專利名稱：一種負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑的制備，特別是指一種負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì) 胞疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤在我國多發(fā)，近年來其發(fā)生率和死亡率逐年上升，成為威脅人類健康的主要 因素之一。腫瘤是全身性疾病，在傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療中，手術(shù)和放療屬于局部治療手 段，盡管能有效減低腫瘤負(fù)荷，但難以解決轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)問題?；熓莻鹘y(tǒng)手段中唯一的全身 治療手段，但存在有效率低(30%左右)、副反應(yīng)大、耐藥性、和嚴(yán)重的免疫抑制等缺陷，而限 制了臨床應(yīng)用。因而臨床期待一種副反應(yīng)小、有效率高、安全、可靠的全身治療手段。腫瘤免疫學(xué)的迅速發(fā)展，為腫瘤免疫治療提供了一種新理念、新思路。腫瘤“免疫 監(jiān)視”學(xué)說的建立，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了一種全新的解釋。腫瘤病人機(jī)體免疫系統(tǒng)的 “免疫監(jiān)視”功能降低，致使其自身免疫系統(tǒng)不能有效的識(shí)別和清除變異的細(xì)胞，造成腫瘤 的發(fā)生?！澳[瘤微環(huán)境”學(xué)說解釋了腫瘤病人自身免疫系統(tǒng)的無能，導(dǎo)致腫瘤無限制生長(zhǎng)的 原因。如何調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的識(shí)別和殺傷功能，達(dá)到治療腫瘤的目的，成為近年來 人們關(guān)注的重點(diǎn)問題。大量的基礎(chǔ)研究證實(shí)，在“腫瘤微環(huán)境”下，會(huì)出現(xiàn)外周血⑶4+⑶25+的調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞(Treg)水平增高，白細(xì)胞介素-10 (IL-10)、腫瘤生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)、白細(xì)胞 介素-4 (IL-4)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)等免疫抑制因子水平升高，以及樹突狀細(xì)胞(DC)功 能降低、腫瘤細(xì)胞的表面抗原隱匿等。特別是Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因素，造成 自身免疫系統(tǒng)功能低下而不能有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，因而造成腫瘤的“免疫逃逸”或 “免疫耐受”。DC細(xì)胞是啟動(dòng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤進(jìn)行識(shí)別和殺傷的關(guān)鍵細(xì)胞。DC細(xì)胞被認(rèn)為是唯 一的和專職的抗原提呈細(xì)胞，DC細(xì)胞能夠在致炎因子的參與下，捕獲腫瘤抗原，通過細(xì)胞內(nèi) 的加工過程制備成抗原多肽，然后將這些抗原多肽轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，并同MHC分子結(jié)合而 形成MHC-抗原復(fù)合物，同時(shí)完成由非成熟DC向成熟DC的轉(zhuǎn)化，獲得其提供抗原和激活T 細(xì)胞的強(qiáng)大功能。DC疫苗是近年來發(fā)展起來的新型腫瘤疫苗，其機(jī)理主要是將攜帶腫瘤抗原的DC 疫苗接種病人，以誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生持久、特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞 的目的。目前DC誘導(dǎo)的腫瘤免疫治療已經(jīng)作為三類醫(yī)療技術(shù)獲批應(yīng)用于臨床。DC疫苗的制備通常包括三個(gè)步驟首先獲取腫瘤抗原，再從病人外周血獲取DC細(xì) 胞，然后用腫瘤抗原沖擊DC使其負(fù)載腫瘤抗原，即制備成DC疫苗。DC疫苗的制備方法很多。首先抗原的選擇種類很多，如腫瘤細(xì)胞性全抗原(放 射線滅活的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物等)、腫瘤細(xì)胞的亞細(xì)胞成分(凋亡小體、外排小體 exosome、自噬小體autophage等)、腫瘤特異性抗原蛋白/多肽、腫瘤相關(guān)性抗原蛋白/多肽、腫瘤細(xì)胞mRNA、雜交融合的腫瘤細(xì)胞等。DC的來源種類也很多，可從外周血的直接分 離、從骨髓造血細(xì)胞分離、從外周血單狀核細(xì)胞分離、免疫磁珠法分離等。體外抗原沖擊一 般采用合適的抗原劑量，加入DC細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，經(jīng)過M-48小時(shí)孵育，祛除游離的抗原 和細(xì)胞碎片即獲得DC疫苗。但是目前DC疫苗的臨床應(yīng)用受到限制，一是由于所用腫瘤抗原的免疫原性不夠 強(qiáng)，二是由于多數(shù)腫瘤病人的腫瘤抗原不易獲得，三是臨床療效有限。腫瘤特異性抗原蛋白 /多肽和腫瘤相關(guān)性抗原蛋白/多肽，抗原性弱，激活免疫的靶點(diǎn)單一，疫苗的免疫原性差， 目前對(duì)大多數(shù)腫瘤來說，尚無法確定其有效的腫瘤特異性或相關(guān)性抗原，且受到HLA限制， 因而很難廣泛應(yīng)用。腫瘤細(xì)胞mRNA雖能代表腫瘤全抗原，但制備過程復(fù)雜、容易降解而造 成抗原的缺失，臨床難以推廣。