專(zhuān)利名稱(chēng)::糖尿病和代謝綜合征的治療的制作方法糖尿病和代謝綜合征的治療本發(fā)明涉及用于治療糖尿病(I型和II型)和代謝綜合征的材料和方法。全世界大約有2.5億糖尿病患者,預(yù)計(jì)該數(shù)字在未來(lái)二十年將翻倍。超過(guò)90%的該人群患有2型糖尿病(T2DM,type2diabetesmellitus)。據(jù)估計(jì),對(duì)患有T2DM的或處于顯性T2DM前的階段的人,目前僅診斷出其中的50-60%。T2DM是異質(zhì)性(heterogeneous)疾病,其特征為糖和脂肪代謝異常。T2DM的病因是多因素的,包括影響β-細(xì)胞功能和組織(例如肌肉、肝、胰和脂肪組織)中胰島素敏感性的遺傳和環(huán)境要素兩者。因此,觀察到胰島素分泌的減少,并伴有進(jìn)展性的細(xì)胞功能降低和慢性胰島素抵抗。胰內(nèi)分泌無(wú)力補(bǔ)償外周胰島素抵抗導(dǎo)致了高葡萄糖血癥和臨床上糖尿病的發(fā)病。目前認(rèn)為,組織對(duì)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取的抵抗是T2DM的主要病理生理決定因素。最佳T2DM干預(yù)的成功標(biāo)準(zhǔn)是血液葡萄糖水平的降低,其可以是血液葡萄糖水平的長(zhǎng)期降低和耐受食物攝入后高血液葡萄糖水平的能力提高兩者,它們由較低的葡萄糖水平峰值和較快的清除來(lái)描述。在這兩種情況下,對(duì)β-細(xì)胞胰島素輸出與功能的壓力都較小??刂芓2DM的一種方法是使用腸促胰島素激素(incretinhormone)、胰高血糖素樣肽Kglucagon-likePeptide1,GLP-1)和葡萄糖依賴(lài)性胰島素釋放多肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptide,GIP),W泌細(xì)胞產(chǎn)生的,它們刺激胰島素的產(chǎn)生。GLP-I作為糖尿病的臨床治療是無(wú)效的,因?yàn)樗捏w內(nèi)半衰期非常短。腸促胰島素的藥理合成的例子是艾塞那肽(Exenatide)和利拉魯肽(Liraglutide),其表現(xiàn)出類(lèi)似于人GLP-I的生物學(xué)特性,但半衰期更長(zhǎng)。然而,這些GLP-I類(lèi)似物與幾種副作用相關(guān),例如,罕見(jiàn)但卻危險(xiǎn)的患胰腺炎的副作用和心血管作用。1988年提交的ΕΡ0309100指出胰淀素(amylin)可與胰島素一起分泌,并根據(jù)其提出了用于治療I型糖尿病的包含胰淀素激動(dòng)劑(例如胰淀素本身和胰島素)的腸胃外組合物。所提出的胰淀素的作用是防止作為胰島素治療作用而發(fā)生的低血糖。據(jù)稱(chēng)胰淀素降低糖原合成的速率。Gomez-Foix等報(bào)道,胰淀素和CGRP在分離的大鼠肝細(xì)胞中發(fā)揮抗胰島素作用,補(bǔ)充了之前胰淀素和CGRP抑制胰島素分泌的報(bào)道。W089/06135提出,阻斷胰淀素作用的化合物(胰淀素拮抗劑)在治療II型糖尿病中有用??捎米饕鹊硭剞卓箘┑幕衔锸且鹊硭丶?dòng)劑的交聯(lián)形式。據(jù)稱(chēng)胰淀素具有使胰腺β細(xì)胞釋放更少胰島素的作用,并且通過(guò)使肌肉細(xì)胞對(duì)胰島素信號(hào)不應(yīng)答,胰淀素還使骨骼肌的基礎(chǔ)糖原合成和胰島素刺激糖原合成均大幅減少。W093/10146公開(kāi)了某些用于治療I型糖尿病和低血糖的用作腸胃外試劑的胰淀素激動(dòng)劑。據(jù)稱(chēng)在I型糖尿病中,胰淀素水平嚴(yán)重降低或不存在。同樣,建議用胰淀素激動(dòng)劑來(lái)預(yù)防胰島素治療所引起的低血液葡萄糖。EP0717635B1/W095/07098提出胰淀素具有升高血糖的作用,但公開(kāi)了其也可降低胃動(dòng)力和減緩胃排空,從而降低而非提高餐后血漿葡萄糖水平。因此,該文件教導(dǎo)了用于該目的的胰淀素激動(dòng)劑,但特別排除了降鈣素。US7399744公開(kāi)了胰淀素或胰淀素激動(dòng)劑用于調(diào)節(jié)身體脂肪的用途。在測(cè)試中,用滲透泵給大鼠遞送的胰淀素使高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的體重增加減少。給出降鈣素(包括硬骨魚(yú)降鈣素)作為適合的激動(dòng)劑實(shí)例,但沒(méi)有給出與其用途相關(guān)的數(shù)據(jù)。因此,目前認(rèn)為可注射的胰淀素是T2DM血糖控制的可行方法,因?yàn)槠錆撛诘匾种撇秃笠雀哐撬胤置诤臀概趴?,減少食物攝入,并因此生理性調(diào)節(jié)糖的吸收。一種胰淀素類(lèi)似物普蘭林肽O^ramlintide)(或Symlin)已被批準(zhǔn)用于治療也使用胰島素的1型和2型糖尿病患者。普蘭林肽治療降低平均血糖水平,并顯著降低了糖尿病患者餐后血糖的病理性升高。普蘭林肽治療也使體重降低,并允許患者使用更少的胰島素。US2009/0018053簡(jiǎn)要地提出了在胃腸道中釋放普蘭林肽用于治療糖尿病的普蘭林肽腸溶包衣制劑。胰淀素是降鈣素家族的一部分,降鈣素家族由降鈣素、α-降鈣素基因相關(guān)肽(a-calcitoningene-relatedpeptide,αCGRP)、βCGRP、腎上腺髓質(zhì)素和胰淀素組成。