中，所述EV71病毒樣顆粒的制備過(guò)程包括(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3⑶蛋白酶基因與pGAPZaA質(zhì)粒分別連接后構(gòu)建Pl-pGAPZ a A和3⑶-pGAPZ a A重組質(zhì)粒；(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株所述重組質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMDl 168表達(dá)菌株，得到Pl-pGAPZ a A_3CD_pGAPZ a A-SMDl 168 畢赤酵母重組表達(dá)菌株；(3)菌體培養(yǎng)及EV71病毒樣顆粒純化培養(yǎng)所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株，離心分離上清液，所述上清液經(jīng)超速離心后的沉淀用蔗糖密度梯度離心，獲得EV71 病毒樣顆粒。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建并培養(yǎng)能夠表達(dá)EV71病毒樣顆粒的畢赤酵母重組表達(dá)菌株，成功的獲得了一種易于通過(guò)菌體培養(yǎng)獲得，適合工業(yè)化生產(chǎn)，且便于純化的EV71病毒樣顆粒。進(jìn)一步，所述Pl-pGAPZ a A重組質(zhì)粒是將Pl蛋白基因與pGAPZaA質(zhì)粒均用RiilI 內(nèi)切酶和^iclI內(nèi)切酶分步雙酶切后，用T4DNA連接酶將Pl基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接得到。 進(jìn)一步，所述3⑶-pGAPZ a A重組質(zhì)粒是將所述3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA質(zhì)粒均用EcoRI和^CbaI內(nèi)切酶分步雙酶切后，用T4DNA連接酶將3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接得到。進(jìn)一步，所述3⑶蛋白酶基因和Pl蛋白基因是以EV71病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增獲得。進(jìn)一步，所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株是用電穿孔儀先將所述3⑶-pGAPZaA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SMDl 168酵母表達(dá)菌株，用低濃度博萊霉素zeocin篩選得到3⑶-pGAPZ α A-SMD1168 重組表達(dá)菌株，然后再將所述Pl-pGAPZ α A質(zhì)粒轉(zhuǎn)入3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重組表達(dá)菌株，用高濃度博萊霉素zeocin篩選得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168重組表達(dá)菌株。進(jìn)一步，所述低濃度博萊霉素zeocin是指100 μ g/ml濃度的博萊霉素，所述高濃度zeocin是指500 μ g/ml濃度的博萊霉素。進(jìn)一步，所述EV71病毒樣顆粒純化是將所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液 5000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清，超速離心28000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心4小時(shí)，棄上清， 沉淀用磷酸鹽緩沖液PBS溶解，鋪于不連續(xù)重量百分比蔗糖梯度15^^30^^45%和60% 上，于28000轉(zhuǎn)/分鐘4°C離心1小時(shí)，收集15% -30%層病毒帶，用磷酸緩沖液稀釋，28000 轉(zhuǎn)/分鐘4°C離心2. 5小時(shí)，棄去上清液，即得純化的EV71病毒樣顆粒。本發(fā)明提供的一種手足口病疫苗，所述疫苗的制備方法包括(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用EV71病毒Pl蛋白基因和3CD蛋白酶基因與pGAPZaA質(zhì)粒分別連接后構(gòu)建 Pl-pGAPZ α A和3⑶-pGAPZ α A重組質(zhì)粒；(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株所述重組質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168表達(dá)菌株，得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168重組表達(dá)菌株；C3)菌體培養(yǎng)及EV71病毒樣顆粒純化培養(yǎng)所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株，離心分離上清液，所述上清液經(jīng)超速離心后沉淀用蔗糖密度梯度離心，獲得EV71病毒樣顆粒；(4)制備疫苗所述EV71病毒樣顆粒用磷酸緩沖液溶解到40 μ g/ml，與等體積弗氏完全佐劑相混合制成疫苗。本發(fā)明的有益效果在于1.表達(dá)本發(fā)明EV71病毒樣顆粒的畢赤酵母重組表達(dá)菌株易于篩選得到重組轉(zhuǎn)化子具有kocin抗性標(biāo)記基因，可直接用kocin進(jìn)行篩選，大大簡(jiǎn)化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過(guò)程。