專利名稱：抑制肝星狀細(xì)胞增殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制肝星狀細(xì)胞增殖的方法。
背景技術(shù)：
肝星狀細(xì)胞(HSC)通過(guò)促進(jìn)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的積累而在肝損傷后的修復(fù)過(guò)程中起重要作用?；旧希琀SC被激活成增殖性的收縮態(tài)肌成纖維細(xì)胞樣表型。這一激活過(guò)程由涉及大量細(xì)胞因子的旁分泌和自分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)共同啟動(dòng)和維持(Gressner等，2007)。旁分泌刺激取決于肝中多種不同細(xì)胞類型，例如肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和庫(kù)普弗細(xì)胞。這些細(xì)胞分泌不同細(xì)胞因子，如TGF- β U PDGF, bFGF和EGF (Friedman, 2008)。HSC據(jù)信在多種重要臨床癥狀的發(fā)病中起作用，例如，肝纖維化、肝硬化、肝門高血壓和肝癌(Geerts (2004), J. Hepatol. 40 (2) :331)。因此，HSC也已成為抗纖維化治療開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)(Bataller 等，(2001), Semin Liver Dis. 21 (3) :437 ；Bataller 等，(2005)，J. Clin Invest. 115(2) 209 ；Friedman(2003), J. Hepatol. 38 Suppl 1 :S38)。HSC激活是纖維發(fā)生中的主導(dǎo)事件。激活過(guò)程中，靜息的維生素A貯存細(xì)胞轉(zhuǎn)化成增殖性、纖維發(fā)生、促炎性收縮態(tài)“肌成纖維細(xì)胞”(Friedman0003)，J. Hepatol. 38 Suppl 1 :S38 ；Bataller 等，(2005)，J. Clin Invest. 115(2) :209 ；Cassiman 等，(2002)， J. Hepatol. 36 (2) :200)。HSC激活連續(xù)推進(jìn)，涉及細(xì)胞功能的漸變。在體內(nèi)，激活的HSC 遷移并積累到組織修復(fù)位點(diǎn)，分泌大量ECM成分并調(diào)控ECM降解(Cassiman等，(2002)， J. Hepatol. 36(2) :200)。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了抑制肝星狀細(xì)胞增殖的方法，包括直接下調(diào)肝星狀細(xì)胞中連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性。所述肝星狀細(xì)胞可以是體外或體內(nèi)的，可以受到肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病影響。所述肝星狀細(xì)胞可以是激活的肝星狀細(xì)胞。下調(diào)可以包括遞送下列物質(zhì)之一到肝星狀細(xì)胞內(nèi)Snail、編碼Snail的核酸分子、針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的siRNA、編碼針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的siRNA的核酸分子、針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的反義RNA、編碼針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的反義RNA的核酸分子、針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的DNA酶或者編碼針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的DNA酶的核酸分子。本發(fā)明的另一方面提供了可下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼可下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子在抑制肝星狀細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，包括在生產(chǎn)抑制肝星狀細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面提供了可下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼可下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子在治療對(duì)象的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病中的應(yīng)用，包括在生產(chǎn)治療對(duì)象的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面提供了可下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼可下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子用于抑制肝星狀細(xì)胞增殖，或治療對(duì)象的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病。所述試劑可包含Snail、針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的siRNA、針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的反義RNA 或針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的DNA酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明下面特定實(shí)施方式的描述以及附圖將會(huì)明白本發(fā)明的其它方面和特征。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明下列附圖僅以舉例方式說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方式

圖1.不同濃度hTGF- β 1對(duì)Cx43mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。將HSC-2和10天體外激活原代HSC(pHSC)分別用1和10ng/ml hTGF-β 1處理10和M小時(shí)以用于mRNA和蛋白質(zhì)分析。(A)通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR獲得Cx43的mRNA表達(dá)，所述數(shù)據(jù)分析為相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SDfP < 0. 05，**P < 0. 005)。(B)在Western 印跡中用10微克總蛋白進(jìn)行Cx43分析。顯示了肌動(dòng)蛋白表達(dá)作為加樣對(duì)照。顯示了每個(gè)細(xì)胞來(lái)源的代表性印跡。(C)采用ImageJ評(píng)估條帶強(qiáng)度并根據(jù)β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示2-3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SDfP < 0. 05，**Ρ < 0. 005)。圖2. hTGF- β 1 提高了 HSC-2 中的 Cx43 磷酸化。(A)用 10ng/mlhTGF- β 1 處理 6 小時(shí)后，收集細(xì)胞獲取總細(xì)胞裂解物。在Western印跡中分別用10和40微克總蛋白進(jìn)行Cx43 和pCx43分析。顯示了 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的代表性印跡。采用ImageJ軟件評(píng)估條帶強(qiáng)度。 將pCx43的表達(dá)根據(jù)Cx43進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士 SD廣P < 0. 005)。 (B)HSC-2細(xì)胞用5μΜ PKC抑制劑(BIM I)處理30分鐘后進(jìn)行10ng/mlhTGF-β 1處理，或只用BIM I處理。在Wfestern印跡中用10微克總蛋白進(jìn)行pCx43分析。顯示了 2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的代表性印跡圖。采用ImageJ軟件評(píng)估條帶強(qiáng)度。(C)蓋玻片上的HSC-2細(xì)胞用Cx43和pCx43 S368抗體染色進(jìn)行免疫熒光分析。Cx43主要位于膜中(頂部)，而pCx43 S368顯示一些膜染色而大部分為胞質(zhì)染色(底部右側(cè))。底部左側(cè)顯示細(xì)胞僅用二抗染色的圖像(對(duì)照)。圖3. HSC-2中間隙連接細(xì)胞間通信的FRAP分析。細(xì)胞在不含酚紅的培養(yǎng)基中用 5，6-羧基二乙酸熒光素孵育30分鐘。沖洗后，在室溫下分析細(xì)胞。左側(cè)漂白前的靶細(xì)胞圖像(箭頭)。中間漂白后的靶細(xì)胞圖像。右側(cè)熒光恢復(fù)15分鐘后的靶細(xì)胞圖像。㈧ 在孤立的細(xì)胞中未觀察到熒光的恢復(fù)。(B)檢查了接觸細(xì)胞。由于從鄰近細(xì)胞流入染料引起靶細(xì)胞的熒光恢復(fù)。(C)代表性實(shí)驗(yàn)曲線描述了接觸細(xì)胞在漂白后熒光逐漸增強(qiáng)。數(shù)據(jù)擬合到恢復(fù)功能以計(jì)算恢復(fù)時(shí)間常數(shù)(τ)。(D)細(xì)胞單獨(dú)用lOng/mlhTGF-β 1,5 μ M BIM I和10ng/ml hTGF- β 1或40 μ M甘珀酸處理6小時(shí)，然后進(jìn)行FRAP分析。由k = 1/ τ計(jì)算轉(zhuǎn)移常數(shù)(k)，并通過(guò)除以與靶細(xì)胞接觸的細(xì)胞數(shù)量(N)標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示均值士SDfP < 0. 05，**P < 0. 005)。圖4. hTGF-β 1處理或轉(zhuǎn)染Snail siRNA后的Cx43和Snail轉(zhuǎn)錄物與蛋白水平分析。通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR獲得Cx43和Snail的mRNA表達(dá)，并分析為相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變
