專利名稱：小干擾rna的改進設(shè)計的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小干擾RNA分子(siRNAs)，與種子區(qū)域內(nèi)的堿基配對相比，其反義鏈(引導(dǎo)鏈)的3’端與正義鏈(過客鏈)的5’端的熱力學(xué)穩(wěn)定性分別得到增強。本發(fā)明涉及的小干擾RNA分子對于靶基因的敲除活性得到增強，并且對RNAses抗性更高，特別是對血清RNAses。本發(fā)明還涉及了一種制備該小干擾RNA分子的方法，一種利用本發(fā)明的這種改進的小干擾RNA分子進行目標(biāo)特異性RNA干擾的方法，以及含有這種小干擾RNA分子的藥物組合物。
背景技術(shù)：
通過小的雙鏈RNA (dsRNA)分子調(diào)節(jié)的RNA干擾(RNAi)是一種用于體外以及體內(nèi)的基因沉默的成熟技術(shù)(近期的綜述，例如，Kim等人發(fā)表的2007年的《自然綜述遺傳學(xué)》 (Nature Reviews Genetics) 8，173-184 頁，綜合引用于此)。小干擾RNA分子以互補的RNAs (特別是信使RNA與病毒RNA，例如病毒基因組或者次基因組RNA)為目標(biāo)，通過轉(zhuǎn)錄-裂解與降解從而達到轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。EP 1 407 044B1描述了一種分離的雙鏈RNA分子，其中各條RNA鏈具有大約 19-23個核苷酸，其中至少一條鏈具有1-3個核苷酸的3’-突出部分，該RNA分子能夠進行目標(biāo)特異性RNA干擾。其他推薦的小干擾RNA分子為具有19-23個堿基對的類似分子，其中，雙鏈RNA的兩端為平末端。EP 1 486 564A1公開了一種能夠進行RNA干擾的雙鏈RNA的特異性選擇的方法， 該RNA干擾通過增強其血清穩(wěn)定性從而使得干擾效率得到提高，其中，雙鏈RNA的單鏈序列經(jīng)過挑選，使得雙鏈兩端的最后1對互補核苷酸對為鳥嘌呤-胞嘧啶堿基對，或者最后4對互補核苷酸對中的至少兩對為鳥嘌呤-胞嘧啶堿基對，其中，該雙鏈DNA的第一端具有1-4 個未配對的核苷酸的突出部分，而第二端不具有突出部分，其中，該單鏈突出部分的特點在于，直接緊鄰于最后一對互補核苷酸對的未配對的核苷酸含有嘌呤堿基。所有經(jīng)過EP 1 486 564A1所描述的方法篩選出的特異性雙鏈RNA分子在其引導(dǎo)鏈上均具有3’突出部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有改良的基因沉默活性的小干擾RNA 分子。解決上述技術(shù)問題的方法通過權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的具體實施例進行詳細闡述。特別是，本發(fā)明提供了一種能夠進行目標(biāo)特異性RNA干擾的分離的雙鏈RNA分子， 該雙鏈RNA分子與小干擾RNA分子的種子區(qū)域內(nèi)的堿基配對相比，其過客鏈的5’端與引導(dǎo)鏈的3’端的熱力學(xué)穩(wěn)定性分別得到增強。本發(fā)明的小干擾RNA分子的設(shè)計通過(i)提高靶向基因的敲除效率以及(ii)提高對RNAses的抗性從而顯著地增強其基因沉默活性。
因此，本發(fā)明特別涉及一種能夠進行目標(biāo)特異性RNA干擾的分離的雙鏈RNA分子， 該雙鏈RNA分子在其過客鏈的5’端和引導(dǎo)鏈的3’端具有至少3個鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對。 優(yōu)選地，本發(fā)明的RNA分子在其過客鏈的5’端和引導(dǎo)鏈的3’端分別具有3-10個，即3，4， 5，6，7，8，9或者10個鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的RNA分子的特征在于， 過客鏈的5’端具有3-10個，即3，4，5，6，7，8，9，或者10個鳥嘌呤核苷酸序列，而引導(dǎo)鏈的 3’端具有3-10個，即3，4，5，6，7，8，9或者10個胞嘧啶核苷酸序列，反之亦然。最優(yōu)選地， 本發(fā)明的RNA分子在其過客鏈的5’端具有5個鳥嘌呤核苷酸序列，而在其引導(dǎo)鏈的3’端具有5個胞嘧啶核苷酸序列，反之亦然。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“能夠進行目標(biāo)特異性RNA干擾的分離的雙鏈RNA分子”指的是一種雙鏈核糖核苷酸，其中，一條鏈(正義鏈或者過客鏈)反映的是目標(biāo)RNA(例如，目標(biāo)基因的信使RNA或者病毒RNA，例如病毒基因組的或次基因組的RNA)的核苷酸序列，第二條鏈(稱為反義鏈或者引導(dǎo)鏈)能夠與正義鏈或者過客鏈形成RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，具有基本上分別與正義鏈或者過客鏈和目標(biāo)RNA互補的序列。