專利名稱：與存在于人巨細胞病毒gB糖蛋白的AD1區(qū)域的特定的不連續(xù)表位結(jié)合的單克隆抗體及其 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與人巨細胞病毒(human Cytomegalovirus)(以下有時稱為“HCMV”) 結(jié)合的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。特別是涉及與HCMV的gB糖蛋白的ADl區(qū)域結(jié)合的人單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。
背景技術(shù)：
人巨細胞病毒(HCMV)與人皰疹病毒6型(HHV-6)、人皰疹病毒7型(HHV-7)相同， 屬于皰疹病毒科β皰疹病毒亞科。直徑約為180nm，在野生株中編碼165個基因，其是基因組大小約為2351Λρ (非專利文獻1和2、的雙鏈DNA病毒，在皰疹病毒科中是最大的。HCMV的種屬特異性強，不感染人以外的動物，但普遍感染人，在人體內(nèi)與廣泛的組織具有親和性。而且，一旦感染則在宿主的免疫建立后也不被排除，會終生保持。HCMV 一旦感染則終生潛狀感染，在日本人成人中9成以上已經(jīng)感染HCMV并帶有病毒，但在健康人中病毒活化引起疾病的情況很少見。但是，在艾滋病、癌癥、器官移植后、骨髓移植后、血液透析后等免疫缺陷狀態(tài)下， 該潛伏感染的HCMV產(chǎn)生再活化，有時會引起間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、胃腸炎、腦炎等根據(jù)情況會致死的嚴重的HCMV感染癥(非專利文獻3和4)。另外，如果胎兒期孕婦受到HCMV的原發(fā)感染，HCMV感染由孕婦經(jīng)由胎盤波及至胎兒，則會引發(fā)先天性CMV感染癥(congenital cytomegalovirus disease ；也稱為巨細胞包涵體病或先天性巨細胞包涵體病(cytomegalic inclusion disease))，引起流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡?；蛘?，不死亡的情況下有時也會引起低出生體重、肝脾腫大、黃疸、血小板減少性紫癜、小頭畸形、精神發(fā)育障礙、智力發(fā)育遲緩、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、聽覺障礙等。此外，在新生兒期或嬰兒期，當來自母親的HCMV抗體的轉(zhuǎn)移不充分時，有時也會由于經(jīng)產(chǎn)道、母乳、尿液或唾液等的HCMV感染而引發(fā)肝功能異常、間質(zhì)性肺炎、單核細胞增多癥等(非專利文獻3、 4 禾口 5)。HCMV感染癥已成為世界性的問題，正在推進能夠抑制上述HCMV所致的各種病態(tài)的發(fā)病或緩和該病態(tài)的預(yù)防或治療藥的開發(fā)。近年來，作為抑制HCMV的增殖的抗病毒藥， 已開發(fā)出更昔洛韋(Ganciclovir)(非專利文獻6和7)、磷甲酸(i^scarnet)(非專利文獻 8)、纈更昔洛韋(Valganciclovir)(非專利文獻9)等。更昔洛韋在細胞內(nèi)變?yōu)榛钚孕偷母袈屙f-三磷酸，是通過與作為DNA聚合酶的底物的脫氧鳥苷-三磷酸(dGTP)競爭性地拮抗來抑制DNA聚合酶、從而妨礙病毒DNA的合成的抗病毒藥，主要用于艾滋病等免疫缺陷狀態(tài)下的巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎的治療、CD4淋巴細胞數(shù)為100/mm3以下的晚期HIV感染癥中的巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎的發(fā)病抑制，作為醫(yī)藥品也受到了認可。但是，有報道指出更昔洛韋等抗病毒劑具有造血障礙等各種副作用，其使用方式如上所述受到限制。作為更昔洛韋的副作用，頻率最高、需要注意的是骨髄抑制伴發(fā)的血液障礙。白細胞、紅細胞、血小板異常減少，作為其初期癥狀，可以觀察到發(fā)燒、喉嚨疼痛、異常疲倦、皮下出血等出血傾向。根據(jù)情況，精神神經(jīng)系統(tǒng)可見異常，產(chǎn)生頭痛、眩暈、失眠、思考異常、焦慮感等。另外，在動物實驗中報道了致畸性、致突變性、致癌性，在妊娠中無法使用。除此之外，通過在先天性HCMV感染癥的重癥病例中使用更昔洛韋，具有減少神經(jīng)后遺癥表現(xiàn)和改善聽力衰退的發(fā)展等效果(非專利文獻10)，但關(guān)于作為更昔洛韋的副作用即骨髄抑制、致畸性、致癌性的問題，仍需要進行充分且慎重的研究。纈更昔洛韋是更昔洛韋的L-纈氨酸酯，在經(jīng)口給藥后通過腸道和肝臟的酯酶轉(zhuǎn)換成更昔洛韋。因此，作用機制和副作用與更昔洛韋相同，存在骨髄抑制、致畸性、致癌性的問題，在日本主要作為艾滋病等免疫缺陷狀態(tài)下的巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎的治療藥得到了認可。另一方面，磷甲酸是焦磷酸的類似物，與DNA聚合酶的焦磷酸結(jié)合位點直接作用而抑制DNA聚合酶，由此抑制HCMV的增殖。對于耐更昔洛韋的HCMV也有效。作為主要的副作用，有惡心、貧血、血清肌酐上升、嘔吐、低鎂血癥、低鉀血癥、感覺異常等，特別是出現(xiàn)休克、腎損害的頻率高，因此需要慎重給藥。在日本僅允許對艾滋病患者中確診為HCMV視網(wǎng)膜炎的患者或臨床上強烈疑似HCMV視網(wǎng)膜炎的患者使用，不能以預(yù)防感染為目的使用(非專利文獻8)。由上述內(nèi)容可知，迫切期望開發(fā)出能夠預(yù)防上述HCMV所致的各種疾病的發(fā)病或緩和其癥狀、并且無副作用的藥物。其中，迄今為止作為抗HCMV抗體已進行了兩件臨床開發(fā)，一件是專利文獻3中記載的抗HCMV抗體“C23 (開發(fā)時被稱為TI-23) ”，其為識別gB糖蛋白的AD2區(qū)域的抗體，另一件是專利文獻4中記載的抗HCMV抗體“SDZ MSL 109”，其為識別HCMV表面的gH糖蛋白的單克隆抗體。特別是C23，據(jù)報道具有高中和活性，由空斑法求得的50%阻止?jié)舛葹?. 5 μ g/mL(非專利文獻11)，但中途放棄了開發(fā)。另一方面，對于HCMV的疫苗也進行了深入的開發(fā)，但現(xiàn)狀是尚未得到可耐臨床使用的疫苗。此外，近年來，開發(fā)出人源抗CMV高效價丙種球蛋白制劑，在美國在應(yīng)對腎移植伴發(fā)的HCMV感染癥的發(fā)病預(yù)防方面得到認可。但是，由于抗CMV高效價丙種球蛋白制劑是人源血液制劑，因此還存在各種問題。例如，由于是人來源丙種球蛋白的混合物，因此批次間的活性存在較大偏差，且活性低，另外供給量有限，此外還常伴有未知的病原性病毒、病原體的混入等風(fēng)險等。因此，能夠與HCMV結(jié)合且中和其感染性(使其生物學(xué)活性喪失)的單克隆抗體 (以下有時稱為“抗HCMV抗體”)，作為HCMV所致的各種病態(tài)的預(yù)防或治療藥受到期待，例如，對于免疫缺陷狀態(tài)的患者，在針對因HCMV而引起的各種疾病的預(yù)防或治療戰(zhàn)略上非常有用。S卩，認為為了使HCMV的活性喪失從而預(yù)防疾病的發(fā)病或緩和癥狀，將對HCMV具有強親和性和高中和能力、且不顯示過敏反應(yīng)的人源抗HCMV抗體作為所謂“抗體藥物”進行給藥是特別有效的。
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但是，迄今為止所報道的HCMV抑制抗體(例如，專利文獻1、2、3、4和幻在對于 HCMV的親和性和中和能力等方面是不充分的，因此無法期待充分抑制HCMV的生物活性并預(yù)防HCMV所引起的各種疾病的發(fā)病或緩和其癥狀。因此，迫切期望開發(fā)出作為不引起異物識別應(yīng)答的人單克隆抗體、對于HCMV的親和性、特異性和中和能力優(yōu)異、可期待作為預(yù)防或治療藥應(yīng)用的抗HCMV抗體及其抗原結(jié)合片段。此外，最近有文獻指出為了抑制HCMV在生物體內(nèi)的增殖，不僅中和活性很重要， 阻止細胞間感染也很重要(非專利文獻12和13)，因而迫切期望兼具細胞間感染阻止活性的抗HCMV抗體?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 日本特表平8-50M03號公報專利文獻2 日本特表平8-506325號公報專利文獻3 :W087/03602專利文獻4 :W093/021952專利文獻5 :W02007/094423非專利文獻非專利文獻 1 :Davison, A. J. et al. , The human cytomegalovirus genome revisited comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J. Gen. Virol., 2003 ；84 :pl7-28非專利文獻 2 :Dolan, A. et al. , Genetic content of wild-type human cytomegalovirus. J. Gen. Virol. , 2004 ；85 :pl301_1312非專利文獻3 :多屋馨子，感染癥O話寸^卜j力· 口々^ > ；^感染癥， Infectiou Diseases Weekly Report Japan. 2003 ；第 15週10-14# 專禾Ij JC ^ 4 Griffiths, P. D. , The treatment of cytomegalovirus infection. J. Anti. Chemo. ，2002 ；49 :p243-253非專利文獻 5 :Demmler, G. J. , Congential cytomegalovirus infection and disease. Seminars in Pediatric Infection Diseases. Seminors in Pediatric Infectious Diseases, 1999 ；10 :pl95_200非專禾Ij 文獻 6 :Freitas， V. R. et al. , Activity of9- (1, 3-dihydroxy-2-Propoxymethel)guanine compared with that of acyclovir against human, monkey, and rodent cytomegaloviruses. Anti. Agent Chemo. , 1985 ；28 :p240_245非專利文獻7 :田辺三菱製薬株式會社、抗寸^卜 > 力‘π々4 > ^化學(xué)療法剤7 )>點滴靜注用500mg、if > *々α if義製剤?zhí)砀段臅?2007年10月改訂)非專利文獻8 7 7卜，七才、力株式會社、抗々4 > 7剤點滴注射用‘于、7力 > 匕· ^ 24mg/mL才、7力A才、7卜f卜·J々么水和物注射剤?zhí)砀段臅?2007年6月改訂)非專利文獻9 田辺三菱製薬株式會社、抗寸^卜 > 力‘π々4 > ^化學(xué)療法剤八 'J今寸錠4500mg、A y ^y >7 η 義塩酸塩製剤?zhí)砀段臅?2007年10月改訂)
]非專利文獻 10 :Kimberlin, D. W. et al. , Effect of ganciclovir therapy onhearing in symptomatic congental cytomegalovirus disease involving the central nervous system ；randomized,controlled trial. J. Pediatr. , 2003 ；143 :16-25非專 利文 獻 11 :Masuho, Τ. , et al. , Human monoclonal antibodies neutralizing human cytomegalovirus. J. Gen. Virol, 1987 ；68 :pl457_1461非專利文獻 12 :Navarro、D. et al. ,Glycoprotein B of human cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells. Virology, 1993 ; 197 :pl43_158非專利文獻 13 :0hizumi,Y. ,Neutralizing mechanism of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein 130/55. J. Gen. Virol., 1992 ；73 :p2705-270
發(fā)明內(nèi)容
由以上可知，與HCMV特異性結(jié)合且充分抑制其生物活性的抗體或抗原結(jié)合片段， 在針對因HCMV而引起的各種疾病的治療戰(zhàn)略上或預(yù)防戰(zhàn)略上非常有用。另一方面，目前作為醫(yī)藥品得到認可的大部分抗體藥物，其給藥量非常大，每天數(shù) mg 數(shù)百mg，而且價格昂貴。除抗體醫(yī)藥品之外的迄今為止上市的生物醫(yī)藥品，大多每天的給藥量為數(shù)十μ g lmg。與此相比，抗體醫(yī)藥品每天所需的給藥量是迄今為止的生物醫(yī)藥品的約10倍至1000倍，差距非常大。HCMV會導(dǎo)致各種疾病狀態(tài)，對于這些疾病的治療， 當考慮到波及新生兒、幼兒和孕婦的可能性時，重要的課題在于活性高且治療用量少、可較低地抑制治療費等。即，雖為抗體藥物但要求高生物活性，從醫(yī)療費等方面出發(fā)，親和性越優(yōu)異且具有越高的中和能力則作為醫(yī)藥品的有用性越高。另外，關(guān)于抗體醫(yī)藥品，雖然所需生產(chǎn)量大幅增加，但生產(chǎn)設(shè)備在世界范圍內(nèi)處于不足狀態(tài)。從這樣的狀況出發(fā)，如果是親和性和中和能力優(yōu)異的抗體，則能夠以更少的量發(fā)揮效果，因此期望具有更高親和性和中和能力的人抗HCMV單克隆抗體。而且，HCMV原本在體內(nèi)就對廣泛的組織和細胞種類具有感染性(Sinzger，C. et al.，Curr Top Microbiol Immunol.，2008 ；325 :p63_83)，因而認為，就抗HCMV抗體顯示臨床效果的方面而言，重要的是，無論感染宿主細胞為成纖維細胞型和上皮細胞/內(nèi)皮細胞型中的任何一種類型，均具有有效的中和活性。此外，如果考慮到HCMV在生物體內(nèi)的感染擴大的方式，則期望該抗HCMV抗體不僅具有單純的中和能力，而且還兼具阻止細胞間感染的能力。進而，如果考慮到作為醫(yī)藥品的有效性和安全性，則期望提供含有對于導(dǎo)致各種疾病狀態(tài)的HCMV具有高中和能力和細胞間感染阻止能力的人源單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明人為了獲得如上所述的抗體進行了不懈努力，結(jié)果通過創(chuàng)造性的研究成功地獲得了一種人單克隆抗體，該抗體可特異性識別存在于HCMV gB糖蛋白上的ADl區(qū)域中的、迄今為止未報道過的不連續(xù)表位，并且兼具高中和能力和高細胞間感染阻止能力，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及以下所述的抗HCMV單克隆抗體或其結(jié)合性片段、編碼該抗體或結(jié)合性片段的DNA(多核苷酸)、含有該DNA的載體、含有該載體的宿主細胞等。[1] 一種抗體或其抗原結(jié)合片段，與人巨細胞病毒(HCMV)gB糖蛋白的ADl區(qū)域結(jié)合，其識別存在于ADl區(qū)域中的序列號25的氨基酸序列、序列號沈的氨基酸序列和序列號 27的氨基酸序列構(gòu)成的不連續(xù)序列作為表位。[2] 一種抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體為與人巨細胞病毒(HCMV)gB糖蛋白的 ADl區(qū)域特異性結(jié)合、且能夠中和其生物活性的單克隆抗體，其中，(i)重鏈的可變區(qū)含有(a)選自由序列號13的氨基酸序列、和序列號13的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDRl的氨基酸序列、(b)選自由序列號14的氨基酸序列、和序列號14的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)選自由序列號15的氨基酸序列、序列號15的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、和序列號22所示的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR3的氨基酸序列；以及(ii)輕鏈的可變區(qū)含有(a)選自由序列號16的氨基酸序列、和序列號16的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDRl的氨基酸序列、(b)選自由序列號17的氨基酸序列、和序列號17的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)選自由序列號18的氨基酸序列、和序列號18的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR3的氨基酸序列。[3]如上述[2]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與由HCMV-gB糖蛋白的549 580位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(序列號2 和596 640位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(序列號24)的區(qū)域中存在的2個以上的不連續(xù)序列構(gòu)成的表位特異
