專利名稱：用于增強(qiáng)t細(xì)胞功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)抑制T細(xì)胞的程序性死亡-1配體1 (ProgrammedDeath-1 Ligand LPD-L1)和 / 或程序性死亡-1 配體 2 (ProgrammedDeath-1 Ligand 2，PD_L2)的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，等等。
背景技術(shù)：
經(jīng)由B7:CD^共刺激分子家族的信號(hào)強(qiáng)烈地參與T細(xì)胞反應(yīng)的活化、抑制和調(diào)節(jié)。 已知屬于B7 ⑶觀共刺激分子家族的PD-I (程序性死亡1)分子與PD-Ll和PD-L2反應(yīng)，并負(fù)調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)1)。首先，據(jù)認(rèn)為在T細(xì)胞上表達(dá)的PD-I與在抗原呈遞細(xì)胞或癌細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1，或者在抗原呈遞細(xì)胞上的PD-L2反應(yīng)以抑制T細(xì)胞的活化。另一方面，已知PD-Ll也表達(dá)于T細(xì)胞上。最近，證實(shí)了以下可能性，即PD-Ll不僅與PD-I也與B7-1 (⑶80)結(jié)合，并且存在于T細(xì)胞上的PD-Ll向所述T細(xì)胞發(fā)送負(fù)信號(hào) (非專利文獻(xiàn)2)。然而，完全未知在免疫反應(yīng)中表達(dá)于T細(xì)胞上的PD-Ll所起的生理學(xué)和病理學(xué)作用。關(guān)于PD-L2，目前只知道它只在誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)于得自骨髓的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、BlB細(xì)胞和肥大細(xì)胞上，不清楚它在T細(xì)胞上的表達(dá)。因此，還不完全了解生理性地或強(qiáng)制地表達(dá)于T細(xì)胞上的PD-L2所起的作用。已證實(shí)如下可能性來(lái)自共刺激分子(其代表為CTLA4或PD-1)的免疫應(yīng)答抑制信號(hào)，通過(guò)抑制自身反應(yīng)T細(xì)胞在初始階段的引發(fā)或效應(yīng)子功能誘導(dǎo)耐受(免疫耐受)，同時(shí)與來(lái)自共刺激分子(其代表為τ細(xì)胞受體(TCR)或CD^)的免疫應(yīng)答活化信號(hào)相平衡， 從而保護(hù)組織免受自身反應(yīng)T細(xì)胞傷害，并在另一方面調(diào)控傳染免疫或腫瘤免疫。另外，據(jù)認(rèn)為某些腫瘤或病毒利用共刺激分子通過(guò)直接或間接的機(jī)制來(lái)抑制T細(xì)胞的活化和增殖， 以弱化針對(duì)它們的免疫反應(yīng)。此外，據(jù)認(rèn)為歸因于T細(xì)胞功能紊亂的部分疾病中，共刺激分子的異常是引起T細(xì)胞功能紊亂的原因?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Keir M，和另外三人，Annu. Rev.免疫學(xué)，第洸卷，第677-704頁(yè) (2008)非專利文獻(xiàn)2 =Butte M，和另外四人，Immunity，第27卷，第111-122頁(yè)(2007)發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，和具有經(jīng)增強(qiáng)功能的T細(xì)胞。解決所述問(wèn)題的方法本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)人工調(diào)控T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)來(lái)調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答是可能的。具體而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗腫瘤T細(xì)胞中PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的減少增強(qiáng)所述T細(xì)胞的抗腫瘤作用，從而使本發(fā)明得以完成。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及[1]用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，包括抑制所述T細(xì)胞的程序性死亡-1配體
31 (PD-Ll)和/或程序性死亡-1配體2 (PD-L2)的表達(dá)；[2] [1]的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中所述T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；[3] [2]的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞、調(diào)控 T 細(xì)胞(controlling T cell)或 Thl7 細(xì)胞；[4] [1]的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中所述功能增強(qiáng)是T細(xì)胞干擾素-Y (IFN-γ)的產(chǎn)生增強(qiáng)；[5] [1]的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中通過(guò)針對(duì)PD-Ll和/或PD-L2 WsiRNA 抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)； [6]具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，所述T細(xì)胞在PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)方面受到抑制；[7] [6]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中所述T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；[8] [7]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞、調(diào)控T細(xì)胞或Thl7細(xì)胞；[9] [6]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中所述功能增強(qiáng)是T細(xì)胞干擾素-Y (IFN-γ)的產(chǎn)生增強(qiáng)；[10] [6]的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中通過(guò)針對(duì)PD-Ll和/或PD-L2的 siRNA抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)；和[11]用于對(duì)W]_[10]中任一項(xiàng)的具有經(jīng)增強(qiáng)功能的T細(xì)胞顯示敏感性的疾病的治療劑，其包含所述T細(xì)胞作為活性成分。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，等等。該 T細(xì)胞增強(qiáng)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答，并可用于有效的癌癥免疫療法，或可用于傳染病或自身免疫性疾病的治療或預(yù)防。附圖簡(jiǎn)述[

圖1]圖1是分析⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞的PD-Ll表達(dá)的圖。[圖2]圖2是分析⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞的PD-Ll表達(dá)的圖。[圖3]圖3是分析⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞的PD-L2表達(dá)的圖。[圖4]圖4是顯示⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞的干擾素Y(IFN- y )濃度的圖。[圖5]圖5是顯示⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞的IFN-γ濃度的圖。[圖6]圖6是分析LCL的PD-L1表達(dá)的圖。[圖7]圖7是分析LCL的PD-L2表達(dá)的圖。[圖8]圖8是顯示⑶8陽(yáng)性四聚體-陽(yáng)性T細(xì)胞的比例的圖。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本文中，“Τ細(xì)胞的經(jīng)增強(qiáng)的功能”意為改良所述T細(xì)胞的效應(yīng)子功能。所述T細(xì)胞的經(jīng)增強(qiáng)的功能(其不限制本發(fā)明)，包括在所述T細(xì)胞的增殖速率上的提高、在細(xì)胞因子產(chǎn)量上的增加、或細(xì)胞毒性的改良。此外，所述T細(xì)胞的經(jīng)增強(qiáng)的功能包括在受抑制狀態(tài)例如無(wú)反應(yīng)性(無(wú)應(yīng)答性)狀態(tài)或休眠狀態(tài)下所述T細(xì)胞的耐受性的消除和抑制，更確切
4地說(shuō)，所述T細(xì)胞從所述受抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變到所述T細(xì)胞對(duì)來(lái)自外界的刺激作出反應(yīng)的狀態(tài)。本發(fā)明中，“無(wú)反應(yīng)性”包括免疫細(xì)胞對(duì)刺激(例如，通過(guò)活化受體或細(xì)胞因子的刺激)的無(wú)應(yīng)答性。無(wú)反應(yīng)性可因例如暴露于免疫抑制劑或暴露于高劑量的抗原而發(fā)生。這種無(wú)反應(yīng)性通常是抗原特異性的，和甚至在完成暴露于所耐受的抗原之后仍持續(xù)。例如，T 細(xì)胞中的無(wú)反應(yīng)性的特點(diǎn)在于不產(chǎn)生細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素(IL)-2)。T細(xì)胞的無(wú)反應(yīng)性發(fā)生在當(dāng)T細(xì)胞暴露于抗原時(shí)缺乏第二個(gè)信號(hào)(共刺激信號(hào))的情況下接收到第一個(gè)信號(hào)(經(jīng)由TCR或CD-3的信號(hào))的時(shí)候。本文中，“PD-L1”意指PD-I的配體1，它是表達(dá)于所謂的抗原呈遞細(xì)胞(例如活化的單核細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞)上的共刺激分子，也被稱作B7-H1。GenBank檢索號(hào)AF233516 顯示了人PD-Ll的核苷酸序列，NM_021893顯示了小鼠PD-Ll核苷酸序列(Freeman等人· (2000) J. Exp. Med. 192 1027)。本文中，“PD-L2”意指PD-I的配體2，也被稱作B7-DC。GenBank檢索號(hào)NM_025239 顯示了人PD-L2的核苷酸序列，NM_021896顯示了小鼠PD-L2的核苷酸序列(Nature Immunology，2001，第 2 卷，第 3 期，第 26H67 頁(yè))。