在使用小干擾RNA分子進行轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機制中，僅僅反義鏈或引導(dǎo)鏈被引入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中(也有可能是過客鏈進入該RISC復(fù)合物中，但是，如果這樣，目標(biāo)RNA則不能被識別出來，并且RNA干擾無法啟動)。在被稱為“種子”區(qū)域的引導(dǎo)鏈的5’端的前10 個核苷酸被認為是用于識別RISC復(fù)合物內(nèi)的信使RNA的核心區(qū)域。因此，優(yōu)選為引導(dǎo)鏈的種子區(qū)域內(nèi)的序列100%反映出目標(biāo)信使RNA的序列。本發(fā)明的雙鏈RNA分子可以具有1-5個核苷酸的3’ -突出部分，優(yōu)選為在過客鏈上具有1，2或3個核苷酸。因此，本發(fā)明的雙鏈RNA分子的另一端(即過客鏈的5’端和引導(dǎo)鏈的3’端)為平末端(即末端無突出部分)。此外，在不包括過客鏈的5’端與引導(dǎo)鏈的 3’端各自的鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對序列，也不包括過客鏈3’端的可選擇的突出部分(如果有的話)的情況下，本發(fā)明中的小干擾RNA分子優(yōu)選為具有1016個核苷酸的長度，19-22 個更佳，特別優(yōu)選為21個核苷酸。本發(fā)明的雙鏈RNA分子的穩(wěn)定性可通過以下一項或多項措施得到提高如果過客鏈具有3’ -突出部分，則該3’ -突出部分可以通過選擇嘌呤核苷酸，特別是腺嘌呤或鳥嘌呤核苷酸使其穩(wěn)定，進一步還可以采取修飾的類似物對3’ -突出部分的嘧啶核苷酸進行替換，例如，使用2’ -脫氧胸腺嘧啶核苷取代3’ -突出部分的尿嘧啶核苷酸。此外，2’ -羥基的脫除也可以增強3’ -突出部分的核酸酶抗性，特別是在組織培養(yǎng)基中。此外，該RNA分子也可能含有至少一個修飾的核苷酸類似物，特別是在雙鏈RNA形成區(qū)域內(nèi)。與自然形成的核苷酸相比，核苷酸類似物的化學(xué)修飾可以發(fā)生在核糖，磷酸以及/ 或堿基部分。為了使分子具有增強的穩(wěn)定性，尤其是針對RNA降解酶，特別優(yōu)選為對骨架進行修飾，也就是核糖以及/或磷酸部分。核糖修飾過的核糖核苷酸的優(yōu)選實施例為一類類似物，其中，2’ -羥基被選自由 H，OR, R，鹵素，SH，SR, NH2, NHR, NR2,或CN組成的組中的一個基團取代，其中，R為C1-C6的烷基，烯基或炔基，鹵素為氟，氯，溴或碘。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，術(shù)語“修飾過的核糖核苷酸”還包括2’ -脫氧衍生物，在某些情況下又被稱為“脫氧核苷酸”。諸如2’ -0-甲基類似物的2’ -0-修飾的類似物，也可能被包括在種子區(qū)域內(nèi)，舉例來說，為了使脫靶效應(yīng)達到最小而位于引導(dǎo)鏈的2位(從其5’端算起)。如前所述，至少一個修飾過的核糖核苷酸可以選自于在其堿基部分進行化學(xué)修飾的類似物。這些類似物包括但不局限于5-氨基烯丙基(aminoallyl)-尿苷，6-氮雜 (aza)-尿苷，8-氮雜(aza)-腺苷，5-溴-尿苷，7_去氮(deaza)-腺苷，7_去氮(deaza)-鳥苷，N6-甲基-腺苷，5-甲基-胞苷，4-硫代尿苷。對骨架修飾的核糖核苷酸實例中，其中相鄰核糖核苷酸之間的磷酸酯基團被修飾為硫代磷酸酯(phosphothioate)基團。如果過客鏈具有3’ -突出部分，該3’ -突出部分也可以進行標(biāo)記，從而用于分析， 尤其是診斷，以及應(yīng)用中的探測。“標(biāo)記”可以是能夠通過物理學(xué)，化學(xué)以及/或生物學(xué)手段對小干擾RNA進行探測的任何化學(xué)物質(zhì)。連接或者整合到3’-突出部分的一個或多個核苷酸上的典型標(biāo)記為放射性標(biāo)記，發(fā)色團以及熒光團(比如熒光素，TAM等等)。除了鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對以及可選擇的3’ -突出部分之外，過客鏈與目標(biāo)分子 (即為目標(biāo)RNA)的序列一致性優(yōu)選為至少70%。更加優(yōu)選地是，一致性至少為85%，最優(yōu)選為100%。反過來，意味著引導(dǎo)鏈序列與期望的目標(biāo)RNA的互補性至少為70%，更加優(yōu)選地是85%，最優(yōu)選為100%。尤其是，最優(yōu)選為，上面所定義的引導(dǎo)鏈的種子區(qū)域與目標(biāo) RNA100 % 互補。