4化。通過(guò)Western印跡測(cè)定蛋白表達(dá)。顯示了 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的代表性印跡。數(shù)字表示采用ImageJ軟件評(píng)估的根據(jù)β _肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的條帶強(qiáng)度。(A)HSC_2和10天體外激活原代HSC(pHSC)用1和lOng/ml hTGF-β 1處理10小時(shí)。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SD(*P < 0. 05，**P < 0. 005)。(B)HSC_2 細(xì)胞用 Snail siRNAs 1 或 3 轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)。在 mRNA和蛋白水平，都有Snail降低和相關(guān)的Cx43升高。mRNA數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值 ±SD (*Ρ < 0. 005)。(C)HSC-2 細(xì)胞用 lOng/mlhTGF-β 1 處理。在 2、6 和 10 小時(shí)后收集細(xì)胞作mRNA研究。mRNA數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SD (與O小時(shí)相比乍< 0. 05廣P
<0. 005，AN0VA)。(D) HSC-2 細(xì)胞用 10ng/ml hTGF-β 1 處理。在 10,24 和 30 小時(shí)后收集細(xì)胞用于Snail和Cx43的Western印跡分析。顯示了 2個(gè)實(shí)驗(yàn)之一的代表性印跡。數(shù)字表示了采用ImageJ軟件評(píng)估的根據(jù)β _肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的條帶強(qiáng)度。圖5. Snail與大鼠Cx43啟動(dòng)子中潛在Snail識(shí)別序列(CAGGTG)的結(jié)合。㈧使用12天體外激活HSC的5 μ g核提取物進(jìn)行EMSA。泳道1 觀察到Snail與寡核苷酸探針結(jié)合后的較高分子量條帶。泳道2 在采用200倍過(guò)量未標(biāo)記寡核苷酸的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中，未觀察到條帶遷移。泳道3:在反應(yīng)中沒(méi)有核提取物時(shí)未觀察到遷移。泳道4:突變寡核苷酸探針不能結(jié)合核提取物中的Snail。(B)使用經(jīng)lOng/ml hTGF-β 1處理2小時(shí)或經(jīng)Snail siRNA處理M小時(shí)的HSC-2的5 μ g核提取物進(jìn)行EMSA。經(jīng)hTGF- β 1處理的HSC-2與未處理HSC-2相比，Snail-寡核苷酸復(fù)合物所對(duì)應(yīng)條帶的強(qiáng)度增加。另一方面，轉(zhuǎn)染了 Snail siRNA的細(xì)胞與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，凝膠遷移條帶的強(qiáng)度減弱。用TATA結(jié)合蛋白(TBP)的表達(dá)作為加樣對(duì)照。圖6.通過(guò)細(xì)胞數(shù)和增殖標(biāo)記PCNA表達(dá)評(píng)估表明hTGF- β 1降低HSC-2細(xì)胞增殖。 細(xì)胞在分析前用lOng/ml hTGF-β 1處理48小時(shí)。(A)細(xì)胞用胰蛋白酶消化并如材料和方法所述計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SDfP <0.05)。(B)在Western印跡中用 10微克總蛋白進(jìn)行Cx43和PCNA分析。顯示了 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的代表性印跡。(C)采用 ImageJ評(píng)估條帶強(qiáng)度并根據(jù)加樣對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值 ±SD CP < 0. 05，**Ρ < 0. 005)。圖7.通過(guò)細(xì)胞數(shù)和增殖標(biāo)記PCNA表達(dá)評(píng)估表明轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA降低HSC-2細(xì)胞增殖。在分析前，用兩種Cx43 siRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)。㈧通過(guò)定量PCR分析 Cx43mRNA表達(dá)，表示為相對(duì)模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的倍數(shù)變化。(B)細(xì)胞用胰蛋白酶消化并如材料和方法所述計(jì)數(shù)。(A)和(B)的所有數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SDfP < 0. 005)。(C) 在Wfestern印跡中分別用10和1微克總蛋白進(jìn)行Cx43和PCNA分析。顯示了代表性的印跡。 (D)圖是Western印跡的密度計(jì)量分析。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SD ΓΡ < 0. 05， **Ρ < 0. 005)。圖8. Snail siRNA對(duì)TGF-β 1依賴性細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的影響。用SnailsiRNA 1或 3獨(dú)立轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞計(jì)數(shù)和PCNA免疫印跡分析前48小時(shí)加入lOng/ml hTGF-β 1。(A) 使用10微克總蛋白進(jìn)行PCNA表達(dá)研究。肌動(dòng)蛋白作為加樣對(duì)照。顯示了 2個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性印跡圖。數(shù)字表示了采用ImageJ軟件評(píng)估的根據(jù)β _肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的條帶強(qiáng)度。 (B)細(xì)胞用胰蛋白酶消化并如材料和方法所述計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值士SDfP
<0. 005)。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)連接蛋白43(Cx4;3)影響肝星狀細(xì)胞的增殖速率以及細(xì)胞內(nèi)Cx43 水平或活性下調(diào)抑制HSC的增殖。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TGF- β 1通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制蛋白Snail影響HSC中Cx43的下調(diào)。TGF- β 1 是最為深入研究的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，其對(duì)HSC有多種效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)膠原代謝、收縮和增殖(Hellerbrand 等，1999 ；Kato 等，2004 ；Kharbanda 等，2004 ；Saile 等，1999 ；Verrecchia 和Mauviel，2007)。TGF-β 1在肝纖維化期間上調(diào)，并引起HSC激活(Hellerbrand等，1999 ； Kanzler等，1999)。Saile等和Shen等的研究表明，TGF-β 1通過(guò)使細(xì)胞停止在Gl期并同時(shí)抑制凋亡而降低HSC的增殖(Saile等，1999 ；Shen等，2003)。盡管TGF-β 1是促纖維產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在非受控HSC激活的情況下具有引起ECM蛋白積累的“不需要”效果，但它在抑制HSC增殖方面可具有積極的一面。然而，由于TGF-βΙ有不同的效果包括促纖維效果，為了開(kāi)發(fā)直接抑制增殖而不通過(guò)TGF-βΙ的方法，發(fā)明人對(duì)HSC中TGF-βΙ的下游靶標(biāo)進(jìn)行了鑒定。本方法利用 TGF- β 1對(duì)HSC的下游抗增殖效果，無(wú)需給予TGF- β 1，從而避免了 TGF- β 1可能引起的任何促纖維化效果。連接蛋白43鑒別為HSC增殖的調(diào)控子提供了抑制HSC生長(zhǎng)的方便方法， 特別是與肝纖維化和肝纖維化相關(guān)疾病有關(guān)的HSC生長(zhǎng)。 連接蛋白43是HSC中表達(dá)的間隙連接蛋白。間隙連接是相鄰細(xì)胞間形成的微觀通道，允許通過(guò)交換小分子和離子(循環(huán)核苷酸、肌醇磷酸酯、Ca2+、K+)進(jìn)行細(xì)胞間通信。每個(gè)間隙連接通道由相鄰細(xì)胞間的兩個(gè)半通道(連接子)形成。連接子本身由稱為連接蛋白的蛋白亞基構(gòu)成(Goodenough等，1996)，目前已知道超過(guò)20種不同的連接蛋白(Eyre等， 2006)。在肝中，肝細(xì)胞表達(dá)連接蛋白沈和32(Cx26、Cx32)，而非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞、橢圓形細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞)表達(dá)連接蛋白43 (Cx43) (Gonzalez等，2002)。細(xì)胞間通信是細(xì)胞用于有效調(diào)節(jié)協(xié)同應(yīng)答的重要工具。HSC通過(guò)由Cx43組成的功能性間隙連接彼此通信。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，外源人TGF-β KhTGF-β 1)，一種促纖維化刺激物，在 HSC細(xì)胞系和原代HSC中降低Cx43的mRNA和蛋白水平。此外，hTGF-β 1提高了 Cx43在絲氨酸368的磷酸化。如間隙-FRAP分析所示，這些效果導(dǎo)致HSC之間間隙連接細(xì)胞間通信降低。還觀察到來(lái)自HSC核提取物的鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail與Cx43啟動(dòng)子中Snail共有序列的結(jié)合。在相同背景下，Snail siRNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)致Cx43上調(diào)表明TGF-β 1可通過(guò)Snail調(diào)節(jié)Cx43。