腫瘤細(xì)胞裂解物等，含有腫瘤細(xì)胞全抗原的蛋白或多肽，抗 原性強(qiáng)且完整，DC細(xì)胞攝取加工后所攜帶的抗原靶點(diǎn)全面，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的抗腫瘤免疫全 面，因而是一種很好的抗原選擇，但許多病人的腫瘤細(xì)胞難以獲取或細(xì)胞數(shù)量不足，是臨床 亟待解決的問題。應(yīng)用蠟塊標(biāo)本制備腫瘤全抗原，盡管擴(kuò)大了自體腫瘤抗原的來源，但標(biāo)本 處理的過程中難以避免大量抗原成分的丟失，使其臨床應(yīng)用同樣受限。用以上抗原制備的 DC疫苗，經(jīng)臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)療效有限。因而，臨床急需一種臨床獲取方便、抗原靶點(diǎn)完整、抗原性強(qiáng)且穩(wěn)定、并能在臨床 容易操控的特定條件下，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大抗腫瘤免疫應(yīng)答的腫瘤特異性DC疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備 方法，采用一種自體腫瘤相關(guān)全抗原，制備自體腫瘤抗原特異性DC疫苗，并能在特定條件 下激發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是
一種負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，包括如下工藝步驟
A、制備自體腫瘤相關(guān)全抗原；
B、采取和分離培養(yǎng)DC細(xì)胞；
C、用自體腫瘤相關(guān)全抗原沖擊DC細(xì)胞，使DC細(xì)胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性 DC疫苗。本發(fā)明的具體技術(shù)解決方案和工藝路線是 所述的步驟A包括如下工藝步驟
Al、采用手術(shù)切除、內(nèi)鏡或穿刺活檢獲得的新鮮腫瘤組織、胸腹水離心獲得的新鮮自體 腫瘤細(xì)胞中的一種制成自體腫瘤細(xì)胞裂解物蛋白；
A2、將步驟Al中的自體腫瘤細(xì)胞裂解物蛋白和同源的細(xì)胞株裂解物蛋白混合，制備成 自體腫瘤相關(guān)全抗原。步驟Al中手術(shù)切除、內(nèi)鏡或穿刺活檢獲得的新鮮腫瘤組織采用如下方法 取腫瘤周邊部分組織0. 3-1. Ocm3，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復(fù)洗滌
3-5次，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋 白定量備用。步驟Al中胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細(xì)胞采用如下方法取胸、腹水1500-2000ml，在轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，生理鹽水洗滌離 心3次，300目鋼網(wǎng)過網(wǎng)后獲得單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白
定量備用O步驟A2中和同源的細(xì)胞株抗原混合，制備成自體腫瘤相關(guān)全抗原采用如下方法 反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量，制成同源細(xì)胞株裂解物蛋白；將同
源細(xì)胞株裂解物蛋白與步驟Al中制備的自體腫瘤細(xì)胞裂解物蛋白按照質(zhì)量比為1:1的比 例混合，制備成自體腫瘤相關(guān)全抗原備用。步驟B中DC細(xì)胞的采取選用外周血直接采取獲得、外周血單狀核細(xì)胞分離獲得、 通過骨髓造血細(xì)胞分離獲得、通過骨髓或其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化獲得、或 通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、單狀核細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 分離分化獲得方法中的一種。步驟B單狀核細(xì)胞采集和分離包括
Bi、單狀核細(xì)胞采集前，用GM-CSF 150μβ皮下注射，1次/日，行骨髓動(dòng)員2_3天； Β2、用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，按照說明書中“單狀核細(xì)胞采集”的設(shè)定參數(shù)設(shè) 定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞140_160ml ；
B3、將步驟B2中的單狀核細(xì)胞分裝入50ml離心管，細(xì)胞離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/分離心5分 鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，加入質(zhì)量比為10%葡萄糖酸鈣溶液2. 5ml吹打混勻， 56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清制備成自體滅活血清，4°C冷藏備用； B4、收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含密度為1.077g/ml的密度梯度淋巴細(xì)胞分離 液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)在2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，一次 性吸管吸取中間白色細(xì)胞層即為單狀核細(xì)胞。分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽 水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，在1500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘后棄上清；加入生理 鹽水45ml輕柔吹打混勻，在1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘洗滌，棄上清；重復(fù)洗滌3次 后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞總數(shù)量6-10 X IO9)；