本文中，“T細(xì)胞”也被稱作T淋巴細(xì)胞，意指在參與免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞中的得自胸腺的細(xì)胞。T細(xì)胞包括⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTL)、⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞)、抑制性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(例如調(diào)控T細(xì)胞)、效應(yīng)細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、記憶 T細(xì)胞、表達(dá)TCR α和β鏈的α β T細(xì)胞、和表達(dá)TCR γ和δ鏈的Υ δ T細(xì)胞中的任一種。T細(xì)胞包括T細(xì)胞的前體細(xì)胞，其中定向分化為T細(xì)胞。除體液(例如血液(外周血、 臍帶血等)和骨髓液)之外，“包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體”的實(shí)例還包括，已從體液中收集、分離、純化或誘導(dǎo)的包含外周血單核細(xì)胞(PBMC)、造血細(xì)胞、造血干細(xì)胞、臍帶血單核細(xì)胞等的細(xì)胞群體。此外，可將包含T細(xì)胞和得自造血細(xì)胞的多種細(xì)胞群體用于本發(fā)明。這些細(xì)胞可能已通過(guò)細(xì)胞因子(例如IL-幻在體內(nèi)或離體活化。像這些細(xì)胞一樣，可使用任何從活體收集的細(xì)胞或通過(guò)離體培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，例如，通過(guò)本發(fā)明的方法按原狀獲得的或通過(guò)冷凍保藏獲得的T細(xì)胞群體。本文中，“癌癥”意指惡性腫瘤，是指顯示異常增殖表型或異常細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞，其具有顯示自動(dòng)增殖從而造成不可控的細(xì)胞增殖的特征?！澳[瘤細(xì)胞”包括“惡性腫瘤細(xì)胞” 或“良性腫瘤細(xì)胞”，也被稱作“得自瘤的細(xì)胞”。本文中，“表達(dá)”意指通過(guò)自核酸(例如基因、多核苷酸、和寡核苷酸)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 mRNA，或通過(guò)自mRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽。“表達(dá)的抑制”是指與無(wú)抑制的情況相比轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物以顯著量減少。本文中表達(dá)的抑制表示，例如轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物的量減少30 %或更多，優(yōu)選50 %或更多，更優(yōu)選70 %或更多，進(jìn)一步優(yōu)選90 %或更多。(1)本發(fā)明的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法和具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞。本發(fā)明用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法是包括抑制所述T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2 表達(dá)的步驟的方法。另外，本發(fā)明的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞是通過(guò)本發(fā)明用于增強(qiáng)T 細(xì)胞功能的方法獲得的細(xì)胞。本發(fā)明的增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法有可能改善T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，包括T細(xì)胞增殖速率的提高，細(xì)胞因子產(chǎn)量的增加或細(xì)胞毒性的改良。此外，消除或抑制T細(xì)胞的受抑制狀態(tài)例如無(wú)反應(yīng)性狀態(tài)或休眠狀態(tài)，改善T細(xì)胞對(duì)來(lái)自外界的刺激的敏感性。本發(fā)明如此獲得的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞可用于治療或預(yù)防癌癥、傳染病或自身免疫性疾病中。在本發(fā)明的方法中，可離體或體內(nèi)實(shí)施抑制T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的步驟。其中離體實(shí)施所述步驟的本發(fā)明方法包括下述步驟(a)制備T細(xì)胞或包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體，和(b)抑制步驟(a)中獲得的T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)，以制備具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞。所述方法可應(yīng)用于包括過(guò)繼免疫療法在內(nèi)的細(xì)胞免疫療法，并且是有用的。步驟(a)可為從活體中分離T細(xì)胞或包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體的步驟，或制備已確立的T細(xì)胞或包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體的步驟。