專利名稱：用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由山竹果皮的提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物。
背景技術(shù)：
皮膚的皺紋、彈性的下降、水分保持能力下降等皮膚病會使患有皮膚病的患者看起來年老、有損外觀，還會有產(chǎn)生癢和痛等不適的情況。因此，需要皮膚病的治療或預(yù)防。皮膚病的原因雖然尚未完全弄清楚，但認為其大多是由活性氧引起的?；钚匝跏侵秆蹙哂谢瘜W(xué)活性而形成的化學(xué)物類(chemical species)，非常不穩(wěn)定且顯示出強氧化能力。作為活性氧，已知的有過氧化物陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、單態(tài)氧等。另一方面，生物體中具備通過過氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等各種酶，還有維生素E、維生素C、β-胡蘿卜素、尿酸等的作用將活性氧除去的抗氧化作用。然而，當(dāng)產(chǎn)生的活性氧過多時，就會超過生物體具備的抗氧化作用。這種狀態(tài)稱為氧化應(yīng)激狀態(tài)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖及核酸等會被氧化。在皮膚組織中，由于活性氧會引起表皮的角化細胞受到損傷、細胞外基質(zhì)的代謝紊亂，其結(jié)果是由于角質(zhì)厚度變得不均勻或角質(zhì)層屏障機能降低而引起干燥，并進一步導(dǎo)致皺紋產(chǎn)生。此外，在真皮中，由于活性氧會使成纖維細胞受到損傷，而使得真皮膠原的量降低，促進膠原間形成交聯(lián)，并使得真皮的柔軟性和伸縮性降低。作為這樣的機制的詳細描述，可認為是如下所述。即，活性氧對表皮組織的細胞的受體及其配體產(chǎn)生影響，引起源于表皮角化細胞和真皮成纖維細胞的白介素1(IL-1 :interleukin 1)和TNF-α (腫瘤壞死因子tumor necrosis factor-α )等細胞因子的產(chǎn)生，此外，對轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生影響，誘導(dǎo) AP-I (激活蛋白-1 activator protein-1)和NF-κ β的活化，并誘導(dǎo)增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP:matrix metalloprotease)的產(chǎn)生。特別是MMI3S的活化被認為是形成皺紋、促進老化的原因。作為在皮膚組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧的代表，紫外線是已知的。紫外線是10 400nm的不可見光，根據(jù)對人和環(huán)境的影響的不同，分為UVA(315 400nm)、UVB080 315nm)和UVC(^Onm以下)。通常人在日常生活中照射到的紫外線主要是太陽光。太陽光中含有UVA、UVB和UVC的波長的紫外線。其中，UVC被臭氧層吸收，幾乎不會到達地表，但 UVA和UVB的一部分會到達地表，給皮膚帶來各種各樣的變化。因暴露于紫外光下，皮膚組織中會產(chǎn)生過氧化氫、過氧化物陰離子、單態(tài)氧等。反復(fù)且長期暴露在紫外線下，會對皮膚的結(jié)構(gòu)和機能產(chǎn)生不良影響。這種現(xiàn)象稱為光老化。此外，已知因紫外線照射引起的炎癥， 即曬傷(sun burn)，在皮膚組織中進一步誘導(dǎo)了活性氧的產(chǎn)生。關(guān)于紫外線暴露對真皮的影響，還可以確認其一部分受通過表皮得到控制。山竹是以馬來半島附近為原產(chǎn)地，為金絲桃科(Guttiferae)藤黃屬常綠喬木，分布遍及泰國、印度、斯里蘭卡、馬來西亞等，被作為果樹栽培。不僅如此，山竹自古就在東南亞地區(qū)被作為天然藥物使用，已知具有抗炎癥作用和抗菌效果，被作為退燒藥、傳染病治療藥物，并且山竹還被用于皮膚的炎癥和損傷的治療。
關(guān)于山竹的抗氧化作用有如下的報道。已知在山竹果皮提取物中含有多種有效成分，以具有非常強的抗氧化作用的氧雜蒽酮為代表，還含有豐富的兒茶素、多酚、多糖、 礦物質(zhì)、維生素等。其中，對多酚之一的氧雜蒽酮研究不斷深入，并報道了多種氧雜蒽酮類化合物(《農(nóng)業(yè)與食物化學(xué)雜志》，第M卷，第2077頁 2082頁，2006年出版(Journal of Agricultural and food chemistry 54 :2077-2082,2006))。作為山竹果皮中含有的特有的氧雜蒽酮，具代表性的化合物有α-倒捻子素(α-mangostin)和Y -倒捻子素 (Y-mangostin)，這些化合物顯示具有抑制脂質(zhì)氧化的作用。特別是Y _倒捻子素，被發(fā)現(xiàn)具有比α-生育酚和BHA更強的抑制氧化的作用和與α-生育酚同等的除去自由基的作用 (《藥學(xué)雜志》，第114卷，第2期，第129頁 133頁，1994年出版(YAKUGAKU ZASSI 114(2) 129-133,1994))。另一方面，還已知α -倒捻子素和Y _倒捻子素具有抗組胺效果或者抗血清素效果(日本專利第3968405號公報)另一方面，關(guān)于山竹對皮膚、肌膚的改善和治療等還有如下報道。日本專利特開 2007-31287號公報公開了含有露兜樹(日語〃 > ^ ^ )果實成分的化妝品，其中摻入了山竹提取物。日本專利特開2002-47125號公報公開了含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的皮脂分泌抑制劑，并揭示山竹提取物含有該抑制劑。此外，日本專利特開平9-87155號公報公開了以山竹為有效成分的紫外線吸收劑。此外，日本專利申請?zhí)卦?008-134246號報道了通過口服攝入山竹提取物以治療、預(yù)防特異性皮炎?？墒牵搱蟮纼H將對象限定于特異性皮炎。即，在這些報道中都沒有揭示山竹提取物不含有其他有效成分而被用作治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物。此外，對山竹果皮的提取物進行了各種安全性試驗。日本專利特開平5-17365號公報的W015]段中用小鼠進行了采用口服給藥的急性毒性試驗，結(jié)果顯示，即使給予IOg/ Kg的山竹果皮提取物，也未觀察到死亡例。另外，在日本專利特開平4-Μ4004號公報的
段所示的安全性試驗中，進行了將山竹果皮提取物涂布于人皮膚的刺激性試驗，結(jié)果顯示，刺激性極低，其安全性高。另一方面，作為除山竹以外的可降低或者除去活性氧的作用的成分，已知有例如綠茶多酚和葡萄種子中的原花色素。2004年出版的《調(diào)查皮膚生理病理學(xué)雜志》第122卷的第 1480 頁 1487 頁(Journal of investigative Dermatology 122 :1480-1487，2004) 中報道了綠茶多酚在無毛小鼠皮膚試驗中具有抑制由UV引起的氧化損傷和MMP表達的效果。2007年出版的《分子癌癥療法》第6卷第3期的第995頁 1005頁(Molecular Cancer Therapeutics6(3) =995-1005,2007)中報道了葡萄種子中的原花色素可以抑制因UVB產(chǎn)生的氧化過激，并抑制MAI3K和NF-κ β的活化。發(fā)明的揭示在上述的文獻中都沒有揭示山竹提取物具有治療和/或預(yù)防皮膚病的效果。本發(fā)明的目的在于提供由用極性溶劑從山竹(Garcinia mangostana L.)果皮提取的提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物。