通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染敲減Cx43導(dǎo)致HSC增殖減慢。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明在HSC中新鑒定的 TGF-β 1的下游效應(yīng)，即通過(guò)Snail信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響Cx43的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞間通信，本方法中探索了該效應(yīng)而避免使用TGF-β 1本身。所觀察到的TGF- β 1在HSC中對(duì)Cx43的效應(yīng)可能與TGF- β 1在其它各種細(xì)胞類型中對(duì)Cx43的效應(yīng)不同。例如，Pimentel等的研究顯示，外源TGF-β 1在心肌細(xì)胞中上調(diào) Cx43表達(dá)(Pimentel等，2002)。Wyatt等證明了 TGF- β 1本身對(duì)Cx43表達(dá)沒(méi)有影響，但改變了成骨樣細(xì)胞中的Cx43磷酸化狀態(tài)(Wyatt等，2001)，另一出版物(Neuhaus等，2008)顯示TGF-βΙ在尿平滑肌細(xì)胞中下調(diào)Cx43。這些不同細(xì)胞類型中的不同應(yīng)答支持了細(xì)胞特異性應(yīng)答不同的觀點(diǎn)，以及TGF-β 1對(duì)多種細(xì)胞類型發(fā)揮多效性作用的想法。因此，提供了抑制肝星狀細(xì)胞增殖的方法。所述方法包括直接下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性。下調(diào)可以包括將下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸遞送到HSC內(nèi)。
本文所用的連接蛋白43是指需要抑制增殖的肝星狀細(xì)胞表達(dá)的天然連接蛋白 43，或可包括由遞送到細(xì)胞內(nèi)的載體編碼的連接蛋白43或者是遞送給細(xì)胞的蛋白質(zhì)。由載體或作為蛋白質(zhì)遞送給細(xì)胞的連接蛋白43可與所述細(xì)胞表達(dá)的連接蛋白43相同，或者它可以是來(lái)自另一物種的同源物。所述Cx43可以是人Cx43，例如包括以下序列、基本由其組成或者由其組成[SEQ ID NO 1]MGDWSALGKLLDKVQAYSTAGGKVWLSVLFIFRILLLGTAVESAWGDEQSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVRFWVLQIIFVSVPTLLYLAHVFYVMRKEEKLNKKEEELKVAQTDGVNVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGKVKMRGGLLRTYIISILFKSIFEVAFLLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVD
CFLSRPTEKTIFIIFMLVVSLVSLALNIIELFYVFFKGVKDRVKGKSDPYHATSGALSPAKDCGSQKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTCDRNNSSCRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFPDDNQNSKKLAAGHELQPLAIVDQRPSSRASSRASSRPRPDDLEI或者，所述Cx43可以是大鼠Cx43，例如包括以下序列、基本由其組成或者由其組成[SEQ ID NO 2]MGDWSALGKLLDKVQAYSTAGGKVWLSVLFIFRILLLGTAVESAWGDEQSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVRFWVLQIIFVSVPTLLYLAHVFYVMRKEEKLNKKEEELKVAQTDGVNVEMHLKQIEIKKFKYGIEEHGKVKMRGGLLRTYIISILFKSVFEVAFLLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKTIFIIFMLVVSLVSLALNIIELFYVFFKGVKDRVKGRSDPYHA
TTGPLSPSKDCGSPKYAYFNGCSSPTAPLSPMSPPGYKLVTCDRNNSSCRNYNKQASEQNWANYSAEQNRMGQAGSTISNSHAQPFDFPDDNQNAKKVAAGHELQPLAIVDQRPSSRASSRASSRPRPDDLEI本文所用的“基本由……組成”或“基本組成為”是指在所述蛋白質(zhì)序列的一端或兩端包括1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、5個(gè)、10個(gè)或更多氨基酸的蛋白質(zhì)序列，或者是在所述核酸序列的一端或兩端包括1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、5個(gè)、10個(gè)或更多核苷酸的核酸分子，但補(bǔ)充的氨基酸或核苷酸不對(duì)所述蛋白質(zhì)或核酸的活性有實(shí)質(zhì)性影響?；钚訡x43是經(jīng)翻譯、折疊、翻譯后修飾并在細(xì)胞內(nèi)定位的Cx43，其具有Cx43的生物學(xué)功能或活性，包括Cx43的HSC增殖活性。在Cx43蛋白未經(jīng)或未適當(dāng)翻譯、折疊、翻譯后修飾或在細(xì)胞內(nèi)定位的任何情況下，即使所述基因被轉(zhuǎn)錄，可能出現(xiàn)增殖阻斷。活性連接蛋白43是指能上調(diào)其表達(dá)所在的HSC增殖的連接蛋白43，包括未被抑制性磷酸化的連接蛋白43，例如在kr368或在物種同源物的類似位置未被磷酸化的連接蛋白43。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，抑制性磷酸化是指絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸殘基上的磷酸化，其導(dǎo)致蛋白質(zhì)與該位置未被磷酸化的蛋白質(zhì)相比活性下調(diào)?；钚訡x43還可具有組裝入連接子并在其中發(fā)揮作用的能力， 包括當(dāng)連接子組裝到細(xì)胞間間隙連接中時(shí)。因此，提及連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性是指活性連接蛋白43抑制肝星狀細(xì)胞增殖的效應(yīng)，這是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)連接蛋白43并維持活性狀態(tài)(即非抑制的)連接蛋白43 表達(dá)的結(jié)果。
在上下文允許的情況下，除非另有說(shuō)明，本文所用術(shù)語(yǔ)細(xì)胞(包括在HSC的情況下)是指并包括單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群體。類似地，在上下文允許的情況下，除非另有說(shuō)明，提及細(xì)胞也包括提及單個(gè)細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞是任何肝星狀細(xì)胞，包括靜息或活化的HSC，并包括肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病中涉及的HSC。所述HSC可以是體外HSC，包括原代或永生化的，和從對(duì)象移植出來(lái)的離體HSC，或者可以是在體內(nèi)情況下包括人對(duì)象的內(nèi)源性HSC。所述HSC可以是轉(zhuǎn)基因HSC，包括在體內(nèi)情況下例如包括轉(zhuǎn)基因HSC的動(dòng)物模型中，或者是在體外情況下。所述HSC可以是需要抑制增殖或分裂的任何HSC，包括肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病中涉及的激活HSC，所述疾病包括其中HSC增殖上調(diào)的疾病。本文所用的細(xì)胞增殖是指 DNA復(fù)制、生長(zhǎng)和分裂的過(guò)程，該過(guò)程引起細(xì)胞總數(shù)的增加。例如通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，包括與增殖未受抑制的HSC群體比較，或者通過(guò)檢測(cè)增殖特異性細(xì)胞標(biāo)記如增殖特異性標(biāo)記PCNA，可以容易地測(cè)定增殖或增殖抑制。抑制增殖或者細(xì)胞增殖的抑制包括使細(xì)胞不能復(fù)制DNA、生長(zhǎng)或分裂，或不能適當(dāng)復(fù)制DNA、生長(zhǎng)或分裂，或者降低或阻滯DNA復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂，加之通過(guò)細(xì)胞凋亡或其它細(xì)胞死亡機(jī)制引發(fā)細(xì)胞死亡。抑制可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。Cx43的HSC增殖活性下調(diào)是指破壞、打斷、降低、限制、阻斷或預(yù)防Cx43促進(jìn)或上調(diào)增殖、復(fù)制或細(xì)胞周期進(jìn)展從而導(dǎo)致抑制增殖的任何機(jī)制。下調(diào)包括Cx43的物理改變， 例如通過(guò)翻譯后修飾，包括抑制性磷酸化，或者失去或缺乏必要的翻譯后修飾。下調(diào)還包括遺傳修飾，包括顯著降低或阻斷Cx43的表達(dá)，包括提高Snail表達(dá)或通過(guò)阻斷Cx43的轉(zhuǎn)錄或翻譯。顯著降低是指Cx43的表達(dá)水平是HSC增殖活性未被下調(diào)的細(xì)胞中應(yīng)產(chǎn)生Cx43表達(dá)水平的，例如，約 50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%。所述遺傳修飾包括Cx43編碼核酸的修飾，例如，部分或全部的開(kāi)放閱讀框被去除、替換或打斷，使得基因產(chǎn)品顯著減少或沒(méi)有、沒(méi)有穩(wěn)定的基因產(chǎn)品、或沒(méi)有功能性基因產(chǎn)品得以表達(dá)。所述遺傳修飾還包括Cx43編碼核酸的修飾，使得部分或全部Cx43基因調(diào)控區(qū)被去除、替換、打斷或抑制，導(dǎo)致Cx43編碼基因表達(dá)的蛋白質(zhì)顯著減少或沒(méi)有。所述遺傳修飾進(jìn)一步包括修飾所述細(xì)胞以轉(zhuǎn)錄與Cx43基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子至少一個(gè)片段互補(bǔ)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致Cx43轉(zhuǎn)錄物沒(méi)有翻譯或翻譯降低。所述遺傳修飾進(jìn)一步包括修飾細(xì)胞以轉(zhuǎn)錄或表達(dá)小干擾RNA(siRNA)分子，該分子靶向Cx43基因轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致Cx43轉(zhuǎn)錄物沒(méi)有翻譯或翻譯降低。