專利名稱：穩(wěn)定的生長激素化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐受蛋白水解性降解的穩(wěn)定的生長激素(GH)化合物。
背景技術(shù)：
生長激素(GH)是由哺乳動物的垂體前葉分泌的多肽激素。依賴于物種，GH是由大約190個氨基酸殘基組成的蛋白，相應(yīng)的分子量是大約22 kDa。GH結(jié)合細胞表面受體(GH 受體(GHIO)并通過該受體發(fā)信號。GH在促進生長、維持正常身體組成、合成代謝和脂類代謝中起關(guān)鍵作用。它也對中間代謝(諸如減少的葡萄糖攝取、增加的脂解作用、增加的氨基酸攝取和蛋白合成)具有直接的作用。該激素也對其它組織發(fā)揮作用，所述組織包括脂肪組織、肝、腸、腎、骨骼、結(jié)締組織和肌肉。已經(jīng)生產(chǎn)并可商業(yè)得到重組hGH，例如作為健高靈 (Pharmacia Upjohn)、Nutropin 禾口 Protropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly)> Serostim (Serono)、諾地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外，在N-末端具有一個額外的甲硫氨酸殘基的類似物也面市， 例如作為Somatonorm (Pharmacia Upjohn/Pfizer)。GH與GH-家族的蛋白的其它成員催乳素(PRL)和胎盤催乳素(PL)具有共同的拓撲學(xué)。GH被歸類成四螺旋束蛋白(圖1)，其表現(xiàn)出具有2個保守二硫鍵的“上-上-下-下” 拓撲學(xué)。具體地，野生型人GH (hGH)由191個氨基酸殘基組成，且具有4個在位置53、165、 182和189處的半胱氨酸殘基，其通過形成2個分子內(nèi)二硫鍵(分別連接C53和C165以及 C182和C189)，穩(wěn)定化蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖1)。通過X-射線結(jié)晶學(xué)，已經(jīng)實驗地確定了游離形式(Chantalet L.藥Λ (1995) Protein and Peptide Letters 3, 333-340)和與它的結(jié)合蛋白(人 GHR (hGHR)的胞外域)復(fù)合(Devos，Α. Μ.藥Λ (1992) Science 255. 306-312)的hGH的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)已經(jīng)儲存在蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中，且可公開得到(PDB 登錄碼分別是IHGU和1HWG)。因而，從公開的hGH結(jié)構(gòu)，可以鑒別出對于hGH與hGHR的結(jié)合而言重要的殘基。此外，已經(jīng)通過核磁共振(NMR)波譜學(xué)研究了 hGH的動力學(xué)性質(zhì) (Kasimova M. R.藥Λ J. Mol. Biol. (2002) M旦，679-695)。X-射線和 NMR 數(shù)據(jù)組合起來可以將確定地結(jié)構(gòu)化和確定地定義的hGH區(qū)域與更少結(jié)構(gòu)化和動力學(xué)的區(qū)域區(qū)分開。預(yù)期hGH的更少結(jié)構(gòu)化和動力學(xué)的區(qū)域?qū)Φ鞍酌讣羟刑貏e易感，且這樣的區(qū)域的正確穩(wěn)定化可以提高蛋白水解穩(wěn)定性。已經(jīng)對hGH進行了廣泛的誘變，以嘗試生成具有希望的化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)的hGH 類似物。具體地，已經(jīng)描述了用于幾種目的的半胱氨酸突變體。US 2003/0162949公開了 GH超基因家族的成員的半胱氨酸變體。提供了產(chǎn)生這些蛋白的位點特異性的生物活性綴合物的一般方法。所述方法包括，將半胱氨酸殘基添加到蛋白的非必需區(qū)域，或使用位點定向誘變，用半胱氨酸殘基置換蛋白中的非必需氨基酸，然后通過添加的半胱氨酸殘基，將半胱氨酸-反應(yīng)性的聚合物或其它類型的半胱氨酸-反應(yīng)性的部分共價地偶聯(lián)到蛋白上。WO 02/055532描述了具有至少一個共價地附著的非多肽部分的基團工程改造的hGH突變體，尤其是其中使用導(dǎo)入的半胱氨酸殘基用于進行加入聚乙二醇的hGH突變體。US 5，951，972描述了生理活性的、衍生化的天然的和重組的哺乳動物和人蛋白和多肽，其中用各種取代基衍生化蛋白中的至少一個天然存在的或摻入的半胱氨酸殘基。已經(jīng)詳細研究了 hGH的蛋白酶剪切。由殘基1 至巧4組成的長環(huán)具有幾種蛋白酶(諸如凝血酶、纖溶酶、膠原酶、枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶)的推定剪切位點。因此，已經(jīng)表明，該hGH部分對蛋白酶剪切特別易感(Lewis，U.J. Ann. Rev. Physiol. (1984.) 46，33-42)。據(jù)報道降解hGH的酶包括凝血酶、纖溶酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶和激肽釋放酶。