2.本發(fā)明的EV71病毒樣顆粒適于制備疫苗本發(fā)明選擇的畢赤酵母重組表達(dá)菌株具有真核生物表達(dá)蛋白質(zhì)的特點(diǎn)一正確加工、修飾、合理的空間折疊，不含內(nèi)毒素和其他有害物質(zhì)，使用安全；由于畢赤酵母加到翻譯蛋白上的糖鏈比釀酒酵母短得多，并且畢赤酵母極少出現(xiàn)過(guò)渡糖基化，可避免外源蛋白生產(chǎn)過(guò)強(qiáng)的免疫原性或因糖鏈過(guò)長(zhǎng)干擾外源蛋白正確折疊而影響其功能。3.適于工業(yè)化生產(chǎn)本發(fā)明選擇的畢赤酵母重組表達(dá)菌株同時(shí)具有原核細(xì)胞生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單、繁殖速度快，對(duì)培養(yǎng)條件要求低，培養(yǎng)基價(jià)廉，能進(jìn)行高密度培養(yǎng)，且能耐受較高的液體靜壓，便于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。4.穩(wěn)定性好pGAPZ α A質(zhì)粒能與酵母宿主細(xì)胞的染色體基因組DNA發(fā)生同源重組，質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失；所采用的畢赤酵母SMD1168菌株是蛋白酶缺陷菌株，可有效降低外源目的蛋白的酶解。5.便于純化啟動(dòng)子為GAP，不需甲醇誘導(dǎo)，便于疫苗生產(chǎn)；同時(shí)含有α分泌信號(hào)，將蛋白分泌至胞外，便于純化。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為本發(fā)明構(gòu)建的3⑶-pGAPZ α A重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明構(gòu)建的Pl-pGAPZ α A重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明構(gòu)建的Pl-pGAPZa A-3CD_pGAPZa A-SMD1168重組菌株表達(dá)制備 EV71病毒樣顆粒構(gòu)建流程圖；圖4為本發(fā)明EV71病毒樣顆粒與對(duì)照組免疫小鼠后總IgG抗體滴度圖；圖5為本發(fā)明EV71病毒樣顆粒與對(duì)照組中和抗體滴度圖；圖6為本發(fā)明EV71病毒樣顆粒與對(duì)照組免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖圖；圖7 為本發(fā)明EV71病毒樣顆粒與對(duì)照組VLP刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的濃度圖；其中1 =SMDl 168菌對(duì)照組 2 空質(zhì)粒重組菌對(duì)照組3:滅活疫苗組4:VLP組
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例本發(fā)明EV71病毒樣顆粒的制備本發(fā)明所采用的RT-PCR、酶切、連接等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法可參考《分子克隆》第二版。制備本發(fā)明EV71病毒樣顆粒的基礎(chǔ)材料包括EV71病毒Pl基因、3⑶基因、 pGAPZ α A質(zhì)粒(美國(guó)hvitrogen公司產(chǎn)品)、SMDl 168酵母菌株(美國(guó)hvitrogen公司廣品)O一、Pl基因，3CD基因克隆1.第一鏈 cDNA 制備用上海生工重組禽類成髓纖維病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 EV71病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2.引物設(shè)計(jì)借助I^rimer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)Pl基因和3⑶基因引物，由上海生工合成，下橫線為酶切位點(diǎn)Pl-上游引物(Pml 1)5’ -TATCTACACGTGCATGGGTTCGCAGGTGTCTAC-3’ Pl-下游引物(SacII) 5，-TATCGTCCGCGGCTAAAGAGTAGTGATCGCTGT-3’ ；3CD-上游引物(EcoRI) 5，-AGCAGAATTCATGGGCCCGAGTCTTGATTT-3 ‘；3CD-下游引物(XbaI) 5，-GCCGTCTAGACTAAAATAACTCGAGCCAATTGCGTC-3’。3. EV71 Pl 和 3CD 基因 PCR 擴(kuò)增用Takara公司PrimerSTAR HS DNA多聚酶以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板用PCR方法擴(kuò)增Pl基因和3CD基因，方法如下Pl基因PCR反應(yīng)體系
dH2031. 5μ 1
5XPrimerSTAR HS DNA polymerase buffer10 μ 1
dNTP(2. 5mmol)4μ 1
Pl上游引物(ΙΟμπιοΙ)1 μ 1
Pl上游引物(ΙΟμπιοΙ)1 μ 1
cDNA2μ 1
PrimerSTAR HS DNA polymerase0. 5μ 1
50 μ 1
Pl基因PCR反應(yīng)條件
98°C, 10s,
60°C, 15s,
72°C,3min ；30 個(gè)循環(huán)；
72°C, IOmin ；
4°C。
3⑶基因PCR反應(yīng)體系
dH2031. 5μ 1