直接下調(diào)是指通過(guò)直接作用而不是通過(guò)其它效應(yīng)物影響Cx43的水平或Cx43的活性。即，直接下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的分子可與Cx43直接相互作用，或與Cx43的編碼核酸如Cx43基因的上游調(diào)控區(qū)或Cx43轉(zhuǎn)錄物直接相互作用。因此，細(xì)胞接觸TGF- β 1不構(gòu)成直接下調(diào)，因?yàn)門GF-β 1通過(guò)激活信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑發(fā)揮其對(duì)Cx43的HSC增殖活性的影響， 其本身并不直接與Cx43基因的調(diào)控區(qū)、Cx43轉(zhuǎn)錄物或Cx43本身相互作用。Cx43的HSC增殖活性可以通過(guò)下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑來(lái)下調(diào)，意味著所述試劑一旦遞送入細(xì)胞就能下調(diào)所述活性。下調(diào)可包括遞送所述試劑到需要抑制增殖的 HSC內(nèi)，包括使HSC與所述試劑接觸使所述試劑被所述細(xì)胞攝取或進(jìn)入所述細(xì)胞。所述試劑能遞送入細(xì)胞內(nèi)，例如，通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，或者通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。例如，若所述試劑是小分子，它可在細(xì)胞膜上溶解，并因而能滲透細(xì)胞。所述試劑也可經(jīng)過(guò)修飾以包括促進(jìn)其運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記。為了指導(dǎo)所述試劑被特定靶細(xì)胞攝取，可以使用特異性傳輸標(biāo)記。例如，所述試劑可修飾成包括半乳糖殘基以提高肝細(xì)胞對(duì)所述試劑的攝取，如US 6，844，319中所述，其全文通過(guò)引用納入本文?；蛘撸鲈噭┛梢园谏锊牧现?，該材料提高或引起細(xì)胞對(duì)所述試劑的攝取，例如通過(guò)將所述試劑包封在膠束或脂質(zhì)體制品中。已知膠束和脂質(zhì)體遞送肽和蛋白質(zhì)給細(xì)胞?；蛘?，可以采用遞送核酸分子給細(xì)胞的技術(shù)，包括轉(zhuǎn)染技術(shù)或轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，其中所述核酸是病毒載體，或者遞送裸露 DNA給細(xì)胞。下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑可以是Cx43HSC增殖活性的抑制劑，例如抑制、 干擾、與之競(jìng)爭(zhēng)或打斷Cx43HSC增殖活性的化合物，包括引起、刺激或增強(qiáng)Cx43的抑制性絲氨酸磷酸化的分子。所述試劑可以是小分子、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其功能性片段、或在kr368或類似氨基酸上抑制性磷酸化Cx43的蛋白激酶，例如蛋白激酶C?；蛘?，所述試劑可以是抑制或干擾Cx43編碼核酸轉(zhuǎn)錄的分子，例如轉(zhuǎn)錄抑制蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子Snail。所述試劑可以是抑制或干擾編碼Cx43的RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯的分子，例如干擾編碼Cx43的RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯的DNA酶或siRNA或者針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的反義RNA分子?；蛘?，下調(diào)可包括遞送編碼所述試劑的核酸分子到要抑制增殖的HSC內(nèi)，包括使 HSC與所述核酸分子接觸從而所述核酸分子被所述細(xì)胞攝取或進(jìn)入所述細(xì)胞。一旦進(jìn)入 HSC，所述核酸分子將能表達(dá)所述試劑，因此應(yīng)包含必需的調(diào)節(jié)組件影響以實(shí)現(xiàn)所述試劑在所述HSC內(nèi)的表達(dá)。因此，所述核酸分子可以編碼Cx43的抑制劑，例如編碼抑制性磷酸化Cx43的蛋白激酶，或者抑制Cx43編碼基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白。所述核酸分子可編碼能夠抑制或干擾編碼Cx43的RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯的分子，例如DNA酶，針對(duì)編碼Cx43蛋白的轉(zhuǎn)錄物的反義RNA 或siRNA分子。如上所述，應(yīng)當(dāng)了解編碼Cx43轉(zhuǎn)錄、翻譯或Cx43蛋白的抑制劑的任何核酸分子將包含實(shí)現(xiàn)表達(dá)所需的任何必要調(diào)節(jié)元件，該表達(dá)包括所述抑制劑在所述要表達(dá)所述抑制劑并抑制增殖的HSC中的轉(zhuǎn)錄。已知用于產(chǎn)生包含特定編碼序列的核酸分子的分子生物學(xué)和克隆技術(shù)，并且可以采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法方便地產(chǎn)生所述核酸分子。例如，可以遞送Snail或編碼Snail的核酸分子給HSC。如下文實(shí)施例中所示， Snail是鋅指轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)證實(shí)與Cx43編碼區(qū)上游啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的Snail共有序列結(jié)合， 并且顯示下調(diào)Cx43基因的轉(zhuǎn)錄。Snail可包含以下氨基酸序列、基本由其組成或由其組成[SEQ ID NO 3]MPRSFLVRKPSDPNRKPNYSELQDSNPEFTFQQPYDQAHLLAAIPPPEILNPTASLPMLIWDSVLAPQAQPIAWASLRLQESPRVAELTSLSDEDSGKGSQPPSPPSPAPSSFSSTSVSSLEAEAYAAFPGLGQVPKQLAQLSEAKDLQARKAFNCKYCNKEYLSLGALKMHIRSHTLPCVCGTCGKAFSRPWLLQGHVRTHTGEKPFSCPHCSRAFADRSNLRAHLQTHSDVKKYQCQACARTFSRMSLLHKHQESGCSGCPR或者，Snail可包含以下氨基酸序列、基本由其組成或由其組成[SEQ IDNO 4]
MPRSFLVRKPSDPRRKPNYSELQDACVEFTFQQPYDQAHLLAAIPPPEVL
NPAASLPTLIWDSLLVPQVQPVAWATLPLRESPRAAELTSLSDEDSGKSSQPPSPPSPAPSSFSSTSASSLEAEAFIAFPGLGQLPKQLARLSVAKDPQSRKAFNCKYCNKEYLSLGALKMHIRSHTLPCVCTTCGKAFSRPWLLQGHVRTHTGEKPFSCSHCNRAFADRSNLRAHLQTHSDVKRYQCQACARTFSRMSLLHKHQESGCSGGPR可以采用向細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白質(zhì)或小分子的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括采用膠束或脂質(zhì)體包埋技術(shù)實(shí)現(xiàn)利用Snail、其它蛋白試劑、或小分子抑制劑的下調(diào)?？梢韵騂SC內(nèi)遞送靶向Cx43編碼基因的轉(zhuǎn)錄物的DNA酶。DNA酶是由DNA組成的鎂依賴性催化核酸，其能通過(guò)沃森克里克堿基配對(duì)選擇性結(jié)合RNA底物，并在任何嘌呤-嘧啶連接處切割所述RNA底物主鏈的磷酸二酯鍵(Santiago，F(xiàn). S.等，(1999) Nat Med 5 :1264-1269)。DNA酶由兩種不同功能性結(jié)構(gòu)域組成；可完成磷酸二酯鍵切割的15個(gè)核苷酸的催化核心，以及與催化核心側(cè)接的兩個(gè)雜交臂；可以調(diào)整臂的序列相同性以實(shí)現(xiàn)與靶 RNA底物的互補(bǔ)堿基配對(duì)。因此，所述DNA酶具有的互補(bǔ)區(qū)段能與Cx43基因轉(zhuǎn)錄物上位于嘌呤-嘧啶連接側(cè)翼的區(qū)段退火，從而DNA酶的催化核心能在連接處切割所述轉(zhuǎn)錄物，使得轉(zhuǎn)錄物不能被翻譯生成功能性Cx43蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述DNA酶設(shè)計(jì)成在AUG起始密碼子的A和 U殘基之間切割Cx43轉(zhuǎn)錄物。
0089]例如，所述Cx43轉(zhuǎn)錄物可包括以下序列[SEQ ID NO 5]0090]GGCUUUUAGCGUGAGGAAAGUACCAAACAGCAGCGGA⑶U0091]UUAAACUUUAAAUAGACAGGUCUGA⑶GCCUGAACUUGCC0092]UUUUCAUUUUACUUCAUCCUCCAAGGAGUUCAAUCACUUG0093]GC⑶GACUUCACUACUUUUAAGCAAAAGAGUGGUGCCCAG0094]GCAACAUGGGUGACUGGAGCGCCUUAGGCAAACUCCUUGA0095]CAAGGUUCAAGCCUACUCAACUGCUGGAGGGAAGGUGUGG0096]CU⑶CAGUACUUUUCAUUUUCCGAAUCCUGCUGCUGGGGA0097]CAGCGGUUGAGUCAGCCUGGGGAGAUGAGCA⑶CUGCCUU0098]UCGUUGUAACACUCAGCAACCUGGUUGUGAAAAUGUCUGC0099]UAUGACAAGUCUUUCCCAAUCUCUCAUGUGCGCUUCUGGG0100]UCCUGCAGAUCAUAUUUGUGUCUGUACCCACACUCUUGUA0101]CCUGGCUCAUGUGUUCUAUGUGAUGCGAAAGGAAGAGAAA0102]CUGAACAAGAAAGAGGAAGAACUCAAGGUUGCCCAAACUG0103]AUGGUGUCAAUGUGGACAUGCACUUGAAGCAGAUUGAGAU0104]AAAGAAGUUCAAGUACGGUAUUGAAGAGCAUGGUAAGGUG0105]AAAAUGCGAGGGGGGUUGCUGCGAACCUACAUCAUCAGUA0106]UCCUCUUCAAGUCUAUCUUUGAGGUGGCCUUCUUGCUGAU0107]CCA⑶GGUACAUCUAUGGAUUCAGCUUGAGUGCUGUUUAC0108]ACUUGCAAAAGAGAUCCCUGCCCACAUCAGGUGGACU⑶U0109]UCCUCUCUCGCCCCACGGAGAAAACCAUCUUCAUCAUCUUCN 102405287 A說(shuō)明書9/19 頁(yè)CAUGCUGGUGGUGUCCUUGGUGUCCCUGGCCUUGAAUAUC