這組獨(dú)特的肽共有具有N末端二硫橋環(huán)的保守三級(jí)結(jié)構(gòu)[Hay2003BrJWiarmacol]。在哺乳動(dòng)物中,這些肽通過(guò)兩個(gè)密切相關(guān)的II型GPCR(降鈣素受體和降鈣素受體樣受體)和三個(gè)獨(dú)特的受體活性調(diào)節(jié)蛋白(receptoractivity-modifyingprotein,RAMP)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[HayRegulPept2003]。因此,由于受體共享和趨異進(jìn)化,使用這些小信號(hào)分子的任一種可對(duì)多種器官產(chǎn)生更多效的作用。降鈣素(calcitonin,CT)是由甲狀腺的濾泡旁細(xì)胞(C細(xì)胞)產(chǎn)生的天然肽激素,其分泌應(yīng)答于血清中的鈣過(guò)量。CT通過(guò)直接結(jié)合到破骨細(xì)胞表面上其的受體來(lái)減少破骨細(xì)胞重吸收。CT被批準(zhǔn)用于骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥、佩吉特氏病(Paget’sdisease)的治療,所述疾病都涉及加速的骨轉(zhuǎn)換。最近在文獻(xiàn)中描述了降鈣素的一種口服形式。已有很多關(guān)于在動(dòng)物和人中(可能除了在I型糖尿病患者中)施用降鈣素產(chǎn)生致糖尿病作用的報(bào)道。首先對(duì)于動(dòng)物和體外研究,Lupulescu在1974年報(bào)道,無(wú)論是每天一次施用或三次施用一個(gè)月,給兔注射施用大劑量(600MRCU/月或50MRCU/單劑量)的合成鮭魚(yú)降鈣素引起禁食后測(cè)定的葡萄糖水平顯著降低。其機(jī)制目前未知,并且尚無(wú)在葡萄糖耐量測(cè)試后或正常飼喂期間/之后對(duì)葡萄糖水平的作用的研究。他們提出當(dāng)給大鼠、兔或小鼠施用豬降鈣素時(shí),Aldred等1968未觀察到類(lèi)似結(jié)果。Greeley在1989年報(bào)道,對(duì)大鼠腦室內(nèi)施用鮭魚(yú)降鈣素增加葡萄糖刺激的胰島素釋放,然而,葡萄糖的血漿水平不只依賴(lài)于胰島素,其他研究(如下)提示,除了增加胰島素之外,降鈣素也增加胰高血糖素水平,其超過(guò)了胰島素增加的影響從而造成葡萄糖水平的升高。Pittner在1997年報(bào)道,對(duì)大鼠肝細(xì)胞和其他細(xì)胞測(cè)試胰淀素、降鈣素基因相關(guān)肽或者大鼠或鮭魚(yú)降鈣素時(shí)幾乎沒(méi)有作用。Yoimg等在1995年報(bào)道,在大鼠和小鼠中,以靜脈內(nèi)推注注射鮭魚(yú)降鈣素導(dǎo)致空腹血漿葡萄糖的升高,大鼠降鈣素的作用較小。在低血糖大鼠中,降鈣素比胰高血糖素產(chǎn)生更大的血糖恢復(fù),而聯(lián)合使用時(shí),其協(xié)同增加胰高血糖素所產(chǎn)生的血糖恢復(fù)。Yoimg在2005年總結(jié)了在動(dòng)物中胰淀素(詳細(xì)總結(jié))和鮭魚(yú)降鈣素(總結(jié)內(nèi)容較少)對(duì)葡萄糖和乳糖水平的作用。他報(bào)道了對(duì)禁食動(dòng)物腸胃外施用胰淀素和鮭魚(yú)降鈣素均導(dǎo)致葡萄糖水平升高,降鈣素產(chǎn)生更強(qiáng)的葡萄糖增加作用,但該作用在人類(lèi)中輕微或不存在。他還報(bào)道,在臨對(duì)大鼠進(jìn)行口服糖耐量測(cè)試之前腸胃外施用胰淀素降低葡萄糖的增加。因此在這方面顯然的是,胰淀素和鮭魚(yú)降鈣素在大鼠中表現(xiàn)不同,如已公認(rèn)的那樣,腸胃外施用降鈣素在口服糖耐量測(cè)試中產(chǎn)生增加的葡萄糖最大值。Chelikani等在2007年報(bào)道,通過(guò)輸注或重復(fù)注射對(duì)動(dòng)物慢性施用食欲抑制物對(duì)食物攝入或體重未產(chǎn)生持久的作用。盡管急性腸胃外施用鮭魚(yú)降鈣素在大鼠或小鼠中誘導(dǎo)了短期食物攝入的強(qiáng)降低,但該作用僅持續(xù)了3天。然而B(niǎo)ello等在2008年報(bào)道,在恒河猴中,腸胃外施用的鮭魚(yú)降鈣素在整個(gè)5天施用期間的確降低了食物攝入。然后對(duì)于在人中進(jìn)行的研究,Ziegler等(197報(bào)道,在健康的受試者中,輸注合成的人降鈣素對(duì)葡萄糖吸收和胰島素產(chǎn)生有顯著的減弱。Blahos等在1976年報(bào)道,對(duì)健康志愿者肌肉內(nèi)施用鮭魚(yú)降鈣素在早晨禁食期間抑制血液葡萄糖的降低,并使得葡萄糖耐量測(cè)試結(jié)果變差。Petralito等(1979)報(bào)道,在人隱性糖尿病的病例中,證實(shí)輸注鮭魚(yú)降鈣素能夠降低血清胰島素水平并增加血液葡萄糖。Giugliano等在1980年報(bào)道,盡管之前認(rèn)為急性施用降鈣素在正常、肥胖和糖尿病前的人對(duì)象中有損葡萄糖耐量,但是對(duì)胰島素依賴(lài)的糖尿病患者靜脈內(nèi)輸注施用鮭魚(yú)降鈣素消除了正常情況下在精氨酸耐受測(cè)試中所見(jiàn)葡萄糖升高,并且一旦停止降鈣素的輸注,葡萄糖水平立即反彈。Gattereau等(1980)報(bào)道,給骨佩吉特氏病患者注射施用鮭魚(yú)降鈣素或人降鈣素引起了血清葡萄糖的立即中度增加和血清胰島素的輕微降低。