性結(jié)合。[4]如上述[2]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其識別存在于HCMV-gB糖蛋白的 ADl區(qū)域中的序列號25的氨基酸序列、序列號沈的氨基酸序列和序列號27的氨基酸序列構(gòu)成的不連續(xù)序列作為表位。[5]如上述[3]或[4]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有⑴(a)包含序列號13的氨基酸序列的重鏈⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列號14的氨基酸序列的重鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)選自由序列號22的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR3的氨基酸序列；以及(ii)(a)包含序列號16的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列號17的氨基酸序列的輕鏈CDR2的氨基酸序列、和
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(c)包含序列號18的氨基酸序列的輕鏈⑶R3的氨基酸序列。[6]如上述[5]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有⑴(a)包含序列號13的氨基酸序列的重鏈⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列號14的氨基酸序列的重鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列號15的氨基酸序列的重鏈CDR3的氨基酸序列；以及(ii)(a)包含序列號16的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列號17的氨基酸序列的輕鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列號18的氨基酸序列的輕鏈⑶R3的氨基酸序列。[7]如上述[2]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)由序列號10的氨基酸序列、序列號10的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號10的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū) (HCVR)；以及(b)由序列號12的氨基酸序列、序列號12的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號12的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū) (LCVR)。[8]如上述[7]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)包含序列號10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)、和(b)包含序列號12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。[9]如上述[2]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，(a)序列號2或6的氨基酸序列、序列號2或6的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號2或6的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的重鏈(H 鏈)；以及(b)序列號4或8的氨基酸序列、序列號4或8的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號4或8的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的輕鏈(L 鏈)。[10]如上述[9]所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)包含序列號2或6的氨基酸序列的重鏈(H鏈)、和(b)包含序列號4或8的氨基酸序列的輕鏈(L鏈)。[11]如上述[1] [10]中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，上述抗體為人單克隆抗體。[12]如上述[1] [11]中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，上述抗體的類(亞類)為IgGlU)。[13]如上述[1] [12]中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其對于HCMV的實驗室株(AD169)在人成纖維細胞存在下的50%空斑形成阻止?jié)舛葹?. 05μ g/mL(約 0. 3nM)以下。[14]如上述[1] [13]中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其在預(yù)先用 HCMV的實驗室株(AD169)感染人成纖維細胞(MRC-5)的體系中，在0. 2 μ g/mL(約1. 3nM) 以下具有50%以上的細胞間感染阻止能力。[15] 一種用于預(yù)防或治療人巨細胞病毒(HCMV)相關(guān)疾病的醫(yī)藥組合物，其含有上述[1] [14]中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段以及藥學(xué)上可接受的載體。[16]如上述[15]所述的醫(yī)藥組合物，其中，HCMV相關(guān)疾病為(a)免疫缺陷狀態(tài)下的HCMV的再活化所致的間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、胃腸炎或腦炎；(b)HCMV感染由孕婦波及到胎兒所致的先天性CMV感染癥；(c)由上述先天性CMV感染癥引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡；(d)上述先天性CMV感染癥未致死亡時引起的低出生體重、肝脾腫大、黃疸、血小板減少性紫癜、小頭畸形、精神發(fā)育障礙、智力發(fā)育遲緩、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或聽覺障礙；或者(e) 在新生兒期或嬰兒期因HCMV感染而發(fā)病的肝功能異常、間質(zhì)性肺炎或單核細胞增多癥。[17] 一種分離的核酸，其編碼與HCMV gB糖蛋白的ADl區(qū)域特異性結(jié)合、且能夠中和其生物活性的抗HCMV單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述核酸選自以下核酸編碼選自由序列號2、4、6、8、10、12、13 18和22組成的組中的氨基酸序列的核酸、以及與該核酸在高嚴格條件下雜交的核酸。[18] 一種載體，其中，重組有上述[17]所述的核酸。[19] 一種宿主細胞，其中，導(dǎo)入有上述[18]所述的載體。[20]如上述[1] [14]中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段的制作方法，其中， 包括培養(yǎng)上述[19]所述的宿主細胞的步驟。本發(fā)明的抗HCMV抗體、特別是與HCMV-gB糖蛋白的ADl區(qū)域特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，例如在免疫缺陷狀態(tài)下，能夠與導(dǎo)致各種疾病的HCMV特異性結(jié)合，使其生物活性喪失(中和)，從而對HCMV發(fā)揮優(yōu)異的中和能力。另外，在本發(fā)明的抗HCMV-gB糖蛋白ADl抗體為人單克隆抗體的實施方式中具有如下優(yōu)點無免疫原性，也未觀察到免疫反應(yīng)。本發(fā)明的抗HCMV抗體的一個實施方式，對于HCMV還具有較高的細胞間感染阻止能力或細胞間感染阻止活性。如果考慮到HCMV在生物體內(nèi)的感染擴大的方式，則該抗HCMV 抗體不僅具有單純的中和能力還兼具阻止細胞間感染的能力是很有利的。本發(fā)明的抗HCMV抗體或其抗原結(jié)合片段，對于HCMV具有高中和能力和阻止感染擴大的活性，而且在人單克隆抗體的實施方式中不具有免疫原性，因此認為其作為因HCMV 所引起的各種疾病的預(yù)防或治療藥是有用的，例如(a)艾滋病、癌癥、器官移植后、骨髄移植后和血液透析后等免疫缺陷狀態(tài)下的HCMV的再活化所致的間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、胃腸炎、腦炎等各種疾??；(b)HCMV感染由孕婦波及到胎兒所致的先天性CMV感染癥；(c)由上述先天性CMV感染癥引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡；(d)上述先天性CMV感染癥未致死亡時引起的低出生體重、肝脾腫大、黃疸、血小板減少性紫癜、小頭畸形、精神發(fā)育障礙、智力發(fā)育遲緩、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或聽覺障礙；(e)新生兒期或嬰兒期因HCMV感染而發(fā)病的肝功能異常、間質(zhì)性肺炎或單核細胞增多癥等(非專利文獻3、4和5)。另外，含有本發(fā)明的特別優(yōu)選的人單克隆抗體的醫(yī)藥組合物，在極少量時即有效。
此外，近來，作為抗HCMV抗體，還進行了以gH、gL等gB糖蛋白以外的各種表面抗原為靶標的研究，但當考慮到下述(1) (3)的情況時，像本發(fā)明抗體這樣，與gB糖蛋白、 特別是ADl區(qū)域特異性結(jié)合且具有高中和活性的抗體作為HCMV感染癥的預(yù)防或治療藥是非常有用的。(1)有文獻指出，為了抑制HCMV等在生物體內(nèi)的病毒增殖，不僅中和活性很重要， 而且阻止細胞間感染也很重要(非專利文獻12和13)，并且，在最近的gB糖蛋白的研究中，有文獻表明，對于病毒粒子侵入細胞和細胞間感染，gB發(fā)揮了重要的作用(Isaacson， Μ.K. et al.，Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment， assembly, or egress. J. Virology，2009 ；83 :p3891_3903)，針對gB的抗體很有可能還有助于抑制細胞間感染。(2)在HCMV感染所必需的gB糖蛋白中，ADl區(qū)域?qū)τ趃B的功能和立體結(jié)構(gòu)的形成是必需的部分(Qadri, I. et al. ,Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus. J. Gen. Virol, 1992 ；73 ； p2913_2921 ；禾口Britt，W. J. et al. ,Antigenic domain is required for oligomerization of human cytomegalovirus glycoprotein B. J. Virol. , 2005 ；79 :p4066_4079)，并且其在臨床分離的病毒株中也是作為突變少的部分而已知的，因而針對ADl的抗體可能是廣譜的抗體。(3)與AD2區(qū)域的抗體相比，對涉及gB上的較長區(qū)域的不連續(xù)表位進行識別的 ADl抗體的特異性高，因而認為與其他生物分子發(fā)生交叉反應(yīng)而產(chǎn)生無法預(yù)料的副作用的可能性低。


圖1是用流程圖表示產(chǎn)生本發(fā)明的抗HCMV抗體的抗體產(chǎn)生細胞克隆的分離步驟的圖。圖2是對構(gòu)成EV2038 CDR-H3的16個殘基的氨基酸進行非保守性氨基酸取代時， 評價對于ADl的結(jié)合能力。圖3是對EV2038H鏈的121、123、124、1 位進行保守性氨基酸取代時，評價對于 ADl的結(jié)合能力。圖4是將EV2038H鏈的125位的脯氨酸取代成除脯氨酸和精氨酸以外的所有氨基酸時，評價對于ADl的結(jié)合能力。圖5是對構(gòu)成EV2038 CDR-H3的氨基酸中在上述圖2的非保守性氨基酸取代時對于ADl的結(jié)合能力未降低的氨基酸殘基進行保守性氨基酸取代時，評價對于ADl的結(jié)合能力。圖6是在構(gòu)成EV2038⑶R-H3的氨基酸中在非保守性氨基酸取代時對于ADl的結(jié)合能力降低的氨基酸殘基中，以除125位的脯氨酸以外的殘基(121、123、1M和1 位的共四個殘基)為對象，制作共四種在兩處或四處同時進行取代的變異體(兩處取代體I124V/GU6A、I124V/G126S ；四處取代體L121I/W123Y/I124V/GU6A、L121I/W123Y/ I1MV/GU6S)，評價對于ADl的結(jié)合能力。圖7是在構(gòu)成EV2038⑶R-H3的氨基酸中在非保守性氨基酸取代時對于ADl的結(jié)合能力降低的氨基酸殘基中，以除125位的脯氨酸以外的殘基(121、123、1M和1 位的共四個殘基)為對象，制作缺失、插入的各一種變異體(E122del和GU6_D127insE)，評價對于 ADl的結(jié)合能力。圖8是EV2038⑶R-H2區(qū)域的79位的氨基酸殘基的變異體對于ADl的結(jié)合能力的評價。圖9中，(A)圖示出在表位區(qū)域的解析中使用的gB糖蛋白ADl區(qū)域的缺失變異體的克隆，(B)是示出使用這些缺失變異體的蛋白免疫印跡分析結(jié)果的圖。圖10中，㈧是示出使用肽陣列的EV2038的表位·定位的結(jié)果的圖。(B)中，在 gB糖蛋白的氨基酸序列上圖示出上述解析結(jié)果，并且示出了使用EV2038的缺失變異體的解析結(jié)果、以及過去曾報道過的ITC52的表位序列。圖11是示出本發(fā)明的抗HCMV抗體的中和活性評價結(jié)果的圖表。㈧是示出在補體存在下作為陰性對照的對HCMV無特異性的人單克隆抗體(hlgG)、和作為抗ADl抗體的 EV2001(在專利文獻5中公開)對于人巨細胞病毒(AD169株)的中和活性的圖表；(B)是示出在補體存在下hlgG和抗HCVM單克隆抗體(EV2038和HCMV16)對于人巨細胞病毒(AD169 株)的中和活性的圖表；(C)是示出在不存在補體的情況下作為陰性對照的hlgG和EV2001 對于人巨細胞病毒(AD169株)的中和活性的圖表；(D)是示出在不存在補體的情況下hlgG 和抗HCMV單克隆抗體(EV2038和HCMV16)對于人巨細胞病毒(AD169株)的中和活性的圖表。