此外，本發(fā)明的方法可包括從細(xì)胞群體中將包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體分離出以制備細(xì)胞亞群的步驟和/或培養(yǎng)和刺激所述細(xì)胞群體的步驟。這些步驟可在步驟(a)和步驟(b)之前、之后的任意階段或與步驟(a)和步驟(b) 同時(shí)進(jìn)行。在其中離體進(jìn)行抑制T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的步驟的本發(fā)明方法中， 可通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞?例如，細(xì)胞亞群的制備，或所述細(xì)胞群體的培養(yǎng)或刺激)調(diào)控所述方法所適用的細(xì)胞的量和種類。因此，可減少有害事件(例如自身免疫，其為當(dāng)將抑制PD-Ll和 /或PD-L2表達(dá)的物質(zhì)或抑制信號(hào)傳送的物質(zhì)施用于活體時(shí)所關(guān)注的)，因此它是非常有用的?？蓪?shí)施將細(xì)胞群體與包含T細(xì)胞的細(xì)胞亞群分離的步驟，例如，通過(guò)經(jīng)由密度梯度離心的單核細(xì)胞部分的分級(jí)，或通過(guò)將T細(xì)胞的表面標(biāo)記用作指標(biāo)的分離方法。所述表面標(biāo)記的實(shí)例包括⑶3、⑶8和⑶4，并且根據(jù)這些表面標(biāo)記的分離方法在本領(lǐng)域中已知。例如，可如下實(shí)施所述步驟通過(guò)將抗CD8抗體已固定在其上的載體(例如珠?；蚺囵B(yǎng)容器)與包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體混合，然后回收與所述載體結(jié)合的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞。對(duì)于抗⑶8抗體固定于其上的珠粒，例如可適宜地使用⑶8 MicroBeads (由Miltenyi Biotec 制造)、DynabeadsM450CD8 (由 hvitrogen 制造)，和 Eligix 抗 CD8 mAb 包被的鎳顆粒(由Biotransplant制造)。這也與將⑶4用作指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)相同，例如可適宜地使用 CD4MicroBeads ( d3 Miltenyi Biotec ^ijit) >Dynabeads M-450CD4 ( d3 Invitrogen ^ijit)?？赏ㄟ^(guò)選擇適當(dāng)?shù)囊阎囵B(yǎng)條件(這取決于細(xì)胞群體)來(lái)實(shí)施培養(yǎng)細(xì)胞群體和包含T細(xì)胞的細(xì)胞亞群的步驟。另外，在刺激細(xì)胞群體的步驟中，可將已知的蛋白質(zhì)和化學(xué)成分等加入培養(yǎng)基以進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可將細(xì)胞因子、趨化因子或其他成分加入培養(yǎng)基。本文中，對(duì)所述細(xì)胞因子沒(méi)有特定限制，只要它可對(duì)T細(xì)胞起作用即可，它的實(shí)例包括IL-2、 IFN-γ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) - β、IL-15、IL-7、IFN-a、IL_12、CD40L、和 IL-27。從增強(qiáng)細(xì)胞免疫的角度出發(fā)，特別適宜使用IL-2、IFN-y或IL-12，而從改善體內(nèi)轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞存活的角度出發(fā)，適宜地使用IL-7、IL-15或IL-21。另外，對(duì)所述趨化因子沒(méi)有特定限制，只要它對(duì)T細(xì)胞起作用和顯示遷移活性即可，其實(shí)例包括RANTES、CCL21、MIPl a、MIPl β、CCL19、 CXCLl2, IP-IO和MIG?？赏ㄟ^(guò)針對(duì)存在于T細(xì)胞表面上的分子例如，⑶3、⑶觀或⑶44的配體和/或針對(duì)所述分子的抗體的存在來(lái)實(shí)施對(duì)細(xì)胞群體的刺激。此外，可通過(guò)在細(xì)胞表面與其它淋巴細(xì)胞(例如呈遞靶肽(例如得自癌抗原的肽)的抗原呈遞細(xì)胞(樹(shù)突狀細(xì)胞))接觸來(lái)刺激細(xì)胞群體。當(dāng)在體內(nèi)實(shí)施抑制T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的步驟時(shí)，所述步驟通過(guò)向活體施用后述的特異地抑制其表達(dá)的方法來(lái)實(shí)施。因此，可使用合適的藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、微粒、微囊體等)。此外，例如，利用將T細(xì)胞的表面標(biāo)記用作指標(biāo)的遞送系統(tǒng)，可