I^assariello等(1981)報(bào)道,對(duì)人肌肉內(nèi)施用合成的鮭魚(yú)降鈣素在正常人中引起對(duì)葡萄糖耐量測(cè)試應(yīng)答的減弱,并在患有IGT的對(duì)象中引起對(duì)葡萄糖耐量的進(jìn)一步削弱。觀察到了血漿葡萄糖曲線下總的葡萄糖面積約加倍。Starke等在1981年報(bào)道,輸注了鮭魚(yú)降鈣素的正常人志愿者產(chǎn)生了循環(huán)胰高血糖素水平的降低和血清胰島素的降低,由于胰高血糖素降低被胰島素降低的作用所掩蓋,凈效應(yīng)預(yù)期是葡萄糖降低。然而,在胰島素依賴(lài)的糖尿病患者中,鮭魚(yú)降鈣素引起了葡萄糖水平的降低和胰高血糖素的降低。Giugliano等(1982)報(bào)道了對(duì)患有骨佩吉特氏骨病或明顯骨質(zhì)疏松的患者長(zhǎng)期O個(gè)月)施用100MRC單位/天的鮭魚(yú)降鈣素的結(jié)果。伴隨治療,葡萄糖糖耐量沒(méi)有顯著惡化(盡管觀察到葡萄糖峰值的非顯著升高),但是基礎(chǔ)血漿葡萄糖顯著增加。胰島素對(duì)葡萄糖施用應(yīng)答的第一個(gè)10分鐘中所述應(yīng)答被降鈣素削弱。Giustina等(1985)調(diào)查了對(duì)患有骨佩吉特氏病、特發(fā)性骨質(zhì)疏松或Sudeck氏骨營(yíng)養(yǎng)不良的患者中每天兩次肌肉內(nèi)施用100MRC單位鮭魚(yú)降鈣素的短期(15天)作用。所述患者中有些是非胰島素依賴(lài)性糖尿病患者,也接受抗糖尿病治療?;旌喜痛碳ず?,未觀察到短期肌肉內(nèi)sCT治療引起糖代謝的明顯變化。在包括的三個(gè)糖尿病患者中在晚間觀察到了葡萄糖水平的非顯著性降低。Zofkova(1987-Exp.Clin.Endocrinol)發(fā)現(xiàn),在OGTT中通過(guò)靜脈內(nèi)輸注給以IOOU的降鈣素引起血糖在最初較慢的上升之后維持高血糖。將此解釋為是由于對(duì)肝中葡萄糖吸收和代謝的干擾。還觀察到了降鈣素對(duì)胰島素分泌的抑制作用。Zofkova(1987-Horm.Metabol.Res.)研究了在健康志愿者中兩種劑量(50和100U)的鮭魚(yú)降鈣素對(duì)血液葡萄糖水平的作用,并發(fā)現(xiàn)在兩種劑量水平下與上述結(jié)果相似的結(jié)果。Mangiafico(1988)發(fā)現(xiàn),在一個(gè)三周的方案中對(duì)患有高血壓或患有非胰島素依賴(lài)性糖尿病或糖耐量受損的對(duì)象以IOOU/天聯(lián)合施用硝苯地平和鮭魚(yú)降鈣素,在所有的時(shí)間中均產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的血糖升高。Jonderko(1989)發(fā)現(xiàn),在患有十二指腸潰瘍的患者中,62.26pmol/kg的鮭魚(yú)降鈣素消除了餐后胰島素的釋放,并伴有降鈣素的輸注期間血清葡萄糖的相應(yīng)升高。Young(2005)報(bào)道,在大鼠、犬和人中,伴隨膳食施用胰淀素抑制血漿葡萄糖的升高,但在沒(méi)有膳食的情況下,在嚙齒動(dòng)物中胰淀素的施用與血漿葡萄糖升高有關(guān),但在人中不是這樣。總之,上述對(duì)患有非胰島素依賴(lài)性糖尿病或葡萄糖耐量受損的人腸胃外施用的作用的研究確鑿地證實(shí)施用降鈣素沒(méi)有治療效益。我們調(diào)查了經(jīng)腸施用CT是否能夠改善高血糖狀態(tài),并提供改善的血糖控制。在表現(xiàn)出T2DM幾種特征的膳食誘導(dǎo)肥胖(DIO,dietinducedobese)大鼠中,我們比較了鮭魚(yú)CT口服制劑的推定作用與公認(rèn)的PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮的作用。最后,我們調(diào)查了健康成體大鼠中降鈣素對(duì)葡萄糖控制的作用。我們意外地發(fā)現(xiàn)如在下文中進(jìn)行描述和說(shuō)明的,口服施用降鈣素與以前公開(kāi)的注射或輸注的降鈣素產(chǎn)生基本相反的作用。相反,胰島素(例如其也能口服或注射施用)無(wú)論使用哪種途徑都提供相同類(lèi)型的作用。因此,本發(fā)明提供用于經(jīng)腸施用的藥物制劑,其用于治療I型糖尿病、II型糖尿病或代謝綜合征,或用于減輕胰島素抵抗,或用于降低不期望的高空腹血清葡萄糖水平,或用于降低不期望的高峰值血清葡萄糖水平,或用于降低不期望的高峰值血清胰島素水平,所述制劑包含活性化合物,其是除胰淀素外的降鈣素家族成員、除經(jīng)修飾胰淀素外的經(jīng)修飾降鈣素家族成員或降鈣素受體激動(dòng)劑。所述制劑還可包含能使所述活性化合物進(jìn)行有效經(jīng)腸施用的載體。優(yōu)選地,所述制劑配置成用于口服施用至消化道。優(yōu)選地,所述活性化合物是降鈣素,最優(yōu)選是鮭魚(yú)降鈣素。所述活性化合物可以是經(jīng)修飾的降鈣素家族成員,其與除胰淀素外的降鈣素成員有至少75%的氨基酸同源性,并通過(guò)相對(duì)于所述降鈣素家族成員添加、取代或刪除氨基酸而被修飾,且保留結(jié)合并激活降鈣素受體的能力。優(yōu)選地,所述載體包含5-CNAC。本發(fā)明包括I型糖尿病、II型糖尿病或代謝綜合征的治療方法,其包括向需要用其治療所述病癥的患者經(jīng)腸施用藥學(xué)有效量的藥物制劑,所述藥物制劑包含活性化合物,所述活性化合物是除胰淀素外的降鈣素家族成員、除經(jīng)修飾胰淀素外的經(jīng)修飾降鈣素家族成員或降鈣素受體激動(dòng)劑,以及任選地包含能使所述活性化合物進(jìn)行有效經(jīng)腸施用的載體。