5XPrimerSTAR HS DNA polymerase bufferdNTP(2. 5mmol)3CD 上游引物(ΙΟμπιοΙ)3CD 上游引物(ΙΟμπιοΙ)cDNAPrimerSTAR HS DNA polymerase_
10 μ 1 4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 2μ 1 0. 5μ 1
50 μ 13CD基因PCR反應(yīng)條件98°C, 10s,60°C, 15s,72 °C，2min ; 30 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin ；4°C。4. Pl 基因，3CD 基因，pGAPZaA 雙酶切Pl基因和pGAPZaA質(zhì)粒用PmlI內(nèi)切酶(NEB公司)禾Π SacII (NEB公司)內(nèi)切酶分步進(jìn)行酶切，3⑶基因和pGAPZaA質(zhì)粒用EcoRI (NEB公司)和)(bal (NEB公司)內(nèi)切酶分步進(jìn)行酶切。4. 1純化Pl基因和3⑶基因PCR產(chǎn)物用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收純化Pl基因和3⑶基因PCR產(chǎn)物，方法步驟如下(I)Pl基因和3⑶基因PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳；(2)紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，放在1. 5ml離心管中，用Iml TE緩沖液洗一次。用吸頭徹底吸掉液體并用之搗碎凝膠。離心數(shù)秒，加入4倍凝膠體積的溶膠液 Binding Buffer II ；(3)將離心管放在60°C水浴中l(wèi)Omin，每^iin溫和地顛倒以加速凝膠的溶化；(4)等凝膠徹底融化成為膠溶液后，將膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)帶吸附膜的 UNIQ-10 柱中，靜置 2min，8000rpm 離心 Imin ；(5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的濾液，將UNIQ-10柱重新裝在收集管中；(6)加入500 μ 1洗滌液WB于離心柱中，8000rpm離心Imin ；(7)倒掉收集管中的濾液，將UNIQ-10柱重新裝在收集管中。再加入500 μ 1洗滌液WB于離心柱中8000rpm離心Imin ；(8)棄濾液，將UNIQ-10柱重新裝在收集管中，12，OOOrpm離心anin，取下UNIQ-10 柱自然晾干IOmin ；(9)將晾干后的UNIQ-10柱裝在一個(gè)新的高壓滅菌處理過(guò)的1. 5ml離心管中，向離心柱膜中央加入40 μ 1洗脫液(Elution Buffer)，室溫靜置5min ；(10) 12，OOOrpm離心1分鐘，洗脫DNA，凍存于_20°C備用。4. 2 提取 pGAPZ α A 質(zhì)粒用上海生工小量質(zhì)粒提取試劑盒提取pGAPZ α A質(zhì)粒，方法如下
(1)用接種環(huán)接種含pGAPZ α A質(zhì)粒DH5 α凍存菌于kocin+(25 μ g/mL) LB平皿， 37°C 培養(yǎng) 16h ；(2)用無(wú)菌牙簽從LB平板挑取白色單菌落，接種于3mL Zeocin+(25 μ g/mL) LB培養(yǎng)液中，37°C 250r/min振蕩培養(yǎng)12-16h ；(3)無(wú)菌移取1. 5mL菌液置印pendorf管中，12000r/min離心3min，棄上清；(4)每管加入100 μ L預(yù)冷的Sollution I (含RNase Α)，用渦旋器振蕩懸??；(5)加入200 μ L新配制的Sollution II，溫和倒置3_4次混勻，使細(xì)菌裂解，室溫放置2min ；(6)加入350 μ L預(yù)冷的SollutionIII，顛倒混和10次，使之充分中和，室溫放置 5min ；(7) 12000r/min 離心 IOmin ；(8)將上清轉(zhuǎn)移至套放在2ml收集管內(nèi)帶吸附膜的UNIQ-IO柱中，靜置aiiin， 8000rpm 離心 30s ；(9)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的濾液，將UNIQ-10柱重新裝在收集管中；(10)加入500 μ 1洗滌液WB于離心柱中，IOOOOrpm室溫離心Imin ；(11)倒掉收集管中的濾液，將UNIQ-10柱重新裝在收集管中。再加入500 μ 1洗滌液WB于離心柱中IOOOOrpm室溫離心Imin ；(12)棄濾液，將UNIQ-10柱重新裝在收集管中，12，OOOrpm離心2min，取下 UNIQ-10柱自然晾干IOmin ；(13)將晾干后的UNIQ-10柱裝在一個(gè)新的高壓滅菌處理過(guò)的1. 5ml離心管中，向離心柱膜中央加入40 μ 1洗脫液(Elution Buffer)，室溫靜置5min ；(14) 12，OOOrpm離心1分鐘，洗脫DNA，凍存于_20°C備用。4. 3P1基因和pGAPZ α A質(zhì)粒SacII單酶切(1)純化的Pl基因用SacII單酶切，反應(yīng)體系dH2037 μ 110ΧΝΕΒ buffer 45μ 1Pl PCR 膠回收產(chǎn)物 Ο90μ g/ml)7μ 1SacII1 μ 1_Q)pGAPZaA用SacII單酶切，反應(yīng)體系dH2010XNEB buffer 4pGAPZaA 質(zhì)粒(53 μ g/ml)SacII_(3)Pl基因和pGAPZaA SacII單酶切條件37°C，2h，
6 μ 1 5 μ 1
50 μ 1
50 μ 1
38 μ 1 1 μ 10127]65°C,20min。
0128]4. 43CD基因和pGAPZaA質(zhì)粒EcoRI單酶切
0129](1)純化的3⑶基因用EcoRI單酶切，反應(yīng)體系