AUUGAACUCUUCUAUGUUUUCUUCAAGGGCGUUAAGGAUC
GGGUUAAGGGAAAGAGCGACCCUUACCAUGCGACCA⑶GG
UGCGCUGAGCCCUGCCAAAGACUGUGGGUCUCAAAAAUAU
GCUUAUUUCAAUGGCUGCUCCUCACCAACCGCUCCCCUCU
CGCCUAUGUCUCCUCCUGGGUACAAGCUGGUUACUGGCGA
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UGGACCAGCGACCUUCAAGCAGAGCCAGCAGUC⑶GCCAG
CAGCAGACCUCGGCCUGAUGACCUGGAGAUCUAG可以采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成所述DNA酶，例如可采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)連接法在固相載體上以3’到5’方向合成DNA分子，包括使用自動(dòng)化核酸合成儀?；蛘?，可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄編碼DNA酶的核酸分子來(lái)合成所述DNA酶。所述核酸分子可以包含在用于遞送到細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的DNA或RNA載體中，例如病毒載體。合適的病毒載體包括疫苗病毒載體和腺病毒載體。可以通過(guò)將HSC暴露于DNA酶使DNA酶被細(xì)胞攝取并能在細(xì)胞內(nèi)靶向并切割Cx43 轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)功能性Cx43蛋白表達(dá)降低或沒(méi)有表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)所述下調(diào)。暴露可包括本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)，或者通過(guò)微注射技術(shù)將DNA直接注入細(xì)胞。暴露還可包括將細(xì)胞暴露于裸露DNA酶，因?yàn)榧?xì)胞在體內(nèi)會(huì)攝取裸露DNA?；蛘撸鬌NA酶是包括在核酸載體中，如病毒載體，可以用所述病毒載體感染所述細(xì)胞。或者，可以遞送抑制Cx43編碼核酸表達(dá)的反義RNA分子或小干擾RNA(siRNA)分子進(jìn)入HSC。反義RNA分子可包含與Cx43基因RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一個(gè)片段互補(bǔ)的序列，其能與 Cx43轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，從而減少或防止體內(nèi)Cx43基因的表達(dá)。反義RNA分子應(yīng)當(dāng)與靶mRNA有足夠程度的互補(bǔ)性，以避免反義分子與非靶向序列在特異性結(jié)合所需條件下，例如在生理?xiàng)l件下的非特異性結(jié)合。SiRNA分子可以是能引起細(xì)胞內(nèi)的基因特異性RNA干擾，導(dǎo)致體內(nèi)Cx43基因表達(dá)減少或沒(méi)有表達(dá)的任何雙鏈RNA分子，包括能自身折返形成雙鏈siRNA的自體互補(bǔ)單鏈分子。siRNA通常靶向靶mRNA內(nèi)19-23個(gè)堿基的核苷酸序列，如Elbashir等Q001) EMBO J 20 :6877-6888所述，其內(nèi)容通過(guò)引用納入本文。通常，siRNA—條鏈的序列與部分靶轉(zhuǎn)錄物mRNA互補(bǔ)，本文中靶轉(zhuǎn)錄物為Cx43轉(zhuǎn)錄物。設(shè)計(jì)siRNA的指南是本領(lǐng)域已知的，或者可購(gòu)得設(shè)計(jì)與特定靶標(biāo)雜交的siRNA (Ambion、Qiagen)。例如，具有3’ UU雙核苷酸突出端的 siRNA往往在引發(fā)RNA干擾(RNAi)上更有效。針對(duì)特定序列的siRNA分子已有市售，或可以設(shè)計(jì)并且購(gòu)得。同樣，已有用于設(shè)計(jì)siRNA序列的計(jì)算機(jī)程序(例如，Invitrogen)。例如，所述siRNA 可包含具有序列 r (CAG UGC ACA UGU AAC UAA U) dTdT [SEQ ID NO 6]的有義鏈和具有序列 r (AUU AGU UAC AUG UGC ACU G) dTdT [SEQ ID NO :7]的反義鏈，該 siRNA 針對(duì)轉(zhuǎn)錄物中的序列 AAC AGU GCA CAU GUA ACU AAU[SEQ ID NO 8] (Rn_Gjal_l_ HPsiRNA，德國(guó)凱杰公司Oliagen))?；蛘?，所述siRNA可包含具有序列r (GGU AAG CUU CCC UGG UCU A) dTdT [SEQ ID NO 9]的有義鏈和具有序列 r (UAG ACC AGG GAA GCU UAC C) dTdT [SEQ ID NO: 10]的反義鏈，該siRNA針對(duì)轉(zhuǎn)錄物中的序列CAG GUA AGC UUC CCU GGU CUA[SEQ ID NO 11] (Rn_Gjal_5_HP siRNA，德國(guó)凱杰公司)。因此，為了實(shí)現(xiàn)下調(diào)，所述細(xì)胞可暴露于反義RNA、編碼反義RNA的核苷酸、siRNA 或編碼siRNA的核苷酸，例如含有核酸分子的核酸載體，該核酸分子能轉(zhuǎn)錄反義轉(zhuǎn)錄物或能形成雙鏈siRNA的單鏈、自體互補(bǔ)siRNA分子?？梢圆捎蒙鲜龊怂峄瘜W(xué)合成方法和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)克隆技術(shù)合成這種反義分子、siRNA分子或載體。因此，可以通過(guò)遞送所述試劑進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)HSC增殖的抑制，其包括使所述細(xì)胞與所述試劑接觸，使細(xì)胞攝取試劑，使試劑與Cx43或編碼Cx43的DNA或RNA相互作用，從而下調(diào)Cx43的HSC增殖活性。所述方法可以在受肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病影響的HSC中進(jìn)行，包括導(dǎo)致肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病或與其產(chǎn)生有關(guān)的HSC，或者由于肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病引起或者在其發(fā)生期間被激活的HSC。因此，要抑制增殖的HSC可以是需要治療肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病的對(duì)象的體內(nèi)HSC，對(duì)象包括哺乳動(dòng)物，包括人。肝纖維化相關(guān)疾病是指可能造成、引起肝纖維化、或與肝纖維化相關(guān)的任何疾病、 失調(diào)或癥狀，所述肝纖維化包括原發(fā)性纖維化和繼發(fā)性纖維化。所述疾病包括肝纖維化，包括例如，肝硬化、丙肝感染、乙肝感染、與酒精或肥胖相關(guān)的脂肪性肝炎、威爾遜病、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝癌。因此，遞送所述試劑或編碼所述試劑的核酸給細(xì)胞包括將有效量的所述試劑給予對(duì)象。本文所用術(shù)語(yǔ)“有效量”是指在劑量上和實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果必需的時(shí)間段內(nèi)，例如能有效抑制對(duì)象內(nèi)HSC增殖和/或治療肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病的量?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將所述試劑或編碼所述試劑的核酸給予對(duì)象。所述試劑或編碼所述試劑的核酸可以全身給予，或者可以直接在HSC的位點(diǎn)給予。給藥到所述位點(diǎn)包括注射到所述位點(diǎn)、或手術(shù)植入，還可包括經(jīng)肝的傳入和傳出血管，例如肝門靜脈、肝靜脈或膽管，通過(guò)水力遞送所述試劑或編碼所述試劑的核酸。所述試劑或編碼所述試劑的核酸的給藥濃度和量可以不同，取決于需治療的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病、與肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病有關(guān)的細(xì)胞類型、將給予的分子類型、給藥模式、以及對(duì)象的年齡和健康狀況。為協(xié)助給藥，所述下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸可以配制成藥物組合物的組分。因此，提供了藥物組合物，包含下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸，以及可選地包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑。這種藥物組合物可用于治療肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病。所述組合物可常規(guī)包含藥學(xué)上可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑和各種相容載體。 對(duì)于所有形式的遞送，所述下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸可以配制在生理鹽水溶液中。由于多肽在給藥時(shí)可能不穩(wěn)定，當(dāng)所述下調(diào)Cx43 HSC增殖活性的試劑是多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，可能需要將所述肽或蛋白質(zhì)包括在有助于保護(hù)和/或保存所述肽或蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體或其它生物材料中直至遞送給靶細(xì)胞。所述藥學(xué)上可接受稀釋劑的比例和特性由選定的給藥途徑、與肝細(xì)胞的相容性和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐所決定。通常，所述藥物組合物用某些組分配制，這些組分不會(huì)殺傷或顯著損傷所述下調(diào)Cx43 HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸的生物學(xué)性質(zhì)。