具體實施例方式1.本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段根據(jù)本申請發(fā)明的一個實施方式，提供與人巨細胞病毒(HCMV)的gB糖蛋白特異性結(jié)合且能夠中和其生物活性的抗體或其抗原結(jié)合片段。在更具體的實施方式中，提供與 HCMV的gB糖蛋白的ADl區(qū)域中存在的不連續(xù)表位特異性結(jié)合、且能夠中和該蛋白的生物活性的抗體或其抗原結(jié)合片段?！叭司藜毎《?HCMV)的gB糖蛋白”(或者“HCMV gB糖蛋白”或“HCMB-gB糖蛋白”)是構(gòu)成HCMV的外殼的主要糖蛋白之一，已知其有助于病毒粒子侵入細胞、細胞融合和病毒的細胞間感染。HCMV gB糖蛋白的氨基酸序列(HCMV病毒的代表株AD169株的氨基酸序列)能夠從可公開利用的序列數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot)中以登錄號P06473的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號137)而獲得?！叭司藜毎《?HCMV)的gB糖蛋白的ADl區(qū)域”或“HCMV gB糖蛋白ADl區(qū)域”， 是指由HCMV gB糖蛋白的氨基酸序列中552-635位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的區(qū)域(Wagner 等，Journal of Virology, Vol. 66, No. 9，Sept. 1992，p. 5290—5297)。本說明書中，“表位”以本領(lǐng)域中通常使用的含義來使用，是指作為抗體結(jié)合的對象的、抗原分子的較小的部分結(jié)構(gòu)(巖波生物學(xué)事典第4版(1996年第1次印刷發(fā)行))。根據(jù)本發(fā)明的更具體的實施方式，ADl區(qū)域中存在的不連續(xù)表位存在于由人巨細胞病毒(HCMV)gB糖蛋白的549 580位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(序列號23) 和596 640位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(序列號24)的區(qū)域中。更具體而言， 上述不連續(xù)表位由序列號25的氨基酸序列、序列號沈的氨基酸序列和序列號27的氨基酸
13序列構(gòu)成。在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段含有(a)包含序列號2或6的氨基酸序列的重鏈(H鏈)、和(b)包含序列號4或8的氨基酸序列的輕鏈(L鏈)；該抗體或抗原結(jié)合片段與人巨細胞病毒的gB糖蛋白特異性結(jié)合，能夠中和其生物活性?；蛘?，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段含有(a)包含序列號10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)、和(b)包含序列號12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)；該抗體或抗原結(jié)合片段與與人巨細胞病毒的gB糖蛋白特異性結(jié)合，能夠中和其生物活性?；蛘撸景l(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段中，(i)重鏈的可變區(qū)的CDR(互補決定區(qū)，Complementarity Determining Region) 1、 ⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別含有(a)序列號13的氨基酸序列、(b)序列號14的氨基酸序列、和(c)序列號15的氨基酸序列；(ii)輕鏈的可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別含有(a)序列號16的氨基酸序列、(b)序列號17的氨基酸序列、和(c)序列號18的氨基酸序列，該抗體或抗原結(jié)合片段與人巨細胞病毒的gB糖蛋白特異性結(jié)合，能夠中和其生物活性。此外，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段還包含與人巨細胞病毒的gB糖蛋白特異性結(jié)合且能夠中和其生物活性的、上述抗體或抗原結(jié)合片段的功能性等價物，例如含有(a)序列號2或6的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、 添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號2或6的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的重鏈(H鏈)；以及(b)序列號4或8的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、 添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號4或8的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的輕鏈(L鏈)?；蛘?，上述抗體或抗原結(jié)合片段的功能性等價物含有(a)序列號10的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號10的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)(HCVR)；以及(b)序列號12的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號12的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)(LCVR)?；蛘?，上述抗體或抗原結(jié)合片段的功能性等價物含有
(i)(a)選自由序列號13的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR1、(b)選自由序列號14的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR2、 禾口(c)選自由序列號15的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、和序列號22所示的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR3 ；以及(ii)(a)選自由序列號16的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR1、(b)選自由序列號17的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR2、 禾口(C)選自由序列號18的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR3。上述功能性等價物的氨基酸序列中的突變數(shù)的上限，以是否與HCMV的gB糖蛋白特異性結(jié)合且能夠中和其生物活性為指標來決定。HCMV的中和活性例如可以通過后述的實施例9和10中記載的方法來評價。另外，細胞間感染抑制能力的評價例如可以通過實施例 11所示的方法來評價。本說明書中使用的“抗體”這一用語，是指四條多肽鏈、即兩條重(H)鏈和兩條輕 (L)鏈通過二硫鍵相互連接而構(gòu)成的免疫球蛋白分子。本申請發(fā)明中的單克隆抗體也由分別包含兩條輕鏈(L鏈)和重鏈(H鏈)的免疫球蛋白分子構(gòu)成。各H鏈由H鏈可變區(qū)(有時稱為“HCVR”或“VH”)、H鏈恒定區(qū)(H鏈恒定區(qū)包括三個結(jié)構(gòu)域，有時分別稱為“CH1”、 “CH2”、“CH3”(總稱CH))構(gòu)成。各L鏈由L鏈可變區(qū)(有時稱為“LCVR”或“八”)和L鏈恒定區(qū)(L鏈恒定區(qū)包括一個結(jié)構(gòu)域，有時稱為“CJ)構(gòu)成。特別是HCVR和LCVR，從與抗體的結(jié)合特異性相關(guān)的方面來看是很重要的。抗體主要通過LCVR和HCVR的氨基酸殘基與靶抗原相互作用，因此可變區(qū)內(nèi)的氨基酸序列與位于可變區(qū)外的序列相比，在各個抗體之間的差異更大。此外，在HCVR和LCVR中，還可以進一步細分成在各種抗體間保持更恒定的、稱為骨架區(qū)(FR)的區(qū)域和稱為互補決定區(qū)(CDR)的超可變區(qū)。HCVR和LCVR分別包括三個CDR和四個FR，它們依次按照FRl、CDRl、FR2、CDR2、 FR3、⑶R3、FR4的順序從氨基末端排列至羧基末端?？贵w的“抗原結(jié)合片段”(或簡稱為“抗體片段”)這一用語，是指具有與抗原(例如HCMV)特異性結(jié)合的能力的一個或多個抗體片段。需要說明的是，該片段還包括具有與抗原特異性結(jié)合的最小限度的氨基酸序列的肽。另外，“抗原結(jié)合片段”中還包括具有與抗原特異性結(jié)合的抗體的可變區(qū)、互補決定區(qū)的單鏈抗體(scFV)、雙特異性抗原、多特異性抗原等。需要說明的是，本說明書中，為了簡化，也將“抗體或抗原結(jié)合片段”簡稱為“抗體”?！澳軌蛑泻虷CMV的生物活性的抗體”，是指通過與HCMV或HCMV感染細胞結(jié)合而抑制HCMV的生物活性的抗體。作為“HCMV的生物活性”，代表性地包含引起以下(a) (e)所例示的疾病的HCMV 的活性，但不限定于此，也包括可誘發(fā)因活化的HCMV的活動而引起的各種疾病的HCMV的活性(a)艾滋病、癌癥、器官移植后、骨髄移植后、血液透析后等免疫缺陷狀態(tài)下的 HCMV的再活化所致的間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、胃腸炎、腦炎等各種疾病；(b)HCMV感染由孕婦波及到胎兒所致的先天性CMV感染癥；(c)由上述先天性CMV感染癥引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡；(d)上述先天性CMV感染癥未致死亡時引起的低出生體重、肝脾腫大、黃疸、血小板減少性紫癜、小頭畸形、精神發(fā)育障礙、智力發(fā)育遲緩、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或聽覺障礙；(e)新生兒或嬰兒期因HCMV感染而發(fā)病的肝功能異常、間質(zhì)性肺炎、單核細胞增多癥等(非專利文獻3、4和5)。本說明書中使用的“由HCMV引起的疾病”這一用語，包括表明或者可以認為患有該疾病的被測對象具有HCMV是該疾病的病理生理原因、或者是使該疾病惡化的原因之一的疾病以及其他疾病。因此，可以預(yù)測對于HCMV的生物活性為病因的疾病，通過抑制HCMV 的生物活性，可以緩和該疾病的癥狀和/或發(fā)展。這樣的疾病例如通過使用上述抗HCMV抗體可以使癥狀緩和或治愈。具體而言，通過提高患該疾病的被測對象的生物學(xué)流體中的抗 HCMV抗體濃度(例如，提高被測對象的血清、血漿、滑液中的抗HCMV抗體的濃度)，可以證明上述疾病。本說明書中使用的“抑制效果”、“抑制”(阻害)、“抑制”(抑制)、“能夠抑制”等用語是指，使起因于抗原(HCMV)的生物活性降低約5 100%、優(yōu)選10 100%、更優(yōu)選20 100%、更優(yōu)選30 100%、更優(yōu)選40 100%、更優(yōu)選50 100%、更優(yōu)選60 100%、更優(yōu)選70 100%、進一步優(yōu)選80 100%?？勺儏^(qū)的氨基酸序列承擔(dān)著一大半的抗體-抗原相互作用，因此如果將以特定的天然產(chǎn)生型的抗體為來源的可變區(qū)序列或CDR部分的序列移植至具有不同性質(zhì)的不同抗體來源的恒定區(qū)或骨架序列，構(gòu)建以上述狀態(tài)含有上述可變區(qū)序列或CDR部分的序列的表達載體，則能夠表達仿效特定的天然產(chǎn)生型抗體的性質(zhì)的重組抗體。因此，在重新制作與原來的抗體具有同樣的結(jié)合特性的完整重組抗體時，不需要獲得特定抗體的全部序列。只要有該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列或CDR部分的序列， 對于該目的而言有時也是足夠的。序列號13、14和15是分別與重鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3對應(yīng)的氨基酸序列。另夕卜， 序列號16、17和18是分別與輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3對應(yīng)的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的優(yōu)選抗體是序列號13、14、15、16、17、和18分別與重鏈的⑶Rl、⑶R2和⑶R3、以及輕鏈的 ⑶R1、⑶R2和⑶R3對應(yīng)的情況。但是，只要是與HCMV特異性結(jié)合且能夠中和其生物活性的單克隆抗體，則不需要序列號13、14、15、16、17、和18分別與重鏈的⑶Rl、CDR2和CDR3、 以及輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3對應(yīng)。特別是重鏈的⑶R-3，可以是選自序列號22所示的氨基酸序列組中的氨基酸序列。另外，只要具有上述中和活性，則CDR序列可以是在選自序列號13、14、15、16、17和18的各組中的氨基酸序列中具有1個 幾個(具體而言，為1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1個)氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列。CDR以外的氨基酸序列沒有特別限定，CDR以外的氨基酸序列來源于其他抗體、特別是其他種屬的抗體的所謂CDR移植抗體也包括在本發(fā)明的抗體中。其中，優(yōu)選CDR以外的氨基酸序列也來源于人的抗體，根據(jù)需要骨架區(qū)(FR)也可以具有1個 幾個(具體個數(shù)與上述相同)氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變。這些抗體的制作方法可以使用公知的方法(Riechmann L, et al.，Reshaping human antibodies for therapy. Nature，332 :323_327，1988)。本發(fā)明中，當然優(yōu)選完全人抗體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個以上的氨基酸殘基缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合是指，在同一序列中任意的1個或多個氨基酸序列中的位置上，具有1個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、插入或添加，可以同時發(fā)生缺失、取代、插入和添加中的兩種以上。