0130]dH2030 μ 1
0131]IOXNEB EcoRI buffer5μ 1
0132]3CD PCR 膠回收產(chǎn)物(145μ g/ml)14 μ 1
0133]EcoRI1 μ 1
0134]_
0135]50 μ 1
0136](2)提取的pGAPZaA用EcoRI單酶切，反應(yīng)體系
0137]dH206μ 1
0138]IOXNEB EcoRI buffer5μ 1
0139]pGAPZaA(53 μ g/ml)38 μ 1
0140]EcoRI1 μ 1
0141]_
0142]50 μ 1(3) 3CD 基因和 pGAPZaA EcoRI 單酶切條件37°C，2h，65°C,20min。4. 5P1基因，pGAPZaA SacII單酶切產(chǎn)物，3CD基因和pGAPZaA EcoRI單酶切產(chǎn)物分別純化用上海生工PCR產(chǎn)物回收試劑盒分別回收，按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，步驟如下(1)將酶切產(chǎn)物移至滅菌的1.5ml離心管中，加入5倍體積的溶膠液Binding Buffer II ；(2)將混合液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)帶吸附膜的UNIQ-IO柱中，室溫靜置 2min，6000rpm 離心 Imin ；(3)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的濾液，將UNIQ-IO柱重新裝在收集管中；(4)加入500 μ 1洗滌液WB于離心柱中，8000rpm離心Imin ；(5)倒掉收集管中的濾液，將UNIQ-IO柱重新裝在收集管中。再加入500 μ 1洗滌液WB于離心柱中8000rpm離心Imin ；(6)棄濾液，將UNIQ-IO柱重新裝在收集管中，12000rpm離心anin，取下UNIQ-IO 柱自然晾干IOmin ；(7)將晾干后的UNIQ-IO柱裝在一個(gè)新的高壓滅菌處理過(guò)的1. 5ml離心管中，向離心柱膜中央加入40 μ 1洗脫液(Elution Buffer)，室溫靜置5min。(8) 12000rpm離心1分鐘，洗脫DNA，凍存于_20°C備用。4. 6P1基因，pGAPZaA SacII單酶切純化產(chǎn)物用PmlI 二次酶切(I)Pl基因SacII單酶切純化產(chǎn)物用RiilI雙酶切反應(yīng)體系dH208. 5μ 1IOXNEB buffer 15μ 10160]Pl SacII單酶切回收產(chǎn)物；35 μ 1
0161]100 X BSA0. 5 μ 1
0162]PmlI1 μ 1
0163]_
0164]50 μ 1
0165](2)pGAPZaA質(zhì)粒SacII單酶切純化產(chǎn)物用RiilI雙酶切反應(yīng)體系
0166]dH208. 5μ 1
0167]10ΧΝΕΒ buffer 15μ 1
0168]pGAPZaA SacII單酶切回收產(chǎn)物35 μ 1
0169]100 X BSA0. 5 μ 1
0170]PmlI1 μ 1
0171]_
0172]50 μ 1(3)Pl基因SacII單酶切純化產(chǎn)物和pGAPZaA質(zhì)粒SacII單酶切純化產(chǎn)物PmlI雙酶切條件37°C，2h，65°C,20min。4. 7 3⑶基因，pGAPZaA EcoRI單酶切回收產(chǎn)物)(bal進(jìn)行雙酶切(1)3CD基因EcoRI單酶切回收產(chǎn)物)(bal雙酶切反應(yīng)體系
0178]dH2012. 5μ 1
0179]10ΧΝΕΒ buffer 25μ 1
0180]3CD )(bal單酶切回收產(chǎn)物31 μ 1
0181]100 X BSA0. 5 μ 1
0182]XbaI1 μ 1
0183]_
0184]50 μ 1
0185](2) pGAPZaA EcoRI單酶切回收產(chǎn)物)(bal雙酶切反應(yīng)體系
0186]dH2012. 5μ 1
0187]10ΧΝΕΒ buffer 25μ 1
0188]3CD )(bal單酶切回收產(chǎn)物31 μ 1
0189]100 X BSA0. 5 μ 1
0190]XbaI1 μ 1
0191]_
0192]50 μ 1(3)3CD基因EcoRI單酶切回收產(chǎn)物，pGAPZaA EcoRI單酶切回收產(chǎn)物)(bal雙酶切條件37°C，2h，65°C,20min。5.雙酶切產(chǎn)物純化
Pl 基因，pGAPZaA SacII, PmlI 雙酶切產(chǎn)物，3CD 基因和 pGAPZaAEcoRI，XbaI 雙酶切用上海生工PCR產(chǎn)物回收試劑盒分別回收，按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，同本章1.6. 1。6.純化雙酶切產(chǎn)物連接用Takara公司的T4DNA連接酶分別將Pl基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物(hell， Bull)，3CD基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物(EcoRI，XbaI)進(jìn)行連接。(I)Pl基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接體系10XT4 DNA ligase buffer1 μ 1Pl 基因雙酶切產(chǎn)物(SacII，PmlI)7μ 1pGAPZaA 雙酶切產(chǎn)物(SacII，PmlI)1 μ 1Τ4 DNA ligase1 μ 1_10 μ 1Pl基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接條件16°C，24h。