通常，本發(fā)明中的小干擾RNA分子特別優(yōu)選為以下序列對(過客鏈/引導(dǎo)鏈)SEQ ID NO :5/SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :17/SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19/SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21/SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23/SEQ ID NO :24 以及 SEQ ID NO :25/SEQ ID NO 26。本發(fā)明的主題還涉及了一種制備上述定義的分離的雙鏈RNA分子的方法，包括以下步驟(a)制備一條過客鏈和一條引導(dǎo)鏈，該過客鏈的5’端具有至少3個鳥嘌呤以及/ 或胞嘧啶核苷酸序列，可選擇地在該過客鏈的3’端具有1-5個核苷酸的突出部分(即過客鏈可以比引導(dǎo)鏈長1-5個核苷酸)，該引導(dǎo)鏈的3’端具有至少3個鳥嘌呤以及/或胞嘧啶核苷酸序列，其中，過客鏈上5’端具有的至少3個鳥嘌呤以及/或胞嘧啶核苷酸序列與引導(dǎo)鏈上3’端具有的至少3個鳥嘌呤以及/或胞嘧啶核苷酸序列互補(即除了過客鏈上3’ 端可選擇的1-5個核苷酸的突出部分之外，過客鏈與引導(dǎo)鏈的序列互補)；(b)過客鏈與引導(dǎo)鏈在形成雙鏈RNA分子的條件下結(jié)合，該雙鏈RNA分子可選擇地在過客鏈的3’端具有1-5個核苷酸的突出部分。本發(fā)明中雙鏈RNA分子的鏈可以由化學(xué)合成法或酶法制備。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈RNA 分子的鏈由化學(xué)合成法制備時，過客鏈5’端終端的核苷酸在其核糖的5’端為單磷酸。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈RNA分子的鏈由酶法制備時，過客鏈5’端終端的核苷酸在其核糖的5’端為三磷酸。因此本發(fā)明也指的是過客鏈5’端終端的核苷酸在其核糖的5’端為單磷酸基團或者是三磷酸基團的雙鏈RNA分子?；瘜W(xué)合成方法可以包括，例如，在Narang等人發(fā)表的1979年的《酶學(xué)方法》 (Methods in Enzymology) 68 :90里描述的磷酸三酯法，在Braun等人發(fā)表的1979年的《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology) 68 109里描述的磷酸二酯法，在Beaucage等人發(fā)表的1981年的《四面體通訊》(Tetrahydron Letters) 22 :1859中描述的二乙基磷酸酰胺法，以及US-A-4，458，066中公開的載體法。制備本發(fā)明中的雙鏈RNA分子的酶法優(yōu)選為使用RNA-依賴型RNA聚合酶 (RdRPs)。RdRPs為一類從病毒例如杯狀病毒(如諾瓦克病毒(norovirus)，沙波病毒 (sapovirus)，水皰疹病毒(vesivirus)，兔類病毒(lagovirus))以及丙型肝炎病毒等中得到相應(yīng)的酶。關(guān)于杯狀病毒，參見W0-A-2007/0123^?？蛇x擇地，本發(fā)明中小干擾RNA分子的制備方法步驟(a)中定義的RNA單鏈也可以利用合成的DNA模板或者從能夠復(fù)制質(zhì)粒的重組宿主細胞中制備的DNA質(zhì)粒，通過DNA-依賴型RNA聚合酶進行制備。在這方面適用的 DNA-依賴型RNA聚合酶優(yōu)選為選自噬菌體例如T7，T3的RNA聚合酶，或者SP6RNA聚合酶 (參見，例如，Milligan等人發(fā)表的1989年的《酶學(xué)方法》(Methods Enzymo 1.) 180，51-62)。特別是，為了大規(guī)模制備本發(fā)明中的雙鏈RNA分子，優(yōu)選為首先采用化學(xué)合成法(舉例同上)制備少量的雙鏈RNA分子，然后進行雙鏈RNA的酶法擴增，優(yōu)選為采用 W0-A-2007/012329公開的杯狀病毒的RdRP。關(guān)于使用RdRPs，特別是來自于杯狀病毒科的 RdRPs的骨架修飾的雙鏈RNA分子的酶制品，參見W0-A-2009/150156。本發(fā)明的分離的雙鏈RNA分子特別適用于目標(biāo)特異性RNA干擾。因此，本發(fā)明還涉及一種目標(biāo)特異性RNA干擾的方法，包括將一個真核細胞或有機體與一個如上限定的雙鏈 RNA分子(或者不止一個雙鏈RNA分子)相接觸，其中細胞或有機體含有目標(biāo)RNA(比如，由所述細胞或有機體表達的信使RNA，或者比如基因組的或次基因組的病毒RNA)，該目標(biāo)RNA 與雙鏈RNA分子的過客鏈的序列一致性至少為70 %。