可以用制備適于給予對(duì)象的藥學(xué)上可接受組合物的已知方法制備所述藥物組合物，例如將有效量的下調(diào)Cx43 HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸，與任何一種或多種補(bǔ)充活性物質(zhì)，用藥學(xué)上可接受的載劑組合在混合物中。例如，在Remington’ s Pharmaceutical Sciences (《雷明頓藥物科學(xué)》，麥克出版公司，美國(guó)賓夕法尼亞州伊斯頓， 1985)中描述了合適的載劑。在此基礎(chǔ)上，所述藥物組合物包括但不限于，下調(diào)Cx43的HSC 增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸的溶液、加有一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑或稀釋劑，并包含在有合適PH且與生理液體等滲的緩沖溶液中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所述藥物組合物可取決于選定的給藥途徑以多種形式給予對(duì)象。本發(fā)明的組合物可以局部給藥、經(jīng)手術(shù)給藥或者通過(guò)注射給予所需位點(diǎn)。所述下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸的溶液可以配制在生理合適的緩沖液中。在常規(guī)儲(chǔ)存和使用條件下，這些制品含有防腐劑以避免微生物生長(zhǎng)， 這將維持所述下調(diào)CX43的HSC增殖活性的試劑的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備合適的制劑。例如，在《雷明頓藥物科學(xué)》和1999年出版的The United States Pharmacopeia The National Formulary (《美國(guó)藥典:國(guó)家處方集》)(USP 24 NF19)中描述了可供選擇和制備合適制劑的常規(guī)步驟和成分。藥物組合物需使用的劑量取決于需治療的具體病癥，所述病癥的嚴(yán)重程度，包括年齡、身體狀況、尺寸和重量等對(duì)象個(gè)體參數(shù)，治療的持續(xù)時(shí)間，同時(shí)治療(如果有)的特性、特定給藥途徑和衛(wèi)生專業(yè)人員知識(shí)和技能范圍內(nèi)的其它類似因素。這些因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可用最少的常規(guī)實(shí)驗(yàn)解決。還考慮了下調(diào)Cx43的HSC增殖活性的試劑或編碼所述試劑的核酸的用途，包括在生產(chǎn)抑制HSC增殖或治療肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，包括根據(jù)本文所述方法的各種應(yīng)用。本發(fā)明的方法和用途用以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明。 實(shí)施例材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)條件按已公開(kāi)的步驟(Weiskirchen和Gressner，2005)從雄性Wistar 大鼠中分離原代肝星狀細(xì)胞。采用的方案已得到新加坡生物醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)(Biomedical Research Council of Singapore)的動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee) (IA⑶C)的批準(zhǔn)。通過(guò)分離后1天的維生素A自熒光評(píng)估原代HSC的純度。細(xì)胞系HSC-2另有描述(MaiAach等，2008)。所有細(xì)胞在37°C、5% CO2循環(huán)的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)中使用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μ g/ml鏈霉素的高葡萄糖達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(D-MEM)。胰蛋白酶-EDTA從Biochrome公司(德國(guó))購(gòu)得。所有其它細(xì)胞培養(yǎng)試劑來(lái)自Irwitrogen(美國(guó)加州)。
用重組人TGF- β 1處理肝星狀細(xì)胞在處理前M小時(shí)，將HSC接種入75cm2組織培養(yǎng)瓶。在60-70%細(xì)胞匯合時(shí)，加入重組人TGF-β 1 (hTGF-β 1)到1或lOng/ml的終濃度，并孵育2、6、10、對(duì)或30小時(shí)。對(duì)照處理中，僅將磷酸緩沖鹽水(PBQ給予細(xì)胞。在一些實(shí)驗(yàn)中，HSC-2細(xì)胞用終濃度為5 μ M的雙吲哚基馬來(lái)酰亞胺(BIM I)處理30分鐘，然后用 10ng/ml hTGF-β 1 處理。逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR 根據(jù)生產(chǎn)商方案(RNA II試劑盒，德國(guó)Machery-Nagel公司) 從細(xì)胞中分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR的所有試劑來(lái)自Applied Biosystems (美國(guó)加州)。將1微克總RNA在50 μ 1的總反應(yīng)體積中以RT試劑盒(Ν8080234)所述條件逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用 Fast Real Time PCR System(快速實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)，Applied Biosystems 公司) 進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。在10 μ 1的PCR反應(yīng)體積中使用3 μ 1 cDNA。針對(duì)目標(biāo)基因Cx43和 Snail以及針對(duì)內(nèi)源對(duì)照β -肌動(dòng)蛋白的iTaqman探針?lè)謩e是foi01433957_ml、I n00441533_ gl和4352341E。PCR條件為95°C 20秒，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán):95V 3秒和60°C 30秒。SDS-PAGE和Wfestern印跡如最近所描述的(Lim等，2008)進(jìn)行細(xì)胞裂解和隨后的SDS-PAGE總蛋白分離，然后是Wfestern印跡。膜用含5%脫脂奶的TBS-Tween(TBS-T) 封閉。Cx43(sc_9059，美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology))、在絲氨酸368磷酸化的Cx43(pCx43 Ser368，3511S，美國(guó)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(Cell Signaling ^Technology))、PCNA (Ab29，英國(guó) Abcam 公司)和 β-肌動(dòng)蛋白(Α22^，美國(guó) Sigma 公司) 的一抗分別以1 1000、1 750,1 5000和1 7500的稀釋度應(yīng)用于封閉溶液。在 TBS-T中清洗3遍后，偶聯(lián)有馬辣根過(guò)氧化物酶的適當(dāng)二抗(美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司) 以1 2000的稀釋度加入封閉溶液中。在TBS-T中清洗3遍后，用ECL Plus (RPN2132，英國(guó)GE健康護(hù)理公司(GE Healthcare))將膜顯影。在4°C用pCx43抗體孵育過(guò)夜。所有其它孵育在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。用ImageJ軟件(W. Rasband, NIH ；rsb. info. nih. gov/ij/)進(jìn)行Western印跡的半定量密度計(jì)量分析。免疫熒光染色按別處所述(MaiAach等，2002)進(jìn)行HSC-2細(xì)胞的免疫熒光染色， 以1 50的稀釋度使用抗體Cx43(C-6219，美國(guó)Sigma公司)和在絲氨酸368磷酸化的 Cx43 (pCx43 kr368，3511S美國(guó)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)。二次抗體抗兔Alexa488和抗兔 Alexa555(美國(guó)hvitrogen公司)以1 200的稀釋度使用。用LEICA RMB-DM落射熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)獲取圖像。間隙連接細(xì)胞間通信的分析HSC_2在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)過(guò)夜。在90%細(xì)胞匯合時(shí)，加入hTGF- β 1 (終濃度lOng/ml)或甘珀酸(終濃度40 μ Μ)并孵育6小時(shí)。對(duì)照細(xì)胞中僅給予PBS?；蛘?，在添加hTGF-β 1前30分鐘加入BIM I (終濃度5 μ Μ)。在PBS 快速?zèng)_洗后，細(xì)胞在無(wú)酚紅、含50 μ g/ml終濃度5，6-羧基二乙酸熒光素(美國(guó)Research Organics公司)的D-MEM中孵育，37°C潮濕培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。然后用PBS沖洗細(xì)胞2 次，加入無(wú)酚紅的D-MEM，再繼續(xù)進(jìn)行光漂白后的熒光恢復(fù)(FRAP)試驗(yàn)。使用裝有DM6000 的LEICA TCS SP2(德國(guó)LEICA公司)軟件包中所含的FRAP應(yīng)用程序。使用63x浸沒(méi)物鏡 (Leica HCX APO L U-V-I 63x/0. 90ffater UV)。488nm 的氬氣激光用作激發(fā)，捕捉 500 和 535nm之間的熒光信號(hào)。條件如下在10%激光能量下進(jìn)行5次漂白前掃描，以15秒的間隔在100%激光能量下進(jìn)行40次漂白掃描，之后進(jìn)行60次漂白后掃描。在漂白期間，采用縮放(Zoom)模式以漂白感興趣區(qū)域(ROI)內(nèi)確定的單個(gè)細(xì)胞(靶細(xì)胞)。在漂白后獲取期間用全掃描面積對(duì)所有數(shù)據(jù)作光漂白的校正。將校正的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(Originftx) 7 SR4，美國(guó) OriginLab公司)擬合到函數(shù)F(t) = Ff(F00-Ftl) (l-e_tA)，來(lái)評(píng)估恢復(fù)時(shí)間常數(shù)τ，其中 F(t)是校正的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)00是熒光強(qiáng)度的漸近值。