專利名稱：一種治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種關(guān)于人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤 的多肽藥物。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒的英文全稱是human papilloma virus，簡稱HPV。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)，宮頸癌是女性癌癥死因的第二殺 手，每年新增約50萬病例，其中有20%發(fā)生在中國。好發(fā)年齡呈雙峰狀，35 39歲和60 64歲。近年已明確，幾乎所有的宮頸癌都由人乳頭瘤病毒引起。其中，超過2/3的宮頸癌病 例可歸咎于兩種類型的HPV 16型和18型。發(fā)生宮頸癌的病因至今尚未完全明了，可能與性生活紊亂，過早性生活，早年分 娩，多產(chǎn)，地理環(huán)境等因素有關(guān)。分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示90%以上的宮頸癌伴有HPV感 染。宮頸癌以鱗狀細(xì)胞癌最為多見，其次為腺癌和腺鱗癌等。高危型人乳頭瘤病毒的感染 是誘發(fā)宮頸癌的必要條件，幾乎所有的宮頸鱗癌中都可以檢測到HPV-DNA的存在。目前治療宮頸癌的只能采用手術(shù)、放療，或兩者聯(lián)合使用。近年來，在上述方法基 礎(chǔ)上加免疫治療受到重視并取得較好的效果。單獨應(yīng)用一種治療方法的并發(fā)癥發(fā)生率為 3 11%，聯(lián)合應(yīng)用兩種治療方法的并發(fā)癥發(fā)生率達(dá)到30%或以上。手術(shù)和放療各有優(yōu)缺 點。目前的趨勢是強(qiáng)調(diào)綜合治療，把手術(shù)、放療和化療進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，以達(dá)到提高治療效 果、改善生活質(zhì)量、減低并發(fā)癥、盡可能保留生育功能和卵巢功能的目的。綜合治療宮頸癌的方法，歸納起來有以下幾種1)手術(shù)治療法切除標(biāo)本的正常組織邊緣距離腫瘤病灶最少達(dá)Icm以上。其缺點 是損傷大，不能憑肉眼發(fā)現(xiàn)受HPV病毒感染的細(xì)胞，因此，被感染的細(xì)胞清除不徹底。2)放射治療法放療包括外照射和腔內(nèi)放療。適用于各期患者，常和手術(shù)、化療配 合使用。該方法主要缺點是雖然能夠殺死受HPV病毒感染的細(xì)胞，但是，射線對正常組織 細(xì)胞損傷較大。3)化學(xué)治療法化療可用于術(shù)前、術(shù)后，或放療前后，也常與放療同時進(jìn)行，以提 高放療的療效。迄今為止，已報道有M種細(xì)胞毒藥物用于進(jìn)展或復(fù)發(fā)宮頸癌的化療，單藥 化療以順鉬的研究最廣泛，療效也最肯定。該方法主要缺點是雖然能夠殺死受HPV病毒感染的細(xì)胞，但是，化療藥物對正常組織細(xì)胞的毒性較 大，出現(xiàn)諸如過敏性休克、嘔吐、白細(xì)胞減少、抵抗力下降等副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物，它 可以專門針對受HPV16型病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行有效地破壞，而且對人體無毒副作用。本發(fā)明的目的是通過這樣的技術(shù)方案實現(xiàn)的，它的氨基酸序列為氨基 端-YICEDTSVTV-羧基端；利用賴氨酸具有兩個氨基、一個羧基的特點，以賴氨酸為接頭，將多個該氨基酸序列組成多拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)。正常人體的外周血單核細(xì)胞(簡稱PBMC) —般不具有特異性溶破受到HPV16型病 毒感染的細(xì)胞的功能，本發(fā)明提供的多肽在體外與HLA-A*0201陽性人體的外周血單核細(xì) 胞共同孵育，可以增加這些外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(簡稱CTL)的數(shù)量 50% -80%，還可以誘導(dǎo)激活CTL溶破HPV16型陽性的腫瘤細(xì)胞，溶破率為60% -90%。本發(fā)明的基本的氨基酸序列來源于GENBANK報道的氨基酸序列，采用蛋白質(zhì)表位 分子設(shè)計的原理和方法，對HPV16型的E2蛋白序列進(jìn)行CTL表位分析，主要是基于量化基 序法確定E2蛋白的CTL表位，具體做法是從E2蛋白第1位氨基酸殘基開始，逐個截取九 肽段或十肽段，共獲得357條九肽段和356條十肽段。對于每一條肽段，在結(jié)合矩陣中查找 各位點氨基酸殘基的結(jié)合系數(shù)，這九肽或十肽結(jié)合系數(shù)相乘后再乘以標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)，即為該九 肽或十肽與HLA-A*0201的結(jié)合系數(shù)。最后，選取結(jié)合系數(shù)最高的幾條肽段作為候選CTL表 位。以此方法找到了具有功能的本發(fā)明所述的氨基酸序列，即氨基端-YICEDTSVTV-羧基 端。合成本發(fā)明所述的氨基酸序列的方法均是現(xiàn)有的成熟技術(shù)，它是按照如下的方法 制成的采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，起始選用0.0125mmol，PSC樹脂(ABI公司生產(chǎn)，批號 A5F013)，分別按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的序列特征，使肽鏈從C端逐個向N端延伸，各 氨基酸原料(美國ABI公司生產(chǎn))的用量為0. Immol0各種氨基酸保護(hù)基團(tuán)是各氨基酸 的 alpha 氨基為 Fmoc 保護(hù)，其余側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，Arg (Mtr)、Tyr (tBu)、Thr (tBu)、Tyr (tBu)、 Asp(OtBu)0每步縮合都加入HoBt/Dcc活化保護(hù)氨基酸的羧基。