過客鏈與目標(biāo)信使RNA之間的序列一致性的特別優(yōu)選值如上所述。優(yōu)選地，雙鏈RNA分子被引入細胞或有機體。將本發(fā)明中的小干擾RNA引入細胞或有機體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知?？蓞⒖紝⒑怂?，特別是將小干擾RNA分子，引入細胞或有機體的方法指南，比如，由Ausubel等人編寫的約翰威立出版社出版的最新版的《精編分子生物學(xué)實驗指南》，紐約，美國(Ausubel et al. (ed. )Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York, USA)。本發(fā)明的雙鏈RNA分子可用于基礎(chǔ)科學(xué)與應(yīng)用科學(xué)領(lǐng)域中，作為藥物和/或診斷工具以及實驗性研究的工具。根據(jù)本發(fā)明，RNA分子的醫(yī)療目的優(yōu)選為與至少一種藥物載體，賦形劑以及/或稀釋劑相結(jié)合被包含于一種藥物組合物中。本發(fā)明文中的藥物組合物的劑型以及給藥途徑為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，操作指南可參見最新版的Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. , Easton, PA,USA)。RNA干擾分子的治療應(yīng)用的必要條件還涉及該分子對RNAses的抗性。RNAses普遍存在于有機體內(nèi)，并且在血清以及其他體液中特別豐富。迄今為止，由于血清RNAses對 RNA干擾分子的降解一直妨礙著這類分子的廣泛的治療應(yīng)用，特別是靜脈注射。該問題的一種解決方法曾經(jīng)是對正義鏈或是反義鏈的核苷酸進行化學(xué)修飾，通常為引入2’ -0-甲基或 3’_氟基團。盡管其RNAses抗性得到增強，但是這樣的化學(xué)修飾通常會降低其基因沉默效率。本發(fā)明通過對RNA干擾分子的正義鏈/反義鏈的新設(shè)計，為小干擾RNA分子提供了增強的RNAses抗性，甚至不需要對核苷酸進行任何化學(xué)修飾，因此使得基因沉默效率不
6受影響。此外，本發(fā)明還涉及了一種包括本發(fā)明的雙鏈RNA的診斷試劑盒，以及至少一種用于檢測雙鏈RNA的方法。該診斷試劑盒優(yōu)選為含有用于標(biāo)記(放射性標(biāo)記物質(zhì)，發(fā)色團， 或者熒光團)的化學(xué)試劑以及/或檢測本發(fā)明的標(biāo)記雙鏈RNA的化學(xué)試劑。根據(jù)本發(fā)明的該試劑盒還包括如本發(fā)明所限定的一種或多種預(yù)標(biāo)記的雙鏈RNA(比如，如上面舉例所述的利用熒光團對3’ -突出部分進行標(biāo)記的雙鏈RNA)。本發(fā)明的小干擾RNA分子特別適用于疾病的治療，包括由傳染源，比如細菌，病毒或真菌，以及腫瘤引起的傳染性疾病。關(guān)于本發(fā)明中的小干擾RNA分子，優(yōu)選為包含到相應(yīng)的藥物組合物中用于對抗病毒性疾病，優(yōu)選為該小干擾RNA對抗一種病毒，優(yōu)選為選自于由杯狀病毒科(Calicivihdae)，正粘液病毒科(Orthomyxoviridae)，副粘液病毒科 (Paramyxoviridae)，小核糖核酸病毒禾斗(Picornaviridae)，黃病毒禾斗(Flaviviridae)，披膜病毒科CTogaviridae)，肝炎病毒科(Hepaciviridae)以及星狀病毒科(Astroviridae) 組成的組中。本發(fā)明中的小干擾RNA分子優(yōu)選對抗的杯狀病毒科包括諾瓦克病毒 (norovirus),沙波病毒(sapovirus),兔類病毒(Iagovirus)禾口水皰疫病毒(vesivirus)。 因此，本發(fā)明的小干擾RNA序列可選擇性地降低，優(yōu)選為清除傳染源或腫瘤的基因表達。本發(fā)明的小干擾RNA分子特別優(yōu)選為對抗貓杯狀病毒(FCV)，并包含正義鏈(過客鏈)為SEQ ID NO 5以及反義鏈(引導(dǎo)鏈)為SEQ ID NO 6的小干擾RNA。本發(fā)明的小干擾RNA分子更加優(yōu)選為對抗人鼻病毒IB(HRVlB)，并包含以下序列對(過客鏈/弓丨導(dǎo)鏈) SEQ ID NO :17/SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :19/SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :21/SEQ ID NO 22，SEQ ID NO :23/SEQ ID NO :24 以及 SEQ ID NO :25/SEQ ID NO :26。本發(fā)明還提供了一種用于治療疾病，優(yōu)選為病毒(舉例如上面所述)或者腫瘤性疾病的方法，該方法包括給需要這種治療的優(yōu)選的哺乳動物，特別是人類患者服用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明還涉及了一種真核細胞或者真核非人有機體，該真核細胞或者真核非人有機體被如上所限定的雙鏈RNA分子或尤其編碼的DNA轉(zhuǎn)染或者變換。


