專利名稱：納米粒子制備的糖脂免疫抗原的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種新型納米粒子制備的糖脂抗原，該糖脂抗原對觸發(fā)免疫系統(tǒng)釋放抗癌和抗病毒細胞因子具有較強的活性。與早先發(fā)明的糖脂抗原相比，這種新型的納米粒子制劑不會造成免疫系統(tǒng)的無反應性(刺激后無應答)，也可以重復用來治療長期疾病，例如癌癥和慢性病毒性疾病。
背景技術(shù)：
α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(KRN7000) (Alpha-galactosylceramide)—種有效的免疫療劑。α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(又稱為KRN7000)是一種海綿派生的鞘糖脂(參見美國專利US 5780441)。它是NKT細胞的超拮抗劑抗原，通過Thl細胞因子(干擾素)介導機制， 限制小鼠模型黑色素瘤轉(zhuǎn)移并抑制乙肝病毒的復制。在一些包括癌癥以及丙肝患者的臨床試驗中，已經(jīng)驗證了 α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的安全性，并且它可以強烈誘導Thl細胞因子應答。自然殺傷T(NKT)細胞是亞群獨特的淋巴細胞，其具有T細胞和NK細胞的標記和功能。NKT細胞在抗原(α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺)刺激的兩小時內(nèi)激活，并產(chǎn)生大量的Thl 和Th2細胞因子。除了分泌細胞因子，NKT細胞還在啟動幾種類型的免疫細胞之間的細胞與細胞接觸及通訊中發(fā)揮極其重要的作用，包括樹突細胞、巨噬細胞、CD4T細胞和CD8T細胞。與識別肽抗原的常規(guī)T細胞相比，NKT細胞識別由非多態(tài)MHC樣分子CDld呈遞的脂類抗原?？扇苄驭?-半乳糖苷神經(jīng)酰胺誘導NKT細胞的無反應性。α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺的一個主要問題是，在一劑治療后，它會導致NKT無應答(無反應性)，這是由于α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺可以被外周血液中表達⑶Id的B細胞呈遞(

圖1Α)，并且在沒有合適的共刺激分子的情況下刺激NKT細胞。為了解決可溶性α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺誘導的無反應性，Dhodapkar和Meinmarm 研究出一種細胞治療方法(圖1Β)，通過靜脈內(nèi)注射用α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺脈沖的，由患者的外周血單核細胞離體產(chǎn)生的樹突細胞。這種細胞治療方法避免了 NKT無反應機制，并且對誘發(fā)癌癥患者的腫瘤特異性抗原CD8應答具有很強的功效。但是，細胞療法花費高昂， 并且由于病毒感染患者的組織并不符合GMP程序，所以對他們來說細胞療法非常不切實際。因此，需要新的方法來在體內(nèi)重復且有效地刺激NKT細胞。納米粒子制備的α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺克服了 NKT的無反應性?；谏鲜鲞M展， 本發(fā)明人假設包裝在納米粒子中的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺優(yōu)先被樹突細胞攝取，然后釋放到溶酶體中(圖1C)。α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺加載到溶酶體的抗原提呈分子CDld(非MHC 抗原提呈分子)上，然后再循環(huán)到細胞表面，從而激活NKT細胞。本發(fā)明的技術(shù)通過化學合成，將α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺結(jié)合到多聚體基納米粒子表面。利用α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的表面結(jié)合而不是封裝方法的基本原理?？梢钥紤]兩種將α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺加載到納米粒子的方法1)表面覆蓋，也就是首先合成納米粒子，然后將α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺結(jié)合到納米粒子的表面；幻直接封裝方法，也就是將 α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺和多聚體混合到一起，并形成納米粒子，同時α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺均勻分布在該納米粒子內(nèi)。由于NKT細胞的生物學行為，即對應α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺藥品的細胞類型，本發(fā)明人決定采用前一種方法。如圖2所示，NKT細胞的激活包括增殖、收縮和記憶階段。在增殖階段中，NKT細胞產(chǎn)生抗腫瘤和抗病毒的細胞因子。在收縮和記憶階段中，大多數(shù)NTK細胞死亡，而只有 5-10%的“記憶” NKT細胞開始“休眠”，并且重新規(guī)劃自身用于下次刺激。因此，α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的連續(xù)釋放不會有效地激活NKT細胞，結(jié)果表明，α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺的連續(xù)釋放反而會造成NKT細胞的免疫無應答(無反應性)。