B5、在75cm3培養(yǎng)瓶中加入RPMI-1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng) 瓶活化；將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè)/ml，按體積百分比 為10%-20%加入自身血清，于37°C，體積百分比為5%0)2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分 鐘取出，移除懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞。步驟C包括如下工藝方法
在步驟B制備的DC細(xì)胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，在培養(yǎng)基中按照如下含量添加 各種組分
GM-CSF 500μδ/500πι1 IL-4 300μδ/500πι1 慶大霉素2. 0萬單位/500ml
其中無血清DC培養(yǎng)基選自美國SIGMA公司或美國BD公司的產(chǎn)品； 將上述培養(yǎng)基置于37°C，體積百分比為5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)；第6天 加入步驟A制備的自體腫瘤相關(guān)全抗原5(^g/ml，次日補(bǔ)充體積百分比為10%_15%的自體血 清，培養(yǎng)2天后獲取DC疫苗，流式細(xì)胞檢測(cè)CD80、CD83、CD86、HLA-ABC, HLA-DR表達(dá)，鑒定 DC疫苗功能。
本發(fā)明所制備的DC疫苗是這樣使用的
本發(fā)明制備的自體腫瘤特異性DC疫苗，主要用途有兩個(gè)方面，一是體外誘導(dǎo)制備自體 腫瘤特異性CTL，過繼回輸行腫瘤的細(xì)胞免疫治療；二是表淺淋巴結(jié)接種，體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特 異性殺傷，用于DC疫苗接種的腫瘤免疫治療，或聯(lián)合過繼回輸?shù)募?xì)胞免疫治療。DC疫苗接 種治療或聯(lián)合DC-CIK-CTL過繼回輸治療前，首先應(yīng)用小劑量CTX或TBI技術(shù)，對(duì)病人的腫 瘤微環(huán)境進(jìn)行干擾，可顯著下調(diào)Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因子水平，消除腫瘤微環(huán) 境中的免疫抑制因素，打破腫瘤免疫耐受。干擾后次日，行DC疫苗的表淺淋巴結(jié)接種和/ 或DC-CIK-CTL過繼回輸治療。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)，在以上條件下，本發(fā)明制備的DC 疫苗，能夠有效的在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性CTL，并能有效的對(duì)腫瘤產(chǎn)生高效率的 特異性殺傷。本發(fā)明所制備的疫苗的試驗(yàn)結(jié)果如下 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> (一)應(yīng)用腫瘤病人自體腫瘤相關(guān)全抗原，負(fù)載自體DC細(xì)胞，制備自體腫瘤抗原特異性 DC疫苗；
(二)應(yīng)用負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的DC，激活自體T淋巴細(xì)胞，制備自體腫瘤特異性 CTL (效應(yīng)細(xì)胞)；
(三)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)DC疫苗誘導(dǎo)的CTL對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺傷效率；
(四)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)DC疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫殺傷效應(yīng)；
(五)臨床試驗(yàn)研究證實(shí)DC疫苗在干擾腫瘤微環(huán)境、打破腫瘤免疫耐受條件下臨床應(yīng) 用的實(shí)際療效。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
(一)自體腫瘤相關(guān)全抗原獲取手術(shù)切除、內(nèi)鏡或穿刺活檢獲取的新鮮腫瘤組織、胸腹 水離心獲取的新鮮腫瘤細(xì)胞、同組織來源的細(xì)胞株。(二)自體DC和T細(xì)胞獲取應(yīng)用COBE Spectra血液成分分離機(jī)，獲取外周血DC 和T細(xì)胞。(三)DC疫苗制備自體腫瘤相關(guān)全抗原負(fù)載DC細(xì)胞，獲得DC疫苗。(四)DC疫苗的功能檢測(cè)
(1)DC疫苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL的實(shí)驗(yàn)負(fù)載抗原的DC和T細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得腫瘤特 異性CTL ；
(2)in vitro實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤特異性CTL對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)(Cytotoxicity assay)；
(3)in vivo實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察CTL的腫瘤特異性殺傷效應(yīng)；
(五)臨床試驗(yàn)選擇肺癌病人10例，按照特定治療流程進(jìn)行治療，觀察臨床療效和副反應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)步驟