已經(jīng)研究了大鼠組織中的 hGH 的降解(Garcia-BarrosJ. Endocrinol. Invest. (2000) 23，748 - 754)。在大鼠甲狀腺胰凝乳蛋白酶-樣蛋白酶中，最初發(fā)現(xiàn)在大體積(bulky)和親脂的氨基酸殘基處的有利切割切開Y143和S144之間的肽鍵，從而導(dǎo)致產(chǎn)生雙鏈分子，隨后在 Y42和S43之間切割，從而釋放出N-末端肽F1-Y42。通過胰凝乳蛋白酶-樣蛋白酶在F146 和D147之間的切割，并進一步通過羧肽酶的作用，進一步加工雙鏈分子中的裂開的環(huán)。已經(jīng)報道了幾種生產(chǎn)針對蛋白水解性降解穩(wěn)定化的hGH類似物的方法。Alam等人(J. Biotech. 65, 183 - 190 (1998))通過特異性的點突變，設(shè)計了耐受凝血酶和纖溶酶的hGH突變體。凝血酶特異性地在R134和T135之間切割hGH，且雙突變體R134D、T135P產(chǎn)生耐受凝血酶切割的hGH變體，且三突變體R134D、T135P、K140A導(dǎo)致產(chǎn)生對纖溶酶的耐受性。此外，后一種hGH突變體在7天時間段內(nèi)耐受人血漿的蛋白酶解。EP534568描述了通過將R134突變成丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或組氨酸，針對蛋白水解性降解穩(wěn)定化的hGH突變體。W02004022593/Nautilus描述了一般的高通量定向進化方法，以生產(chǎn)具有增加的蛋白水解穩(wěn)定性的修飾的細胞因子，包括GH變體。W02006048777/Nautilus具體地描述了具有提高的蛋白水解穩(wěn)定性的修飾的hGH 類似物。所述類似物含有 1-5 個在位置 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、 102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185 和 187-191 處的突變。半胱氨酸殘基的導(dǎo)入，可以潛在地導(dǎo)致不希望的二硫鍵連接的二聚體的形成，且在W02006048777 中，特別地從該范圍中排除了半胱氨酸對氨基酸殘基的置換；在W02006048777 (第65頁) 中敘稱“明確地避免半胱氨酸殘基對氨基酸的置換，這是因為該變化可能導(dǎo)致分子間二硫鍵的形成”。明顯需要開發(fā)可耐受蛋白水解性降解的hGH化合物。這樣的穩(wěn)定化的化合物應(yīng)當表現(xiàn)出增加的對蛋白酶剪切的穩(wěn)定性，同時保留hGH的希望的生物學(xué)性質(zhì)。這樣的GH分子會具有增加的穩(wěn)定性、更慢的清除率和/或延長的體內(nèi)半衰期。此外，蛋白治療劑通常需要靜脈內(nèi)地或皮下地施用，這是因為它們通常不是充分地可口服的。蛋白的低口服生物利用率部分地歸因于在胃腸道中的蛋白水解性降解。因此， 也需要開發(fā)可口服施用來治療hGH相關(guān)障礙的hGH化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及包含額外二硫鍵的hGH化合物。在本發(fā)明的hGH化合物中，已經(jīng)通過將野生型hGH序列中的至少一個氨基酸突變成半胱氨酸，導(dǎo)入了至少一個額外的半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的hGH化合物中，以下述方式選擇突變位點(1)將導(dǎo)入的一個或多個半胱氨酸殘基適當?shù)胤湃胝郫B的蛋白的三維結(jié)構(gòu)中，以允許形成在野生型蛋白中不存在的額外二硫鍵，O)不破壞hGH的天然結(jié)構(gòu)，(3)與野生型hGH相比，所述hGH化合物表現(xiàn)出增加的對蛋白酶剪切的穩(wěn)定性或其它增強的功能性，和所述hGH化合物保留與野生型hGH 有關(guān)的希望的生物活性。這樣的可耐受在胃腸道中的蛋白水解性降解的hGH化合物的二硫化物變體，可以被開發(fā)成口服施用的用于治療hGH相關(guān)障礙的藥物。


圖1結(jié)合到hGH結(jié)合蛋白的2個拷貝上的hGH的結(jié)構(gòu)(PDB 1HWG)。hGH中的4個主要螺旋顯示為深灰色，并標記為歷-份。用箭標指示方向(N —C末端)。分別用N和C 標記hGH的N-和C-末端。用黑色棍和球分別表示連接C53和C165以及C182和C189的 2個二硫鍵。還標記了 LU8和D154，它們分別表示連接H3和H4的長柔性環(huán)中的第一個和
最后一個殘基。圖2 hGH的野生型氨基酸序列，其中突出顯示和標記了 4個主螺旋(H1-H4)。還標記了 3個連接主螺旋的環(huán)(L1-L3)。螺旋定義表示與它的結(jié)合蛋白復(fù)合的hGH (PDB 1HWG)。
圖3野生型hGH和具有額外二硫鍵的hGH化合物的蛋白水解性消化的時程。使用的蛋白酶是胰凝乳蛋白酶(圖A)和彈性蛋白酶(圖B)。如實施例5所述進行測定。相對于溫育時間繪制完整蛋白的量(按照相對于t=0時的％)。在表中列出了通過將數(shù)據(jù)擬合至一次指數(shù)所衍生出的T1A (小時)。