根據(jù)上述機制，本發(fā)明人設計了表面覆蓋的方法，所述方法使α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺在被樹突細胞和巨噬細胞吞噬后迅速釋放到血清中，而不是使α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺穩(wěn)定地釋放。相比之下，眾所周知封裝方法適合長期連續(xù)的釋放封裝的藥物。封裝的納米粒子靜脈內(nèi)注射后聚集在肝臟或脾臟，封裝藥物的穩(wěn)定釋放可以持續(xù)長達10天的時間。因此，封裝方法并不適于釋放NKT配體目的。選擇生物降解多聚體基納米粒子的基本原理。如PLGA的多聚體具有良好的生物適合性、生物降解性及商業(yè)實用性，并且早先申請中的多聚體還可以送遞藥物，例如蛋白、 肽疫苗和疏水性抗癌藥物?？梢岳帽┞对诩{米粒子表面的多聚體的酰基與胺基結(jié)合。然而，α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺并不包含胺基。由于已知半乳糖的6-0Η基團對于α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的抗原活性并非必需，因此，本發(fā)明人發(fā)明了糖脂類似物即6-氨基乙氧基-6-脫氧-α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺，其在半乳糖的6-0Η基團中含有胺基。這允許形成酰胺鍵(參見圖幻。為了避免針對任何以外的蛋白抗體應答(例如鏈霉抗生素蛋白-生物素系統(tǒng))，本發(fā)明人會直接將 α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺結(jié)合到納米聚合材料。α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺和多聚體在小鼠和人體中都不具備抗原性，并且多聚體和α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺的化學結(jié)合不會產(chǎn)生免疫反應抗原決定簇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種納米粒子制備的糖脂免疫抗原，其包含兩種組分1)大小為10-2000納米的納米粒子，該納米粒子由可生物降解的多聚體組成，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚己酸內(nèi)脂或其它聚酯類多聚體；多正脂類多聚體、聚酐類多聚體和聚磷腈類多聚體，以及由兩種或兩種以上的上述多聚體組成的任何共聚物。2) 6-氨基乙氧基-6-脫氧-α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺。本發(fā)明應用的關(guān)鍵技術(shù)是，通過酰胺鍵將組分2化學結(jié)合于組分1的表面(參見圖3)。本發(fā)明的目的是，為糖脂抗原提供一種新型表面結(jié)合制劑，其能夠在癌癥和慢性病毒感染狀況的長期治療中重復刺激免疫系統(tǒng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，結(jié)合到納米粒子表面的糖脂能夠重復刺激NKT細胞產(chǎn)生IFN- γ， 該IFN-γ是具有強效抗癌和抗病毒活性的細胞因子。在小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種新型藥物具有抗癌作用。實施本發(fā)明的最佳模式
納米粒子的制備，以聚(乳酸乙醇酸)(簡稱為PLGA)作為實例。在存在穩(wěn)定的共聚物的情況下，利用納米沉淀法制備納米球。將來自Absorbable Polymers International (Pelham，AL，USA)的PLGA溶于丙酮(0. 5%重/容)。將該多聚體溶液逐滴添加到一種含有泊洛沙胺904(美國新澤西州帕瑟伯尼市BASF懷恩多特公司)的水溶液中。在室溫下攪拌該混合物，直至有機溶劑完全干燥。將由此產(chǎn)生的納米粒子分散體通過一個Iym的過濾器，并通過離心純化。將納米粒子重新分散到水中，在液氮中速凍并進行凍干。在_20°C的條件下儲存干粉制劑。該方法提供的納米粒子的直徑為約50nm-2000nm， 顆粒大小取決于PLGA的分子量、攪拌速度以及表面活性劑的濃度。制備包含可以直接結(jié)合到PLGA納米粒子的胺基的6-氨基乙氧基_6_脫氧-α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(參見圖4和圖5)。6-氨基乙氧基-6-脫氧-α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺與PLGA納米粒子的結(jié)合。以1 % 和10% (w/w比)，將6-氨基乙氧基-6-脫氧-α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺結(jié)合到PLGA顆粒。試驗實施例1 本發(fā)明藥物的免疫刺激活性通過納米粒子制備的α GalCer (半乳糖基神經(jīng)酰胺)在體內(nèi)刺激NKT細胞將包含IygWa-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的納米粒子注射給C57BL6型小鼠，利用非結(jié)合的納米粒子作為陰性對照。同時，本發(fā)明人研究了可溶形式的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺。體內(nèi)重復刺激NKT細胞從(緬因州巴港市(Bar Arbor, ME))杰克遜實驗室 (Jackson Laboratory)購入 C57/BL6 型小鼠，遵循機構(gòu)方針(institutional guideline), 在標準的無病原條件下將其安置在安德森癌癥中心(M. D. Anderson Cancer Center)的動物設備中。