(一)自體腫瘤相關(guān)全抗原的制備
自體腫瘤相關(guān)全抗原的制備方法如下取手術(shù)切除、內(nèi)鏡或穿刺獲得的新鮮自體腫瘤 標(biāo)本、胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細(xì)胞抗原，和同源的細(xì)胞株抗原混合，制備成自體腫 瘤相關(guān)全抗原。這種自體腫瘤相關(guān)全抗原的特點(diǎn)是一是具有和自體腫瘤相關(guān)的腫瘤全抗原，該全抗原的抗原靶點(diǎn)完整、穩(wěn)定、抗原性強(qiáng)，具備個(gè)體化特征且不存在HLA限定性；二是 同源的細(xì)胞株抗原成分95%以上和自體腫瘤抗原相同，因而能有效地補(bǔ)充自體腫瘤抗原的 不足，而且少量的異抗原可使抗原性增強(qiáng)；三是大多數(shù)腫瘤病人可通過以上抗原制備方法 獲得自體腫瘤相關(guān)抗原，從而獲得免疫治療的機(jī)會(huì)；四是少數(shù)不能獲取自體腫瘤抗原的病 人，可以用相同組織來源的細(xì)胞株抗原代替，同樣不失自體腫瘤抗原相關(guān)的特征。具體步驟是
(1)手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織取腫瘤周邊部組織(避免腫瘤中心的壞死組織) 0. 3-1. Ocm3 (可液氮或-80°C冰箱保存?zhèn)溆?，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反 復(fù)洗滌3-5次，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過 網(wǎng)后蛋白定量備用。(2)胸、腹水獲得的腫瘤細(xì)胞取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm離心，生理鹽水洗 滌離心3次，300目鋼網(wǎng)過網(wǎng)后獲得單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后
蛋白定量備用。(3)同組織來源細(xì)胞株反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量備用。(4)取自體腫瘤裂解物蛋白和同源細(xì)胞株裂解物蛋白各50%，混合制備成自體腫瘤 相關(guān)全抗原，定量備用。(二)DC細(xì)胞的獲取和分離
本發(fā)明采用的DC細(xì)胞，可通過外周血直接采取獲得，可通過外周血單狀核細(xì)胞分離獲 得，可通過骨髓造血細(xì)胞分離獲得，可通過骨髓或其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化 獲得，還可以通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、外周血單狀核細(xì)胞、骨髓造血 細(xì)胞、或其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離或定向分化獲得。具體步驟是
(1)單狀核細(xì)胞采集單狀核細(xì)胞采集前，首先應(yīng)用GM-CSF 150μβ皮下注射，1次/日， 行骨髓動(dòng)員2-3天。采集日，應(yīng)用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，按照說明書中“單狀核細(xì) 胞采集”的設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞140_160ml。分裝 入50ml離心管，細(xì)胞離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制 備自體滅活血清(加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離 心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細(xì)胞分離液 (Ficoll, 1. 077)15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)離心2000rpmX 15分鐘，一次性 吸管吸取中間白色細(xì)胞層(單狀核細(xì)胞)。分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽水的 50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打 混勻，離心IOOOrpmX5分鐘洗滌，棄上清。重復(fù)洗滌3次后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞 計(jì)數(shù)(細(xì)胞總數(shù)量6-10X109)。(2)DC細(xì)胞分離75cm2培養(yǎng)瓶分別加入RPMI-1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放 置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化。將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè) /ml，加入終濃度10-20%的自身血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘取出， 移除懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液(用作CIK和CTL制備)，貼壁細(xì)胞即為非成熟DC細(xì)胞(imature DC)。(3)流式細(xì)胞檢測(cè)取培養(yǎng)5天的imDCs 1. 2X 106/ml，加入20%兔血清400ul，4°C 冰箱避光孵育20分鐘；分裝入流式細(xì)胞檢測(cè)管，300g離心10分鐘，棄上清，分別加入標(biāo)有不同顏色熒光素的單克隆抗體工作液10μ1 (PE-IgG2a mAb, FITC-IgG2bmAb, PE-IgGlmAb, PE-HLA-ABCmAb，F(xiàn)ITC-HLA-DRmAb，PE-CD83mAb，PE-CD80mAb，PE-CD86mAb)，避光 4°C 30 分鐘 進(jìn)行標(biāo)記，PBS洗2次，上機(jī)檢測(cè)。