所述方法可包括確定患者是否患有所述病癥的預(yù)備步驟,和/或確定在所述患者中何種程度的所述治療能有效減輕所述病癥的后續(xù)步驟,例如,在每個(gè)病例中,進(jìn)行口服葡萄糖耐量測(cè)試或檢測(cè)靜息血糖水平(restingbloodsugarlevel)。為改善對(duì)患者體重的控制,以達(dá)成體重降低或避免體重增加,優(yōu)選每天至少施用兩次所述活性化合物,例如,每天2至4次。所述活性化合物的制劑可包含適于該施用方案的單位劑量??墒┯盟龌钚曰衔镆云诳刂普M(jìn)行糖尿病或代謝綜合征治療之患者的體重。口服經(jīng)腸制劑通過(guò)吞咽攝入,以在胃以下的腸中進(jìn)行后續(xù)的釋放,并由此通過(guò)門(mén)靜脈遞送到肝,這與含于口中使其通過(guò)舌下或頰粘膜途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到血流的制劑不同。不受理論的限制,我們推測(cè),我們?cè)诒疚闹兴鶊?bào)道的降鈣素作用根據(jù)是腸胃外施用還是經(jīng)腸施用的顯著改變可能由以下原因引起經(jīng)腸施用使降鈣素在胃吸收后立即通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝,使肝中的受體暴露于比靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用時(shí)高得多的降鈣素濃度。盡管降鈣素的半衰期短(與GLP-I的類(lèi)似),直接途徑后經(jīng)腸施用降鈣素至肝使得抗高血糖作用得以實(shí)現(xiàn)。注射和口服施用降鈣素之間的作用逆轉(zhuǎn)的潛在機(jī)制可能是足夠高濃度的降鈣素能夠作為激動(dòng)劑而作用于正常情況下被胰淀素所作用的受體,并因此可產(chǎn)生胰淀素樣作用,而在較低濃度下,降鈣素僅對(duì)產(chǎn)生高血糖作用的其他受體有效。不過(guò)其他解釋是可能的。例如,可能是口服施用這些制劑直接作用的降鈣素受體不同于那些注射的降鈣素所作用的受體,例如,在腸道本身上的受體。降鈣素在眾多物種中是高度保守的。降鈣素的示例序列如下人CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPSEQIDNO1鮭魚(yú)CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTPSEQIDNO2小鼠CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVEAPSEQIDNO3雞CASLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTPSEQIDNO4鰻魚(yú)CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTPSEQIDNO5大鼠CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVGAPSEQIDNO6馬CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAPSEQIDNO7犬-1CSNLSTCVLGTYSKDLNNFHTFSGIGFGAETPSEQIDNO8犬-2CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAPSEQIDNO9豬CSNLSTCVLSAYWRNLNNFHRFSGMGFGPETPSEQIDNO:10因此,本發(fā)明中使用的優(yōu)選物質(zhì)具有通式CXiX2LSTCX3LX4X5X6X7X8X9Xi0XiiXi2Xi3Xi4Xi5Xi6Xi7Xi8Xi9X20X21GX22X23X24PSEQIDNO:11其中X1是A、G或S;優(yōu)選S;X2是N或S;優(yōu)選N;X3是M或V;優(yōu)選V;X4是G或S;優(yōu)選G;X5是T、K或A;優(yōu)選T或K;最優(yōu)選K;X6是L或Y;優(yōu)選L;X7是T、S或W;優(yōu)選T或S;最優(yōu)選S;X8是Q、K或R;優(yōu)選Q;X9是D、E或N;優(yōu)選D或E;最優(yōu)選E;X10是F或L;優(yōu)選L;X11是N或H;優(yōu)選H;X12是K或N;優(yōu)選K;X13是F或L;優(yōu)選L;X14是H或Q;優(yōu)選Q;X15是T或R;優(yōu)選T;X16是F或Y;優(yōu)選Y;X17是P或S;優(yōu)選P;X18是Q、G或R;優(yōu)選Q或R;最優(yōu)選R;X19是T、I或M;優(yōu)選T;X20是A、N、D、S或G;優(yōu)選N;X21是1、1\¥或?;優(yōu)選1\X22是V、S、A或P;優(yōu)選V、S或A;最優(yōu)選SX23是G或E;優(yōu)選G;X24是A或T;優(yōu)選T。因此,優(yōu)選所述物質(zhì)具有式csnlstcvlgx5lx7qx9lhklqtypx18tntgx22gtpSEQIDNO12其中X5是T或K;更優(yōu)選KX7是T或S;更優(yōu)選SX9是D或E;更優(yōu)選EX18是Q或R;更優(yōu)選R;爐2是¥、3或々;更優(yōu)選5。