構(gòu)成自然界的蛋白質(zhì)的氨基酸，可以根據(jù)其側(cè)鏈的特性進行分組，例如，作為具有同樣特性的氨基酸組，可以分類為芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、中性氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有烴鏈的氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸)、及其他(甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)的組等。作為包括非天然型氨基酸在內(nèi)的能夠相互取代的氨基酸殘基的例子，還有下述的分組，同一組中所含的氨基酸殘基能夠相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、 環(huán)己基丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4_ 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。本發(fā)明中，進一步優(yōu)選的抗體含有(a)序列號10的氨基酸序列；序列號10的氨基酸序列中具有1個 幾個(具體而言，為1 9個、1 8個、1 7個、1 6個、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個或1 個)氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列；或與序列號10的氨基酸序列具有95%以上(優(yōu)選96%以上、97%以上、98%以上、 99%以上或99. 5%以上)的同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)(HCVR)；和(b)序列號12的氨基酸序列；序列號12的氨基酸序列中具有1個 幾個(具體個數(shù)與上述相同)氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列；或與序列號12的氨基酸序列具有95%以上(具體的百分數(shù)與上述相同)的同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。需要說明的是，氨基酸序列或堿基序列的同一性可以使用Karlin和Altschul提出的算法 BLAST (Proc. Natl. Acad. ki. USA 872264-2268,1990 ；proc Natl Acad Sci USA 90 :5873,1993)來確定。已開發(fā)出基于BLAST的算法的、稱為BLASTN和BLASTX的程序 (Altschul SF, et al J Mol Biol 215:403,1990)。使用 BLASTN 分析堿基序列時，參數(shù)例如設(shè)為score = 100、wordlength = 12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如設(shè)為score = 50,wordlength = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，利用各程序的默認參數(shù)。本發(fā)明中，進一步優(yōu)選的抗體含有(a)序列號10的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)(HCVR)和(b)序列號12的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。本發(fā)明中，進一步優(yōu)選的抗體含有(a)序列號6的氨基酸序列；序列號6的氨基酸序列中具有1個 幾個(具體個數(shù)與上述相同)氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列；或與序列號6的氨基酸序列具有 95%以上(具體的百分數(shù)與上述相同)的同一性的氨基酸序列所示的重鏈(H鏈)；和(b) 序列號8的氨基酸序列；序列號8的氨基酸序列中具有1個 幾個(具體個數(shù)與上述相同) 氨基酸殘基的缺失、取代、插1入、添加或這些1突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列；或與序列號8的氨基酸序列具有95%以上(具體的百分數(shù)與上述相同)的同一性的氨基酸序列所示的輕鏈(L鏈)。本發(fā)明中最優(yōu)選的抗體為含有序列號6的氨基酸序列所示的重鏈(H鏈)和序列號8的氨基酸序列所示的輕鏈(L鏈)的完全人單克隆抗體。另外，本發(fā)明中優(yōu)選的抗體的類(亞類)為IgGl(A)0上述本發(fā)明的抗HCMV抗體或其抗原結(jié)合片段的特征在于，與導(dǎo)致各種疾病的 HCMV特異性結(jié)合且中和其生物活性，與現(xiàn)有的抗HCMV抗體相比具有更高的中和能力。在此，“特異性結(jié)合”是指識別規(guī)定的抗原并與其結(jié)合。典型地，本發(fā)明的抗體與HCMV(特別是人HCMV)的解離常數(shù)(Kd值)優(yōu)選為 IX IO-7M以下，更優(yōu)選為IX 10- 以下，進一步優(yōu)選為IX IOl以下，最優(yōu)選為IX IO-iciMW 下。為了測定抗體與HCMV的解離常數(shù)，可以使用公知的方法。例如，可以利用固定在芯片上的抗HCMV抗體，通過BIAC0RET100 (注冊商標)等蛋白質(zhì)相互作用分析裝置進行測定。關(guān)于抗HCMV抗體的中和能力，可以通過考察用免疫染色法測得的感染阻止率或空斑形成阻止率來進行評價。即，在將HCMV的代表株AD169株或Towne株接種到能夠感染的細胞培養(yǎng)體系中時，預(yù)先使其與各種濃度的抗HCMV抗體接觸一定時間，然后將它們接種至細胞，感染M小時后通過免疫染色測定HCMV感染細胞數(shù)并求出感染阻止率，或者在感染 5 6天后由所形成的空斑數(shù)求出其阻止率，由此能夠測定抗HCMV抗體的中和活性。本發(fā)明的抗HCMV抗體或其抗原結(jié)合片段，以對于AD169株的中和活性計，優(yōu)選在 1 μ g/mL(約7nM)以下、更優(yōu)選在0. 1 μ g/mL(約0. 7nM)以下、進一步更優(yōu)選在0. 05 μ g/ mL(約0. 3nM)以下、最優(yōu)選在約0.03 μ g/mL(約0.2ηΜ)以下具有約50%的空斑形成阻止能力。另外，作為細胞間感染阻止能力，可以通過將預(yù)先感染了 HCMV的細胞培養(yǎng)一定時間后，在該細胞培養(yǎng)體系中添加各種濃度的抗HCMV抗體來評價細胞間感染的抑制效果。本發(fā)明的抗HCMV抗體或其抗原結(jié)合片段，優(yōu)選在終濃度2μ g/mL(約13nM)以下、 更優(yōu)選在0. 5μ g/mL (約3nM)以下、進一步更優(yōu)選在0. 2 μ g/mL (約0. 13nM)以下具有50% 以上的細胞間感染阻止能力。需要說明的是，本申請發(fā)明的抗體只要以完全長度的抗體或其抗原結(jié)合片段、或者表示可變區(qū)的序列號6、8、10或12的氨基酸序列、表示互補決定區(qū)(CDR)的序列號13 18的氨基酸序列為基礎(chǔ)，則利用該技術(shù)領(lǐng)域中的公知技術(shù)，就可以得到與HCMV特異性結(jié)合且能夠中和其生物活性的重組人單克隆抗體、單克隆抗體(還包括嵌合抗體、人源化抗
18體)、或它們的抗原結(jié)合片段。這些抗體屬于本申請發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。例如，重鏈和輕鏈的信號序列在蛋白質(zhì)成熟的過程中被切斷，對最終的抗體特性沒有貢獻，但為了追加欠缺的序列，可以將克隆化的cDNA序列利用連接法或PCR擴增法組合到合成寡核苷酸中。取而代之，也可以以一組短的、具有重復(fù)序列的寡核苷酸的形式合成整個可變區(qū)， 并通過PCR擴增法進行組合，從而制作完全人工的可變區(qū)克隆。2.編碼本發(fā)明的抗體等的核酸根據(jù)本申請發(fā)明的另一實施方式，提供一種分離的核酸，其編碼與HCMV特異性結(jié)合且能夠中和其生物活性的抗HCMV單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述核酸選自以下核酸編碼選自由序列號2、4、6、8、10、12、13 18和22組成的組中的氨基酸序列的核酸、以及與該核酸在高嚴格條件下雜交的核酸。上述核酸優(yōu)選為DNA或RNA，更優(yōu)選為DNA。下述的分離的核酸也包含在本申請發(fā)明中其編碼與HCMV結(jié)合且能夠中和其生物活性的抗HCMV單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，且該分離的核酸與編碼選自由2、4、6、8、 10、12、13 18和22組成的組中的氨基酸序列的核酸具有高同一性。在此，“具有高同一性” 是指能夠在高嚴格條件下與規(guī)定的核酸序列雜交的程度的序列同一性，例如，具有60%、 70%、80%、90%或95%、或者超過上述程度的同一性。“高嚴格條件”例如為5XSSC、5X鄧哈特溶液、0.5% SDS、50 %甲酰胺、50°C 的條件(例如，參照 J. Sambrook 等的 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，特另lj是 11. 45 節(jié)"Conditions for Hybridization of Oligonucleotide ftObes”)。在這些條件下，可以期待有效地得到溫度越高則具有越高同一性的多核苷酸(例如，DNA)。其中，作為影響雜交的嚴格性的要素，認為有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多個要素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適當選擇這些要素能夠?qū)崿F(xiàn)同樣的嚴格性。作為在上述高嚴格條件下雜交的核酸，包含與編碼序列號2、4、6、8、10、12、13 18和22中任一種氨基酸序列的核酸具有例如70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、 97%以上或99%以上的同一性的核酸。堿基序列的同一性可以利用上述的同一性檢索算法等來確定(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 872264-2268,1990 ；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)。另外，本發(fā)明中優(yōu)選的核酸為同時編碼序列號10和12的氨基酸序列的DNA，進一步優(yōu)選為同時編碼序列號6和8的氨基酸序列的DNA。進一步更優(yōu)選的核酸為同時編碼序列號2和4的氨基酸序列的DNA。更進一步優(yōu)選的核酸為同時含有序列號5和7的核酸的核酸，更進一步優(yōu)選的核酸為含有序列號1和3的核酸這兩者的核酸。3.本發(fā)日月的jH本、宿t細朐,禾Π抗體的泡K乍方法本發(fā)明還涉及重組有上述核酸的載體和導(dǎo)入有該載體的宿主細胞、以及使用它們的抗體的制作方法。本發(fā)明的抗體也可以作為使用公知方法得到的重組人抗體來制作(參照Nature， 312 643,1984,Nature, 321 :522，1986等)。例如，本發(fā)明的抗體可以通過將導(dǎo)入有本發(fā)明的載體的宿主細胞進行培養(yǎng)并從培養(yǎng)上清等中純化所產(chǎn)生的抗體來制作。更具體而言，可以通過下述方法制造將編碼Vh和\的cDNA分別插入到含有編碼由同一細胞或不同的人細胞制作的人抗體Ch和/或人抗體Q的基因的動物細胞用表達載體中以構(gòu)建人抗體表達載體，并導(dǎo)入到動物細胞中進行表達。用于重組編碼本發(fā)明的抗體的￥11或\的核酸的載體沒有限定，優(yōu)選蛋白質(zhì)基因等的表達中通用的、特別是適合于抗體基因的表達的載體或高表達用載體。作為優(yōu)選的例子， 可列舉出含有EF啟動子和/或CMV增強子的載體。另外，通常分別制作重組有編碼Vh或八的核酸的表達載體，并共轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，但也可以重組到單一的表達載體中。用于導(dǎo)入表達載體的宿主細胞沒有限定，優(yōu)選蛋白質(zhì)基因等的表達中通用的、特別是適合于抗體基因的表達的細胞。例如，可列舉出細菌(大腸桿菌等)、放線菌、酵母、昆蟲細胞(SF9等)、哺乳類細胞(C0S-1、CH0、骨髓瘤細胞等)。為了在工業(yè)上生產(chǎn)重組抗體，通常利用穩(wěn)定地、以高水平生產(chǎn)該抗體的重組動物細胞株，例如CHO細胞株。這種重組細胞株的制作、克隆化、用于高表達的基因擴增和篩選可以利用公知的方法(例如，參照 Omasa T. J. Biosci. Bioeng.，94，600-605，2002 等)。本發(fā)明除了包含由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成的抗體以外，還包含本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段。作為抗原結(jié)合片段，例如有Fab (抗原結(jié)合片段，fragment of antigen binding)、Fab’、F(ab’)2，作為通過接頭等將抗體的活性片段結(jié)合而成的物質(zhì)，例如有單鏈抗體(single chain Fv :scFv)、二硫鍵穩(wěn)定抗體(disulfide stabilized Fv:dsFv)，作為含有抗體的活性片段的肽，例如可列舉出含有CDR的肽。這些物質(zhì)可以通過將本發(fā)明的抗體用適當?shù)牡鞍追纸饷高M行處理的方法或基因重組技術(shù)等公知的方法進行制造?？贵w的純化可以使用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法或親和色譜法等公知的純化手段進行。除此之外，通過近年開發(fā)的、利用基因工程學(xué)技術(shù)在噬菌體表面表達重組抗體的噬菌體展示抗體技術(shù)，以噬菌體融合蛋白的形式表達人工地使vH、八基因改組〔ny 'j > 夕)而多樣化的 scFv (單鏈可變區(qū)片段，single chain Fragment of variable region) 抗體，也可以得到特異抗體。該技術(shù)可以避免免疫，并且作為代替細胞融合法的人源化抗體制作技術(shù)受到很高的評價。只要是使用該技術(shù)，以本申請說明書中的序列號2、4、6、8、10、 12、13 18和22的氨基酸序列為參考而制作的特異抗體或其抗原結(jié)合片段，均屬于本申請發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。此外，將近年開發(fā)的通過抗體的糖鏈部分的修飾來大幅改善抗體的ADCC活性的 P0TELLIGENT技術(shù)應(yīng)用于本申請發(fā)明的抗體而得到的抗體(參照Niwa R. , et al，Clin. Cancer Res.，10，6248-6255 (2004))、將改善CDC活性的C0MPLEGENT技術(shù)應(yīng)用于本申請發(fā)明的抗體而得到的抗體(參照Kanda S.，et al,Glycobiology, 17,104-118(2007))也屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。另外，作為抗體制作的方法，通常利用小鼠、兔、山羊等實驗動物來獲取多克隆抗體或單克隆抗體，但這樣得到的抗體具有所使用的動物種類的特征性序列，因此如果直接施用于人則會被人免疫系統(tǒng)作為異物識別，可能會引起人抗動物抗體的應(yīng)答(即，產(chǎn)生抗體的抗體)。本發(fā)明的抗HCMV單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，可以由健康人等的血液來源的