結(jié)果
腫瘤病人非成熟DC的表面標(biāo)志物⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR均顯著低于健康正常人 (P<0. 01, respectively ； Table 1):
Table 1. DC markers in imature DCs (n=10 ；x±s)
DCmarkersPatientswithcancerHealthyvolunteersCD8019. 17±3. 31*42. 11 ±4. 79林CD8326. 33±4. 72*54. 70 ±4. 47**CD8632. 53±6. 05*83. 62 ±10. 26**HLA-DR40. 32 ±8. 24*80. 13±13. 52**HLA-ABC94. 69±9. 24 *95. 14±10. 68 #
氺 vs 氺氺P<0.01, respectively; * vs # : P>0. 05； (三)DC疫苗的制備
自體腫瘤特異性DC疫苗，是通過自體腫瘤相關(guān)全抗原沖擊非成熟DC細(xì)胞，然后將負(fù)載 腫瘤全抗原的非成熟DC細(xì)胞培養(yǎng)成熟制備而成。具體步驟是
上述貼壁的DC細(xì)胞中加入RPMI-1640無血清培養(yǎng)基20ml (含GM-CSF 500μδ/500πι1, IL-4 30(^g/500ml，慶大霉素2. 0萬單位/500ml)，置于37°C，5%C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò) 增培養(yǎng)。第6天加入自體腫瘤相關(guān)全抗原5(^g/ml，次日補(bǔ)充10-15%的自體血清，培養(yǎng)48 小時(shí)獲取DC疫苗(

圖1)。DC標(biāo)志物鑒定取培養(yǎng)7天的imDCs 1. 2X 106/ml，加入20%兔血清400μ1，4 冰 箱避光孵育20分鐘；分裝為6管，300g離心10分鐘，棄上清，分別加入標(biāo)有不同顏色熒光素 的單克隆抗體工作液 10μ1 (PE-IgG2a mAb, FITC-IgG2bmAb, PE-IgGlmAb, PE-HLA-ABCmAb， FITC-HLA-DRmAb，PE_CD83mAb，PE_CD80mAb，PE_CD86mAb)，避光 4°C 30 分鐘進(jìn)行標(biāo)記，PBS 洗2次，上機(jī)流式細(xì)胞檢測(cè)。分泌IL-12功能檢測(cè)取培養(yǎng)48小時(shí)后的DC上清液，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)， 按ELISA試劑盒說明，測(cè)定J值，計(jì)算各組上清中IL-12的平均濃度，并據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 IL-12 的量(pg/ml)。T細(xì)胞活化功能鑒定取imDC、mDC、以及自體和異體T淋巴細(xì)胞，分別按E:T=20:1 的比例加入96孔圓底培養(yǎng)板，37°C、5%C02培養(yǎng)箱共培養(yǎng)M小時(shí)，加入CCK-8試劑20 μ 1/ 孔，培養(yǎng)3小時(shí)后，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。結(jié)果
非成熟DC培養(yǎng)5天后，于第6天加入腫瘤抗原，培養(yǎng)2天后，完成DC的成熟過程，并制 備成DC疫苗。此時(shí)的DC為成熟DC，其特征為細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的樹突樣突起(圖2)、細(xì) 胞表面標(biāo)志物的表達(dá)顯著上調(diào)(Table 2)、分泌IL-12的水平顯著提高(圖3)、并能有效的 激活自體或異體T細(xì)胞(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下 工藝步驟A、制備自體腫瘤相關(guān)全抗原；B、采取和分離培養(yǎng)DC細(xì)胞；C、用自體腫瘤相關(guān)全抗原沖擊DC細(xì)胞，使DC細(xì)胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性 DC疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟A包括如下工藝步驟Al、采用取手術(shù)切除、內(nèi)鏡或穿刺獲得的新鮮腫瘤組織、以及胸腹水離心獲得的新鮮自 體腫瘤細(xì)胞中的一種，制成自體腫瘤細(xì)胞裂解物蛋白；A2、將步驟Al中的自體腫瘤細(xì)胞裂解物蛋白和同源的細(xì)胞株裂解物蛋白混合，制備成 自體腫瘤相關(guān)全抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟Al中手術(shù)切除、內(nèi)鏡或穿刺獲得的新鮮腫瘤組織采用如下方法取腫瘤周邊部分組織0. 3-1. Ocm3，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復(fù)洗滌 3-5次，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟Al中胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細(xì)胞采用如下方法取胸、腹水1500-2000ml，在轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，生理鹽水洗滌離 心3次，300目鋼網(wǎng)過網(wǎng)后獲得單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量備用O