本申請的發(fā)明人以提供由用極性溶劑從山竹果皮提取的提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物為目的，進行了認真研究，發(fā)現(xiàn)用極性溶劑從山竹的果皮提取的提取物可以治療和/或預(yù)防皮膚病，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供由用極性溶劑從山竹的果皮提取的提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物。本發(fā)明提供所述用于治療和/或預(yù)防上述皮膚病的組合物，所述皮膚病由活性氧引起。本發(fā)明提供所述用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，所述皮膚病由紫外線照射引起。另外，本發(fā)明還提供含有所述用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物的食品。本發(fā)明中山竹的果皮可使用從山竹果實(新鮮或干燥物)得到的果皮。山竹的果皮可直接使用，但如果考慮到提高提取率，則較好是在粉碎或制成粉末后進行提取。此外， 也可在提取前用非極性溶劑將山竹果皮脫脂。本發(fā)明的提取中使用選自作為極性溶劑的甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯和水的至少1種極性溶劑來實施提取。也可將2種以上的溶劑組合起來實施提取。另外，如果考慮到用作口服劑或飲食品的情況，則作為提取溶劑，從安全性的角度來看優(yōu)選使用乙醇、或者水和乙醇的組合。提取的溫度無特別限定，從提取效率的角度來看， 較好在室溫到溶劑的沸點溫度的范圍內(nèi)。提取時間根據(jù)溶劑的種類、果皮的狀態(tài)(新鮮或干燥物、粉碎物或粉末等)和提取溫度而變化，較好在0. 5 M小時的范圍內(nèi)。提取物也可以根據(jù)需要用蒸發(fā)器等將提取溶劑濃縮或除去。此外，提取物也可根據(jù)需要通過溶劑分提或色譜法進行純化后使用。本說明書中“皮膚”與“肌膚”的意義相同，是動物身體的表面層，由表皮、真皮、皮下組織形成。本說明書中，“皮膚病”是指具有皮膚炎癥、水分減少、柔性降低、產(chǎn)生皺紋中的至少1種的狀態(tài)。本說明書中“活性氧”是指氧具有化學(xué)活性而形成的化學(xué)物類，非常不穩(wěn)定且顯示出強氧化能力，作為例子可例舉過氧化物陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫、單態(tài)氧、一氧化氮、二氧化氮、臭氧、過氧化脂質(zhì)。本說明書中的“紫外線”是波長為10 400nm的光線。本發(fā)明的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物的給藥方法沒有限定，較好是口服攝入。因此，本發(fā)明的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物可以添加到清涼飲料、點心、冷飲、乳制品、酒類和肉類等食品中。作為用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物的山竹果皮提取物的給藥劑量隨給藥方法和必要的治療而變化，不可一概而論，在口服攝入的情況下，提取物的給藥劑量為動物每Ikg體重60 250mg，人為0. 3mg 300mg/kg體重/天，更好為0. 5mg 200mg/kg體重/天。本發(fā)明的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，可規(guī)定處方量而使得以作為食品的1天的常規(guī)攝入量可滿足上述的有效量。1天的劑量也可分數(shù)次攝入。根據(jù)本發(fā)明，提供了由山竹果皮的提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物。山竹被稱為“果后”，其果實可供食用，知名度也高，是印象良好的原材料。因此，由山竹果皮的提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，易于被消費者接受，可令人滿意地作為添加到食品的組合物使用。另外，由于本發(fā)明是山竹中通常應(yīng)當(dāng)廢棄的果皮的提取物，所以原料可以低價獲得，在環(huán)境保護的觀點來看也是較好的。
此外，本發(fā)明的提取物是用極性溶劑從山竹中提取的，即使不進行進一步的純化也可獲得上述效果。附圖的簡單說明

圖1表示山竹果皮提取物的混餌給藥實驗的日程。圖2表示UVB燈的光譜分布。圖3是對Cutometer SEM 575的各種參數(shù)進行說明的圖。圖4表示體重。圖4A是體重變化的曲線圖，圖4B是全部數(shù)據(jù)。圖5表示食入量。圖5A是食入量變化的曲線圖，圖5B是食入量數(shù)據(jù)。圖6表示皮膚含水量。圖6A表示含水量的經(jīng)時變化和測定時的濕度，圖6B表示第8周時的含水量。圖7表示皮膚彈性。圖7A表示分組時的皮膚彈性，圖7B表示解剖時的皮膚彈性。圖8表示背部皮膚的外觀。圖8A是對照㈠組中第3號無毛小鼠的外觀，圖8B是對照⑴組中第沈號無毛小鼠的外觀，圖8C是0.15% (+)組中第36號無毛小鼠的外觀。圖9表示光老化模型的無毛小鼠的HE染色標(biāo)本。(a)是對照㈠組中第9號無毛小鼠的標(biāo)本，(b)是0. 072%㈠組中第11號無毛小鼠的標(biāo)本，(c)是對照⑴組中第25 號無毛小鼠的標(biāo)本，(d)是0.072% (+)組中第四號無毛小鼠的標(biāo)本，(e)是0. 15% (+)組中第41號無毛小鼠的標(biāo)本，(f)是GlcN⑴組中第50號無毛小鼠的標(biāo)本。圖10表示由病理HE染色標(biāo)本算出的表皮厚度。圖11表示皮膚提取物的SDS-PAGE的結(jié)果。圖12表示用于檢測I型膠原的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果。圖12A表示皮膚提取物的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，圖12B表示通過光密度分析法測定的條帶強度。圖13A表示通過醋酸纖維膜電泳進行的GAG鑒定，圖1 表示通過光密度分析法測定的條帶強度。圖14表示通過TBA法測定的過氧化脂質(zhì)的測定結(jié)果。圖15表示皮膚提取物的SDS-PAGE的結(jié)果。圖16A表示通過蛋白質(zhì)印跡法得到的羰基蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果，圖16B表示通過光密度分析法測定的條帶強度。圖17表示血漿中過氧化脂質(zhì)的測定結(jié)果。
圖18表示山竹果皮提取物的強制口服給藥實驗的日程。
圖19表示從皮膚組織中提取可溶性成分的提取步驟圖。
圖20表示含水量。圖20A是變化的曲線圖，圖20B是全部數(shù)據(jù)。
圖2IA表示皮膚彈性。
圖2IB表示RO 拉伸性。
圖21C表示Rl 恢復(fù)至原來狀態(tài)的力。
圖21D表示R2 整體的彈性。
圖21E表示R3。
圖21F表示R4。
圖21G表示R5。
圖21H表示R6。