具體實施例方式本發(fā)明涉及具有額外二硫鍵的穩(wěn)定的hGH化合物。所述二硫鍵是在半胱氨酸對之間形成，所述半胱氨酸中的一個或兩個通過點突變導(dǎo)入到野生型hGH序列中。選擇突變位點，從而使得導(dǎo)入的半胱氨酸殘基適當?shù)胤湃胝郫B的蛋白的三維結(jié)構(gòu)中，以允許形成二硫鍵。如果僅導(dǎo)入一個半胱氨酸，它在形成二硫鍵時的配偶體將包括在野生型hGH 中存在的4個半胱氨酸殘基之一。可以如下得到具有額外二硫鍵的折疊的蛋白通過由合適的宿主生物體表達可溶形式的hGH的適當半胱氨酸突變體，或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的生長激素化合物的標準重折疊條件，從內(nèi)含體回收(Cabrita和Bottomley， Biotechnology Annual Review 10, 31-50 Q004))。通過計算方法可以輔助鑒別導(dǎo)入額外二硫鍵的候選位置，例如使用實驗地確定的與它的結(jié)合蛋白的2個拷貝復(fù)合的hGH的三維結(jié)構(gòu)(PDB登錄碼1HWG)。導(dǎo)入二硫鍵的適當位置的選擇，可以基于在Dombkowski Α., A., Bioinformatics 19, 1852-1853 (2003)和 Petersen 等人，Protein Eng. 12, 535-548 (1999)中所述的二硫鍵的距離和幾何學(xué)標準。選擇半胱氨酸突變體，從而使得導(dǎo)入的二硫鍵不破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，且對希望的與hGH有關(guān)的生物活性具有最小的負面影響。因而，構(gòu)建化合物，從而使得導(dǎo)入的二硫鍵不損害與hGHR的相互作用。已經(jīng)從IHWG中鑒別出對于受體相互作用而言重要的hGH區(qū)域。 因而，通過分析IHWG結(jié)構(gòu)，可以引導(dǎo)用于導(dǎo)入二硫鍵的適當位置(它們就生物活性而言是中性的)的選擇。
可以選擇半胱氨酸突變體，從而使得導(dǎo)入的二硫鍵提供增加的對蛋白酶剪切的穩(wěn)定性。所述蛋白的一級氨基酸序列，部分地確定了蛋白對蛋白酶切割的易感性。蛋白酶可以是相對非特異性的，或可以以可變程度的選擇性，識別一級氨基酸序列中的特定基序。但是，起底物作用的蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)和動力學(xué)強烈地影響蛋白水解穩(wěn)定性。高度柔性的和動態(tài)的環(huán)結(jié)構(gòu)對蛋白酶催化的切割特別脆弱，而確定地結(jié)構(gòu)化的區(qū)域通常具有更低的脆弱度。因而，通過導(dǎo)入二硫鍵穩(wěn)定化蛋白的動態(tài)區(qū)域，可以保護免于蛋白酶剪切。本發(fā)明的一個方面涉及在SEQ ID No. 1中包含額外二硫鍵的生長激素化合物。如下文所述，根據(jù)本發(fā)明的生長激素化合物多肽優(yōu)選地與SEQ ID No. 1表示的人生長激素具有高水平的同一性，因此與在SEQ ID No. 1中定義的人生長激素相比，生長激素化合物包含一個或多個額外的二硫鍵。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供了根據(jù)SEQ ID No. 1的穩(wěn)定的GH化合物，其通過引入額外二硫鍵而耐受蛋白水解性降解。在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含在與SEQ ID No. 1中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、 F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、 I58C/S144C、P59C/Q137C, P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、 R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、/S85C/ Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、 L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C相對應(yīng)的位置處的至少一個氨基酸對之間的額外二硫鍵。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含在與SEQ ID No. 1中的R16C/ L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/ Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/ F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/ F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和 /或V185C/S188C相對應(yīng)但不限于此的位置處的至少一個氨基酸對之間的額外二硫鍵。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含在與SEQ ID No. 1中的A17C/ E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C 和 R94C/D107C 相對應(yīng)但不限于此的位置處的至少一個氨基酸對之間的額外二硫鍵。