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟A2中的自體腫瘤抗原和同源的細(xì)胞株抗原混合，制備成自體腫瘤相 關(guān)全抗原采用如下方法反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量，制成同源細(xì)胞株裂解物蛋白；將同 源細(xì)胞株裂解物蛋白與步驟Al中制備的自體腫瘤細(xì)胞裂解物蛋白按照質(zhì)量比為1:1的比 例混合，制備成自體腫瘤相關(guān)全抗原備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟B中DC細(xì)胞的采取選用外周血直接采取獲得、外周血單狀核細(xì)胞分離 獲得、通過骨髓造血細(xì)胞分離獲得、通過骨髓或其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化獲 得、或通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、外周血單狀核細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞、 間充質(zhì)干細(xì)胞分離或定向分化獲得方法中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟B單狀核細(xì)胞采集和分離包括Bi、單狀核細(xì)胞采集前，用GM-CSF 150μδ皮下注射，1次/日，行骨髓動(dòng)員2_3天； Β2、用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，按照說明書中“單狀核細(xì)胞采集”的設(shè)定參數(shù)設(shè) 定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞140_160ml ；B3、將步驟B2中的單狀核細(xì)胞分裝入50ml離心管，細(xì)胞離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，加入質(zhì)量比為10%葡萄糖酸鈣溶液2. 5ml吹打混勻， 56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清制備成自體滅活血清，4°C冷藏備用； B4、收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含密度為1.077g/ml的密度梯度淋巴細(xì)胞分離 液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)在2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，一次 性吸管吸取中間白色細(xì)胞層即為單狀核細(xì)胞；分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，在1500 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘后棄上清；加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，在1000轉(zhuǎn)/分 的轉(zhuǎn)速下離心5分鐘洗滌，棄上清；重復(fù)洗滌3次后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)；B5、在75cm3培養(yǎng)瓶加入RPMI-1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶 活化；將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè)/ml，按體積百分比為 10%-20%加入自身血清，于37°C，體積百分比為5%0)2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘 取出，移除懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟C包括如下工藝方法在步驟B制備的DC細(xì)胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，在培養(yǎng)基中按照如下含量添加 各種組分GM-CSF 500μδ/500πι1 IL-4 300μδ/500πι1 慶大霉素2. 0萬單位/500ml其中無血清DC培養(yǎng)基選自美國SIGMA公司或美國BD公司的產(chǎn)品； 將上述培養(yǎng)基置于37°C，體積百分比為5%0)2的飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)；第6天加 入步驟A制備的自體腫瘤相關(guān)全抗原5(^g/ml，次日補(bǔ)充體積百分比為10%_15%的自體血 清，培養(yǎng)2天后獲取DC疫苗，流式細(xì)胞檢測(cè)CD80、CD83、CD86、HLA-ABC, HLA-DR表達(dá)，鑒定 DC疫苗功能。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物細(xì)胞制劑的制備，特別是指一種負(fù)載自體腫瘤相關(guān)全抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗的制備方法。包括制備自體腫瘤相關(guān)全抗原，采取和分離培養(yǎng)DC細(xì)胞，用自體腫瘤相關(guān)全抗原沖擊DC細(xì)胞，使DC細(xì)胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性DC疫苗。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的所用腫瘤抗原的免疫原性不夠強(qiáng)、抗原靶點(diǎn)不完全、多數(shù)腫瘤病人的腫瘤抗原不易獲得等問題。本DC疫苗具有能夠有效的在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性CTL、并能高效率的對(duì)腫瘤產(chǎn)生特異性殺傷、臨床應(yīng)用的總體有效率高、無明顯毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102091327SQ201010606960
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者杰夫·梅德因, 蔡建輝, 謝紹建 申請(qǐng)人:蔡建輝