圖1是與現(xiàn)有技術(shù)中具有EP 1 407 044B1中公開的設(shè)計小干擾 RNAC Tuschl-siRNA")以及平末端小干擾RNA(“ Blunt-siRNA")相比，本發(fā)明的雙鏈RNA(以下也稱為"RiboxX-siRNA")設(shè)計的原理示意圖。以19個核苷酸的雜多聚序列為例。種子區(qū)域使用方框突出標(biāo)記。Tuschl-siRNA的特征在于長度為19-25個核苷酸， 并在其3’端具有2個核苷酸的突出部分。Blimt-SiRNA不具有突出部分，長度為19-25個核苷酸。RiboxX-siRNA(優(yōu)選為1846個核苷酸)在其反義鏈(引導(dǎo)鏈)的3’端與正義鏈(過客鏈)的5’端具有鳥嘌呤/胞嘧啶堿基配對，優(yōu)選長度為3-10個核苷酸。在過客鏈的3’端可能具有突出部分，優(yōu)選為1-5個核苷酸。本發(fā)明中的小干擾RNA分子，與種子區(qū)域(使用方框突出標(biāo)記)內(nèi)的堿基配對相比，其反義鏈(引導(dǎo)鏈)的3’端與正義鏈(過客鏈)的5’端的熱力學(xué)穩(wěn)定性得到增強。該熱力學(xué)穩(wěn)定性反過來使得通過RISC復(fù)合物對 RiboxX-siRNA的合成以及隨后反義鏈的裝載效率更高。圖2是本發(fā)明中的小干擾RNA(〃 RiboxX-siRNA")，具有EP 1407044B1中公開的設(shè)計的(“Tuschl-siRNA")小干擾RNA以及平末端小干擾RNA(“ Blunt-siRNA") 的熔點實驗的示意圖，從而比較其熱力學(xué)穩(wěn)定性。以19個核苷酸長度的雜多聚序列為例。 種子區(qū)域采用方框突出標(biāo)記。該熱力學(xué)穩(wěn)定性通過雙鏈RNA(dsRNA)的熔點(Tm)來評估。 Tm是通過雙鏈RNA與STOR-Green溫育后采用LightCycler (羅氏診斷股份有限公司，德國曼海姆)進行測定的。STOR-Green是一種與雙鏈RNA結(jié)合而不能與單鏈RNA(ssRNA)結(jié)合插入的熒光染料。隨著反應(yīng)溫度的升高，到達dsRNA-雜合體的Tm值，dsRNA熔解，釋放出 STOR-Green，隨后通過LightCycler測量的熒光減弱。作為微分方程的曲線積分使得作為波峰的Tm值得到精確測量。VC表示病毒對照。圖3是用于本發(fā)明中的小干擾RNA(" RiboxX-siRNA “)與相應(yīng)的具有EP 1 407 044B1中公開的設(shè)計的現(xiàn)有小干擾RNA(〃 Tuschl-siRNA")的定性分析的蛋白質(zhì)印跡分析對比照片。以19個核苷酸長度的雜多聚序列為例。種子區(qū)域采用方框突出標(biāo)記。 RiboxX-siRNA的活性通過病毒侵染模型進行評估。第一步，單層細胞(CRFK-CeIIs)采用小干擾RNA或不采用小干擾RNA預(yù)侵染4小時。然后，使用貓科杯狀病毒的病毒最小滴定量侵染單層細胞(CRFK-CeIIs)。第二步，對細胞的或者病毒的蛋白進行純化，然后用于蛋白質(zhì)印記分析，分別采用針對NS7-聚合酶或者貓科杯狀病毒的VPl-衣殼基因的特異性抗體。(A) NS7-聚合酶基因與貓科杯狀病毒的VPl-衣殼基因經(jīng)過Tuschl-siRNA (簡寫為T_siRNA)處理后表達的敲除情況的蛋白質(zhì)印跡分析。(B)NS7-聚合酶基因與貓科杯狀病毒的VPl-衣殼基因經(jīng)過RiboxX-siRNA處理后表達的敲除情況的蛋白質(zhì)印跡分析。圖4是用于比較本發(fā)明中的小干擾RNA ( 〃 RiboxX-siRNA “)與具有EP 1407044B1中公開的設(shè)計的小干擾RNA(〃 Tuschl-siRNA")的敲除活性的定量分析的實驗結(jié)果示意圖。以19個核苷酸長度的雜多聚序列為例。種子區(qū)域采用方框突出標(biāo)記。 RiboxX-siRNA的活性通過病毒侵染模型(貓科杯狀病毒)進行評估。第一步，單層細胞 (CRFK-CeIIs)采用小干擾RNA或不采用小干擾RNA預(yù)侵染4小時。然后，使用貓科杯狀病毒的病毒最小滴定量侵染單層細胞(CRFK-CeIIs)。第二步，細胞或者病毒RNA經(jīng)過提取，純化，然后用于病毒基因組的實時定量PCR。病毒RNA的數(shù)值采用管家基因(house-ke印ing gene)作為標(biāo)準(zhǔn)對照，此處采用β-actin。(A)當(dāng)被侵染的單層細胞使用EP 1 407044B1中公開的小干擾RNA(" Tuschl-siRNA")進行處理時實時定量PCR顯示病毒基因組的表達下降50%。