(2) 3⑶基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接體系dH205μ 110ΧΤ4 DNA ligase buffer2. 5μ 13CD基因雙酶切產(chǎn)物15 μ 1pGAPZaA 雙酶切產(chǎn)物(EcoRI，XbaI)1. 5 μ 1Τ4 DNA ligase1 μ 1_25 μ 1pGAPZaA (EcoRLXbaI)自連對(duì)照連接體系dH2020 μ 110ΧΤ4 DNA ligase buffer2. 5 μ 1pGAPZaA 雙酶切產(chǎn)物(EcoRI，XbaI)1. 5 μ 1T4 DNA ligase1 μ 1_25 μ 13⑶基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接條件16°C，20h。7.轉(zhuǎn)化Dffia感受態(tài)細(xì)胞Pl基因和pGAPZaA質(zhì)粒連接產(chǎn)物，3⑶基因和pGAPZ α A質(zhì)粒連接產(chǎn)物， pGAPZaA (SacI I, PmlI)自連對(duì)照，pGAPZ α A (EcoRI，XbaI)自連對(duì)照連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化 Dffia感受態(tài)細(xì)胞，用抗生素koCin+LB(25y g/ml)平板篩選陽(yáng)性克隆。方法如下(1)取出4管100μ lDH5a感受態(tài)細(xì)胞，置冰上；
(2)分別加入Pl基因-pGAPZ α A質(zhì)粒，3CD基因-pGAPZ α A質(zhì)粒連接產(chǎn)物 pGAPZ α A(SacILPmlI)自連對(duì)照，pGAPZ α A (EcoRI，XbaI)自連對(duì)照連接產(chǎn)，各 10 μ 1，輕輕搖勻，冰上放置30min ；(3) 42°C水浴中熱擊 90s ；(4)迅速置冰上4min ；(5)向管中加入ImlLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)；(6)移入試管中，37°C振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)?？剐曰?；(7)取500 μ 1涂布于含抗生素koCin+LB(25 μ g/ml)的篩選平板上，倒置37°C培養(yǎng) 16h。8.陽(yáng)性克隆鑒定挑取陽(yáng)性克隆，用Zeoc in+LB (25 μ g/ml)培養(yǎng)，用菌液為模板分別做P1基因， 3CD基因PCR進(jìn)行篩選初步鑒定，PCR條件如上。擴(kuò)增出Pl基因或3CD基因菌落為陽(yáng)性菌落，培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒，分別命名為Pl-PGAPZ α A, 3⑶-pGAPZ α Α,以提取質(zhì)粒為模板，再用 PCR進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序?qū)B接插入方向和基因序列進(jìn)行鑒定，測(cè)序引物為質(zhì)粒多克隆酶切位點(diǎn)兩端序列，上游引物5-CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG-3’ ；下游引
物，--GCGCTATTCAGATCCTCTTCTG-3，。
二、制備重組酵母菌株
1.重組質(zhì)粒線性化
用BspHI (NEB公司切酶單酶切Pl-pGAPZaA，3CD_pGAPZaA重組質(zhì)粒，使線性化,
(l)Pl-pGAPZaA BspHI 單酶切體系
dH2048 μ 1
10XNEB buffer 410 μ 1
Pl-pGAPZaA40 μ 1 (2 μ g)
BspHI2μ 1
100 μ 1
(2) 3CD-pGAPZaA BspHI 單酶切體系
dH2048 μ 1
10XNEB buffer 410 μ 1
3CD-pGAPZaA40 μ 1 (2 μ g)
BspHI2μ 1
100 μ 1
(3) BspHI單酶切條件
37°C, IOh,
65°C,20mino
2.線性化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SMDl 168酵母菌株
2. ISMDl 168酵母感受態(tài)制備
(1)取SMD1168菌種用接種環(huán)接種在YPD培養(yǎng)皿，30°C培養(yǎng)約48h ；(2)挑取SMD1168單克隆接種于3ml YPD液體培養(yǎng)基中，30°C，300rpm培養(yǎng)約20h ；(3)取 Iml 菌液接種于 100ml YPD 中，30°C，300rpm 培養(yǎng)至 0D600 為 1. ；35，約 IOh ；(4)3000g，4°C離心 5min，棄上清；(5)沉淀中加入8mlYPD和2mlHEPES，懸浮細(xì)胞，輕輕混勻；(6)加入 250 μ 1 IM DTT，30°C靜置培養(yǎng) 15min ；(7)加入約40ml預(yù)冷的IM山梨醇至終體積50ml ；(8)3000g，4°C離心 5min，棄上清；(9)加入50ml預(yù)冷的IM山梨醇，輕輕吹打，懸浮細(xì)胞；(10)3000g，4°C離心 5min，棄上清；(11)加入25ml預(yù)冷的IM山梨醇，輕輕吹打，懸浮細(xì)胞；(12)3000g，4°C離心 5min，棄上清；(13)加入100 μ 1預(yù)冷的IM山梨醇，輕輕吹打，懸浮細(xì)胞，置冰上。2. 