每步縮合用含有20%六 氫吡啶的NMP溶液去除Fmoc保護(hù)基，肽鏈合成后，按照ABI公司推薦的步驟，將含樹脂的 肽鏈加入處于冰浴條件下的混合反應(yīng)液中，反應(yīng)液的成分結(jié)晶苯酸0. 75g、酒石酸乙二胺 (EDT) 0. 25ml、苯硫基甲烷(Thionaisole)O. 5ml、去離子水0. 5ml、三氟乙酸10ml。在室溫條 件下持續(xù)攪拌，反應(yīng)時間為4. 5小時，把肽鏈從樹脂上裂解下來，同時去除多種保護(hù)基。將 混合液經(jīng)4G的玻璃濾器過濾，以濾掉切下的樹脂及保護(hù)基團(tuán)，并用三氟乙酸沖洗反應(yīng)瓶和 濾器，將濾液在常溫下低壓蒸發(fā)至1 anl，加乙醚50ml使多肽沉淀后，經(jīng)6G濾器過濾后， 冷凍干燥，所得便是肽產(chǎn)品。以上過程都是在ABI-431A固相自動肽合成儀(美國生產(chǎn))上 完成。本發(fā)明涉及的合成多肽藥物或疫苗可以室溫保存、運輸，也可以自動化批量生產(chǎn)。使用現(xiàn)有的成熟技術(shù)，制備表達(dá)HPV16型E2蛋白的靶細(xì)胞，叫Caski細(xì)胞；按照本領(lǐng)域公知的方法獲得HLA_A*0201陽性人體的外周血單核細(xì)胞(簡稱 PBMC)；培養(yǎng)上述PBMC細(xì)胞M小時后，取懸液O XlO6Ail) 4瓶。加入本發(fā)明所述的氨基 酸序列多肽(20yg/ml)，加入等量完全培養(yǎng)基作為對照組，37°C，5%C02環(huán)境下孵育。7天 后重復(fù)該刺激過程，共反復(fù)刺激3次。最末一次刺激后第3天收集懸浮細(xì)胞，這些細(xì)胞具有 針對HPV16型E2蛋白的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性(CTL細(xì)胞)，計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明涉及的 合成多肽藥物或疫苗可以使CTL細(xì)胞數(shù)量較對照組增加50% -80%。將轉(zhuǎn)染了 HPV16之E2基因的Caski細(xì)胞與上述CTL細(xì)胞共同孵育，發(fā)現(xiàn)該CTL細(xì) 胞可以溶破轉(zhuǎn)染了 HPV16之E2基因的Caski細(xì)胞，溶破率得到60% -90%。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有便于運輸保存和自動化批量生產(chǎn)的優(yōu)點， 它具有激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力，該特異性CTL細(xì)胞具有殺傷、溶破具 有人乳頭瘤病毒16型相關(guān)腫瘤標(biāo)志的靶細(xì)胞，效果明顯，而且無毒副作用。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明本發(fā)明的氨基酸序列為氨基端-YICEDTSVTV-羧基端；利用賴氨酸具有兩個氨 基、一個羧基的特點，以賴氨酸為接頭，將多個該氨基酸序列組成多拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)。該多肽可以體外刺激HLA_A*0201陽性人體的外周血單核細(xì)胞，可以增加這些外 周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(簡稱CTL)的數(shù)量提高50%-80%，還可以激活 CTL溶破對HPV16型腫瘤細(xì)胞，溶破率為60% -90%。實施例1 它的氨基酸序列可以為
權(quán)利要求
1.一種治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物，其特征在于它的氨基酸序列 為氨基-YICEDTSVTV-羧基。
2.如權(quán)利要求1所述的治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物，利用賴氨酸具 有兩個氨基、一個羧基的特點，以賴氨酸為接頭，所形成的特殊連接方式，其特征在于它的 氨基酸序列的連接形式為
3.如權(quán)利要求1所述的治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物，利用賴氨酸具 有兩個氨基、一個羧基的特點，以賴氨酸為接頭，所形成的特殊連接方式，其特征在于它的 氨基酸序列的連接形式為
4.如權(quán)利要求1所述的治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物，利用賴氨酸 具有兩個氨基、一個羧基的特點，以賴氨酸為接頭，其特征在于它的氨基酸序列的連接形式 為ντΓΡητ<ιντνKLYTAVSST
全文摘要
一種治療人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物，涉及一種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種關(guān)于人乳頭瘤病毒16型引發(fā)的腫瘤的多肽藥物。其特征在于它的氨基酸序列為YICEDTSVTV；利用賴氨酸具有兩個氨基、一個羧基的特點，以賴氨酸為接頭，將多個氨基酸序列形成特殊的連接方式。本發(fā)明具有便于運輸保存和自動化批量生產(chǎn)的優(yōu)點，它具有激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力，該特異性CTL細(xì)胞具有殺傷、溶破帶有人乳頭瘤病毒16型相關(guān)腫瘤標(biāo)志的靶細(xì)胞，效果明顯，而且無毒副作用。
文檔編號A61P31/20GK102085354SQ20101061668
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者呂鳳林, 楊力, 田菲菲 申請人:重慶大學(xué)