EC50 (在50%的試驗中敲除病毒RNA表達的有效濃度)設(shè)置為2 μ M。4次獨立的測量值的平均值+/-SEM如圖所示。(B)當(dāng)被侵染的單層細胞使用RiboxX-siRNA進行處理時，實時定量PCR顯示病毒基因組的劑量依賴性下降。4次獨立的測量值的平均值+/-SEM 如圖所示。VC表示病毒對照。測量的本發(fā)明中小干擾RNA顯示EC50值僅為0. 05uM,與具有現(xiàn)有技術(shù)(特別是EP 1 407 044B1)中設(shè)計的小干擾RNA的EC50值相比下降40倍。圖5是本發(fā)明的又一小干擾RNA(〃 RiboxX-siRNA “)與具有EP 1407044B1 中公開的設(shè)計的小干擾RNA(" Tuschl-siRNA")相比的蛋白質(zhì)印跡分析照片，用于敲除活性的評估。其中各小干擾RNA采用相同的濃度，為20nM。以19個核苷酸長度的雜多聚序歹Ij (分別為RxX-RNA-I至RxX-RNA-5以及T-RNA-I至T-RNA-5)為例。本發(fā)明的小干擾RNA活性通過病毒侵染模型(人鼻病毒1B，HRV1B)進行評估。(A)經(jīng)過20nM的 RiboxX-siRNA (RxX-siRNA-1至RxX_siRNA-5)處理的VP1 -衣殼基因的表達敲除活性的蛋白質(zhì)印跡分析。以細胞基因(β-actin)的表達作為對照。(B)經(jīng)過20nM的現(xiàn)有技術(shù)小干擾RNA (Τ-siRNA-l至T_siRNA_5)處理的HRVlB的VPl-衣殼基因的表達敲除活性的蛋白質(zhì)印跡分析。以細胞基因(β-actin)的表達作為對照。細胞對照指的是細胞未被病毒感染，病毒對照指的是細胞被病毒感染(感染復(fù)數(shù)為0.0 但是并未使用小干擾RNA進行處理。標(biāo)記分子量標(biāo)記如圖中所示。圖6是本發(fā)明中的小干擾RNA ( ‘‘ RiboxX-siRNA ‘‘)與現(xiàn)有技術(shù)中具有EP 1407044B1公開的設(shè)計的小干擾RNA(〃 Tuschl-siRNA “)相比較，經(jīng)過溴化乙錠染色之后的聚丙烯酰胺凝膠電泳的照片，用于血清穩(wěn)定性的評估。為了評估小干擾RNA對血清RNAses的抗性，本發(fā)明的設(shè)計的小干擾RNA(RX-SiRNA)或現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計的小干擾 RNA(T-SiRNA)與胎牛血清㈧或者鼠血清⑶溫育，然后在指定時間點取出，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。
具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例進行進一步闡述，但不局限于此。例1 本發(fā)明中的雙鏈RNA與現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計的序列對比以下實驗(結(jié)果如圖2至圖4所示)中所使用的小干擾RNA的正義鏈與反義鏈序列如下所示“ Tuschl-"或者〃 T-siRNA"(比較的小干擾 RNA)_ιΕ義鏈(5' -3'方向):acucugagcuucgugcuuaTT(SEQ ID NO 1)- β. ^ Ijl (5' -3' TJ 1 ) :uaagcacgaagcucagaguTT (SEQ ID NO 2) “ blunt-siRNA"(比較的 siRNA)-正義鏈(5，-3，方向):acucugagcuucgugcuua(SEQ ID NO :3)-反義鏈(5，-3，方向):uaagcacgaagcucagagu (SEQ ID NO: 4)" RiboxX-siRNA"(本發(fā)明的小干擾 RNA):-正義鏈(5，-3，方向):GGGGGacucugagcuucgugcuua(SEQID NO :5)-反義鏈(5，-3，方向):uaagcacgaagcucagaguCCCCC(SEQID NO :6)上述小干擾RNA以貓科杯狀病毒FCV/DD/2006/GE (GenBank登錄號DQ424892)的病毒基因組的5' -UTR(未翻譯區(qū))為靶基因，對應(yīng)于病毒基因組的位點四-47。例2 本發(fā)明的小干擾RNA比現(xiàn)有技術(shù)的小干擾RNA的熱穩(wěn)定性增強為了測量Tm值，如例1所述的正義與反義RNA鏈分別退火，然后雙鏈RNA與 SYBRGreen(Invitrogen)溫育。退火反應(yīng)體系總體積為16 μ L，包含4 μ L正義RNA鏈(1 μ g/ μ L)以及 4 μ L 反義 RNA 鏈(1 μ g/ μ L)，3 μ L 退火緩沖液(Tris-Cl pH 7. 8，NaCl 150mM)， 以及5 μ L不含RNA聚合酶以及DNA聚合酶的水。