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含在與SEQ ID No. 1中的Q84C/ Y143C相對應(yīng)的位置處的氨基酸對之間的額外二硫鍵。在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著 SEQ ID No. 1 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、 N47C/T50C、Q49C/G161C, F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、 I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、 L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、 Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、 V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著、但不限于 SEQ ID No. 1 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/ G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C,I58C/S144C、P59C/Q137C,P61C/E66C、P61C/ T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/ Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、 V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著、但不限于 SEQ ID No. 1 中的 A17C/E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C 和 R94C/D107C。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的生長激素化合物包含一對突變，所述突變對應(yīng)著SEQ ID No. 1中的位置Q84C/Y143C。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過在環(huán)區(qū)段和螺旋結(jié)構(gòu)之間導(dǎo)入二硫鍵，實現(xiàn)生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過在一個環(huán)區(qū)段內(nèi)導(dǎo)入二硫鍵，實現(xiàn)生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過在多個環(huán)區(qū)段內(nèi)導(dǎo)入二硫鍵，實現(xiàn)生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過在螺旋之間導(dǎo)入二硫鍵，實現(xiàn)生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一個實施方案中，至少一個導(dǎo)入的二硫鍵連接生長激素化合物的2個半胱氨酸殘基，其中至少一個所述半胱氨酸殘基在野生型hGH中不存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的導(dǎo)入的二硫鍵位于使用在 Dombkowski A.，A.，Bioinformatics 19, 1852—1853 (2003)禾Π Petersen 等人， Protein Eng. 12(7)，535-548 (1999)中所述的距離和幾何學(xué)標準選擇的半胱氨酸殘基之間。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的導(dǎo)入的一個或多個二硫鍵穩(wěn)定化連接H3和H4的環(huán)(L3，殘基128-154)，即導(dǎo)入的二硫鍵中的至少一個半胱氨酸位于包含殘基128-154的區(qū)段中(圖1和2)。表 權(quán)利要求
1.在SEQID No. 1中包含額外二硫鍵的生長激素化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長激素化合物，其中所述多肽序列與由SEQID No. 1定義的hGH具有至少80%、諸如90%、諸如95%、諸如96%、諸如97%、諸如98%或諸如99%同一性。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含在一個環(huán)區(qū)段和一個螺旋區(qū)段之間、或在一個環(huán)區(qū)段內(nèi)、或在多個環(huán)區(qū)段之間、或在多個螺旋區(qū)段之間的額外二硫鍵。