2電穿孔轉(zhuǎn)化SMDl 168感受態(tài)細(xì)胞(1)電轉(zhuǎn)杯用預(yù)冷的滅菌水和IM山梨醇分別沖洗三遍，置冰上預(yù)冷；(2)取 1 μ g 線性化的 Pl-pGAPZaA 或 3CD_pGAPZaA 禾Π 40 μ 1 制備的 SMDl 168 感受態(tài)細(xì)胞在冰上混勻，加入電轉(zhuǎn)杯中；(3)2000V，8msec 電擊；(4)往電轉(zhuǎn)杯中迅速加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇；(5)轉(zhuǎn)入15ml離心管中，30°C靜置培養(yǎng)Ih ；(6)加入 Iml YPD，200rpm，30°C 培養(yǎng) Ih ；(7)取菌液 200 μ 1，涂 Zeocin+YPD(100 μ g/ml)平板，篩選 3CD_pGAPZaA 陽(yáng)性克隆。3. SMDl 168重組菌株鑒定3. 1菌液培養(yǎng)挑取陽(yáng)性克隆接種于5ml Zeocin+YPD (100 μ g/ml)培養(yǎng)液中培養(yǎng)約24h。3. 2提取酵母基因組用天根生物公司酵母基因組提取試劑盒提取陽(yáng)性菌株基因組DNA，方法如下(1)取酵母細(xì)胞，12000rpm離心lmin，盡量吸除上清；(2)向菌體中加入600 μ 1山梨醇buffer，加入大約50Ulyticase，充分混勻。30°C 處理30min，4000rpm離心lOmin，棄上清，收集沉淀；(3)向沉淀中加入200 μ 1緩沖液GA重懸沉淀，充分混勻；(4)加入20 μ 1蛋白酶K溶液，混勻；(5)加入220 μ 1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(6)加入220 μ 1無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以
去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(7)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)放入收集管的吸附柱中，12000rpm 離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液⑶，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；(9)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；(10)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液Pff, 12000rpm離心30s，倒掉廢液；(11)將吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(12)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200 μ 1洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置5min，120000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。3. 3重組菌株P(guān)CR鑒定取提取的酵母基因組DNA2 μ 1為模板，用PCR方法擴(kuò)增Pl或3⑶基因，PCR結(jié)果陽(yáng)性者為重組成功菌株。4. Pl-pGAPZ α A-3CD-pGAPZaA_SMDl 168 重組菌株制備及鑒定(1)用3⑶-pGAPZaA重組SMDl 168菌株制備成感受態(tài)細(xì)胞，方法同上；(2)用線性化Pl-pGAPZaA電轉(zhuǎn)制備的3CD_pGAPZaA重組SMDl 168感受態(tài)細(xì)胞，方法同上；(3)用抗生素 kocin+YPD (500 μ g/ml)平板篩選 Pl-pGAPZaA_3CD-pGAPZaA 重組 SMDl 168陽(yáng)性克隆，方法同上；(4)挑取陽(yáng)性克隆接種于5ml Zeocin+YPD (100 μ g/ml)培養(yǎng)液中培養(yǎng)約24h ；(5)用天根公司酵母基因組提取試劑盒提取陽(yáng)性菌株基因組DNA ；(6)取提取的酵母基因組DNA2 μ 1為模板，用PCR方法擴(kuò)增Pl和3⑶基因，Pl和 3⑶共同陽(yáng)性者為重組成功菌株，命名為Pl-pGAPZaA-3⑶-pGAPZaASMD1168酵母菌株。5.病毒樣顆粒純化培養(yǎng)菌液50ml，5000rpm離心lOmin，取上清，超速離心28000rpm/min離心4h，棄上清，沉淀用PBS溶解。然后鋪于不連續(xù)蔗糖梯度(15，30，45和60% )上，于觀，OOOrpm/ min 4°C離心lh，分別收集15%-30%、3% _45%、45%-60%三層病毒帶。用磷酸緩沖液稀釋，28，000rpm/min 4°C離心 2. 5h，棄去上清液，將沉淀溶于TE (10mmol/L Tris-HCl，lmmol/ L EDTA，pH 7.4)溶液中。從15%-30%這條帶內(nèi)取乳白色病毒帶，即為純化的病毒樣顆粒。試驗(yàn)例EV71病毒樣顆粒免疫原性試驗(yàn)1.材料和方法1.1免疫原制備5L 培養(yǎng)基接種 Pl-pGAPZa A-3CD_pGAPZa A SMDl 168 重組菌后，30 °C，250rpm/ min,培養(yǎng)96h, 5，000rpm/min離心lOmin，取上清，超速離心28，000rpm/min離心4h，棄上清，沉淀用PBS溶解。然后鋪于不連續(xù)蔗糖梯度(15，30，45和60% )上，于觀，OOOrpm/min 4°C離心lh，收集15% -30%之間乳白色帶，用磷酸緩沖液稀釋，28，000rpm/min 4°C離心 2. 5h，棄去上清液，得EV71 VLP (即本發(fā)明的EV71病毒樣顆粒)。RDa細(xì)胞培養(yǎng)EV71毒株，收獲病毒液，病毒液超速離心后用不連續(xù)蔗糖密度梯度進(jìn)行純化，純化方法同制備EV71 VLP。