20抗體產(chǎn)生細胞獲得，其為完全人抗體。該完全人抗體即使作為抗體藥物施用于人體，也不具有免疫原性，不會觀察到免疫反應(yīng)。另夕卜，本申請發(fā)明的抗HCMV單克隆抗體，由于具有比以往的抗HCMV單克隆抗體更高的中和能力，因此利用更少的給藥量就可以期望相同程度的治療效果。接下來，對得到本發(fā)明的抗HCMV單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段的步驟進行說明， 但得到本發(fā)明的抗體等的方法不受這些記載的任何限制，如上所述，當然可以進行該技術(shù)領(lǐng)域中的通常的變更。本發(fā)明的抗HCMV單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段可以通過下述方法獲得經(jīng)過各種步驟從健康人的血液中分離產(chǎn)生該抗體的細胞克隆，從抗體產(chǎn)生細胞克隆的培養(yǎng)上清中獲得抗體，對所得的抗體進行親和純化。1)針對HCMV的完全人抗體產(chǎn)生細胞克隆的分離從健康人的血液中分離B淋巴細胞，誘導(dǎo)該B淋巴細胞的增殖。增殖誘導(dǎo)的方法本身是公知的，例如可以通過使用癌的誘導(dǎo)因子“艾伯斯坦-巴爾病毒(EB病毒)” (Epstein-Barr virus)(以下，稱為 EBV)的轉(zhuǎn)化法(D. Kozbor 等)進行。S卩，用EBV感染上述B淋巴細胞，進行增殖誘導(dǎo)，將增殖的細胞作為抗體產(chǎn)生細胞文庫。2)由抗體產(chǎn)生細胞文庫回收單克隆抗體由增殖誘導(dǎo)的細胞回收單克隆抗體的方法可以通過單克隆抗體的制作中常用的公知方法進行。從所述抗體產(chǎn)生細胞文庫中選擇產(chǎn)生與HCMV結(jié)合的抗體的淋巴細胞克隆，由其培養(yǎng)上清中取出抗體。即，通過有限稀釋法從所述抗體產(chǎn)生細胞文庫中選擇產(chǎn)生與HCMV結(jié)合的抗體的細胞群(克隆)。為了檢測與HCMV結(jié)合的克隆，優(yōu)選采用使用HCMV來源的抗原和小鼠抗人IgG標記抗體的ELISA。通過培養(yǎng)選擇出的抗體陽性細胞群，并反復(fù)篩選，可以得到僅產(chǎn)生目標抗體的細胞群(克隆)。圖1中示出表示直到上述抗體產(chǎn)生細胞克隆的分離為止的步驟的流程圖。3)使用蛋白A或G的親和純化為了純化抗HCMV抗體，可以在滾瓶、2升裝的轉(zhuǎn)瓶、或其他培養(yǎng)體系中增殖所選擇的細胞。將所得到的培養(yǎng)上清過濾、濃縮后，供給到利用蛋白A或者蛋白G-瓊脂糖凝膠(GE Healthcare公司)等進行的親和層析中，由此可以純化該蛋白質(zhì)。將緩沖液更換為PBSjlJ 用OD28tl或優(yōu)選濁度計分析，可以判斷濃度。同種型可以通過同種型抗原特異性的方法來考察。這樣得到的抗HCMV抗體是由在人體內(nèi)致敏的B淋巴細胞制作的完全人抗體，因此針對抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能性低。另外，關(guān)于抗體產(chǎn)生細胞克隆的制作，特點還在于利用了具有感染B淋巴細胞并誘導(dǎo)其增殖的活性的EB病毒。EB病毒法的優(yōu)點在于，能夠制作在人體內(nèi)產(chǎn)生的天然的抗體以及能夠得到親和性高的抗體。例如，已知針對HCMV的人抗體比人工免疫小鼠而制作的抗體的親和性高約10 100 倍。通過EB病毒感染而增殖的B淋巴細胞群成為抗體產(chǎn)生細胞的文庫。由該文庫分離特定的抗體產(chǎn)生細胞克隆，可以得到人抗體。4.含有本發(fā)明的抗體的醫(yī)藥組合物接下來，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療人巨細胞病毒(HCMV)相關(guān)疾病的醫(yī)藥組合物，其含有上述抗體或其抗原結(jié)合部分以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的抗HCMV抗體或其抗原結(jié)合片段對于HCMV具有高于現(xiàn)有的抗HCMV抗體的中和能力，因此作為HCMV相關(guān)疾病(因HCMV而引起的各種疾病)的預(yù)防或治療藥是有用的。因HCMV而引起的疾病是指預(yù)測通過抑制HCMV活性可緩和該疾病的癥狀和/或發(fā)展的疾病。本說明書中使用的“HCMV相關(guān)疾病”這一用語，包括表明或者可以認為患有該疾病的被測對象具有HCMV是該疾病的病理生理原因、或者是使該疾病惡化的原因之一的疾病以及其他疾病。即，本發(fā)明的抗HCMV抗體或其抗原結(jié)合片段對于HCMV具有高中和能力，因此也可以期待作為因HCMV而引起的各種疾病、例如(a)艾滋病、癌癥、器官移植后、骨髄移植后、血液透析后等免疫缺陷狀態(tài)下的HCMV的再活化所致的間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、胃腸炎、腦炎等各種疾?。?b)HCMV感染由孕婦波及到胎兒所致的先天性CMV感染癥；(c)由上述先天性CMV感染癥引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡；(d)上述先天性CMV感染癥未致死亡時引起的低出生體重、肝脾腫大、黃疸、血小板減少性紫癜、小頭畸形、精神發(fā)育障礙、智力發(fā)育遲緩、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或聽覺障礙；(e)新生兒期或嬰兒期因HCMV感染而發(fā)病的肝功能異常、間質(zhì)性肺炎或單核細胞增多癥等的預(yù)防或治療藥(非專利文獻3、4和5)。本說明書中使用的“作為醫(yī)藥品可接受的載體”中，包含生理學(xué)上可適用的任意的、或者全部的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、等滲劑和吸收延緩劑等。作為醫(yī)藥品可接受的載體的例子，包括水、鹽類溶液、磷酸緩沖生理鹽水、葡聚糖、 甘油、乙醇等中的一種或多種、以及它們的組合。作為注射劑等使用時，組合物中優(yōu)選含有 PH調(diào)節(jié)劑、等滲劑，例如糖、甘露醇、山梨醇等多元醇、或氯化鈉。作為醫(yī)藥品可接受的載體中，還可以含有潤濕劑、乳化劑、防腐劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑等用于提高抗體或抗體部分的保存性或有效性的少量的輔助物質(zhì)。本發(fā)明的組合物可以制成各種劑型。這樣的組合物例如包括溶液(例如可注射、 可輸液的溶液)、分散液、懸浮液、片劑、膠囊、錠劑(卜口一^")、丸劑、粉末、脂質(zhì)體、栓劑等液體、半固體、固體的劑型。優(yōu)選的劑型根據(jù)所期望的給藥形態(tài)和治療的適用例而異。通常優(yōu)選的組合物為與用于以其他抗體對人進行被動免疫的組合物相同的組合物等可注射或可輸液的溶液的形態(tài)。優(yōu)選的給藥形態(tài)為非經(jīng)口給藥(例如通過靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi))。在優(yōu)選的實施方式中，抗體通過靜脈輸液或靜脈注射給藥。在另一優(yōu)選的實施方式中，抗體通過肌肉內(nèi)注射或皮下注射給藥。本發(fā)明的抗體和抗體片段可以混合到適于非經(jīng)口給藥的醫(yī)藥品組合物中。使用單一種類的抗體或抗體部分時，優(yōu)選作為含有0. 1 250mg/mL抗體的可注射的制劑進行制備。另一方面，混合多種抗體使用時，優(yōu)選作為含有0.001 lOOmg/mL抗體的可注射的制劑進行制備。另外，該多種抗體的混合比例可以適當設(shè)定。
可注射的制劑可以通過將有效成分溶解于液體中而得到的物質(zhì)或使有效成分冷凍干燥而得到的物質(zhì)加入到弗林特(7 U >卜)瓶、棕色瓶、安瓿或預(yù)充式注射器中而構(gòu)成。緩沖劑可以采用PH5.0 7.0(最適情況下為pH6.0)的L-組氨酸(1 50mM)，最適情況下可以采用5 IOmM的L-組氨酸。其他合適的緩沖劑包括琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀，但不限定于此。為了改變濃度0 300mM的溶液(就液體劑型而言，最適情況為150mM)的滲透壓，可以使用氯化鈉。冷凍干燥的劑型中可以含有冷凍保護物質(zhì)、主要是 0 10% (最適情況為0. 5 5. 0% )的蔗糖。其他合適的冷凍保護物質(zhì)包括甘露醇、海藻糖和乳糖。冷凍干燥的劑型中可以含有增量劑、主要是1 10%的甘露醇(最適情況為 2 4% )。液體和冷凍干燥的劑型這兩者中可以使用穩(wěn)定劑、主要是1 50mM(最適情況為5 IOmM)的L-蛋氨酸。其他合適的穩(wěn)定劑包括甘氨酸、精氨酸和Polysorbate 80等， Polysorbate 80的情況下，可以含有O 0. 05% (最適情況為0. 005 0. 01% )。其他表面活性劑包括Polysorbate 20和BRIJ表面活性劑，但不限定于此。本醫(yī)藥組合物通常在制造和貯藏的條件下必須無菌且穩(wěn)定。該組合物可以配方為溶液、微型乳劑、分散液、脂質(zhì)體或適合高藥物濃度的其他規(guī)定構(gòu)造。無菌的可注射溶液可以通過將必要量的活性化合物(即抗體或抗體部分)與根據(jù)需要使用的上述成分中的一種或組合一起混合到適當?shù)娜軇┲校缓筮M行過濾滅菌來制備。通常，將活性化合物混合到含有基本的分散介質(zhì)和從上述列舉的物質(zhì)中選擇的所需的其他成分的無菌載體(vehicle) 中，由此制備分散液。在用于制備無菌的可注射溶液的無菌粉末制劑的情況下，優(yōu)選的制備方法為前述的該滅菌過濾溶液的冷凍真空干燥和噴霧干燥，由此，得到除活性成分的粉末之外還含有任意的其他所需成分的組合物。溶液的適當?shù)牧鲃有岳缈梢酝ㄟ^下述方式維持使用卵磷脂等的包衣；或者，分散液的情況下維持必要的粒度；或者，使用表面活性劑。 可注射組合物的長期吸收可以通過在該組合物中含有使吸收延緩的藥劑、例如單硬脂酸鹽或明膠來進行。本醫(yī)藥組合物中還可以混合有輔助性的活性化合物。在某個實施方式中，將本發(fā)明的抗體或抗體部分與對于治療HCMV引起的疾病有用的一種或多種其他治療藥一起配方，或者與這樣的其他治療藥同時給藥。例如，本發(fā)明的抗HCMV抗體或抗體部分可以和與其他靶標結(jié)合的一種或多種其他抗體(例如，與HCMV的其他結(jié)合位點結(jié)合的抗體)一起配方，或者與這樣的其他抗體同時給藥。此外，本發(fā)明的一種或多種抗體可以與前述治療藥中的兩種或兩種以上組合使用?；谶@樣的組合的療法能夠有利地利用更低用量的所給藥的治療藥，因此，可以避免各種單一療法可能伴隨的毒性或并發(fā)癥。需要說明的是，本說明書中出現(xiàn)的核苷酸或氨基酸序列與序列號的關(guān)系如下所述。序列號1表示含有信號序列的、編碼針對HCMV的gB糖蛋白的ADl區(qū)域的抗體(以下，“抗 ADl抗體” )(EV2038)的H鏈的核苷酸序列。序列號2表示含有信號序列的、抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列。序列號3表示含有信號序列的、編碼抗ADl抗體(EV2038)的L鏈的核苷酸序列。
序列號4表示含有信號序列的、抗ADl抗體(EV2038)的L鏈的氨基酸序列。序列號5表示不含信號序列的、編碼抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的核苷酸序列。序列號6表示不含信號序列的、抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列。序列號7表示不含信號序列的、編碼抗ADl抗體(EV2038)的L鏈的核苷酸序列。序列號8表示不含信號序列的、抗ADl抗體(EV2038)的L鏈的氨基酸序列。序列號9表示編碼抗ADl抗體(EV2038)的H鏈可變區(qū)的核苷酸序列。序列號10表示抗ADl抗體(EV2038)的H鏈可變區(qū)的氨基酸序列。序列號11表示編碼抗ADl抗體(EV2038)的L鏈可變區(qū)的核苷酸序列。序列號12表示抗ADl抗體(EV2038)的L鏈可變區(qū)的氨基酸序列。序列號13表示抗ADl抗體(EV2038)的H鏈CDRl的氨基酸序列。序列號14表示抗ADl抗體(EV2038)的H鏈CDR2的氨基酸序列。序列號15表示抗ADl抗體(EV2038)的H鏈CDR3的氨基酸序列。序列號16表示抗ADl抗體(EV2038)的L鏈CDRl的氨基酸序列。序列號17表示抗ADl抗體(EV2038)的L鏈CDR2的氨基酸序列。序列號18表示抗ADl抗體(EV2038)的L鏈CDR3的氨基酸序列。序列號19表示實施例中制作EV2038 CDR-H3變異體時使用的38Hind-S引物的核苷酸序列。序列號20表示實施例中制作EV2038的⑶R-H3變異體時使用的38Not_A引物的核苷酸序列。序列號21表示實施例中制作EV2038的CDR-H3變異體時使用的堿基序列確認用引物的核苷酸序列。序列號22
表示抗ADl抗體的CDR-H3的氨基酸序列中的共有氨基酸序列。序列號23表示通過實施例中所示的缺失突變法確定為表位存在區(qū)域的、HCMV gB糖蛋白ADl 區(qū)域的549位 580位的氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。序列號M表示通過實施例中所示的缺失突變法確定為表位存在區(qū)域的、HCMV gB糖蛋白ADl 區(qū)域的596位 640位的氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。序列號25表示通過實施例中所示的肽陣列法確定為表位區(qū)域的、HCMV gB糖蛋白ADl區(qū)域的549位 560位的氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。序列號沈表示通過實施例中所示的肽陣列法確定為表位區(qū)域的、HCMV gB糖蛋白ADl區(qū)域的569位 576位的氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。序列號27表示通過實施例中所示的肽陣列法確定為表位區(qū)域的、HCMV gB糖蛋白ADl區(qū)域的625位 632位的氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。