由k= l/τ計(jì)算轉(zhuǎn)移常數(shù)(k)，并通過(guò)除以與靶細(xì)胞接觸的細(xì)胞數(shù)量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。各細(xì)胞的熒光恢復(fù)約為50%。電泳遷移率變動(dòng)分析根據(jù)大鼠Cx43基因(NW_001084790)，合成(新加坡 Research Biolabs)具有Snail共有序列(下劃線)的生物素化雙鏈寡核苷酸探針TGCTC AACCCAGTCAGGTGATGCCTGAACAAA-3 [SEQ ID NO: 12]。在突變的雙鏈寡核苷酸探針中，Snail 的共有序列改變?yōu)镃AGGAA0用NE-PER核與胞質(zhì)提取試劑盒(美國(guó)Pierce公司)獲得核蛋白提取物。用Snail試劑盒中的試劑根據(jù)其操作方案(AY1398，美國(guó)Panomics公司)進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析。簡(jiǎn)而言之，在添加Ιμ 探針(存液20ηΜ)前，5yg核蛋白提取物在由聚d(I-C) ,5x結(jié)合緩沖液和無(wú)核酸酶的水組成的反應(yīng)混合物中孵育5分鐘?？偡磻?yīng)體積為10 μ 1。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，在添加標(biāo)記探針前5分鐘加入2 μ 1未標(biāo)記的探針(存液2 μ Μ)。 反應(yīng)在15°C孵育30分鐘。在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)中分離樣品，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。Snail和連接蛋白43 siRNA轉(zhuǎn)染臨轉(zhuǎn)染前，將l_2xl06 HSC-2細(xì)胞接種入100_ 細(xì)胞培養(yǎng)皿并37°C孵育。向Iml無(wú)血清的D-MEM中加入siRNA至終濃度ΙΟηΜ，再加入120 μ 1 HiPerfect轉(zhuǎn)染試劑(德國(guó)Qiagen公司)并孵育10分鐘。將siRNA/轉(zhuǎn)染試劑溶液滴加到細(xì)胞中并孵育對(duì)或48小時(shí)。對(duì)于模擬對(duì)照，細(xì)胞中僅加入HiPerfect試劑。所用Snail siRNA 是 Rn_Snail_l 和 Rn_Snail_3,所用 Cx43 siRNA 是 Rn_Gjal_l 和 Rn_Gjal_5 (德國(guó) Qiagen 公司)。細(xì)胞計(jì)數(shù)處理后，細(xì)胞用PBS清洗1次，并用胰蛋白酶/EDTA脫離。SOOrpm離心 4分鐘后，細(xì)胞團(tuán)重懸浮在Iml D-MEM中，細(xì)胞用GUAVAPCA-96 (美國(guó)加州Guava技術(shù)公司) 的前向散射功能計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有定量結(jié)果均表示為均值士SD。在適當(dāng)?shù)那闆r下，用假定相等方差的雙尾斯氏t檢驗(yàn)和單向ANOVA Scheff6事后檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)是 P值< 0. 05。除非另有說(shuō)明，圖例所示ρ值是基于斯氏t檢驗(yàn)。結(jié)果hTGF-β 1下調(diào)Cx43轉(zhuǎn)錄物和蛋白表達(dá)為檢查Cx43 mRNA的調(diào)節(jié)，用促纖維化 hTGF-β 1刺激HSC-2細(xì)胞10分鐘。實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)顯示，lng/ml和10ng/ml hTGF-β 1引起 Cx43轉(zhuǎn)錄物分別降低30%和45% (圖1A)。此外，還觀察到hTGF-β 1下調(diào)Cx43蛋白(圖 IB和C)。當(dāng)10天體外激活原代HSC經(jīng)受hTGF- β 1處理時(shí)，觀察到Cx43 mRNA和蛋白調(diào)節(jié)的趨勢(shì)相似(圖1A、B和C)。hTGF- β 1提高Cx43的磷酸化補(bǔ)充hTGF- β 1后，觀察到Cx43在絲氨酸368磷酸化的提高(圖2A)，這歸因于Cx43總庫(kù)(下降)中pCx43 S368的比例提高。pCx43條帶的真實(shí)性通過(guò)在λ -磷酸酶處理后該條帶的消失得到證實(shí)(圖2Α)。用蛋白激酶C(H(C)抑制劑BIM I預(yù)處理細(xì)胞和隨后的hTGF-β 1處理，降低了 Cx43在絲氨酸368位的磷酸化(圖 2B)。還進(jìn)行了 Cx43和pCx43 S368的免疫熒光染色，以研究pCx43 S368在HSC-2細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞分布。Cx43很大程度上沿細(xì)胞膜分布，而pCx43 S368顯示胞質(zhì)內(nèi)擴(kuò)散或散點(diǎn)染色
15和一些膜定位(圖2C，箭頭)。hTGF-β 1降低了 HSC之間的間隙連接細(xì)胞間通信Cx43是HSC中表達(dá)的主要間隙連接蛋白質(zhì)，已顯示形成功能性的間隙連接(Fischer等，2005)。本發(fā)明使用間隙-FRAP技術(shù)(Abkici等，2007)分析HSC之間的GJIC(間隙連接細(xì)胞間通信)。為證實(shí)這一方法，證明了在分離的漂白細(xì)胞中沒(méi)有自發(fā)的熒光恢復(fù)(圖3A，箭頭)，而接觸的細(xì)胞恢復(fù)其熒光的約 50% (圖;3B，箭頭)。這表明，確實(shí)檢測(cè)到染料從未漂白細(xì)胞經(jīng)間隙連接轉(zhuǎn)移到漂白細(xì)胞， 而不是熒光信號(hào)本身的恢復(fù)。圖3C是描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所擬合的恢復(fù)功能的示意圖。甘珀酸是已確立的GJIC(間隙連接細(xì)胞間通信)抑制劑(Doll等，1968)。在本文情況中，甘珀酸使染料轉(zhuǎn)移速率(k)降低幾乎50% (圖3D)。這一結(jié)果用作間隙-FRAP技術(shù)檢測(cè)GJIC變化可靠性的陽(yáng)性對(duì)照。這些發(fā)現(xiàn)顯示，在hTGF-β 1處理的HSC細(xì)胞中的熒光染料5，6-羧基二乙酸熒光素的轉(zhuǎn)移速率顯著降低(圖3D)，提示與PBS處理的HSC (對(duì)照)相比，這些細(xì)胞中的GJIC降低。發(fā)現(xiàn)當(dāng)在添加TGF-β 1前用PKC抑制劑BIM I處理細(xì)胞時(shí)，減弱了 TGF- β 1誘導(dǎo)的GJIC下調(diào)(圖3D)。hTGF- β 1通過(guò)Snai 1下調(diào)Cx43表達(dá)已知TGF- β 1上調(diào)Snai 1的表達(dá)，Snai 1是一種參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Peinado等，2003)。另一方面，Snail對(duì)于抑制E-鈣粘著蛋白在上皮腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和Cx43在EMT期間的轉(zhuǎn)錄是必需的(Batlle 等，2000 ；de Boer等，2007)。圖4A顯示，hTGF-β 1在HSC-2細(xì)胞系和體外激活的原代HSC 內(nèi)誘導(dǎo)Snail mRNA。用兩種Snail特異性siRNA(l和3)轉(zhuǎn)染HSC-2引起Snail mRNA和蛋白下調(diào)幾乎50% (圖4B)。同時(shí)，觀察到Snail siRNA 1和3轉(zhuǎn)染后，Cx43的mRNA(31 %和 43% )和蛋白(18%和23% )水平分別上調(diào)(圖4B)。為進(jìn)一步支持Cx43調(diào)節(jié)可部分通過(guò) Snail介導(dǎo)的主張，證實(shí)了 hTGF-β 1處理最多30小時(shí)后，與Cx43的減少相對(duì)應(yīng)，Snail在轉(zhuǎn)錄物和蛋白表達(dá)上都有增加(圖4，C和D)。HSC的核提取物與Cx43啟動(dòng)子上的Snail共有序列結(jié)合為進(jìn)一步評(píng)估Snail調(diào)節(jié)Cx43基因表達(dá)的可能性，采用基于大鼠Cx43啟動(dòng)子的含Snail共有序列(CAGGTG)的生物素化寡核苷酸探針和12天體外激活HSC的核提取物進(jìn)行了電泳遷移率變動(dòng)分析。該共有序列在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1412bp。通過(guò)寡核苷酸探針在6%聚丙烯酰胺凝膠上的遷移率改變顯現(xiàn)Snail與其共有序列的結(jié)合(圖5A，泳道1)。該結(jié)合可以用200倍過(guò)量的冷(未標(biāo)記)探針競(jìng)爭(zhēng)掉(5A，泳道2~)。此外，沒(méi)有核提取物時(shí)(圖5A，泳道幻，和使用在 Snail共有序列中有2個(gè)堿基對(duì)突變的突變生物素化探針(CAGGMl時(shí)(圖5A，泳道4)，檢測(cè)不到信號(hào)，表明觀察到的是核提取物中的Snail蛋白和探針之間的特異性結(jié)合。用細(xì)胞系HSC-2的核提取物也獲得相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。類似地，使用經(jīng)lOng/ml hTGF-β 1 處理的HSC-2核提取物產(chǎn)生更強(qiáng)的條帶，而轉(zhuǎn)染了 Snail siRNA的細(xì)胞產(chǎn)生了較弱的條帶 (圖5B)，進(jìn)一步示范了 Snail和其在Cx43啟動(dòng)子上的共有序列之間的結(jié)合特異性。連接蛋白43調(diào)節(jié)HSC增殖已知TGF- β 1可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。用細(xì)胞計(jì)數(shù)和增殖標(biāo)記增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的免疫印跡分析證實(shí)了對(duì)HSC-2增殖的影響。用hTGF-β 1處理 HSC-2引起細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖6Α)，PCNA和Cx43的表達(dá)也降低(圖6，B和C)。除GJIC 以外，通過(guò)用Cx43 siRNA減弱Cx43 mRNA水平來(lái)研究了 Cx43在HSC增殖的TGF- β 1依賴性調(diào)節(jié)中的相關(guān)性。將Cx43特異性siRNA 1和5轉(zhuǎn)染到HSC-2引起Cx43 mRNA在兩個(gè)情況中都下調(diào)約65%，表明了 siRNA的功效(圖7A)。