6特異地抑制T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)。抑制T細(xì)胞的PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的方法的實(shí)例包括使用核酸例如針對(duì)PD-Ll 和/或PD-L2的siRNA、反義核苷酸、和核酶。本發(fā)明中使用siRNA是為了選擇性地抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)的目的，并基于利用雙鏈RNA分子的RNA干擾(RNAi)，所述雙鏈RNA分子具有與轉(zhuǎn)錄自編碼PD-Ll和 /或PD-L2的基因的mRNA的核苷酸序列同源的序列和與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列。本文中“具有與轉(zhuǎn)錄自編碼PD-Ll和/或PD-L2的基因的mRNA的核苷酸序列同源的序列和與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列”不僅指每個(gè)序列均與所述mRNA的核苷酸序列同源或互補(bǔ)的事實(shí)，而且還包括每個(gè)序列在使得發(fā)揮所需功能的這樣的范圍內(nèi)大致同源或互補(bǔ)的事實(shí)。所述雙鏈RNA分子被稱作siRNA (短干擾RNA)。所述siRNA可為與轉(zhuǎn)錄自編碼PD-Ll和/或 PD-L2的基因的mRNA的一個(gè)區(qū)域同源/互補(bǔ)的siRNA中的一種，或可為包含多個(gè)與不同區(qū)域同源/互補(bǔ)的RNA分子的siRNA。本發(fā)明中使用的siRNA的鏈長(zhǎng)的實(shí)例從在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制干擾素反應(yīng)的角度出發(fā)包括這樣的鏈長(zhǎng)，其中組成所述siRNA的雙鏈體的其中一鏈具有13- 個(gè)堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)，優(yōu)選15-25個(gè)堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)，進(jìn)一步優(yōu)選20-25個(gè)堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)。另外，所述鏈長(zhǎng)的所有核苷酸序列可得自PD-Ll和/或PD-L2的mRNA的核苷酸序列，或其部分可得自所述核苷酸序列。此外，從在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾的有效性的角度出發(fā)，本發(fā)明所用的siRNA 可為例如具有2-4個(gè)核苷酸突出于3’ -末端側(cè)的單鏈區(qū)的雙鏈RNA形狀，進(jìn)一步優(yōu)選具有 2個(gè)核苷酸突出于3’-末端側(cè)的單鏈區(qū)的雙鏈RNA形狀。作為突出的單鏈區(qū)，例示連續(xù)2-4 個(gè)核苷酸的脫氧胸苷殘基(TT、TTT或TTTT)。本發(fā)明所用的siRNA主要由核糖核苷酸構(gòu)成，其部分可包含不同于核糖核苷酸的核苷酸，例如，脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物，等等?？赏ㄟ^(guò)已知的化學(xué)合成方法合成siRNA，但不特定限制所述方法?？墒褂眠m當(dāng)?shù)哪０搴怂崦复俚?例如，使用RNA聚合酶)制備siRNA。本發(fā)明中所用的siRNA可呈可在分子中形成雙鏈體的單鏈RNA形式，例示具有的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(短發(fā)夾結(jié)構(gòu)sh結(jié)構(gòu))的單鏈RNA，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有siRNA部分作為莖和任意序列作為環(huán)。作為所述任意序列，例示1-30個(gè)核苷酸的序列，優(yōu)選使用1-25個(gè)核苷酸的序列，進(jìn)一步優(yōu)選使用5-22個(gè)核苷酸?？苫谛枰种破浔磉_(dá)的基因序列適宜地設(shè)計(jì)siRNA序列。已報(bào)道許多siRNA設(shè)計(jì)算法(參見(jiàn)，例如，WO 2004/0455M3、和W02004/048566)，也可使用市售的軟件。另外， 有許多根據(jù)需要抑制其表達(dá)的基因序列的信息設(shè)計(jì)siRNA、合成并提供所述siRNA的公司。 因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于需要抑制其表達(dá)的基因序列容易地獲得siRNA。作為本發(fā)明中使用的siRNA，可使用任一種，只要它是選擇性地抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)的siRNA 即可。例如，在非具體限制的情況下，可將包含核苷酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 9 的siRNA用于PD-Ll，可將包含核苷酸序列SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :11的siRNA用于 PD-L2。在本發(fā)明中，可將反義核苷酸用于抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)。將所述反義核苷酸用于抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如，通過(guò)直接干擾PD-Ll和/或PD-L2的mRNA分子的翻譯，通過(guò)RNA降解酶H降解mRNA，通過(guò)干擾mRNA的5’加帽，通過(guò)掩蔽5’帽，通過(guò)防止翻譯因子與mRNA結(jié)合，或通過(guò)抑制mRNA的多腺苷化。通過(guò)反義核苷酸和PD-Ll和/或PD-L2的mRNA之間的雜交抑制蛋白質(zhì)表達(dá)。為了降低作為反義核苷酸的靶標(biāo)的mRNA的穩(wěn)定性或降解所述mRNA，選擇在所述mRNA上的特定靶定位點(diǎn)。當(dāng)鑒定出一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)時(shí)，設(shè)計(jì)出具有與所述靶位點(diǎn)充分互補(bǔ)(更確切地說(shuō)，其在生理?xiàng)l件下充分雜交并具有足夠的特異性)的核苷酸序列的核苷酸。作為本發(fā)明的方法中使用的反義核苷酸，例如，例示具有鏈長(zhǎng)為8-100個(gè)核苷酸， 優(yōu)選10-80個(gè)核苷酸，更優(yōu)選14-35個(gè)核苷酸的核苷酸。