專利名稱：一種樺褐孔菌降血糖有效部位及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樺褐孔菌降血糖有效部位及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
樺褐孔菌學(xué)名為Fuscoporia obiiqua或Inonotus obliquus，屬于真菌門、擔(dān)子菌 亞門、層菌綱、非褐菌目、褐臥孔菌屬(纖孔菌屬)，別名為白樺茸、樺孔茸、樺癌褐孔菌，生 于白樺、榆樹、赤楊等的樹皮下或活立木的樹皮下或砍伐后的枯干上。16-17世紀(jì)以來東歐、 俄羅斯、波蘭、芬蘭等廣泛利用其來防治各種疑難雜癥，如各種癌癥(胃癌、肝癌、腸癌等)、 心臟病、糖尿病并能抑制艾滋病病毒，抗輻射抑制蛋白質(zhì)生物合成抗有絲分裂及消除其活 性等作用，被稱作是上帝賜給苦難人類的一種神奇的禮物。目前，國內(nèi)對樺褐孔菌降血糖作用的研究較少，孫香花等人研究表明樺褐孔菌提 取物對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的胰島、肝和腎組織損傷病變有一定的保護(hù)和 修復(fù)作用。由于胰島、肝腎與血糖及糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)，因此一定程度上能夠降低血 糖。孫軍恩等研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌液體發(fā)酵液干粉對糖尿病小鼠有顯著的降血糖和抗脂質(zhì)過 氧化作用，并且有突出的抗氧化作用。從目前國內(nèi)外開發(fā)樺褐孔菌的現(xiàn)狀和行業(yè)來看，樺褐孔菌的活性普遍被認(rèn)同，但 都是以子實體煎服或水提為主的粗提物，未對其中活性物質(zhì)進(jìn)行富集和分離，并將活性組 分開發(fā)成新型、高效的保健品或藥品。樺褐孔菌含有數(shù)十種活性成分，因此，樺褐孔菌中降 血糖有效部位的確定不僅為了解樺褐孔菌的降血糖機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，而且通過建立樺褐 孔菌中降血糖活性物質(zhì)的生產(chǎn)和分離技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)揮樺褐孔菌治療糖尿病的作用，并可 開發(fā)出新型的安全降糖藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種樺褐孔菌降血糖有效部位及其制備方法。本發(fā)明所提供的樺褐孔菌降血糖有效部位包括高溫多糖提取物中的有效組分和 常溫多糖提取物中的有效組分。制備方法包括下述步驟a)制備高溫多糖提取物中的有效組分(樺褐孔菌降血糖活性成分)1)將樺褐孔菌子實體粉碎后過20-60目篩，向粉碎過篩后的樺褐孔菌中加入 20-40倍體積的水，靜置提取24-72h，對提取液離心，收集殘渣；2)向步驟1)所述殘渣中加入20-40倍體積的水，80_100°C提取3_5h，對提取液離 心，收集上清液；將所述上清液濃縮，然后加入無水乙醇至乙醇終濃度為70% -85%,0-40C 靜置過夜，離心、收集沉淀，得到高溫提取樺褐孔菌粗多糖；3)將所述高溫提取樺褐孔菌粗多糖進(jìn)行下述處理加蒸餾水溶解，過濾除去沉 淀，濾液過DEAE-52纖維素柱，用0-1. 2mol/L NaCl溶液依次按照下述梯度進(jìn)行洗脫1)水， 2) 0. 15-0. 3mol/L, 3) 0. 45-0. 6mol/L, 4) 0. 8-1. 2mol/L,洗脫速度 100_140ml/h，每個梯度洗 脫2-5倍柱體積，利用自動部分收集器收集各管，苯酚硫酸法檢測多糖含量，合并同一洗脫梯度中有多糖的收集管，分別獲得含量較高的多糖分離組分高溫粗多糖水段洗脫糖、高溫粗多糖0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫糖、高溫粗多糖0. 