圖 211 表示 R7。圖 21J 表示 R8。圖22是用于說明皮膚組織標(biāo)本的觀察方法的圖。(a)表示無UV照射的標(biāo)本，(b) 表示UV照射的標(biāo)本。圖23是背部皮膚HE染色病理的標(biāo)本的照片。圖M表示由HE染色標(biāo)本算出的表皮厚度。圖25表示用于檢測I型膠原的SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果。圖25A表示皮膚提取物的SDS-PAGE的結(jié)果，圖25B表示蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，圖25C表示通過光密度分析法測定的相對的條帶強度。圖沈表示用于檢測核心蛋白聚糖的SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果。圖26A表示皮膚提取物的SDS-PAGE的結(jié)果，圖26B表示蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，圖26C表示通過光密度分析法測定的相對的條帶強度。實施發(fā)明的最佳方式下面例舉本發(fā)明的例子進行說明，但本發(fā)明的范圍不限定于以下的例子。實施例1山竹果皮提取物的制備(引用PAM0712)山竹果皮提取物按照以下所述方法獲得。即，將山竹的IOOg未干燥果皮粉碎，在 IL的70%乙醇中于80°C攪拌提取1小時。將其過濾，用蒸發(fā)器將濾液減壓干燥，得到27. 4g 提取物。實施例2通過摻入山竹果皮提取物的混餌的給藥來確認皮膚病的改善效果實驗材料及實驗方法1.使用動物及飼育環(huán)境將M只6周齡的雄性Hos =HR-I系無毛小鼠預(yù)先飼育一周后，用于實驗。使用以下所述的飼料，以自由攝入、自由飲水的條件在25°C的環(huán)境下進行飼育。此外，在進行皮膚含水量測定時用濕度計測定飼育室的濕度。實驗全部是在東京農(nóng)工大學(xué)動物實驗委員會的許可(No. 19-76)下進行。2.給藥樣品的制備方法給藥飼料的制備委托東洋酵母株式會社(才U工 > 々 >酵母株式會社)進行。使用了 0. 072%山竹果皮提取物混餌、0. 15%山竹果皮提取物混餌，還使用0. 葡糖胺混餌作為陽性對照，使用CRF-I飼料作為陰性對照。每1天的山竹果皮提取物攝入量的基準(zhǔn)如下0. 072%組為120mg/kg體重，0. 15%組為250mg/kg體重。3.飼育日程試驗日程如圖1所示。試驗期間為8周，從2007年10月至12月實施。在預(yù)備飼育1周后，考慮到為了使得在皮膚含水量和粘彈性上沒有偏差，將動物分成6組無UV照射的CRF-I給藥組(對照(-)組)、無UV照射的0. 072%山竹果皮提取物混餌給藥組(0. 072% (-)組)、UV照射的CRF-I給藥組(對照(+)組)、UV照射的0. 072%山竹果皮提取物混餌給藥組(0.072% (+)組)、UV照射的0. 15%山竹果皮提取物混餌給藥組(0. 15% (+)組)、 UV照射的0. %葡糖胺(GlcN)混餌給藥組(GlcN組)。分組后，對UV照射組每周進行3次UV照射。S卩，第1周進行1分鐘的UV照射，第2周進行2分鐘的UV照射，第3、4周進行 3分鐘的UV照射，從第4周至解剖完成時進行4分鐘的UV照射。總照射量為1. 35J。此外， 每周進行2次含水量測定和食入量測定，每周進行1次體重測定。
4.關(guān)于UV照射 使用UVB燈GL20SE (三洋電氣(SANKYO DENKI))，在照射強度為0. 3mff/cm2的條件下進行UV照射。UVB燈的光譜分布如圖2所示，放射波段為208nm 的光線，峰值波長為 280nmo使用數(shù)字式紫外線強度計UV-340 (亞蘇旺>Υ)調(diào)整照射強度。在照射時， 將小鼠單獨放在9cmX5CmXkm&籠子內(nèi)1個半小時，為了減小在各籠子內(nèi)的照射強度的差異，每次照射都輪換籠子來進行。5.皮膚含水量的測定每周2次使用C0RNE0METER(注冊商標(biāo))CM825 (科瑞格+科扎卡電子有限公司 (COURAGE+KHAZAKA electronic GMBH社)制)在UVB照射前將探針置于小鼠腰部進行測定。測定5次，以其平均值作為測定值。6.皮膚粘彈性的測定使用C0T0METER(注冊商標(biāo))SEM575 (科扎卡電子有限公司(KHAZAKA electronic GMBH社)制)，在分組時和解剖時進行測定。本機是通過光傳感器以l/100mm為單位測定吸進探針吸引口的皮膚的高度的機械。通過測定，得到以下r0 r9的10個參數(shù)。在圖3中示出各個值的定義。r0 = e(a)最初波形的振幅最大值(Uf)rl = e (a+b)最初波形的振幅最小值，恢復(fù)到原來狀態(tài)的能力(再變形能力)r2 = (e (a) _e (a+b)) /e (a) (Ua/Uf)r3 = e((rXa) + ((r-l)Xb)):最大振幅和再變形能力的差(整體的彈性)r4 = e ((a+b) X r)r5 = (e (a) -e (a+0. 1)) /e (0. 1)不含粘性變形的皮膚整體的彈性(Ur/Ue)r6 = (e (a) -e (0. 1)) /e (0. 1)相對于彈性膨脹的粘性的比例(Uv/^e)r7 = (e(a)-e (a+0. l)/e(0. 1)彈性的部分與整個波形(彈性100% )的比較值 (Ur/Uf)r8 = e(b)表示負壓解除后的復(fù)原力。r9 = r3-r0 在指針點處的吸入的皮膚高度本試驗中使用吸引口直徑為2mm的探針，在300mbar的負壓下吸引10秒后，迅速解除負壓，立即在脫吸引時間10秒內(nèi)進行測定。測定3次，以其平均值作為測定值。7.背部皮膚照片的拍攝為了觀察小鼠背部皮膚的狀態(tài)，用數(shù)碼相機進行拍攝。在分組時和解剖前2次用異氟烷對小鼠實施氣體麻醉后進行背部照片的拍攝。8.皮膚組織的采集法小鼠的解剖在飼育第57天實施，采血后進行皮膚組織的采集。使用8mm活體解剖穿孔器進行病理分析用的皮膚的采集后，采集背部全部的皮膚，并使用鐮刀狀解剖刀的背部將皮下組織除去。使用JFC-300型冷凍粉碎機(吉田制作所)將皮膚組織在液氮下冷凍粉碎，并保存于-80°C。
9.組織學(xué)分析法將如上所述的采集的背部皮膚展平夾在濾紙中，并放入km的皿中，通過滴下數(shù)滴Mildform ION( ^ ^ F * ；ι Λ ΙΟΝ)(和光純藥工業(yè)公司制)進行固定。然后，根據(jù)常規(guī)方法進行石蠟包埋、分割、切薄片，并實施HE染色，進行病理組織標(biāo)本的制作。標(biāo)本的制作委托株式會社札幌病理綜合研究所(株式會社札幌病理総合研究所)進行。對這些標(biāo)本進行全視野觀察，并對各個體的代表部分(切片的中央附近、組織沒有折皺的部分)實施照片拍攝。此外，使用HE標(biāo)本對各標(biāo)本的表皮厚度各測定10處，通過算出其平均值進行表皮厚度的測定。10.從皮膚組織提取蛋白質(zhì)的方法用甲醇對皮膚冷凍粉碎物進行M小時脫脂后，適量加入含有蛋白酶抑制劑的 PBS (-)，用旋轉(zhuǎn)器攪拌并清洗2次，除去血清成分等。然后，添加皮膚組織濕重的10倍量的提取緩沖液(4M鹽酸胍(GuHCl)/50mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)/0. IM氯化鈉(NaCl)/5mM芐脒鹽酸鹽/IOmM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA_2Na)/0. IM氨基己酸(7笑 7 *寸 >酸)(pH7.4))，在4°C下振蕩72小時進行提取。然后，在轉(zhuǎn)速4000rpm下離心分離30分鐘，對于上清液用RO水進行透析，透析完成后進行冷凍干燥。該試樣用于膠原的檢測。此外，加入相對于皮膚濕重的2倍量的另一蛋白質(zhì)提取液(50mMTriS-HCl/l% Trion X-100/75mM NaCl/lOmM EDTA_2Na/5mM 芐脒鹽酸鹽/0. IM 氨基己酸)，進行提取。提取后，轉(zhuǎn)速4000rpm下離心分離30分鐘，將上清液過濾，供于羰基蛋白質(zhì)的檢測。11.通過SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡法的測定SDS-PAGE按照Laemml i等的方法進行?；贐radford法對冷凍干燥物進行蛋白質(zhì)定量，使各樣品的蛋白質(zhì)濃度一致。在100°c下加熱5分鐘后，急冷，制備用于電泳的樣品。 電泳后，進行CBB染色。在檢測膠原時使用6%丙烯酰胺凝膠進行電泳，在檢測核心蛋白聚糖(實施例幻時使用7. 5%丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳完成后，將凝膠和PVDF膜在印跡用緩沖液 O5mMTris-HCl/190mM 甘氨酸(Glycine)/0. 