該反應(yīng)在65°C溫育30分鐘，然后冰浴15 分鐘。8 μ L 退火的雙鏈 RNA 與 2. 5 μ L SYBR Green (invitrogen)以及 14. 5 μ L 不含 RNA 聚合酶以及DNA聚合酶的水，總體積為25 μ L進行溫育。然后該反應(yīng)在LightCycler (羅氏)上繼續(xù)進行，并在Fl通道下從37°C直到95°C下進行熒光強度的實時測量。該熒光曲線以根據(jù)時間變化的熒光的微分方程被積分(如圖2所示)。圖 2 示出了與現(xiàn)有技術(shù)小干擾 RNA(Blunt-siRNA :55. 39 "C ‘Tuschl-siRNA 62. 08°C )相比，本發(fā)明中的 RNAC RiboxX-siRNA")的 Tm 值得到了提高(71. 82°C )。
例3 本發(fā)明的小干擾RNA的敲除病毒活性單層細胞(CRFK-Cells，培養(yǎng)于六孔板中，每孔300，000個細胞)經(jīng)過或者未經(jīng)例 1中所示的小干擾RNA(T-siRNA和RiboxX-siRNA)進行4小時預(yù)侵染處理。然后，使用貓科杯狀病毒的病毒最小滴定量(750-1250TCID50/ml)侵染單層細胞(CRFK-Cells)。第二步，提取并純化細胞以及病毒蛋白。因此，在棄去轉(zhuǎn)染過的細胞的上清液之后，加入600 μ L 2χΡΡΡ-緩沖液溶解單層細胞。然后經(jīng)過QIAShredder (Qiagen)離心，并在13，OOOrpm下離心2分鐘收集細胞裂解物，然后再向其中加入600 μ L蒸餾水95°C溫育5分鐘。為了進行蛋白質(zhì)印跡分析，將80 μ L細胞裂解物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到HybondECL硝化纖維膜上。然后將薄膜在4°C下與PBS/0. 吐溫20，以及5%脫脂奶粉在4°C下溫育16小時，然后以兔多克隆抗體(anti-NS7或者anti-VPl-衣殼)為一抗室溫下溫育2小時，再用PBS/0. 吐溫20清洗3次，然后加入二抗與辣根過氧化物酶。根據(jù)制造商關(guān)于LAS-3000Biolmager(FujiFilm)的說明書使用超級ECL發(fā)光試劑盒(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce))進行測定。例4 本發(fā)明的小干擾RNA應(yīng)用于病毒侵染模型比現(xiàn)有技術(shù)小干擾RNA效率更高例1中T-siRNA與RiboxX-siRNA的抗病毒活性采用例3中所述的病毒侵染模型進行定量分析。單層細胞(CRFK-CeIIs，培養(yǎng)于六孔板中，每孔300，000個細胞)分別經(jīng)過或者未經(jīng)T-siRNA and RiboxX-siRNA進行4小時預(yù)侵染處理。然后，使用貓科杯狀病毒的病毒最小滴定量侵染單層細胞(CRFK-Cells)。分別如圖4A和圖4B中所示。第二步，使用RNAeasy Mini kit (Qiagen)對細胞以及病毒蛋白進行提取，純化，然后用于病毒基因組的實時定量 PCR0病毒RNA的數(shù)值采用管家基因作為標(biāo)準(zhǔn)對照，此處使用β-actin。實時定量PCR包括反轉(zhuǎn)錄步驟，以及其后的聚合酶鏈反應(yīng)。為了進行反轉(zhuǎn)錄，目標(biāo)RNA與β-actin信使 RNA均使用oligo (dT) 20進行轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液(20 μ L)包含5 μ L RNA模板，4 μ L 5x Superscript-緩沖液，dATP, dCTP, dGTP 和 dTTP 各 0. 4mM, 1 μ Loligo (dT) 20,以及 1 μ L Superscript III(200U/y 1, hvitrogen)，不含核糖核酸酶與脫氧核糖核酸酶的水補足至 20 μ L0該反轉(zhuǎn)錄在50°C下進行60分鐘。為了對病毒RNA進行擴增，實時PCR實驗采用羅氏LightCycler 1.5(羅氏診斷股份有限公司)。反應(yīng)總體積為20 μ L，包括4. 8yL MgCI2，前引物與后引物(5pmol/yL)各 2 μ L，2 μ L TaqMan探針(2pmol/ μ L)，以及2 μ L羅氏熱啟動反應(yīng)混合液，不含核糖核酸酶與脫氧核糖核酸酶的水補足至20 μ L。反應(yīng)中各加入5 μ L模板。PCR循環(huán)條件為95°C下預(yù)溫育10min，61°C下退火5秒，72°C下延伸5秒。在延伸步驟的最后，測量560至640nm(Fl/ F2)下熒光信號。為了完成反應(yīng)，將毛細管冷卻至40°C下aiiin。各樣品的交點值得到測量。 此外，管家基因β-actin的PCR特異性作為內(nèi)部對照。相似地，各樣品的交點值得到測量。如EC50值(如圖4所示)顯示，本發(fā)明的小干擾RNA與現(xiàn)有技術(shù)的小干擾RNA相比，在本實驗條件下其效率要高出40倍。例5 本發(fā)明的又一小干擾RNA與現(xiàn)有技術(shù)的又一小干擾RNA的序列對比使用于以下實驗(結(jié)果如圖5，圖6所示)中的小干擾RNA的正義鏈(過客鏈)與