鮭魚(yú)降鈣素是最優(yōu)選的。另外,降鈣素被公認(rèn)為肽激素家族的成員,該家族包括胰淀素、降鈣素基因相關(guān)肽、腎上腺髓質(zhì)素、垂體中間葉激素、降鈣素基因相關(guān)肽II和降鈣素受體刺激肽-1、降鈣素受體刺激肽_2、降鈣素受體刺激肽_3、降鈣素受體刺激肽-4和降鈣素受體刺激肽_5。其中,相對(duì)于其他降鈣素受體刺激肽,優(yōu)選用于本發(fā)明的是CRSP-I。這些降鈣素家族成員具有顯著程度的氨基酸序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性。這些包括氨基末端的6或7個(gè)氨基酸的二硫橋環(huán)、存在于羧基末端的C-末端酰胺化的芳香殘基和8-18或8-22位殘基的預(yù)測(cè)的兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域。來(lái)自多個(gè)物種的降鈣素家族其他成員的氨基酸序列是胰淀素Akcntatcatqrlanflvhssnnfgailsstnvgsntyseqidno13小鼠KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTYSEQIDNO:14降鈣素基因相關(guān)肽人ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGSKAFSEQIDNO:15豬SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTDVGSEAFSEQIDNO:169腎上腺髓質(zhì)素人tqaqllrvgcvlgtcqvqnlshrlwqlmgpagrqdsapvdpssphsyseqidno17豬yrqsmnnfqglrsfgcrfgtctvqklahqiyqftdkdkdgvaprskispqgyseqidno18垂體中間葉激素vgcvlgtcqvqnlshrlwqlmgpagrqdsapvdpssphsyseqidno19降鈣素基因相關(guān)肽IITacntatcvthrlagllsrsggmvksnfvptnvgskafseqidno:20Aacntatcvthrlagllsrsggmvksnfvptnvgskafseqidno-.21降鈣素受體刺激肽-1Aacntatcmthrlagwlsrsgsmvrsnllptkmgfkifngprrnswfseqidno:22山羊acntatcmthrlagwlsrsgsmvrsnllptkmgfkifsgprknfwfseqidno23犬scnsatcvahwlggllsragsvantnllptsmgfkvynseqidno:24綿羊acntatcmthrlagwlsrsgsmvrsnllptkmgfkifsgpseqidno:25Tacntatcmthrlagwlsrsgsmvrsnllptkmgfkifngpseqidno:26豬scntatcmthrlvgllsrsgsmvrsnllptkmgfkvfgseqidno:27馬scntasclthrlagllssagsmansnllptemgfkvsseqidno:28降鈣素受體刺激肽-2犬ssckdgpcvtnrlegwlaraermvkntfmptdvdpeafghqhkelaaseqidno29山羚羊scnratcvthkmagslsrsgseikrnfmstnvgskafgqseqidno:30豬scntascvthkmtgwlsrsgsvaknnfmptnvdskilseqidno:31降鈣素受體刺激肽-3犬ssckdgpcvtnrlegwlaraermvkntfmptdvdpeafghqhkelaaseqidno32豬scntaicvthkmagwlsrsgswknnfmpinmgskvlseqidno:33降鈣素受體刺激肽-4犬ssckdgpcvtnrlegwlaraermvkntfmptdvdpeafghqhkelaaseqidno34降鈣素受體刺激肽-5犬ssckdgpcvtnrlegwlaraermvkntfmpthvdpedfghqhkelaaseqidno35可以注意到,盡管由不同的基因表達(dá)且源自不同的前體肽,來(lái)自犬的成熟肽CRSP-2、CRSP-3和CRSP-4是相同的。降鈣素家族的幾個(gè)成員的序列也在圖6和7中列出。在圖6中,空白表示相關(guān)的氨基酸與所示大鼠胰淀素序列相同,印出的氨基酸代碼表示該序列在所示位置具有該氨基酸,而灰色框表示所述降鈣素沒(méi)有對(duì)應(yīng)于胰淀素23-27殘基的氨基酸。在圖7中,框出的區(qū)域是完全同源的(缺失除外),且灰色區(qū)域表示在給定序列的那些位置不存在氨基酸。不同家族成員很大程度上能夠結(jié)合并激活被降鈣素激活的相同受體,即能作為降鈣素受體(CT受體)的激動(dòng)劑。與大多數(shù)G-蛋白偶聯(lián)受體不同,CT受體可通過(guò)與三種單次跨膜的受體活性修飾蛋白(RAMP,receptoractivitymodifyingprotein)中的一種結(jié)合而被修飾。在本說(shuō)明書(shū)中,術(shù)語(yǔ)“CT受體激動(dòng)劑”是指能夠以如下定義的至少一種“測(cè)試方案”所證實(shí)的方式結(jié)合并激活所述CT受體的任何化合物,但尤其是肽。術(shù)語(yǔ)“降鈣素家族成員”是指在任何物種中天然存在的降鈣素、胰淀素、降鈣素基因相關(guān)肽、腎上腺髓質(zhì)素、垂體中間葉激素、降鈣素基因相關(guān)肽II和降鈣素受體刺激肽-1中的任一種。