在用Cx43 siRNA 1和5處理48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以評(píng)估細(xì)胞增殖。圖7B清楚說(shuō)明，與模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Cx43 siRNA 后細(xì)胞總數(shù)顯著減少。類似的，Cx43 siRNA也引起Cx43蛋白表達(dá)的下降(圖7，C和D)，證明了 Cx43蛋白可能是該減少的原因。此外，Cx43 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的PCNA表達(dá)低于模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖7，C和D)。還發(fā)現(xiàn)，TGF-β 1下調(diào)細(xì)胞增殖被用Snail siRNA轉(zhuǎn)染HSC-2細(xì)胞所減弱(圖8，A和B)。總結(jié)數(shù)據(jù)顯示，外源hTGF-β 1減少了 HSC細(xì)胞系和體外活化原代HSC中Cx43轉(zhuǎn)錄物和蛋白(圖1)。此外，在經(jīng)hTGF-β 1處理的細(xì)胞中，Cx43(kr368)的磷酸化增加(圖2A)。 結(jié)果表明，PKC負(fù)責(zé)Cx43在絲氨酸368位的磷酸化(圖2B和3D)。這一觀察和先前發(fā)現(xiàn)PKC 使Cx43中絲氨酸368位磷酸化相一致(Lampe等，2000)。由免疫熒光顯示的pCx43 (S368) 的胞質(zhì)和部分膜分布(圖2C)也提示，磷酸化可能不僅影響通道門控(Lampe等，2000)，還影響運(yùn)輸和裝配入連接子。(Solan和Lampe，2005)?？傊?，如間隙-FRAP實(shí)驗(yàn)所示，結(jié)果是 hTGF-β 1處理的HSC細(xì)胞與對(duì)照相比GJIC降低(圖3D)。換而言之，TGF-β 1對(duì)Cx43的調(diào)節(jié)似乎分兩部分，分別由短期(6小時(shí))的pCX43(kr368)升高和長(zhǎng)期(M小時(shí))的Cx43 表達(dá)下調(diào)所引起。已確定TGF- β 1在HSC-2和體外活化原代HSC中上調(diào)Snai 1 (圖4Α)。使用Snai 1 siRNA導(dǎo)致Snail下調(diào)并同時(shí)上調(diào)Cx43 (圖4B)。EMSA結(jié)果表明Snail能特異性識(shí)別其在大鼠Cx43啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。該結(jié)合特異性由Snail不能結(jié)合突變共有序列而得到進(jìn)一步支持。另一方面，用siRNA下調(diào)Snail減弱了結(jié)合(圖5B)。此外，結(jié)果表明 TGF-β 1處理不但提高了 Snail，還增加Snail與其共有序列的結(jié)合(圖5B)。TGF-β 1降低了細(xì)胞數(shù)量(圖6Α)和HSC細(xì)胞增殖能力標(biāo)記PCNA的表達(dá)(圖6， B和C)，這與Sien等的結(jié)果一致。Cx43 siRNA轉(zhuǎn)染到HSC中(圖7A)，細(xì)胞數(shù)量(圖7B) 和PCNA表達(dá)(圖7，C和D)的降低顯示，HSC在Cx43 siRNA轉(zhuǎn)染后增殖比模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照慢，提示TGF-β 1對(duì)HSC增殖的影響可能在某種程度上通過(guò)Cx43介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。TGF-β 1弓丨起的細(xì)胞數(shù)量和PCNA表達(dá)降低被Snail siRNA對(duì)Snail的抑制而減弱(圖8)。本說(shuō)明書引用的所有出版物和專利申請(qǐng)通過(guò)引用納入本文，就如各出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e和單獨(dú)地通過(guò)引用納入本文那樣。任何出版物的引用針對(duì)申請(qǐng)日之前的公開(kāi)而不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不具有先于這些出版物的權(quán)利。在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指示物，除非上下文中有明確說(shuō)明。在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所用的術(shù)語(yǔ)“包含’x‘含有” “包括”以及其它這些術(shù)語(yǔ)形式具有非限制性包含的意義，即，包括具體引用的元素或成分，但不排除任何其它元素或成分。除非另有說(shuō)明，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。雖然出于闡明目的已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和舉例的方式詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)不難了解，可以作出某些改變和修改而不背離所附權(quán)利要求書的精神和范圍。參考文獻(xiàn)Abbaci,M. ,Barberi-Heyob,M. ,Stines,J. 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2權(quán)利要求
1.一種抑制肝星狀細(xì)胞增殖的方法，包括直接下調(diào)肝星狀細(xì)胞中連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝星狀細(xì)胞是體外的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝星狀細(xì)胞是體內(nèi)的。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述肝星狀細(xì)胞是受肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病影響的肝星狀細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述肝星狀細(xì)胞是活化肝星狀細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述下調(diào)包括遞送Snai1或編碼 Snail的核酸分子給肝星狀細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述下調(diào)包括遞送針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的siRNA或針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的siRNA編碼核酸分子給肝星狀細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述下調(diào)包括遞送針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的反義RNA或針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的反義RNA編碼核酸分子給肝星狀細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述下調(diào)包括遞送針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的DNA酶或針對(duì)Cx43轉(zhuǎn)錄物的DNA酶的編碼核酸分子給肝星狀細(xì)胞。
10.下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼下調(diào)連接蛋白43肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子在抑制肝星狀細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。
11.下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼下調(diào)連接蛋白43肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子在生產(chǎn)抑制肝星狀細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
12.下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼下調(diào)連接蛋白43肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子在治療對(duì)象的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
13.下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼下調(diào)連接蛋白43肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子在生產(chǎn)治療對(duì)象的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
14.用于抑制肝星狀細(xì)胞增殖的下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼下調(diào)連接蛋白43肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子。
15.用于治療對(duì)象的肝纖維化或肝纖維化相關(guān)疾病的下調(diào)連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑或編碼下調(diào)連接蛋白43肝星狀細(xì)胞增殖活性的試劑的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了抑制肝星狀細(xì)胞增殖的方法，包括直接下調(diào)肝星狀細(xì)胞中連接蛋白43的肝星狀細(xì)胞增殖活性以治療肝纖維化或相關(guān)疾病。本方法主要涉及用試劑如針對(duì)連接蛋白43轉(zhuǎn)錄物的Snai1、siRNA、反義RNA和DNA酶下調(diào)連接蛋白43。因此，引起活化肝星狀細(xì)胞增殖下調(diào)。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102405287SQ201080011861
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者G·毛巴赫, 卓朗, 林京稼 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局