反義鏈(引導(dǎo)鏈)的序列如下表所示
權(quán)利要求
1.一種能夠進行目標(biāo)特異性RNA干擾的分離的雙鏈RNA分子，在其過客鏈的5’端與引導(dǎo)鏈的3’端具有至少3個鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對。
2.如權(quán)利要求1所述的RNA分子，其特征在于，在其過客鏈的5’端與引導(dǎo)鏈的3’端具有3-10個鳥嘌呤/胞嘧啶堿基對。
3.如權(quán)利要求1或2所述的RNA分子，其特征在于，在其過客鏈的5’端具有3-10個鳥嘌呤核苷酸，在其引導(dǎo)鏈的3’端具有3-10個胞嘧啶核苷酸，反之亦然。
4.如前面任一項權(quán)利要求所述的RNA分子，其特征在于，過客鏈上具有1-5個核苷酸的 3’ -突出部分。
5.如權(quán)利要求4所述的RNA分子，其特征在于，突出部分與熒光團或發(fā)色團相連。
6.如前面任一項權(quán)利要求所述的RNA分子，其特征在于，除了鳥嘌呤/胞嘧啶序列與過客鏈上可選擇的3’ -突出部分，過客鏈與引導(dǎo)鏈的長度為1016個核苷酸。
7.如前面任一項權(quán)利要求所述的RNA分子，其特征在于，過客鏈的5’端終端的核苷酸在核糖的5’處具有一個單磷酸基團。
8.如權(quán)利要求1-6任一項所述的RNA分子，其特征在于，過客鏈的5’端終端的核苷酸在核糖的5’處具有一個三磷酸基團。
9.一種制備如前面任一項權(quán)利要求所述的分離的雙鏈RNA分子的方法包括以下步驟(a)制備過客鏈和引導(dǎo)鏈，該過客鏈的5’端具有至少3個鳥嘌呤以及/或者胞嘧啶核苷酸序列，可選擇地在該過客鏈3’端具有1-5個核苷酸的突出部分，該引導(dǎo)鏈的5’端具有至少3個鳥嘌呤以及/或者胞嘧啶核苷酸序列，其特征在于，在過客鏈的5’端的至少3個鳥嘌呤以及/或者胞嘧啶核苷酸序列與在引導(dǎo)鏈的3’端的至少3個鳥嘌呤以及/或者胞嘧啶核苷酸序列互補；(b)將過客鏈與引導(dǎo)鏈在形成雙鏈RNA分子的條件下結(jié)合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，過客鏈與引導(dǎo)鏈由化學(xué)合成法制備。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，過客鏈與引導(dǎo)鏈由酶法制備。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，過客鏈與引導(dǎo)鏈由RNA-依賴型RNA聚合酶制備，優(yōu)選為從杯狀病毒中得到的RNA-依賴型RNA聚合酶。
13.一種進行目標(biāo)特異性RNA干擾的方法，包括將一個真核細胞或有機體與如權(quán)利要求1-8任一項所述的雙鏈RNA分子接觸，其特征在于，所述細胞或者有機體含有與雙鏈RNA 分子的過客鏈具有至少70%的序列一致性的RNA。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，雙鏈RNA分子被引入細胞或有機體內(nèi)。
15.將如權(quán)利要求1-8任一項所述的RNA分子在基礎(chǔ)或應(yīng)用科學(xué)中用作藥物，診斷工具或者實驗性研究的分子工具的應(yīng)用。
16.一種藥物組成，包括如權(quán)利要求1-8任一項所述的RNA分子，以及至少一種藥物載體，賦形劑以及/或者稀釋劑。
17.被如權(quán)利要求1-8任一項所述的RNA分子或其編碼的DNA分子轉(zhuǎn)染的真核細胞或真核非人體有機體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小干擾RNA分子(siRNAs)，與種子區(qū)域內(nèi)的堿基配對相比，其反義鏈(引導(dǎo)鏈)的3’端與正義鏈(過客鏈)的5’端的熱力學(xué)穩(wěn)定性分別得到增強。本發(fā)明涉及的小干擾RNA分子對于靶基因具有更強的敲除活性，并且對RNAses的抗性更高，特別是對血清RNAses。本發(fā)明還涉及了一種制備該小干擾RNA分子的方法，一種利用本發(fā)明的這種改進的小干擾RNA分子進行目標(biāo)特異性RNA干擾的方法，以及含有這種小干擾RNA分子的藥物組合物。
文檔編號A61K31/7088GK102333869SQ201080008916
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者雅克·羅哈耶姆 申請人:里博克斯艾克斯有限公司