04%十二烷基硫酸鈉(SDS)/20% 甲醇(Methanol))中平衡30分鐘。冰冷下使用濕式的印跡裝置(Bio-Rad公司制)，以0. 05A 通電18小時，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)移后，在室溫下將PVDF膜在封閉溶液中振蕩1小時。檢測膠原時的封閉溶液使用5%脫脂乳/Tris緩沖鹽溶液-吐溫(TBS-Tween)， 檢測核心蛋白聚糖時的封閉溶液使用在5%脫脂乳/TBS-Tween中添加0. 01U/ml比例的軟骨素酶ABC(生化學(xué)工業(yè)公司制)的溶液。然后，在第一抗體溶液(第一抗體5%脫脂乳/ TBS-Tween = 1 1000)中于室溫下振蕩1小時。接著，用TBS-Tween將膜洗凈4次，每次洗5分鐘，在第二抗體溶液中同樣于室溫下振蕩1小時，并進行洗凈。檢測抗原時，使用利用了 HRP反應(yīng)的化學(xué)顯色法。作為化學(xué)反應(yīng)試劑，使用ECL試劑盒(安法瑪西亞生物技術(shù)公司(Amersham-Pharmacia Biotech 社)制)，在富士醫(yī)學(xué) X 射線膠片(FUJI MEDICAL X RAY FILM)(富士膠卷公司制)上曝光后，將膠片顯影。顯影后的膠片，用畫像分析軟件kion Image (世恩公司(Scion Corporation)制)比較條帶強度。另外，檢測膠原時使用抗I型膠原(由豬皮獲得)兔抗血清作為第一抗體，HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體作為第二抗體。另外，檢測核心蛋白聚糖時使用抗核心蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì)兔抗血清作為第一抗體，HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體作為第二抗體。
12.從皮膚組織提取糖胺聚糖(GAG)的方法冷凍粉碎的皮膚用乙醇于4°C進行脫脂1晚后，相對于濕重，添加30倍量的0. 5M NaOH，通過用旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)的同時在4°C下使反應(yīng)進行20小時，引發(fā)β消去反應(yīng)使GAG從蛋白質(zhì)中游離出來。然后，加入添加的NaOH的一半量的IM HC1，進行中和反應(yīng)。用ρΗ試紙確認有沒有中和完全。在這里，加入NaOH的1.5倍量的2Xc0nc.的鏈霉蛋白酶(日語夕子少一)緩沖液，在100°C進行10分鐘熱變性。當(dāng)溶液溫度回到50°C時，加入1片百里酚作為防腐劑，以相對于最初添加的NaOH的量為(w/v)的量加入鏈霉蛋白酶。使用振蕩機在50°C下進行2天的分解反應(yīng)。這時，自反應(yīng)開始M小時后再次添加與最初加入時同樣量的鏈霉蛋白酶。反應(yīng)完成后，以最終濃度為10%的量添加三氯乙酸，在4°C下放置1小時，從而除去蛋白質(zhì)。然后，在0°C和9000g的條件下離心分離15分鐘，使用DISMIC(注冊商標(biāo))(先進科技東洋有限公司(了 Y K > 々東洋(株)社)制)將上清液過濾，進行透析。將透析完成后的液體冷凍干燥，并將冷凍干燥物溶于Milli-Q水中，用于醋酸纖維膜電泳。13.通過醋酸纖維膜電泳進行的GAG分析法為了鑒定無毛小鼠皮膚中的糖胺聚糖的組成，醋酸纖維膜電泳按照Hata等的方法進行。通過上述方法制得的GAG用相對于IOOmg用于提取的皮膚濕重為50 μ 1的Mi 11 i_Q 水溶解來制備用于電泳的試樣。將0. 5μ 1的樣品點到醋酸纖維膜上，使用0. IM吡啶/0. 47Μ 甲酸緩沖液以每Icm膜寬為ImA的固定電流進行電泳。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將溶解濃度為Img/ ml的透明質(zhì)酸(HA)、硫酸皮膚素(此)、硫酸軟骨素(⑶)各50ml混合后使用。電泳完成后， 用阿爾新藍染色液(0.5%阿爾新藍/25%乙醇/10%乙酸)進行染色，并用10%乙酸進行脫色。得到的染點(日語7求7卜)用畫像分析軟件kion Image (世恩公司(Scion Corporation))進行分析。14.使用TBA法的皮膚過氧化脂質(zhì)測定法TBA法被用作綜合測定由脂質(zhì)過氧化生成的幾乎所有的成分、脂質(zhì)過氧化物、丙二醛及其他的醛、醛和蛋白質(zhì)等的反應(yīng)產(chǎn)物的方法，是通過對由硫代巴比妥酸(TBA)和從試樣游離出的硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)的反應(yīng)而生成的紅色色素進行定量來測定脂質(zhì)的過氧化度的方法。皮膚過氧化脂質(zhì)度的測定按照Ohkawa等的方法進行。首先，向皮膚冷凍粉碎物中以濕重15% (w/v)的量添加1. 15% KCl水溶液，并進行攪拌。相對于50mg組織勻漿，依次加入100 μ 1的8. SDS溶液、0. 75ml乙酸緩沖液、25 μ 1的0. 8% BHT乙酸溶液(抗氧化劑)、0. 75ml的0. 8% TBA水溶液、350 μ 1的5mM FeCl3,并充分攪拌，在5°C下保持60分鐘后，在沸水浴中加熱60分鐘。冷卻后加入0. 5ml的Milli-Q水、2. 5ml的丁醇-吡啶混合液 (15 1, ν/ν)并振蕩混合，然后以3000rpm的轉(zhuǎn)速進行20分鐘離心分離。測定上清液在 532nm的吸光度，并根據(jù)校正曲線算出TBARS的量。這時，校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用1，1，3， 3-四乙氧基丙烷(生化學(xué)用和光純藥工業(yè)公司)，添加同量的KCl水溶液替代皮膚冷凍粉碎物來制作空白。15.皮膚組織中氧化蛋白質(zhì)的測定法氧化蛋白質(zhì)之一的羰基蛋白質(zhì)是氧化應(yīng)激的標(biāo)記物。使用Oxyblot 的蛋白質(zhì)氧化檢測試劑盒(Protein Oxidation Detection Kit) (CHEMICON (注冊商標(biāo))公司制)進行羰基蛋白質(zhì)的評定。具體方法如下所述。通過BCA法對各組樣品進行蛋白質(zhì)定量，并將蛋白質(zhì)濃度統(tǒng)一為1. lmg/ml。相對于5μ 1的蛋白質(zhì)試樣添加5μ 1的12% SDS，在這里，通過添加 ομ 1的2，4-二硝基苯腙 (DNPH)并在室溫下孵育15分鐘，將DNPH引入羰基中。然后，添加7. 5 μ 1中和溶液使反應(yīng)終止。使用10%硅膠將DNPH衍生的樣品供于SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)分離，并使用印跡裝置對 PVDF膜實施印跡印染。將轉(zhuǎn)移后的膜在常溫下浸入封閉緩沖液(5%脫脂乳/TBS-Tween) 中1小時進行封閉后，使其在常溫下與第一抗體反應(yīng)1小時。反應(yīng)后用TBS-Tween洗凈4 次，每次5分鐘，再使其在常溫下與第二抗體反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，再次進行洗凈4次，每次 5分鐘。檢測抗原時，使用利用了 HRP反應(yīng)的化學(xué)顯色法。作為化學(xué)反應(yīng)試劑，使用ECL試劑盒(安法瑪西亞生物技術(shù)公司(Amersham-Pharmacia Biotech)制)，在富士醫(yī)學(xué)X射線膠片(FUJI MEDICAL X RAY FILM)(富士膠卷公司制)上曝光后，將膠片顯影。顯影后的膠片，用畫像分析軟件kion Image(世恩公司(Scion Corporation))比較條帶強度。16.