序列號觀表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的117位的纈氨酸 (V)取代成賴氨酸(K)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號四表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的118位的蘇氨酸 (T)取代成色氨酸(W)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號30表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的119位的精氨酸 (R)取代成纈氨酸(V)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號31表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的120位的天冬氨酸(D)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號32表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成谷氨酸(E)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號33表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)取代成亮氨酸(L)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號34表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成蘇氨酸(T)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號35表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成天冬氨酸(D)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號36表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成精氨酸(R)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號37表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號38表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的127位的天冬氨酸(D)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號39表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成天冬酰胺(N)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號40表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成天冬酰胺(N)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號41表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的130位的蛋氨酸 (M)取代成谷氨酰胺(Q)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號42表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的131位的天冬氨酸(D)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號43表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的132位的纈氨酸 (V)取代成賴氨酸(K)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號44表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號45表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成纈氨酸(V)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號46表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號47表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號48表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸(L)取代成脯氨酸(P)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號49表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成酪氨酸(Y)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號50表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號51表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成脯氨酸(P)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號52表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成亮氨酸(L)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號53表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號54表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成亮氨酸(L)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號55表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成蛋氨酸(M)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號56表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成脯氨酸(P)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號57表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成纈氨酸(V)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號58表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號59表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成脯氨酸(P)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號60表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號61表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸(G)取代成絲氨酸( 而得到的變異體的氨基酸序列。序列號62表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成天冬酰胺(N)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號63表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成蘇氨酸(T)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號64表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成甘氨酸(G)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號65表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號66表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號67表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的i25位的脯氨酸 (P)取代成亮氨酸(L)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號68表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成纈氨酸(V)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號69表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成絲氨酸( 而得到的變異體的氨基酸序列。序列號70表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成蘇氨酸(T)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號71表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成天冬酰胺(N)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號72表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成谷氨酰胺(Q)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號73表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成天冬氨酸(D)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號74表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸
28(P)取代成谷氨酸(E)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號75表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成賴氨酸(K)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號76表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成組氨酸(H)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號77表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成半胱氨酸(C)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號78表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成蛋氨酸(M)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號79表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成酪氨酸(Y)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號80表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成色氨酸(W)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號81表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號82表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的117位的纈氨酸 (V)取代成亮氨酸(L)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號83表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的117位的纈氨酸 (V)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號84表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的118位的蘇氨酸 (T)取代成絲氨酸( 而得到的變異體的氨基酸序列。序列號85表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的118位的蘇氨酸 (T)取代成賴氨酸(K)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號86表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的119位的精氨酸 (R)取代成賴氨酸(K)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號87表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的119位的精氨酸(R)取代成蘇氨酸(T)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號88表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的120位的天冬氨酸(D)取代成谷氨酸(E)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號89表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的120位的天冬氨酸(D)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號90表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)取代成天冬氨酸(D)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號91表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號92表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的127位的天冬氨酸(D)取代成谷氨酸(E)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號93表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的127位的天冬氨酸(D)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號94表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號95表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成色氨酸(W)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號96表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號97表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成色氨酸(W)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號98表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的130位的蛋氨酸 (M)取代成苯丙氨酸(F)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號99表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的130位的蛋氨酸 (M)取代成異亮氨酸(I)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號100表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的131位的天冬氨酸(D)取代成谷氨酸(E)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號101表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的131位的天冬氨酸(D)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號102表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的132位的纈氨酸 (V)取代成酪氨酸(Y)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號103表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的132位的纈氨酸 (V)取代成絲氨酸( 而得到的變異體的氨基酸序列。