純化的病毒56°C滅活30min，作為滅活疫苗組。培養(yǎng)SMDl 168菌和空質(zhì)粒(pGAPZ α A) SMDl 168重組菌，用與制備VLP同樣的方法處理菌液，得到的產(chǎn)物作為對(duì)照組，分別稱為SMD1168菌對(duì)照組和空質(zhì)粒重組菌對(duì)照組。1.2小鼠免疫在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買6-8周雌性，BABL/C小鼠40只，在中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院SPF二級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。共分4組，每組10只小鼠，第一組為SMDl 168菌對(duì)照組，第二組為空質(zhì)粒重組菌對(duì)照組，第三組為滅活疫苗組，第四組為VLP組。每組制備產(chǎn)物用PBS溶解為40μ g/ml，每只小鼠用0. 25ml (10 μ g)產(chǎn)物和等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行免疫，免疫方式均為皮下注射；初次免疫后第2，4，6，8，10，12，14，16周從尾靜脈取血，離心取上清，-80°C 保存；初次免疫后第4周，各組用與初次免疫相同的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫；初次免疫后第16 周，頸椎脫白處死所有小鼠取脾。1.3體液免疫檢測(cè)1. 3. 1三明治ELISA法檢測(cè)總IgG(1)包被取96孔ELISA微孔板，每孔加入100 μ 1 1 2000倍稀釋的兔抗EV71 抗體，4°C過(guò)夜；(2)封閉加入5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室溫?fù)u床，反應(yīng)池；(3)洗滌棄封閉液，用TBST洗板3次；(4)加抗原加入100 μ 1熱滅活EV71病毒，37°C反應(yīng)2h ；(5)洗滌棄去滅活病毒液，用TBST洗板5次，在濾紙上印干；(6)加一抗血清加入倍比稀釋的血清(22_212)，37°C反應(yīng)2h ；(7)洗滌棄去倍比稀釋的血清，用TBST洗板5次，在濾紙上印干；(8)加二抗加入1 3000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗；(9)洗滌棄二抗，用TBST洗板5次，在濾紙上印干(10)加入底物顯色每孔加入IOOul 3，3，5，5_四甲基聯(lián)苯胺，充分混勻后置 37 °C, 15min ；(11)終止反應(yīng)顯色結(jié)束后，每孔加入100 μ L 2Μ的H2SO4終止液終止反應(yīng)；(12)測(cè)定光密度OD值30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值，彡陰性對(duì)照孔OD 值1.5倍判為陽(yáng)性。1.3.2中和抗體檢測(cè)1. 3. 2. 1TCID50 測(cè)定1. 3. 2. 1. 1材料與試劑(1)EV71 病毒懸液；(2) RDa 細(xì)胞；(3)消化液0· 25%胰蛋白酶；(4) DMEM維持液(DMEM+2 %胎牛血清、1 %青鏈酶素)；(5) DMEM培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清、1 %青鏈酶素)。1. 3. 2. 1. 2實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用RDa細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，置(X)2孵箱培養(yǎng)至單層細(xì)胞，接種病毒前，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用Hank’ s洗3次。1. 3. 2. 1. 3 操作方法(1)將稀釋管按KT1 10_6依次標(biāo)記，在SYSUB3生物安全柜里用Iml的微量移液累計(jì)總數(shù)
變i 孔數(shù)τ 孔數(shù)1
病毒總接種無(wú)病變細(xì)稀釋度孔數(shù)胞孔數(shù)
權(quán)利要求
1.一種EV71病毒樣顆粒，其特征在于，所述EV71病毒樣顆粒的制備方法包括(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3⑶蛋白酶基因與pGAPZaA質(zhì)粒分別連接后構(gòu)建Pl-pGAPZ a A和3CD_pGAPZ a A重組質(zhì)粒；(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株所述重組質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMDl168表達(dá)菌株，得到 Pl-pGAPZ a A_3CD_pGAPZ a A-SMDl 168畢赤酵母重組表達(dá)菌株；(3)菌體培養(yǎng)及EV71病毒樣顆粒純化培養(yǎng)所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株，離心分離上清液，所述上清液經(jīng)超速離心后的沉淀用蔗糖密度梯度離心，獲得EV71病毒樣顆粒。
2.按照權(quán)利要求1所述的EV71病毒樣顆粒，其特征在于所述Pl-pGAPZa A重組質(zhì)粒是將Pl蛋白基因與PGAPZaA質(zhì)粒均用RiilI內(nèi)切酶和^icII內(nèi)切酶分步雙酶切后，用T4DNA 連接酶將Pl基因和PGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接得到。