血漿中過氧化脂質(zhì)(LPO)的測定委托日研塞爾株式會社(日研廿^ ^ )進行測定。17.統(tǒng)計處理對于所有的參數(shù)，首先確認是否具備正態(tài)性、是否具同方差性后，當(dāng)呈正態(tài)分布且是同方差的情況下進行圖基-克雷默檢驗(Tukey-kramer test)，否則進行席夫F檢驗 (Scheffe' s F test)。結(jié)果1.基礎(chǔ)數(shù)據(jù)為了調(diào)查UV照射及混餌給藥對小鼠有無影響，進行了體重測定和食入量測定。體重測定每周進行一次。食入量測定每周進行2次，各籠分別進行測定。各自的體重測定的結(jié)果示于圖4，食入量測定的結(jié)果示于圖5中。在各組間，沒有發(fā)現(xiàn)體重的差別。此外，關(guān)于食入量，第4周以后，發(fā)現(xiàn)GlcN(+)組的食入量比其他組多的傾向，但食入量的上升對體重沒有產(chǎn)生影響。根據(jù)食入量測定算出的各組的有效成分平均攝入量如下0.072% (-)組為 129mg/kg/天，0. 072% (+)組為 12%ig/kg/天，0. 15% (+)組為洸9mg/kg體重/天，GlcN(+) 組為 434mg/kg/ 天(圖 5B)。2.皮膚含水量為了檢驗因UVB照射以及山竹果皮提取物的給藥產(chǎn)生的對皮膚含水量的影響，使用C0RNE0METER CM 825對皮膚含水量進行了測量。結(jié)果示于圖6。圖6A表示含水量的經(jīng)時變化和測定時的濕度，圖6B表示第8周時的含水量。在UVB照射組，大致從第3周起開始發(fā)現(xiàn)有含水量減少的傾向。到第5周止皮膚含水量在各組間沒有檢測出顯著差異，但從第6周以后至第8周持續(xù)確認到對照(+)組中相對于對照(_)組有顯著減少，且0. 072% (+)組相對于對照(+)組有顯著增加(ρ < 0. 05)。 除此以外，在第7、8周還發(fā)現(xiàn)相對于對照⑴組，GlcN(+)組也有顯著增加。第8周時的皮膚含水量如下對照(“)組為66. 52士3. 44，對照(+)組為57. 60士6. 71，0. 072% (+)組為 62. 89士2. 92，GlcN(+)組為 62. 96士2. 78。
3.皮膚彈性皮膚彈性使用⑶TOMETER SEM575在分組時和試驗完成時測定共2次。對每1個體進行3次測定，將其平均值作為測定值使用。關(guān)于RO的皮膚的拉伸， 確認到相對于對照㈠組，對照⑴組有顯著減少。即得到了由于UV照射，皮膚的拉伸有降低的結(jié)果。此外，關(guān)于Rl的皮膚的恢復(fù)，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，各組沒有變化。關(guān)于反應(yīng)這些數(shù)據(jù)的表示皮膚整體的彈性的R2的值，相對于對照(_)組，發(fā)現(xiàn)對照(+)組有顯著減少。4.病理學(xué)分析為了調(diào)查對皺紋形成的影響，對小鼠背部皮膚的皺紋的狀態(tài)進行了觀察。用異氟烷實施氣體麻醉后用數(shù)碼相機拍攝的背部的照片部分示于圖8。在對照(_)組中，確認有相對于脊椎平行走向的線條(圖8A)，這些線條隨小鼠的運動時隱時現(xiàn)。在對照(+)組中，出現(xiàn)了在與脊椎垂直的方向上的線條(圖8B)，還存在可以確認有皮膚炎癥的個體。此外，在 0.15% (+)組中，無論是相對于脊椎平行走向的皺紋，還是在垂直方向上的皺紋都很淺。還制作了 HE染色標(biāo)本，測定了各組的表皮厚度。使用HE染色標(biāo)本對各標(biāo)本的表皮厚度各測定10處，算出各組的平均值。各組的HE染色標(biāo)本的代表圖示于圖9，表皮厚度的測定結(jié)果示于圖10。表皮厚度結(jié)果如下對照(_)組為23. 20士3.56 μ m，0.072% (-) 組為 21. 88士5. 17 μ m，對照(+)組為 38. 72士7. 56ym,0. 072% (+)組為 43. 17士8. 60 μ m, 0. 15% (+)組為 36. 74士5. 92 μ m，GlcN(+)組為 39. 46士9· 56 μ m。相對于對照(_)組，對照(+)組、0.072% (+)組、0. 15% (+)組、GlcN(+)組中的表皮厚度有顯著增加，確認有增生。確認了由于UV照射，基底層的細胞內(nèi)浮腫和細胞間浮腫增加，顆粒細胞變?yōu)闀駛毎那闆r。表皮增生特別是棘層部分有增生。在0.15% (+)組中可以觀察到棘層的增生，但細胞的狀態(tài)和無照射組接近，雖然觀察到細胞內(nèi)浮腫，可是與0.072% (+)相比較，細胞間浮腫得到了治療。5.根據(jù)SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡法的I型膠原的定量以各組的皮膚提取物為試樣、使用6%聚丙烯酰胺Tris-HCl凝膠作為分離凝膠、 3%聚丙烯酰胺Tris-HCl凝膠作為濃縮凝膠，進行電泳，并通過CBB染色進行確認。對于標(biāo)記物，使用預(yù)先染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)高量程(PrestainedSDS-PAGE Standards High Range) (Control 310001920)。結(jié)果示于圖11。根據(jù)該結(jié)果，確認到各樣品的蛋白質(zhì)量相寸。蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果示于圖12A。發(fā)現(xiàn)在117kDa附近有推測是I型膠原α 1鏈的條帶，并在200kDa附近檢測出認為是β鏈的條帶。圖12Β是通過畫像分析軟件kion Image 將A的條帶強度定量化的圖表。條帶結(jié)果如下所示將對照(_)組定為1時，0.072% (-) 為 1. 56，對照(+)組為 2. 29，0. 15% (+)為 2. 17，0. 072% (+)為 1. 28，GlcN(+)為 1. 25(用 α鏈和β鏈的平均值表示)(圖12Β)。6.通過醋酸纖維膜電泳進行的GAG的鑒定為了鑒定無毛小鼠皮膚提取物中的GAG、特別是與皮膚的水分保持有關(guān)的透明質(zhì)酸(HA)的量，進行了醋酸纖維膜電泳。結(jié)果示于圖13A。使用畫像分析軟件kion Image 分析各染點濃度而得的結(jié)果示于圖13B。HA的條帶強度如下所示將對照(_)組定為1時， 0. 072% (-)為 1. 03，對照(+)組為 1. 25，0. 072% (+)為 0. 93，0. 15% (+)為 0. 86，GlcN(+) 為0.58。由于UV照射HA的量增加，但確認了皮膚含水量與對照(+)組相比有顯著增加的0. 072% (+)山竹果皮提取物給藥組幾乎沒有觀察到HA的量的變化。關(guān)于硫酸軟骨素(CS) 并沒有檢測出來，與3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同的染點存在于CS的下游，在對照(_)組中確認有較深的染點。該染點被認為可能是硫酸乙酰肝素(HS)，但尚未進行鑒定。7.皮膚中過氧化脂質(zhì)的定量為了考察山竹果皮提取物對皮膚的抗氧化效果，通過TBA反應(yīng)進行了過氧化脂質(zhì)的測定。當(dāng)生物體內(nèi)產(chǎn)生氧化過激時，最容易受到損害的是含有高度不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。作為生物體的氧化過激的標(biāo)記物，使用羥基過氧化脂質(zhì)類和硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì) (thiobarbituric acid-reactive substances :TBARS)，該方法被認為是綜合測定脂質(zhì)過氧化度的有用的方法。在Ohkawa法的反應(yīng)中，通過添加EDTA和Fe離子，可以知道試樣中的TBARS是何種物質(zhì)。