序列號104表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成纈氨酸(V)、將1 位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號105表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的IM位的異亮氨酸(I)取代成纈氨酸(V)、將1 位的甘氨酸(G)取代成絲氨酸( 而得到的變異體的氨基酸序列。序列號106表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成異亮氨酸(I)、將123位的色氨酸(W)取代成酪氨酸(Y)、將IM位的異亮氨酸 (I)取代成纈氨酸(V)、將1 位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號107表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成異亮氨酸(I)、將123位的色氨酸(W)取代成酪氨酸(Y)、將IM位的異亮氨酸 (I)取代成纈氨酸(V)、將1 位的甘氨酸(G)取代成絲氨酸( 而得到的變異體的氨基酸序列。序列號108表示使本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)缺失而得到的變異體的氨基酸序列。序列號109表示在本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)與127位的天冬氨酸(D)之間插入谷氨酸(E)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號110表示將本發(fā)明的抗ADl抗體(EV2038)的H鏈的氨基酸序列中的79位的天冬酰胺 (N)取代成谷氨酰胺(Q)而得到的變異體的氨基酸序列。序列號111表示實施例8中制作、使用的合成肽(表5的肽1)的氨基酸序列。
序列號112
表示實施例
序列號113
表示實施例
序列號114
表示實施例
序列號115
表示實施例
序列號116
表示實施例
序列號117
表示實施例
序列號118
表示實施例
序列號119
表示實施例
序列號120
表示實施例
序列號121
表示實施例
序列號122
表示實施例
序列號U3
表示實施例
序列號1
表示實施例
序列號1
表示實施例
序列號126
表示實施例
序列號127
表示實施例
序列號1
表示實施例
序列號1
表示實施例
序列號130
表示實施例
序列號131
中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽
表5的肽幻的氨基酸序列。 表5的肽幻的氨基酸序列。 表5的肽4)的氨基酸序列。 表5的肽幻的氨基酸序列。 表5的肽6)的氨基酸序列。 表5的肽7)的氨基酸序列。 表5的肽8)的氨基酸序列。 表5的肽9)的氨基酸序列。 表5的肽10)的氨基酸序列。 表5的肽11)的氨基酸序列。 表5的肽1 的氨基酸序列。 表5的肽1 的氨基酸序列。 表5的肽14)的氨基酸序列。 表5的肽1 的氨基酸序列。 表5的肽16)的氨基酸序列。 表5的肽17)的氨基酸序列。 表5的肽18)的氨基酸序列。 表5的肽19)的氨基酸序列。 表5的肽20)的氨基酸序列。
表示實施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽21)的氨基酉I序列。
序列號132
表示實施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽22)的氨基酉I序列。
序列號133
表示實施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽23)的氨基酉I序列。
序列號Π4
表示實施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽24)的氨基酉I序列。
序列號135
表示實施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽25)的氨基酉I序列。
序列號136
表示實施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽26)的氨基酉I序列。序列號137表示人巨細胞病毒(HCMV)的gB糖蛋白的氨基酸序列(Swiss-Prot :P06473)。另外，本說明書的實施例1 6中出現(xiàn)的核苷酸或氨基酸序列與序列號的關(guān)系如表1所示。[表1]
含有信號序列無信號序列可變區(qū)CDRlCDR2CDR3H鏈核苷酸序列號159■■氨基酸序列號2610131415L鏈核苷酸序列號3711---氨基酸序列號4812161718以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實施例的任何限定。如果沒有特別說明，則本實施例中使用的步驟可以參照Molecular Cloning =A Laboratory Manual(Third Edition) (Sambrook 等、Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001)。實施例實施例1.針對HCMV的完全人抗體產(chǎn)生細胞克隆的分離至抗體產(chǎn)生細胞克隆的分離為止的流程圖示于圖1。從血清中的抗HCMV抗體值高的人末梢血中分離B淋巴細胞，使其感染EBV。將感染細胞接種到96孔板中，培養(yǎng)約3周后，進行培養(yǎng)上清中的抗HCMV抗體的篩選(一次篩選)。 篩選以針對HCMV 的主要中和表位 ADl 和 AD2(J. Virol.，65，138-146 (1991)，J. Gen. Virol.， 73，2375-2383 (1992)，J. Virol.，66，5290-5297 (1992)，J. Virol.，67，703-710 (1993))的抗體為靶標，使用包覆有GST融合HCMV-ADl或GST融合HCMV-AD2的96孔板，通過ELISA法進行。將確認產(chǎn)生抗HCMV抗體的各孔的細胞進行稀釋，分別接種到新的96孔板中。培養(yǎng)約3周后，進行抗HCMV抗體產(chǎn)生的二次篩選。將所得到的抗體陽性孔的細胞以每孔1 30個接種到新的96孔板中。通過該有限稀釋培養(yǎng)進行克隆操作的結(jié)果，得到產(chǎn)生目標抗體的細胞克隆。實施例2.抗體同種型和亞類的確認使用分離出的抗體產(chǎn)生細胞克隆的培養(yǎng)上清，通過ELISA法確認產(chǎn)生的抗體的同種型(參照文獻Curr Protoc Immunol. 2001 May ；Chapter 2 =Unit 2.2)。ELISA 使用包覆有GST融合HCMV-ADl或AD2的96孔板，作為二次抗體，使用各個同種型和亞類特異性的抗體。結(jié)果，將所得到的抗HCMV抗體的同種型和亞類示于表2。[表 2]
抗體編號靶抗原亞類EV2038ADlIgGl λ實施例3.編碼抗HCMV抗體的DNA的克隆使用Oligo-dT引物，由抗體產(chǎn)生細胞的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，以所得到的cDNA作為模板，利用PCR法進行抗體基因的擴增。PCR中使用的引物基于編碼人IgG抗體H鏈和L鏈的cDNA的數(shù)據(jù)庫進行設(shè)計。為了擴增完全長度的H鏈cDNA和L鏈cDNA，5，末端側(cè)引物具有翻譯起始位點，3’末端側(cè)引物具有翻譯終止位點。實施例4.基于堿基序列的抗體的氨基酸序列的確定將通過PCR法擴增的抗體H鏈和L鏈的cDNA插入質(zhì)粒載體中，利用ABI測序儀確認各自的堿基序列。由所得到的堿基序列確定信號序列、以及抗體H鏈和L鏈的氨基酸序列。另外，抗體的互補決定區(qū)(OTR)的分析中使用Kabat的方法(www. bioinf. org. uk Dr. Andrew C. R. Martin' s Group, Antibodies :General Information)。所得至 Ij 的抗 HCMV 抗體(EV2038)的⑶R序列示于序列號13 18中。具體而言，EV2038的H鏈⑶Rl、H鏈 CDR2、H鏈CDR3、L鏈CDRl、L鏈CDR2和L鏈CDR3的氨基酸序列分別示于序列號13、14、15、 16,17 和 18 中。另外，為了研究與迄今為止作為ADl抗體被報道的單克隆抗體的類似性，對于可變區(qū)的氨基酸序列記載于GenBank等中的抗體，與EV2038的⑶R序列進行比較。用Kabat 法確定已知的人或小鼠來源的ADl抗體的各種CDR序列，分別與同樣確定的EV2038的CDR 序列進行比較。表3中，各個CDR的同一性是由作為比較對象的氨基酸殘基數(shù)(分母)和在該CRD部分中與EV2038位置和種類一致的氨基酸殘基數(shù)(分子)求得的同一性(% )。另外，總計(％ )如下求得將各個CDR的比較中得到的作為分母的氨基酸殘基數(shù)與作為分子的氨基酸殘基數(shù)分別合計，由所得到的總分母和總分子的氨基酸殘基數(shù)求出同一性(％ )。 如表3所示，可知EV2038與已知的ADl抗體完全沒有確認到同一性，與迄今為止報道的 ADl抗體的CDR序列具有很大差異。[表 3]
抗體登錄號來源H鏈CDR的同源性(％)L鏈CDR的同源性(％)總計 (%)(HCVR/LCVR)CDRlCDR2CDR3CDRlCDR2CDR3ITC63BL26539/L26540人20243231572731ITC52L26537/L26538人4024392314925ITG48L26535/L26536人805662429929ITC39L26533/L26534人20242538433630ITC33L26531/L26532人202425504318307-17U39898/U39901小鼠2035252529182627-156U39899/U39902小鼠402425352992627-287U39900/U39903小鼠2024192714920EV2001*人2024192543922出處W02007/094423實施例5.確認所得抗體基因編碼抗HCMV抗體將所得到的H鏈和L鏈的cDNA分別插入表達載體中，并同時導(dǎo)入細胞中?；?qū)肜藐栯x子脂質(zhì)體1J f 7工夕夕S > (Invitrogen)和添加、”H、試劑 anvitrogen)，在制造商推薦的條件下進行(Invitrogen的目錄=Cat. No. 18324-111，Cat. No. 18324-012，或Cat. No. 18324-020)。兩天后回收培養(yǎng)上清，通過使用包覆有抗人IgG抗體和GST融合HCMV-ADl的96孔板的ELISA法，確認培養(yǎng)上清中的抗體為人IgG抗體、以及與HCMV-ADl結(jié)合。實施例6.抗體蛋白的產(chǎn)生將所得到的抗HCMV抗體表達質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細胞中?；?qū)氩捎门c上述細胞時同樣的方法。通過在篩選標記存在下進行培養(yǎng)，得到穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的CHO細胞克隆。將該穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的CHO細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并回收培養(yǎng)上清。將該培養(yǎng)上清添加到蛋白A柱中，通過親和純化得到純化抗體。柱使用HiTrap rProteinA FF(GE Healthcare公司)的預(yù)裝柱，純化條件為柱制造商推薦的條件。純化后，通過ELISA確認抗體的HCMV-ADl或HCMV-AD2結(jié)合性。另外，利用SDS-PAGE進行了約50kDa的抗體H鏈和約 25kDa的抗體L鏈的確認。實施例7.變異體的制作及它們的結(jié)合活性為了研究影響本發(fā)明的抗體或其結(jié)合性片段的特性的氨基酸序列，特別對CDR-H3 區(qū)域(氨基酸編號117 132)進行了考察。需要說明的是，CDR-H3的氨基酸殘基的編號以從包含序列號2所示的信號序列的重鏈的氨基酸序列的N末端(蛋氨酸)起的順序表示。構(gòu)成自然界的蛋白質(zhì)的氨基酸根據(jù)其側(cè)鏈的特性可進行分組，例如，作為具有同樣特性的氨基酸，可以分類為芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、堿性氨基酸 (賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、中性氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有烴鏈的氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸)、及其他(甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)的組等。本項中，“保守性氨基酸取代”是指特性相似的氨基酸間的取代，即主要為上述相同的組內(nèi)的氨基酸取代。該取代時，認為不會對原始的蛋白質(zhì)的特性產(chǎn)生顯著影響，或者不會使其發(fā)生顯著變化。另一方面，“非保守性氨基酸取代”與上述不同，是指取代為與原始的氨基酸的特性有很大不同的氨基酸。(1) EV2038的CDR-H3變異體的制作
35