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著 SEQ ID No. 1 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/ V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C, F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/ Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/ T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/ Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/ T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著 SEQ ID No. 1 中的 A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C, D26/Y103C, F54C/ Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C,I58C/Y143C、I58C/ S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/ T148C 和 / 或 R94C/D107C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個額外二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸存在于與SEQ ID No. 1中的氨基酸128-1M相對應(yīng)的環(huán)3 (L3)中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生長激素，其中所述生長激素化合物包含一個額外二硫鍵， 其中至少一個半胱氨酸存在于與SEQ ID No. 1中的氨基酸135-148相對應(yīng)的區(qū)域中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著 SEQ ID No. 1 中的 ra4C/Y143C、ra4C/S144C、ra4C/F146C、S55C/Y143C、S57C/ Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/ F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/ Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C 和 / 或 F92C/T148C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個連接L3 和螺旋2 (H2)或環(huán)1 (Li)的額外二硫鍵。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物針對一種或多種蛋白酶的降解被穩(wěn)定化，所述蛋白酶例如消化蛋白酶，諸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或彈性蛋白酶，或諸如胰凝乳蛋白酶和/或彈性蛋白酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的生長激素化合物，其中所述多肽包含至少一對突變，所述突變對應(yīng)著SEQ ID No. 1 中的H21/M170、擬6/V102C、D26/Y103C、ra4C/Y143C、ra4C/S144C、 S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、 L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和 / 或 R94C/D107C。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的生長激素化合物，其與在SEQID No. 1中定義的人生長激素相比精確地包含2個額外的半胱氨酸。
13.一種用于制備具有增加的對蛋白水解性降解的穩(wěn)定性的生長激素化合物的方法， 所述方法包括下述步驟a. 在如SEQ ID No. 1所定義的hGH中導(dǎo)入額外的二硫鍵。
14.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的生長激素化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
15.一種治療疾病的方法，其中生長激素活性可以用于治療患者將從循環(huán)生長激素化合物量的增加獲益的疾病或狀態(tài)，所述方法包括，給患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-12 中任一項所述的生長激素化合物或根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的生長激素(GH)化合物，其通過導(dǎo)入半胱氨酸殘基而具有二硫鍵，這使得該化合物耐受蛋白水解性降解。
文檔編號A61K38/27GK102292349SQ201080005067
公開日2011年12月21日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日
發(fā)明者B. 席奧特 C., 德姆思 H., 布雷因霍爾特 J., 諾斯科夫-勞里特森 L., H. 奧爾森 O., 泰格森 P. 申請人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司