已知來源于鏈烯(日語 >少一> )類、鏈二烯(日語 力夕二 f 一> )類的紅色色素的生成被EDTA抑制，而通過添加狗離子得到增強。在本試驗中，沒有添加任何物質(zhì)的情況下，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)顯色，然而在添加!^e離子的情況下發(fā)現(xiàn)有顯色，所以采用了添加狗離子的方法。測定的結(jié)果如圖14所示。TBARS測定的結(jié)果在各組間沒有檢測出顯著差異。8.羰基蛋白質(zhì)的定量蛋白質(zhì)也是受氧化損傷影響的因素之一。在受到光老化的皮膚中，可以發(fā)現(xiàn)在真皮上部的蛋白質(zhì)中有因ROS引起的損害的累積(Sander CS，2002)。蛋白質(zhì)的氧化修飾是指醛或酮的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)(羰基蛋白質(zhì))、酪氨酸的交聯(lián)結(jié)構(gòu)、氨基酸替換、氨基酸的氧化、肽鍵的斷裂等。蛋白質(zhì)的氧化損傷是指例如使酶活性發(fā)生變化、使結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的機能失活、使對蛋白質(zhì)分解的感受性發(fā)生變化(Shacter E，2000)。在氧化修飾的蛋白質(zhì)中，經(jīng)常使用作為代表物質(zhì)的羰基蛋白質(zhì)的定量。從各組的皮膚組織使用蛋白質(zhì)提取液(1% Trion X-100/50mMTris-HCl/75mM NaCl/lOmM EDTA-2Na/5mM芐脒鹽酸鹽/0. IM氨基己酸)得到提取物，將其作為試樣進行電泳后，通過CBB染色確認各樣品的蛋白質(zhì)的量。使用10%聚丙烯酰胺Tris-HCl凝膠作為分離凝膠、3%聚丙烯酰胺Tris-HCl凝膠作為濃縮凝膠。對于標(biāo)記物，使用預(yù)染色的SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)高量程(Prestained SDS-PAGE Standards High Range) (Lot. No. Control310001920)。 結(jié)果示于圖15。根據(jù)該結(jié)果，確認到各試樣的蛋白質(zhì)的量相等。各樣品的羰基蛋白質(zhì)的評定按照上述的“皮膚組織中氧化蛋白質(zhì)的測定法”實施。 用該評定法得到的各樣品的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果示于圖16A。使用兔抗DNP抗體(Rabbit Anti-DNP Antibody)作為第一抗體，使用山羊抗兔 IgG(綴合 HRP) (Goat Anti-Rabbit IgG(HRP-conjugated))作為第二抗體。在分子量為97. 4kDa和68kDa附近檢測出較深的條帶。此外，使用圖畫像分析軟件kion Image對條帶強度進行了深度的定量，并示出將對照 ㈠組作為1時的相對強度(圖16B)。將對照㈠組定為1時，0. 072%㈠為1. 18，對照 (+)組為 3. 18，0. 072% (+)為 1. 33，0. 15% (+)為 1. 86，GlcN(+)為 1. 63，0. 072% (+)組中的條帶強度約為對照(+)組的42%。9.血漿過氧化脂質(zhì)的定量對血漿中的過氧化脂質(zhì)濃度進行了測定，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異(圖17)。討論如上所述，確認到由于UVB照射對照組中皮膚含水量和皮膚彈性下降，通過山竹果皮提取物給藥皮膚含水量增加。已知山竹含有130種以上的有效成分。本發(fā)明中，通過多種成分的綜合的、協(xié)同的作用發(fā)揮抗氧化作用，而且還協(xié)同抗氧化作用以外的效果，認為是顯著地獲得了皮膚病的治療和/或預(yù)防效果。Corneometer的測定范圍是30 40 μ m,在用于無毛小鼠的情況下，認為測定的是角質(zhì)層和表皮的一部分的含水量。根據(jù)病理學(xué)分析的結(jié)果可知，由于UV照射，表皮、特別是棘層有增生，且在基細胞和棘細胞出現(xiàn)了細胞內(nèi)浮腫和細胞間浮腫。與0.072%山竹果皮提取物給藥組相比較，在0. 15%山竹果皮提取物給藥組中可觀察到浮腫狀態(tài)的治療效果， 而且0.15% (+)組的增生度也較低。由此，暗示了山竹果皮提取物的口服攝入對表皮的病理學(xué)變化有治療效果，并且顯示出該效果在0. 15%混餌組更為明顯。然而，關(guān)于含水量，在 0. 072%混餌給藥組發(fā)現(xiàn)有上升。作為與皮膚含水量相關(guān)的因子，對皮膚中的透明質(zhì)酸(HA)、膠原進行了定量，在I 型膠原的定量方面，與無UV照射對照組相比較，UV照射對照組中獲得約2. 1倍的條帶強度。這被認為是在UV照射初期生物體內(nèi)的防御機制發(fā)揮作用，趨于生產(chǎn)增加，因此膠原增加。通過山竹果皮提取物的給藥，膠原的生產(chǎn)減少，這可認為是由于UV照射的損傷減輕，因而不再傾向于膠原的增加。從通過羰基蛋白質(zhì)的檢測來測定氧化應(yīng)激標(biāo)記物的結(jié)果來看，可得到氧化應(yīng)激因 UV照射而增加，通過山竹果皮提取物的攝入氧化應(yīng)激會減少的結(jié)果，并暗示山竹果皮提取物的抗氧化作用與皮膚狀態(tài)的治療有密切關(guān)系。如上所述，在混餌給藥實驗中發(fā)現(xiàn)含水量通過口服攝入山竹果皮提取物而上升。 根據(jù)氧化應(yīng)激標(biāo)記物之一的羰基蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果，暗示氧化應(yīng)激的抑制與因山竹果皮提取物的給藥引起的含水量的上升有關(guān)。實施例3通過山竹果皮提取物的強制口服給藥來確認皮膚病的改善效果1.給藥樣品的制備與口服給藥給藥樣品使用山竹果皮制劑。即，使用山竹果皮提取物阿拉伯膠=1 1的制劑化藥劑。作為對照僅使用阿拉伯膠，還使用膠原作為陽性對照。制備各種濃度的溶液，將 0. lml/10g體重的溶液使用胃管在飼育期間每天對小鼠口服給藥。山竹果提取物溶液制備為高濃度O^ig/ml)和低濃度(12mg/ml)2種，阿拉伯膠溶液的濃度制為2%ig/ml，膠原溶液的濃度制為20mg/ml。2.飼育日程試驗日程如圖18所示。在預(yù)備飼育1周后，基于皮膚含水量和粘彈性進行分組， 將動物分成6組無UV照射的阿拉伯膠給藥組(對照(_)組)、無UV照射的山竹果皮提取物溶液O^ig/ml)給藥組(高濃度(_)組)、UV照射的阿拉伯膠給藥組(對照(+)組)、UV 照射的山竹果皮提取物溶液O^ig/ml)給藥組(高濃度(+)組)、UV照射的山竹果皮提取物溶液(12mg/ml)給藥組(低濃度⑴組)、UV照射的膠原給藥組(膠原⑴組)。每周進行3次UVB照射并且每天通過導(dǎo)管進行強制口服給藥。試驗期間為8周，從2007年5月至7月實施。3.關(guān)于UVB照射