對于構(gòu)成EV2038的⑶R-H3的16個殘基的氨基酸，使用兩步PCR法進行各一種的非保守性氨基酸取代，制作變異體(V117K, T118W，R119V，D120I, L121E，E122L，W123T， I124D, P125R, G126F, D127I, Y128N, Y129N, M130Q, D131I, V132K)。首先，利用 38Hind_S( CACCAAGCTTTGTGCAAGAACATGAAGCATC ；序列號19)和取代部位的反向引物的引物對得到前半部的基因片段，利用取代部位的正向引物和38Not-A (ATAAGAATGCGGCCGCGCCGTCGCACTCA TTTACC ；序列號20)的引物對得到后半部的基因片段。以它們作為模板進行第二次PCR， 得到完全長度的變異體抗體基因。之后，將抗體基因通過Not I的限制酶處理使末端粘性化后，重組到抗體產(chǎn)生用質(zhì)粒中。各變異體的堿基序列的確認使用堿基序列確認用引物 (ACCAGACATAATAGCTGACAG ；序列號21)，利用3130基因分析儀(ABI公司)根據(jù)推薦的操作規(guī)程進行確認。(2) EV2038的CDR-H3變異體的抗體表達確認根據(jù)Lipofectamine LTX (Invitrogen公司)的推薦操作規(guī)程，將所得的變異體質(zhì)粒(H鏈)與L鏈的原始質(zhì)粒一起共同基因?qū)氲紺HO細胞中，采集48小時后的培養(yǎng)上清。 在固定有抗人IgG抗體(0. 25 μ g/孔)的酶標板(Immuno plate) (Maxi sorp，Nunc公司) 中，使連續(xù)稀釋的培養(yǎng)上清在室溫下反應(yīng)1小時。作為二次抗體，使抗人免疫球蛋白Gy和抗人免疫球蛋白G λ (MBL公司)同樣在室溫下反應(yīng)1小時。作為顯色劑，添加50 μ L/mL的含有TMB底物的Sure Blue (MPL公司)，在室溫下靜置30分鐘后，加入等量的1. 5M磷酸，使用酶標儀(680XR、BIO-RAD公司)測定450nm的吸收波長。由、鏈和λ鏈的吸光度判斷抗體的有無并定量。(3)利用ELISA評價EV2038的CDR-H3變異體對于ADl的結(jié)合能力在固定有5 μ g/mL的ADl的酶標板(Poly sorp，Nunc公司)中，使通過系列稀釋以λ鏈為基準調(diào)節(jié)為1 μ g/mL濃度的抗體與其反應(yīng)。之后，與上述同樣地進行ELISA。由所得到的變異體和EV2038 (原始)在450nm的吸光度評價變異體對于ADl抗原的結(jié)合能力。 結(jié)果，EV2038⑶R-H3的除122位以外的、121 1 位殘基的非保守性氨基酸取代顯著降低了對于ADl的結(jié)合能力，因此暗示這些殘基作為ADl的抗體結(jié)合部位(〃，卜一 )很重要(圖2)。(4) EV2038 的 CDR-H3 變異體的制作 2關(guān)于非保守性氨基酸取代中對于ADl的結(jié)合能力降低的5個氨基酸殘基中的121 位、123位、IM位和1 位的四處氨基酸殘基，進行了取代成特性近似的氨基酸的嘗試。所使用的氨基酸分別制作5種，具體而言，制作(圖3)所示的變異體。需要說明的是，關(guān)于 125位的脯氨酸，取代成除原始以外的所有天然氨基酸(圖4)。變異體如前所述進行制作。(5)利用ELISA評價EV2038的CDR-H3變異體對于ADl的結(jié)合能力在固定有5 μ g/mL的ADl的酶標板(Poly sorp, Nunc公司)中，使通過系列稀釋以入鏈為基準調(diào)節(jié)為1 μ g/mL濃度的抗體與其反應(yīng)。之后，與上述同樣地進行ELISA，評價變異體對于ADl的結(jié)合能力。關(guān)于121、123、1對、1沈位的氨基酸，在按照保守性氨基酸進行氨基酸取代時，大部分保持了對于ADl的結(jié)合能力(圖3)。但是，關(guān)于125位的脯氨酸， 在利用其他所有天然型氨基酸(19種)進行取代時，均未確認到對于ADl的結(jié)合能力(圖 4)。由此表明，在本發(fā)明中的EV2038的⑶R-H3中，125位的脯氨酸是該抗體的ADl結(jié)合特性所必需的氨基酸。
(6) EV2038 的 CDR-H3 變異體的制作 3關(guān)于非保守性氨基酸取代中對于ADl的結(jié)合能力未降低的氨基酸殘基(117 120 位、122位、127 132位的共11個殘基)，也利用同樣的方法實施保守性氨基酸取代，并確認ADl的結(jié)合能力的評價。結(jié)果可知具有該區(qū)域中的保守性氨基酸取代的變異體(V117L， V117I, T118S, T118K, R119K, R119T, D120E, D120A, E122D, E122A, D127E, D127A, Y128F, Y128W, Y129F, Y129W, M130F, M130I, D131E, D131A, V132Y, V132S)，與非保守性氨基酸取代時同樣，保持了 ADl的結(jié)合能力(圖5)。(7) EV2038 的 CDR-H3 變異體的制作 4在非保守性氨基酸取代時對于ADl的結(jié)合能力降低的氨基酸殘基中，以除125位的脯氨酸以外的殘基(121、123、1M和1 位的共四個殘基)為對象，制作共四種在兩處或四處同時進行取代的變異體(兩處取代體I124V/G126A，I1MV/GU6S ；四處取代體 L121I/W123Y/I124V/G126A, L121I/W123Y/I124V/GU6S)，評價對于 ADl 的結(jié)合能力。結(jié)果可知，這些重復(fù)取代的變異體均保持了對于ADl的結(jié)合能力(圖6)。(8)EV2038 的 CDR-H3 變異體的制作 5在非保守性氨基酸取代時對于ADl的結(jié)合能力降低的氨基酸殘基中，以除125位的脯氨酸以外的殘基(121、123、1M和1 位的共四個殘基)為對象，制作缺失、插入的各一種變異體(E122del和GU6_D127insE)，評價對于ADl的結(jié)合能力。結(jié)果，E122del和 GU6_D127insE對于ADl的結(jié)合能力均完全消失。由此暗示該部位(121 1 位)的氨基酸殘基數(shù)(6個殘基)對于與ADl的結(jié)合很重要(圖7)。綜合這些結(jié)果，認為EV2038的⑶R-H3的氨基酸序列為下述的共有序列。XnXnXnXnXlXnX2X3PX4XnXnXnXnXnXn (序列號 22)其中，Xn =所有天然型氨基酸& = L、I、V、F 或 AX2 = W、γ 或 F)(3 = I、V、L 或M)(4 = G、S、A 或 T(9) EV2038的CDR-H2變異體的制作為了考察CDR-H3以外的保守性取代是否影響對于ADl的結(jié)合能力，利用與其他變異體同樣的方法，制作使位于EV2038的CDR-H2中的N79變?yōu)镹79Q的變異體，并確認對于 ADl的結(jié)合能力。該結(jié)果證明，即使是使位于⑶R-H2中的N79變?yōu)镹79Q的變異體，也未喪失對于ADl的結(jié)合能力(圖8)。需要說明的是，本項中制作的變異體的H鏈的氨基酸序列(也含有信號序列)的序列號的一覽示于表4。[表 4]
權(quán)利要求
1.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，與人巨細胞病毒HCMV的gB糖蛋白的ADl區(qū)域結(jié)合， 其識別存在于ADl區(qū)域中的序列號25的氨基酸序列、序列號沈的氨基酸序列和序列號27 的氨基酸序列構(gòu)成的不連續(xù)序列作為表位。
2.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體為與人巨細胞病毒HCMV的gB糖蛋白的ADl 區(qū)域特異性結(jié)合、且能夠中和其生物活性的單克隆抗體，其中，(i)重鏈的可變區(qū)含有(a)選自由序列號13的氨基酸序列、和序列號13的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的重鏈⑶Rl的氨基酸序列、(b)選自由序列號14的氨基酸序列、和序列號14的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)選自由序列號15的氨基酸序列、序列號15的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、和序列號22所示的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR3的氨基酸序列；以及( )輕鏈的可變區(qū)含有(a)選自由序列號16的氨基酸序列、和序列號16的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDRl的氨基酸序列、(b)選自由序列號17的氨基酸序列、和序列號17的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)選自由序列號18的氨基酸序列、和序列號18的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列組成的組中的輕鏈CDR3的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與由HCMV-gB糖蛋白的549 580 位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(序列號2 和596 640位的連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(序列號24)的區(qū)域中存在的2個以上的不連續(xù)序列構(gòu)成的表位特異性結(jié)I=I ο
4.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其識別存在于HCMV-gB糖蛋白的ADl 區(qū)域中的序列號25的氨基酸序列、序列號沈的氨基酸序列和序列號27的氨基酸序列構(gòu)成的不連續(xù)序列作為表位。
5.如權(quán)利要求3或4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有⑴(a)包含序列號13的氨基酸序列的重鏈CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列號14的氨基酸序列的重鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)選自由序列號22的氨基酸序列組成的組中的重鏈CDR3的氨基酸序列；以及( )(a)包含序列號16的氨基酸序列的輕鏈CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列號17的氨基酸序列的輕鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列號18的氨基酸序列的輕鏈CDR3的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有⑴(a)包含序列號13的氨基酸序列的重鏈CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列號14的氨基酸序列的重鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列號15的氨基酸序列的重鏈CDR3的氨基酸序列；以及( )(a)包含序列號16的氨基酸序列的輕鏈CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列號17的氨基酸序列的輕鏈CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列號18的氨基酸序列的輕鏈CDR3的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)由序列號10的氨基酸序列、序列號10的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號10的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)(HCVR)；以及(b)由序列號12的氨基酸序列、序列號12的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號12的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)包含序列號10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)、和(b)包含序列號12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。
9.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)序列號2或6的氨基酸序列、序列號2或6的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、 或與序列號2或6的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的重鏈(H鏈)； 以及(b)序列號4或8的氨基酸序列、序列號4或8的氨基酸序列中具有1個 幾個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、添加或這些突變中任意兩種以上的組合的突變的氨基酸序列、或與序列號4或8的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的輕鏈(L鏈)。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有(a)包含序列號2或6的氨基酸序列的重鏈(H鏈)、和(b)包含序列號4或8的氨基酸序列的輕鏈(L鏈)。
11.如權(quán)利要求1 10中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體為人單克隆抗體。
12.如權(quán)利要求1 11中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體的類 (亞類)為 IgGl(A)0
13.如權(quán)利要求1 12中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其對于HCMV的實驗室株AD169在人成纖維細胞存在下的50%空斑形成阻止?jié)舛葹?. 05μ g/mL (約0. 3nM)以下。
14.如權(quán)利要求1 13中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其在預(yù)先用HCMV的實驗室株AD169感染人成纖維細胞MRC-5的體系中，在0. 2 μ g/mL (約1. 3nM)以下具有50% 以上的細胞間感染阻止能力。
15.一種用于預(yù)防或治療人巨細胞病毒HCMV相關(guān)疾病的醫(yī)藥組合物，其含有權(quán)利要求 1 14中任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段以及藥學(xué)上可接受的載體。
16.如權(quán)利要求15所述的醫(yī)藥組合物，其中，HCMV相關(guān)疾病為(a)免疫缺陷狀態(tài)下的 HCMV的再活化所致的間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、胃腸炎或腦炎；(b)HCMV感染由孕婦波及到胎兒所致的先天性CMV感染癥；(c)由所述先天性CMV感染癥引起的流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡； (d)所述先天性CMV感染癥未致死亡時引起的低出生體重、肝脾腫大、黃疸、血小板減少性紫癜、小頭畸形、精神發(fā)育障礙、智力發(fā)育遲緩、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎或聽覺障礙；或者(e)在新生兒期或嬰兒期因HCMV感染而發(fā)病的肝功能異常、間質(zhì)性肺炎或單核細胞增多癥。
17.一種分離的核酸，其編碼與HCMV gB糖蛋白的ADl區(qū)域特異性結(jié)合、且能夠中和其生物活性的抗HCMV單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述核酸選自以下核酸編碼選自由序列號2、4、6、8、10、12、13 18和22組成的組中的氨基酸序列的核酸、以及與該核酸在高嚴格條件下雜交的核酸。
18.—種載體，其中，重組有權(quán)利要求17所述的核酸。
19.一種宿主細胞，其中，導(dǎo)入有權(quán)利要求18所述的載體。
20.權(quán)利要求1 14中任一項所述的抗體或抗原結(jié)合片段的制作方法，其中，包括培養(yǎng)權(quán)利要求19所述的宿主細胞的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，其含有與導(dǎo)致各種疾病狀態(tài)的人巨細胞病毒HCMV的gB糖蛋白的AD1區(qū)域特異性結(jié)合、對HCMV具有優(yōu)異的中和能力的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明提供與HCMV的AD1區(qū)域的不連續(xù)序列特異性結(jié)合、對HCMV具有優(yōu)異的中和能力和細胞間感染阻止能力的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，以及含有該抗體或片段的醫(yī)藥組合物等。
文檔編號A61P7/00GK102378814SQ201080014988
公開日2012年3月14日 申請日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者寅島崇, 栗野里香, 高田賢藏 申請人:株式會社伊貝克