將六周大的C57BL/6型小鼠用于所有的實驗。每個實驗利用一組三只小鼠。給每只小鼠靜脈內(nèi)注射(通過尾靜脈)200 μ L含有1 μ g α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺或納米粒子制備的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的PBS。每隔十天對小鼠進行治療，達三次。用200ml PBS/1% 二甲基亞砜作為對照。每次刺激后，IFN- γ分泌的測量每次藥物治療的M小時后對小鼠采血。使用BD Biosciences (San Jose，CA)的試劑盒，通過 ELISA，測量血清 IFN-γ。結(jié)果納米粒子克服了 NKT細胞的無反應性如通過血清IFN-Y的濃度所測量的，與α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺相同，納米粒子制備的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺的首次注射誘發(fā)細胞因子釋放，在注射對-48小時后達到峰值。如表1所示，納米粒子的制備α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺在每次刺激后都會誘發(fā)IFN-γ分泌。與之相反，可溶性α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺僅在首次治療時引起IFN-Y分泌，并不能在后續(xù)刺激中誘發(fā)IFN-Y分泌。因此本發(fā)明人的新型的α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺制劑可以重復刺激NKT細胞并誘發(fā)IFN- γ產(chǎn)生，而不會導致無反應性。表1 α GalCer納米粒子重復激活NKT細胞產(chǎn)生IFN- y (pg/ml)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)品，其特征在于其在任何構(gòu)型中，含有所述的單獨特性組合或以任何架構(gòu)特性組合。
2.一種組合物，其包含結(jié)合于納米粒子的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺。
3.一種組合物，其包含6-氨基乙氧基-6-脫氧-α -半乳糖苷神經(jīng)酰胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述納米粒子包括聚乳酸、聚(乙醇酸)、聚己酸內(nèi)脂或其它聚酯類多聚體；多正脂類多聚體；聚酐類多聚體和聚磷腈類多聚體，以及由兩種或兩種以上的上述多聚體組成的任何共聚物。
5.一種制造結(jié)合的納米粒子α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺制劑的方法，其中通過酰胺鍵或其它化學鍵將α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺或其類似物化學結(jié)合于納米粒子的表面。
6.一種藥物組合物，其包含結(jié)合的納米粒子α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺。
7.一種防止NKT細胞無反應性的方法，其步驟包括將療效量的由α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺配制的結(jié)合的納米粒子給予有需要的患者。
8.一種預防或治療癌癥、慢性病毒疾病、慢性細菌感染、自身免疫病、哮喘癥、過敏癥、 糖尿病、動脈硬化以及其他慢性疾病狀況的方法，包括將療效量的結(jié)合的納米粒子α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺聯(lián)合蛋白/肽抗原給予有需要的患者。
9.一種蛋白/肽抗原的佐劑，其包含結(jié)合的α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種納米粒子制備的糖脂免疫抗原，其包含兩種組分1)大小為10-2000納米的納米粒子，該納米粒子由可生物降解的多聚體組成，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚己酸內(nèi)脂或其它聚酯類多聚體；多正脂類多聚體、聚酐類多聚體和聚磷腈類多聚體，以及由兩種或兩種以上的上述多聚體組成的任何共聚物。2)6-氨基乙氧基-6-脫氧-α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺。本發(fā)明應用的關(guān)鍵技術(shù)是，通過酰胺鍵將組分2化學結(jié)合于組分1的表面(參見圖3)。本發(fā)明的目的是，為糖脂抗原提供一種新型表面結(jié)合制劑，其能夠在癌癥和慢性病毒感染狀況的長期治療中重復刺激免疫系統(tǒng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，結(jié)合到納米粒子表面的糖脂能夠重復刺激NKT細胞產(chǎn)生IFN-γ，該IFN-γ是具有強效抗癌和抗病毒活性的細胞因子。在小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種新型藥物具有抗癌作用。
文檔編號A61K39/385GK102355908SQ201080005289
公開日2012年2月15日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者周大鵬, 李純 申請人:德克薩斯大學系統(tǒng)評論委員會