使用UVB燈GL20SE (三洋電氣(SANKYO DENKI))在照射強度為0. 3mff/cm2的條件下每周進行3次UVB照射。使用數(shù)字式紫外線強度計UV-340(亞蘇旺(7 * 7 > ))調(diào)整照射強度。將小鼠單獨放在9cmX5CmXkm&籠子內(nèi)1個半小時，為了減小在各籠子內(nèi)的照射強度的差異，每次照射都輪換籠子來進行。照射時間如下第1周進行1分鐘的照射，第2周進行2分鐘的照射，第3周增至 3分鐘，此后進行3分鐘的照射。從第38天起提高照射強度，照射時間設(shè)為4分鐘，但由于小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑，從第43天起改為進行3分30秒的照射?？傉丈淞繛?. 224J。4.從皮膚組織提取蛋白質(zhì)的方法與實施例2同樣地采集的皮膚組織稱量并且各組分別整理，用乙醇進行M小時脫脂，再用剪刀剪碎后，通過用含有蛋白酶抑制劑的PBS(-) (PBS(-)中溶有5mM苯脒鹽酸鹽/IOmM EDTA-2Na/0. IM氨基己酸的溶液)洗凈2次以除去血清成分等。然后，添加相對于皮膚組織濕重為10倍量的蛋白質(zhì)提取液(4M鹽酸胍/50mM Tris-HCl/0. IM NaCl/5mM 芐脒鹽酸鹽/IOmM EDTA-2Na/0. IM氨基己酸(pH7. 4))，使用振蕩機在4 °C下振蕩72小時。在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心分離20分鐘，采集上清液，用7M尿素/50mM Tris-HCl/0. IM NaCl/5mM芐脒鹽酸鹽/IOmM EDTA-2Na/0. IM氨基己酸緩沖液(pH7. 4)進行透析。透析后， 加入T0Y0PEARL (注冊商標(biāo))DEAE-650S (東曹株式會社(東〃 一社)制)，在4°C下振蕩M 小時，分為吸附組分(A)和未吸附組分(B)。對于A，添加洗脫緩沖液(7M尿素/50mM Tris_HCl/2M NaCl/5mM芐脒鹽酸鹽/IOmM EDTA-2Na/0. IM氨基己酸(pH7. 4))，在4°C下振蕩72小時進行提取，其后相對于RO水實施透析。對于B，直接相對于RO水實施透析。在透析后，A、B都進行冷凍干燥，并作為SDS-PAGE 和蛋白質(zhì)印跡用的樣品使用。A用于檢測核心蛋白聚糖，B用于檢測膠原。該步驟示于圖 19。5.其他的實驗與實施例2相同。結(jié)果1.皮膚含水量為了檢驗因UVB照射以及山竹果皮提取物的給藥產(chǎn)生的對皮膚含水量的影響，使用CORNEOMETER CM 825對皮膚含水量進行了測量。結(jié)果示于圖20A及圖20B。到第5周為止在各組間沒有檢測出差異。到第6周時，相對于對照(-)組，對照(+)組顯示出含水量減少的傾向(P < 0. 1)。此外，相對于對照(+)組，在高濃度(+)組發(fā)現(xiàn)有顯著的上升。在第 7周時，相對于對照㈠組，檢測出在對照⑴組有顯著的減少(ρ <0.05)；相對于對照⑴ 組，檢測出在高濃度(+)組有顯著的增加。發(fā)現(xiàn)有顯著差異的第7周時的皮膚含水量結(jié)果如下對照㈠組為78. 83 士 1.90，高濃度㈠組為82. 49 士 4. 89，對照(+)組為73.對士5.41， 高濃度(+)組為77. 43 士 3. 86，低濃度(+)組為74. 26 士 2. 63，膠原(+)組為68. 54 士 2. 91。2.皮膚彈性使用⑶TOMETER SEM575，對無毛小鼠腰部皮膚的彈性進行測定。結(jié)果如圖21A J所示，分組時，在各組間沒有檢測出顯著差異。解剖時，作為皮膚的拉伸的參數(shù)的RO在各組間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，但關(guān)于表示皮膚的恢復(fù)的R1，相對于對照(_)組，確認對照(+)組有顯著的減少(P < 0. 05)。此外，關(guān)于表示皮膚整體的彈性的R2，相對于對照(-)組，確認了在對照(+)組有顯著的減少(P < 0. 01)；相對于對照(+)組，確認了在高濃度(+)組有顯著的增加(P < 0. 05)。此外，相對于高濃度(_)組，確認在高濃度(+)組有顯著的減少。3.病理學(xué)分析背部皮膚HE染色標(biāo)本中應(yīng)該注意的觀察結(jié)果用圖22進行說明。在圖22的無UV 照射標(biāo)本(a)中，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)基細胞層的細胞內(nèi)浮腫，但在UV照射標(biāo)本(b)中觀察到了基細胞層的細胞內(nèi)浮腫。確認了進一步受到損傷時，在細胞間也會發(fā)現(xiàn)有浮腫，并從基底層細胞擴散至棘細胞層，在顆粒細胞中也有曬傷化的細胞。即，具體而言，在HE染色標(biāo)本中關(guān)注3點(1)有沒有發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的曬傷化細胞，(2)在基細胞的細胞內(nèi)及細胞間有無浮腫， (3)細胞間浮腫有沒有延伸至棘層。關(guān)于浮腫，當(dāng)損傷較小時只能觀察到細胞內(nèi)浮腫，但當(dāng)損傷變得越大時會越多地出現(xiàn)細胞間浮腫，基底層的細胞間浮腫也會擴散至棘層。各組的病理分析的結(jié)果示于圖23。圖23表示各組的代表性標(biāo)本。在對照(_)組中，可以觀察到處處都有細胞內(nèi)浮腫。在UV照射組中除了細胞內(nèi)浮腫，細胞間浮腫擴散，有的標(biāo)本中細胞間浮腫擴散到棘層。與對照(+)組相比，在高濃度(+)組中浮腫的狀態(tài)明顯有改善。另外，圖23中由雙線(二重線)圈起的地方表示顆粒細胞的曬傷化細胞，由單線 (一重線)圈起的地方表示基細胞的細胞內(nèi)浮腫，由虛線圈起的地方為基細胞的細胞間浮腫的病理觀察結(jié)果。此外，表皮厚度的測定結(jié)果示于圖對。這些值是對各標(biāo)本各測定10處表皮厚度并計算出平均值而得的結(jié)果。表皮厚度的測定結(jié)果如下對照(_)組為四.87士 11.94μπι， 高濃度㈠組為21. 03 士 2. 46 μ m，對照(+)組為50. 42 士 11. 89 μ m，高濃度(+)組為 39. 63 士 6. 63μπι;相對于對照㈠組，在對照⑴組發(fā)現(xiàn)有表皮增生；相對于高濃度㈠組， 在高濃度(+)組發(fā)現(xiàn)有表皮增生(圖。此外，對于背部皮膚的皺紋形成的狀態(tài)進行觀察，確認了與對照(_)組相比，在對照⑴組形成了較深的皺紋。將高濃度㈠組與高濃度⑴組比較時也觀察到了同樣的狀態(tài)。將對照(_)組與高濃度(_)組進行觀察比較，在外觀上沒有觀察到差異。將對照(+)組與高濃度(+)組比較時，雖然感覺上有一些差異，但并沒有觀察到可表示外觀差別的差異。4. I型膠原的SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡使用6%聚丙烯酰胺凝膠作為分離凝膠、3%聚丙烯酰胺凝膠作為濃縮凝膠，并使用預(yù)染色的 SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)高量程(Prestained SDS-PAGE Standards High Range) (Control 310001920)作為標(biāo)記物進行電泳，通過CBB染色，確認了各樣品的蛋白質(zhì)的量相等。蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果如圖25A及B所示。在116kDa附近確認了認為是I型膠原α鏈的條帶，將對照(_)組的條帶強度定為1時，高濃度(_)組為1.60，對照(+)組為1.50，高濃度(+)組為 2.86( 25C)。5.核心蛋白聚糖的SDS-PAGE及蛋白質(zhì)印跡使用7. 5%聚丙烯酰胺凝膠作為分離凝膠、3%聚丙烯酰胺凝膠作為濃縮凝膠，并使用預(yù)染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)高量程(Prestained SDS-PAGE Standards High Range) (Lot. No. Control 310001920)作為標(biāo)記物進行SDS-PAGE，供于CBB染色，在確認各樣品的蛋白質(zhì)的量相等后，實施蛋白質(zhì)印跡(圖26A及B)。當(dāng)將對照(_)組的條帶強度定為1時，高濃度(_)組為1. 15，對照(+)組為1. 53，高濃度(+)組為1.觀(圖^C)。與無照射對照組相比，在UV照射對照組中核心蛋白聚糖的條帶無論是在低分子側(cè)還是在高分子側(cè)都較寬，在高濃度(+)組中低分子側(cè)的條帶消失。