3.按照權(quán)利要求1所述的EV71病毒樣顆粒，其特征在于所述3⑶-pGAPZ a A重組質(zhì)粒是將所述3CD蛋白酶基因和pGAPZaA質(zhì)粒均用EcoRI和)(baI內(nèi)切酶分步雙酶切后，用 T4DNA連接酶將3⑶蛋白酶基因和pGAPZaA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接得到。
4.按照權(quán)利要求1所述的EV71病毒樣顆粒，其特征在于所述3CD蛋白酶基因和Pl蛋白基因是以EV71病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增獲得。
5.按照權(quán)利要求1所述的EV71病毒樣顆粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株是用電穿孔儀先將所述3CD-pGAPZ α A質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SMD1168酵母表達(dá)菌株，用低濃度博萊霉素zeocin篩選得到3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重組表達(dá)菌株，然后再將所述Pl-pGAPZ α A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入3⑶-pGAPZ α A-SMDl 168重組表達(dá)菌株，用高濃度博萊霉素zeocin篩選得到 Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168 重組表達(dá)菌株。
6.按照權(quán)利要求1所述的EV71病毒樣顆粒，其特征在于所述低濃度博萊霉素zeocin 是指100 μ g/ml濃度的博萊霉素，所述高濃度zeocin是指500 μ g/ml濃度的博萊霉素。
7.按照權(quán)利要求1所述的EV71病毒樣顆粒，其特征在于，所述EV71病毒樣顆粒純化是將所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液5000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清，超速離心28000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心4小時(shí)，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖溶液PBS溶解，鋪于不連續(xù)重量百分比蔗糖梯度15%、30%、45%和60%上，于觀000轉(zhuǎn)/分鐘4°C離心1小時(shí)，收集 15% -30%層病毒帶，用磷酸緩沖液稀釋，28000轉(zhuǎn)/分鐘4°C離心2. 5小時(shí)，棄去上清液，即得純化的EV71病毒樣顆粒。
8.一種手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗的制備方法包括(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用EV71病毒的Pl蛋白基因和3CD蛋白酶基因與pGAPZaA質(zhì)粒分別連接后構(gòu)建 Pl-pGAPZ α A和3⑶-pGAPZ α A重組質(zhì)粒；(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMDl 168表達(dá)菌株，得到Pl-pGAPZ α A_3CD_pGAPZ α A-SMDl 168畢赤酵母重組表達(dá)菌株；C3)菌體培養(yǎng)及EV71病毒樣顆粒純化培養(yǎng)所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株，離心分離上清液，所述上清液經(jīng)超速離心后的沉淀用蔗糖密度梯度離心，獲得EV71病毒樣顆粒，(4)制備疫苗所述EV71病毒樣顆粒用磷酸緩沖液溶解到40 μ g/ml，與等體積弗氏完全佐劑相混合制成疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種EV71病毒樣顆粒及以其制備的手足口病疫苗，所述EV71病毒樣顆粒按照以下步驟制備(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用腸道病毒EV71的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因與pGAPZαA質(zhì)粒分別連接后構(gòu)建P1-pGAPZαA和3CD-pGAPZαA重組質(zhì)粒；(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株所述重組質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168表達(dá)菌株，得到P1-pGAPZαA-3CD-pGAPZαA-SMD1168重組表達(dá)菌株；(3)菌體培養(yǎng)及EV71病毒樣顆粒純化培養(yǎng)所述畢赤酵母重組表達(dá)菌株，離心分離上清液，所述上清液經(jīng)超速離心后的沉淀用蔗糖密度梯度離心，獲得EV71病毒樣顆粒。本發(fā)明的EV71病毒樣顆粒易于通過(guò)菌體培養(yǎng)獲得，穩(wěn)定性好、易于純化，適于制備疫苗，且便于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/125GK102154229SQ201010585028
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者張定梅, 曹開(kāi)源, 陸家海, 黎孟楓 申請(qǐng)人:張定梅, 曹開(kāi)源, 陸家海, 黎孟楓