8-1. 2mol/L NaCl段洗脫糖；經(jīng)試驗 驗證，具有明顯降糖作用的有效組分為高溫粗多糖0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫糖。b)制備常溫多糖提取物中的有效組分(樺褐孔菌降血糖輔助降血脂的活性成分)1)將樺褐孔菌子實體粉碎后過20-60目篩，向粉碎過篩后的樺褐孔菌中加入 20-40倍體積的水，靜置提取24-72h，對提取液離心，收集上清液；將所述上清液1濃縮，然 后加入無水乙醇至乙醇終濃度為70% -85%，0-4°C靜置過夜，離心、收集沉淀，得到常溫提 取樺褐孔菌粗多糖；2)將所述常溫提取樺褐孔菌粗多糖進(jìn)行下述處理加蒸餾水溶解，過濾除去沉 淀，濾液過DEAE-52纖維素柱，用0-1. 2mol/L NaCl溶液依次按照下述梯度進(jìn)行洗脫1)水， 2) 0. 15-0. 3mol/L, 3) 0. 45-0. 6mol/L, 4) 0. 8-1. 2mol/L,洗脫速度 100_140ml/h，每個梯度洗 脫2-5倍柱體積，利用自動部分收集器收集各管，苯酚硫酸法檢測多糖含量，合并有多糖的 組分，分別獲得含量較高的多糖分離組分常溫粗多糖水段洗脫糖、0. 15-0. 3mol/L NaCl段 洗脫糖、常溫粗多糖0. 8-1. 2mol/LNaCl段洗脫糖；經(jīng)試驗驗證，具有降糖、降血脂作用的有 效組分為常溫粗多糖0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫糖。對上述方法制備得到的分離多糖進(jìn)行降血糖功效測試，小鼠利用STZ造模后隨機(jī) 分組，然后對鏈尿佐菌素(STZ)實驗性糖尿病小鼠進(jìn)行樺褐孔菌分離多糖灌胃4周，給藥 劑量分別為90mg/kg. d。4周后觀察小鼠空腹血糖值、臟器指數(shù)、體重、血脂、胰島素等指標(biāo) 的變化，動物實驗結(jié)果表明，高溫粗多糖0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫糖(E組)具有明顯的 降血糖效果，其血糖水平與造模起始時相比下降20 %，顯效率(與初始血糖相比血糖水平 下降的小鼠數(shù)目/該組總的小鼠數(shù)目X100%)為76.92% ；而陽性對照組血糖水平下降 15%，顯效率僅為58%。且常溫多糖0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫多糖(B組)對高血糖小 鼠高甘油三酯水平也有一定的改善，且對小鼠沒有明顯的降低體重的副作用。表明樺褐孔 菌降血糖有效部位可作為降血糖藥物與降血糖保健食品開發(fā)的原料。本發(fā)明的再一個目的是提供上述樺褐孔菌多糖有效組分的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用是褐孔菌多糖有效組分在制備降血糖產(chǎn)品(如藥品或保健 品)中的應(yīng)用。本發(fā)明利用樺褐孔菌這一藥食兼用的野生資源，通過提取分離獲得具有高活性降 糖作用的多糖組分，可以降低臨床用藥毒性，減少西藥帶來的不良副作用，更具有市場競爭 優(yōu)勢。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如 無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所用的樺褐孔菌子實體，購于通化市本土 本特土特產(chǎn)銷售有限公司。實施例1、樺褐孔菌子實體活性多糖的提取分離(1)將樺褐孔菌子實體粉碎后，過40目篩。