討論本實施例中得到以下結(jié)果山竹果皮提取物的給藥對于無毛小鼠改善了因UV照射而降低的皮膚含水量。因此，可認為山竹果皮提取物是對皮膚的水分保持有效果的物質(zhì)。此外，作為導(dǎo)管試料的分散劑，使用認為無含水量改善效果的阿拉伯膠，但在對照組中仍發(fā)現(xiàn)含水量有增加的傾向。有報告(《藥學(xué)國際雜志》第298卷第153頁 263頁， 2005 (International Journal of Pharmaceutics 298 :153_263，2005))指出在簡化的角質(zhì)層的生物體外模型中阿拉伯膠可以抑制脂質(zhì)的過氧化，暗示阿拉伯膠可能顯示出阻礙因 UVB照射產(chǎn)生的氧化過激的作用。此外，對于皮膚彈性，由于UV照射皮膚整體的彈性會有下降，但暗示山竹果皮提取物具有使降低的彈性恢復(fù)的效果。根據(jù)蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)膠原的條帶強度因UV照射而增加。有報告稱在光老化模型的小鼠中，皮膚中的總膠原量不一定因紫外線照射而減少，該結(jié)果與那個報告一致。 無論是無照射還是有照射，通過果皮提取物的給藥，從發(fā)現(xiàn)以浮腫為代表的病理觀察結(jié)果的恢復(fù)來看，可以推測給藥與皮膚組織的恢復(fù)機制有某種關(guān)系，從而引起膠原產(chǎn)生的增加。從核心蛋白聚糖的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果來看，可得到以下結(jié)果因UV照射產(chǎn)生的低分子·高分子量的核心蛋白聚糖會因果皮提取物的給藥而減少。核心蛋白聚糖是具有約 IOOkDa的分子量的蛋白聚糖，在約40kDa的核心蛋白質(zhì)上共價結(jié)合1條硫酸軟骨素鏈或者硫酸皮膚素鏈。核心蛋白質(zhì)是具有富亮氨酸的8 10個氨基酸重復(fù)序列(LRR)的分子量較小的蛋白聚糖。核心蛋白聚糖與膠原或其他分子相互作用，在結(jié)締組織的形成和機能上承擔(dān)重要的作用。報告稱核心蛋白聚糖基因缺損的小鼠與野生型相比，皮膚脆弱且彈性較差。 此外，還有報告稱在纖維形成的調(diào)節(jié)上，向損傷的肌纖維進行局部的核心蛋白聚糖給藥時， 可以抑制過度的纖維形成并改善肌肉修復(fù)。這些報告顯示出核心蛋白聚糖與細胞外基質(zhì)的正常的構(gòu)建有關(guān)。因UV照射增加的比平常的分子量低或高的核心蛋白聚糖主要與含水量、 彈性中的皮膚的彈性降低有關(guān)，通過果皮提取物的給藥核心蛋白聚糖的低分子測的條帶消失，彈性也上升，從這些結(jié)果來看，可認為低分子核心蛋白聚糖的增加有使皮膚彈性減小的作用，而果皮提取物的給藥有抑制低分子核心蛋白聚糖產(chǎn)生的作用。對于詳細的機理，需要進一步的驗證。從以上的結(jié)果來看，山竹果皮提取物的給藥可以使皮膚含水量、皮膚彈性和表皮增生恢復(fù)。此外，可以改善因UV照射引起的病理學(xué)觀察結(jié)果的惡化。其中，推測皮膚彈性的恢復(fù)與因UV照射引起的異常核心蛋白聚糖的抑制有關(guān)。實施例4使用山竹提取物的食品的制備用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備口香糖。

膠基20%砂糖54. 7葡萄糖14. 5糖稀9. 3香料0. 5山竹果皮提取物1.0100. 0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備糖果。砂糖50. 0%糖稀33.4檸檬酸1. 0香料0. 2山竹果皮提取物1. 0水14.4100. 0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備軟糖。明膠60. 0%糖稀23. 0砂糖7. 5植物油脂4. 5甘露糖醇3. 0檸檬汁1.0山竹果皮提取物1. 0
100.0%
用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備巧克力。糖粉40.8%
可可苦料20. 0
全脂奶粉20. 0
可可脂17- 0
甘露糖醇1- 0
山竹果皮提取物1-0
香料0- 2
100.0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備冰糕。
香橙汁25. 0%
砂糖25.0
蛋白10-0
山竹果皮提取物1
香料0.1
水39.8
100.0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備冰激凌。
脫脂奶粉
生奶油25- 0
砂糖10- 0
蛋黃10- 0
山竹果皮提取物1.0
香料0. 1
水3.9
100. 0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備餅干。1級低筋面粉25. 0%1級中筋面粉22. 0精制糖5.0食鹽1.0葡萄糖1. 0棕櫚起酥油12.0碳酸氫鈉0. 2亞硫酸氫鈉0.2大米粉2. 0全脂奶粉1.0代用奶粉0. 6山竹果皮提取物1.0水29. 0100.0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備糖片。
砂糖75.8%葡萄糖19.0蔗糖脂肪酸酯0. 2香料0. 2山竹果皮提取物0. 8水4. 0
100. 0%用實施例1中制備的山竹果皮提取物按照如下所述制備飲料。
橙汁30.0%異構(gòu)糖15. 14
檸檬酸0. 1
維生素C0. 04
香料0. 1
山竹果皮提取物0.2
水42
100. 0% 本申請主張基于2009年3月31日提出申請的日本專利申請?zhí)?009-085411的優(yōu)先權(quán)，引用其內(nèi)容作為本申請的一部分。
權(quán)利要求
1.一種用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，其特征在于，所述組合物由用極性溶劑從山竹(Garcinia mangostana L.)果皮提取的提取物形成。
2.如權(quán)利要求1所述的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，其特征在于，所述極性溶劑為乙醇或乙醇的水溶液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，其特征在于，所述皮膚病由活性氧引起。
4.如權(quán)利要求1 3所述的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，其特征在于，所述皮膚病由紫外線照射引起。
5.如權(quán)利要求1 4所述的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，其特征在于，抑制因紫外線照射引起的皮膚的含水量的減少。
6.如權(quán)利要求1 5所述的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物，其特征在于，抑制因紫外線照射引起的皮膚的損傷。
7.一種含有權(quán)利要求1 6所述的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物的食品。
全文摘要
以提供治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物為目的，發(fā)明人進行了認真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山竹果皮提取物具有抑制皮膚病的效果。本發(fā)明提供由山竹果皮提取物形成的用于治療和/或預(yù)防皮膚病的組合物。
文檔編號A61P17/16GK102365090SQ20108001588
公開日2012年2月29日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者大澤謙二, 成瀬敦, 樋口裕明, 清水和正, 野村義宏, 黑田玲子 申請人:羅蒂株式會社