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的降鈣素家族成員”是指這樣的化合物,其具有相對(duì)于天然序列經(jīng)修飾的任何降鈣素家族成員的氨基酸序列,但所涉及化合物是CT受體激動(dòng)劑。修飾可出于多種原因進(jìn)行,包括為了增加化合物對(duì)CT受體的激動(dòng)劑作用、增加所述化合物的生物半衰期或幫助配制所述化合物以用于藥用(例如,通過(guò)增加其儲(chǔ)存穩(wěn)定性)。除非另有說(shuō)明,單個(gè)降鈣素家族成員的名稱(chēng)(例如,“降鈣素”)是指來(lái)自任何物種(包括以上給出降鈣素序列的每一種物種)的任何天然的該家族成員。后接單個(gè)降鈣素家族成員名稱(chēng)的術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的”是指這樣的化合物,其具有相對(duì)于天然序列被修飾的所涉及降鈣素家族成員氨基酸序列,但所涉及化合物是CT受體激動(dòng)劑。用于本發(fā)明的經(jīng)修飾降鈣素家族成員不包括經(jīng)修飾的胰淀素,并因此應(yīng)該與胰淀素有不超過(guò)50%同源性,優(yōu)選不超過(guò)30%。從圖5中會(huì)觀察到,鮭魚(yú)降鈣素在其32個(gè)氨基酸的組成上僅具有降鈣素的37個(gè)氨基酸中的10個(gè),并因此與胰淀素具有10/32*100%同源性,即27%。排除那些修飾程度使其變得“過(guò)于胰淀素樣”的降鈣素的修飾。在經(jīng)修飾的降鈣素家族成員中,接受上述氨基酸序列修飾可以是通過(guò)添加、缺失或用天然或非天然氨基酸替換。優(yōu)選地,所述經(jīng)修飾的序列與所涉及降鈣素家族成員的天然序列有至少75%的同源性,更優(yōu)選至少90%的同源性,更優(yōu)選至少95%的同源性。因此,本發(fā)明包括其中的活性化合物是經(jīng)修飾的降鈣素成員的制劑,所述經(jīng)修飾的降鈣素成員與除胰淀素外的降鈣素成員有至少75%的氨基酸同源性,并相對(duì)于所述降鈣素家族成員通過(guò)添加、替換或缺失氨基酸進(jìn)行修飾,并保留其結(jié)合并激活降鈣素受體的能力。在物種中,用于本發(fā)明的降鈣素家族成員的優(yōu)選順序是硬骨魚(yú)>鳥(niǎo)類(lèi)>非人哺乳動(dòng)物>人。降鈣素家族成員如果天然存在,則可以是天然的或是合成的(包括重組的),而如果不是天然存在的,則可以是合成的。鮭魚(yú)降鈣素在天然降鈣素中尤其優(yōu)選。測(cè)試方案為了確定候選化合物是否是降鈣素受體激動(dòng)劑,開(kāi)發(fā)了四種測(cè)試方案。在75cm2培養(yǎng)瓶中將C0S-7細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合度。用來(lái)自hvitrogen的pcDNA3.1(+)將受體編碼序列轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。使用7.8μLFuGene6試劑,以300ng的單獨(dú)的pcDNA-CTR構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(測(cè)試方案1),或以300ngpcDNA-CTR構(gòu)建體和1μgpcDNA-RAMP-1共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(測(cè)試方案2),或以pcDNA-RAMP-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞(測(cè)試方案3),或以pcDNA-RAMP-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞(測(cè)試方案4)。整合進(jìn)入pcDNA-CTR構(gòu)建體中的CTRDNA的序列是genebank編號(hào)CALCRNM_001742中給出的人降鈣素受體cDNA序列。整合進(jìn)入pcDNA-RAMP構(gòu)建體的RAMP1DNA、RAMP2DNA禾ΠRAMP3DNA的序列是如下具體genebank編號(hào)中給出的人RAMP序列。RAMPl:NM_005855RAMP2:NM_005854RAMP3:NM_00585648小時(shí)后,通過(guò)胰酶處理將細(xì)胞消化下來(lái),以500Xg離心,并重懸于環(huán)化酶緩沖液(含有0.1%(重量/體積)BSA和ImMIBMX的DMEM)中。將細(xì)胞(5XIO5)等分入1.5ml的Eppendorf管中,并在37°C下預(yù)孵育20分鐘。隨后,在不存在(基礎(chǔ))或存在濃度遞增(100微摩爾濃度、1微摩爾濃度、0.01微摩爾濃度)的激動(dòng)劑的條件下孵育18分鐘。在該系統(tǒng)中包含ImM毛喉素(Forskolin),其作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)測(cè)定最大cAMP累積。孵育后,根據(jù)cAMP-EIA試劑盒(AmershamBiosciences,US)提供的方案對(duì)細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP進(jìn)行反應(yīng)定量。