(2)常溫提取粗多糖的制備向粉碎過篩后的樺褐孔菌中加入30倍體積的水，靜置提取48h，提取液離心(4000r/min)，留殘渣，收集上清液，減壓濃縮至原體積的1/10，加 無水乙醇至乙醇終濃度為80%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀，50°C干燥稱重，得到常溫提取 粗多糖。多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，計算得到多糖得率(多糖得率=(粗多糖重量 /材料重量)X 100% )為5. 3%。(3)高溫提取粗多糖的制備將常溫提取粗多糖剩余的殘渣用水洗滌2遍后，加入 原干粉重量30倍的水，90°C水浴提取3h，提取液離心(4000r/min)，留殘渣，收集上清液，減 壓濃縮至適當(dāng)體積，加無水乙醇至乙醇的終濃度為80%，4°C靜置過夜，離心收集沉淀，50°C 干燥稱重，得到高溫提取粗多糖，多糖得率為3. 2%。(4)樺褐孔菌粗多糖的柱層析分離取兩種水提法制備的粗多糖分別加適量蒸餾 水溶解，過濾除去沉淀。將兩種粗多糖過DEAE-52纖維素陰離子交換柱，分別用蒸餾水， 0. 2mol/L NaCl溶液，0.5mol/L NaCl溶液、1. Omol/L NaCl溶液分段洗脫，用自動部分收 集器收集流出液，控制速度120ml/h，每個梯度洗脫4倍柱體積，苯酚硫酸法檢測每管多糖 濃度，洗脫至無糖流出。獲得含量較高的多糖分離組分常溫粗多糖水段洗脫糖、0. 2mol/ LNaCl段洗脫糖、常溫粗多糖1. Omol/L NaCl段洗脫糖、高溫粗多糖水段洗脫糖、高溫粗多 糖0. 2mol/L NaCl段洗脫糖、高溫粗多糖1. Omol/L NaCl段洗脫糖。對比例1、樺褐孔菌粗提物的制備將樺褐孔菌子實體粉碎后，過40目篩。取樺褐孔菌子實體粉末加入30倍體積水 中，90°C提取3h，取提取液置50°C烘箱中干燥，即得到樺褐孔菌粗提物。實施例2、樺褐孔菌各多糖組分的降血糖藥理活性評價(1)試驗材料樺褐孔菌粗提物及樺褐孔菌各多糖組分按實施例1方法制備。陽性對照藥物鹽 酸二甲雙胍片，北京藥業(yè)有限公司，規(guī)格0. 25gX 50片/盒。鏈脲佐菌素(STZ)美國sigma 公司。葡萄糖氧化酶試劑盒北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。甘油三酯試劑盒北京北化康泰 臨床試劑盒有限公司。酶法總膽固醇測定試劑盒中生北控生物科技股份有限公司。胰島 素放射免疫分析藥盒中國原子能所。試驗動物SPF級ICR小鼠，雄性，體重18_22g。由軍科院實驗動物中心提供。動 物許可證編號為SCXK (軍)2002-001。(2)試驗方法①高血糖小鼠模型的制備和分組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，連續(xù)四天腹腔注射STZ 35mg/kg 4次(臨用前用0. lmol/L檸檬酸緩沖鹽緩沖液溶解)，第6天禁食不禁水6h，斷 尾取血測血糖值，取血糖值12mmol/L以上的高血糖小鼠隨機(jī)分組，每組12只。另設(shè)正常對 照、模型對照組、陽性對照組。具體分組如表1所示。表1樺褐孔菌不同分離組分名稱及動物實驗劑量編號_灌胃樣品_劑量(mg/(kg.d))
權(quán)利要求
1.一種制備樺褐孔菌降血糖活性成分的方法，包括下述步驟1)將樺褐孔菌子實體粉碎后過20-60目篩，向粉碎過篩后的樺褐孔菌中加入20-40倍 體積的水，靜置提取24-72h，對提取液離心，收集殘渣；2)向步驟1)所述殘渣中加入20-40倍體積的水，80-100°C提取3-5h，對提取液離心， 收集上清液；將所述上清液濃縮，然后加入無水乙醇至乙醇終濃度為70% -85%，0-4°C靜 置過夜，離心、收集沉淀，得到高溫提取樺褐孔菌粗多糖；3)將所述高溫提取樺褐孔菌粗多糖進(jìn)行下述處理加蒸餾水溶解，過濾除去沉淀，濾 液過DEAE-52纖維素柱，依次按照下述梯度進(jìn)行洗脫1)水，2)0. 