如果在4個(gè)測(cè)試方案中的任一個(gè)中,其在10微摩爾濃度的濃度下誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)生比載劑對(duì)照(含有0.1%(重量/體積)BSA和ImM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)的DMEM)多50%,則認(rèn)為受試化合物是CTR激動(dòng)劑。當(dāng)以甚至1微摩爾濃度使用時(shí),sCT會(huì)產(chǎn)生(至少在測(cè)試方案1中)多于陰性對(duì)照10倍的誘導(dǎo)。因此優(yōu)選地,本發(fā)明中使用的化合物在至少一個(gè)測(cè)試方案中提供至少100%(即,2X)的誘導(dǎo),優(yōu)選至少5倍的誘導(dǎo)。或者,本發(fā)明中使用的化合物在至少一個(gè)所述方案中提供至少25%的sCT所給出的誘導(dǎo),優(yōu)選至少50%的sCT所給出的誘導(dǎo)。優(yōu)選的CTR激動(dòng)劑在至少兩個(gè)所述測(cè)試(優(yōu)選測(cè)試方案1和2或1和4)中產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果,優(yōu)選在三個(gè)測(cè)試方案(優(yōu)選1、2和4)并且最優(yōu)選在全部4個(gè)測(cè)試方案中產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果?;蛘?,優(yōu)選測(cè)試方案1中的測(cè)試化合物提供的反應(yīng)比測(cè)試方案2至4任一個(gè)中測(cè)試化合物的反應(yīng)大至少25%,更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少100%。在US5,536,812中會(huì)找到可以在本發(fā)明中使用的經(jīng)修飾的降鈣素的例子。因此,可用高絲氨酸酰胺(Hse-Μ)替換(代替)降鈣素的C-末端脯氨酸-酰胺。尤其優(yōu)選如此修飾的鮭魚(yú)或鰻魚(yú)降鈣素??扇鏕B1,590,645中教導(dǎo)的那樣通過(guò)用更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)替代Cys-Cys環(huán)元件來(lái)修飾降鈣素或其他降鈣素家族成員,所述穩(wěn)定結(jié)構(gòu)如通過(guò)用氨基辛二酸替代這些Cys殘基的第一個(gè)和第二個(gè)(一般為第一個(gè)和第七個(gè)氨基酸)來(lái)提供,這樣sCT變成SEQIDNO:36如在EP0464549所述,發(fā)揮降鈣素受體激動(dòng)劑之作用的降鈣素類(lèi)似肽可具有通式CXiNlstcx2LGX3X4X5GX6X7X8LX9XioTXiiPXi2TXi3X14GX15GX16P-X17SEQIDNO:37其中X1為Ser,Gly或Ala;X2為Val或Met;X3為T(mén)hr或Lys;X4為T(mén)yr或Leu;X5為T(mén)hr或Ser;X6為Asp或Glu;X7為Phe或Leu;X8為Asn或His;X9為T(mén)yr,Phe或Leu;X10為His或Gln;X11為T(mén)yr或Phe;X12為Gln或Arg;X13為Ala、Ser、Asn或Asp;X14為lie、Thr或Val;X15為Val、Ser或Ala;X"5為Ala、Thr或Val;和X17為酰胺化的高絲氨酸,與包含1至20個(gè)碳原子的烷基伯胺反應(yīng)的高絲氨酸-內(nèi)酯,或任選的多肽鏈,并在C-末端包含酰胺化的高絲氨酸?;蛘?,降鈣素類(lèi)似物可具有序列PO-I(CGNLSTCMLGKLSQELHKLQTYPQTAIGVGAP-NH2SEQIDNO:38),其具有人降鈣素N-和C-末端的10個(gè)氨基酸的序列以及鮭魚(yú)降鈣素的12個(gè)氨基酸的中央?yún)^(qū)域,或P0-23([環(huán)-Aspl、Lys7]-[des-Gly2]-[Leu8]-PO-1)或P0-29([Aspl5、Asnl7、Phel9、His20]-P0-23)。P0-23用Asp-Lys肽鍵構(gòu)成的環(huán)結(jié)構(gòu)替代P0-1N-末端Cys-Cys的S-S鍵以增強(qiáng)物理化學(xué)穩(wěn)定性。在PO-四中修飾了P0-23分子的中心區(qū)域,使其更接近于人降鈣素。文獻(xiàn)中已知很多其他具有降鈣素受體激動(dòng)劑特性的經(jīng)修飾降鈣素。本發(fā)明所用的降鈣素受體激動(dòng)劑包括“小分子”(非肽)激動(dòng)劑。這些例如為滿(mǎn)足經(jīng)典的成藥性規(guī)則是優(yōu)選的,因此其優(yōu)選具有如下5項(xiàng)中的至少4項(xiàng)分子量<500、IogP(其在正辛醇和水中分配系數(shù)的對(duì)數(shù),log(cw/c7K))彡5、氫鍵供體彡5、H-鍵受體(N和0原子的總數(shù))<10和任選地一個(gè)或兩個(gè)極性表面的面積<140A2(或氫鍵供體和受體的總數(shù)<12)和可旋轉(zhuǎn)鍵<10。適于本發(fā)明使用的劑型包括片劑、小片劑(minitablet)、膠囊、顆粒劑、丸劑、粉劑、泡騰固體和可咀嚼固體制劑。所述制劑可包含明膠,優(yōu)選為水解明膠或低分子量明膠。