15-0. 3mol/L，洗脫速度 100-140ml/h,每個梯度洗脫2-5倍柱體積，收集0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫組分，即得到 所述樺褐孔菌降血糖活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)為加蒸餾水溶解，過濾除去 沉淀，濾液過DEAE-52纖維素柱，依次按照下述梯度進(jìn)行洗脫1)水，2)0. 2mol/L，洗脫速度 120ml/h,每個梯度洗脫4倍柱體積，收集0. 2mol/LNaCl段洗脫組分，即得到所述樺褐孔菌 降血糖活性成分。
3.權(quán)利要求1或2所述方法制備得到的樺褐孔菌降血糖活性成分。
4.權(quán)利要求3所述的樺褐孔菌降血糖活性成分在制備降血糖和/或降血脂產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥品或保健品。
6.一種制備樺褐孔菌降血糖輔助降血脂的活性成分的方法，包括下述步驟1)將樺褐孔菌子實體粉碎后過20-60目篩，向粉碎過篩后的樺褐孔菌中加入20-40倍 體積的水，靜置提取24-72h，對提取液離心，收集上清液；將所述上清液1濃縮，然后加入無 水乙醇至乙醇終濃度為70% -85%，0-4°C靜置過夜，離心、收集沉淀，得到常溫提取樺褐孔 菌粗多糖；2)將所述常溫提取樺褐孔菌粗多糖進(jìn)行下述處理加蒸餾水溶解，過濾除去沉淀，濾 液過DEAE-52纖維素柱，依次按照下述梯度進(jìn)行洗脫1)水，2)0. 15-0. 3mol/L，洗脫速度 100-140ml/h,每個梯度洗脫2-5倍柱體積，收集0. 15-0. 3mol/L NaCl段洗脫組分，即得到 樺褐孔菌降血糖輔助降血脂的活性成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟3)中將所述常溫提取樺褐孔菌 粗多糖進(jìn)行下述處理加蒸餾水溶解，過濾除去沉淀，濾液過DEAE-52纖維素柱，依次按照 下述梯度進(jìn)行洗脫1)水，2)0. 2mol/L，洗脫速度120ml/h，每個梯度洗脫4倍柱體積，收集 0. 2mol/LNaCl段洗脫組分，即得到樺褐孔菌降血糖輔助降血脂的活性成分。
8.權(quán)利要求6或7所述方法制備得到的樺褐孔菌降血糖輔助降血脂的活性成分。
9.權(quán)利要求8所述的樺褐孔菌降血糖輔助降血脂的活性成分在制備降血糖輔助降血 脂產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥品或保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種樺褐孔菌降血糖有效部位及其制備方法和應(yīng)用。該降血糖有效部位是按照下述方法制備得到的以樺褐孔菌子實體為原料，分別用常溫和高溫水提取、過濾、濃縮，濃縮物加乙醇沉淀獲得多糖，分別將常溫和高溫水提多糖過DEAE-52纖維素柱，分別用蒸餾水和不同濃度的NaCl溶液分段洗脫，收集分段洗脫峰糖液。體內(nèi)降血糖活性實驗表明常溫粗多糖0.2mol/L NaCl段洗脫糖和高溫粗多糖0.2mol/L NaCl段洗脫糖具有明顯降血糖活性，這兩種成分在相同條件下與降糖藥鹽酸二甲雙胍具有相似的降血糖活性，并且未見明顯的毒副作用。
文檔編號A61K36/07GK102038720SQ20101059275
公開日2011年5月4日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者劉萍, 張瑩, 羅巖, 路春桃 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)