所述制劑可這樣獲得對(duì)包含降鈣素或其片段或綴合物和水解明膠或低分子量明膠的均質(zhì)水溶液進(jìn)行冷凍干燥,并進(jìn)一步將所得的固體材料加工成所述口服藥物制劑,并且其中所述明膠可具有1000至15000道爾頓的平均分子量。所述制劑可包含保護(hù)性載體化合物,例如,5-CNAC或本文中公開(kāi)的其他化合物。盡管優(yōu)選口服制劑(例如片劑和膠囊),用于本發(fā)明的組合物可以采用栓劑等形式。降鈣素(例如鮭魚(yú)降鈣素)的口服遞送是通常選擇的遞送途徑,因?yàn)橄鄬?duì)于其他遞送模式,其方便、相對(duì)容易且一般無(wú)痛,患者的順應(yīng)性更好。然而,生物、化學(xué)和物理屏障(例如胃腸道中變化的PH、強(qiáng)消化酶和活性劑不能滲透的胃腸道膜)使對(duì)哺乳動(dòng)物口服遞送降鈣素(例如,鮭魚(yú)降鈣素)存在問(wèn)題,例如,起初由于(至少部分因?yàn)?降鈣素在胃腸道中的穩(wěn)定性不足和降鈣素不易通過(guò)腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)入血流,降鈣素(其為長(zhǎng)鏈多肽激素,由哺乳動(dòng)物的甲狀腺濾泡旁細(xì)胞和鳥(niǎo)類(lèi)與魚(yú)類(lèi)的后腮腺分泌)的口服遞送被證明是困難的。而下文描述了適合的口服制劑。降鈣素和其他家族成員可通過(guò)與適合的載體化合物混合配制而用于經(jīng)腸(尤其是口服)施用。以其自身或在水溶液/懸浮液中口服施用時(shí)不能有效地產(chǎn)生骨修復(fù)作用。適合的載體化合物包括US5,773,647和US5866536中描述的那些,其中5_CNAC(N_(5_氯代水楊酰)-8-氨基辛酸,通常以其二鈉鹽使用)尤其有效。其他優(yōu)選的載體或遞送劑為SNAD(10-(2-羥基苯甲酰氨基)癸酸的鈉鹽)和SNAC(N-(8-[2-羥基苯甲酰基]氨基)辛酸的鈉鹽)。此外,WO00/059863公開(kāi)了式I1權(quán)利要求1.用于經(jīng)腸施用的藥物制劑,其用于治療i型糖尿病、ii型糖尿病或代謝綜合征,或用于減輕胰島素抵抗,或用于降低不期望的高空腹血清葡萄糖水平,或用于降低不期望的高峰值血清葡萄糖水平,或用于降低不期望的高峰值血清胰島素水平,所述制劑包含活性化合物,其為除胰淀素外的降鈣素家族成員、除經(jīng)修飾胰淀素外的經(jīng)修飾降鈣素家族成員或降鈣素受體激動(dòng)劑。2.權(quán)利要求1的制劑,其被配制用于口服施用至消化道。3.權(quán)利要求1或2的制劑,其中所述活性化合物是降鈣素。4.權(quán)利要求3的制劑,其中所述降鈣素是鮭魚(yú)降鈣素。5.權(quán)利要求1或2的制劑,其中所述活性化合物具有通式cxix2lstcx3lx4x5x6x7x8x9xi0xiixi2xi3xi4xi5xi6x17x18x19x20x21gx22x23x24pseqidno11其中x1是a、g或s;x2是n或s;x3是m或v;x4是g或s;x5是t、k或a;x6是l或y;x7是t、s或w;x8是q、k或r;x9是d、e或n;xltl是f或l;x11是n或h;x12是k或n;x13是f或l;x14是h或q;x15是t或r;x^是f或y;x17是p或s;x"^q、g或r;x19是τ、i或m;x20是a、n、d、s或g;x21是i、t、v或f;儼是g或e;爐4是六或t。6.權(quán)利要求5的制劑,其中所述活性化合物具有式csnlstcvlgx5lx7qx9lhklqtypx18tntgx22gtpseqidno12其中X5是T或K;X7是T或S;X9是D或E;Xw是Q或R;鏟2是V、S或A。7.權(quán)利要求1或2的制劑,其中所述活性化合物是經(jīng)修飾的降鈣素家族成員,其與除胰淀素外的降鈣素成員有至少75%的氨基酸同源性并且其相對(duì)于所述降鈣素家族成員通過(guò)添加、替換或刪除氨基酸而被修飾,并且其保持結(jié)合和激活所述降鈣素受體的能力。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的制劑,其中所述活性化合物與載體一起配制以用于口服施用。9.權(quán)利要求8的制劑,其中所述載體增加所述活性化合物的口服生物利用度。10.權(quán)利要求8的制劑,其中所述載體包括5-CNAC、SNAD或SNAC。11.一種方法,其用于治療I型糖尿病、II型糖尿病或代謝綜合征,或用于減輕胰島素抵抗,或用于降低不期望的高空腹血清葡萄糖水平,或用于降低不期望的高峰值血清葡萄糖水平,或用于降低不期望的高峰值血清胰島素水平,所述方法包括向需要用其治療所述病癥的患者經(jīng)腸施用藥學(xué)有效量的藥物制劑,所述藥物制劑包含活性化合物,其為除胰淀素外的降鈣素家族成員、除經(jīng)修飾胰淀素外的經(jīng)修飾降鈣素家族成員或降鈣素受體激動(dòng)劑,并任選地包含能使所述活性化合物進(jìn)行有效經(jīng)腸施用的載體。全文摘要經(jīng)腸施用的除胰淀素(amylin)外的降鈣素家族成員(尤其是降鈣素本身)有效治療I型糖尿病、II型糖尿病或代謝綜合征,減輕胰島素抵抗以及降低血清葡萄糖水平。文檔編號(hào)A61P5/50GK102369018SQ201080011177公開(kāi)日2012年3月7日申請(qǐng)日期2010年3月10日優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日發(fā)明者克勞斯·克里斯蒂安森,莫滕·阿塞爾·卡爾斯達(dá)爾申請(qǐng)人:北歐生物科技公司