在本發(fā)明中，可將核酸(例如用于抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)的siRNA和反義核苷酸)直接導(dǎo)入細(xì)胞，或可將經(jīng)設(shè)計(jì)使得在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄所述siRNA或所述反義核苷酸的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)直接導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可適宜地使用用于導(dǎo)入核酸的試劑例如 TransIT-TKO(由 Mirus 制造)和人 T 細(xì)胞 Nucleofector Kit(Amaxa)。另一方面，當(dāng)使用其中轉(zhuǎn)錄RNA分子的核酸構(gòu)建體時(shí)，可使用功能性連接于啟動(dòng)子下游的核酸構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子在T細(xì)胞中在可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄編碼siRNA或反義核苷酸的核酸的情況下能夠發(fā)揮功能， 但該核酸構(gòu)建體不具體限制本發(fā)明。另外，為了實(shí)現(xiàn)基因的有效轉(zhuǎn)錄，與啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)協(xié)作的其它調(diào)控序列(例如，增強(qiáng)子序列或終止子序列)可存在于所述核酸構(gòu)建體中。 另外，為了通過(guò)同源重組將待導(dǎo)入T細(xì)胞染色體的對(duì)象插入的目的，例如可將基因安排在包含核苷酸序列的側(cè)翼序列之間，每個(gè)所述核苷酸序列與染色體中基因的所需靶插入位點(diǎn)的兩側(cè)核苷酸序列具有同源性。在所述核酸構(gòu)建體中所用的啟動(dòng)子不受具體限制，只要它可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用即可，其實(shí)例包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子、RNA聚合酶III啟動(dòng)子和人工可調(diào)控的啟動(dòng)子。RNA聚合酶II啟動(dòng)子的實(shí)例包括CMV啟動(dòng)子。另外，基于RNA聚合酶III的啟動(dòng)子的實(shí)例包括tRNA啟動(dòng)子、TOsnRNA啟動(dòng)子和組蛋白Hl啟動(dòng)子。作為可用四環(huán)素人工調(diào)控的啟動(dòng)子，例示可用四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子，其實(shí)例包括四環(huán)素調(diào)控的U6啟動(dòng)子和TR啟動(dòng)子。 另外，所述啟動(dòng)子和Cre-IoxP系統(tǒng)的組合使得有可能更嚴(yán)格地控制轉(zhuǎn)錄。可構(gòu)建用于轉(zhuǎn)錄siRNA的核酸構(gòu)建體以使可抑制目標(biāo)基因功能的雙鏈RNA的有義鏈和反義鏈通過(guò)下述系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄(A)串聯(lián)型，其中編碼有義RNA的核酸和編碼反義RNA的核酸分別連接在兩個(gè)不同的啟動(dòng)子的下游，并將這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位安排在正向方向，分別轉(zhuǎn)錄所述有義RNA和所述反義RNA，(B)以下類型，其中將編碼有義RNA的核酸和編碼反義RNA 的核酸呈正向方向分別安排在一個(gè)啟動(dòng)子的下游，并轉(zhuǎn)錄具有莖-環(huán)型(或短發(fā)夾型)的 RNA，其中直接連接或用環(huán)連接所述有義RNA和所述反義RNA，或(C)反向型，其中將啟動(dòng)子分別安排在編碼有義鏈和反義鏈的核酸(分別具有兩條鏈)的兩端側(cè)，并用不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄兩條RNA鏈。本發(fā)明中，可根據(jù)使用條件(例如，細(xì)胞種類、有義序列或反義序列的種類等)使用串聯(lián)型、莖-環(huán)型或反向型?？蓪⒈景l(fā)明使用的核酸構(gòu)建體摻入適當(dāng)?shù)妮d體(例如，質(zhì)粒載體或病毒載體)以在細(xì)胞中更穩(wěn)定地發(fā)揮效果。此外，可將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體摻入細(xì)胞的染色體DNA上。 所述質(zhì)粒載體的實(shí)例包括但不具體限于，PiGENE tRNA質(zhì)粒(商標(biāo)名，由iGENE制造)、 siLentGene (由Promega制造)和pSEC Hygro載體(由Ambion制造)。為了將所述質(zhì)粒載體導(dǎo)入細(xì)胞中，可使用利用載體(例如脂質(zhì)體或配體-聚賴氨酸)的方法、磷酸鈣法、電穿孔法、基因槍法，等等。不具體限制病毒載體，通常使用在基因?qū)敕椒ㄖ惺褂玫囊阎《据d體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體、假型載體)、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、猿猴病毒載體、痘苗病毒載體或仙臺(tái)病毒載體。特別優(yōu)選地，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或慢病毒載體。作為病毒載體，優(yōu)選其中復(fù)制能力缺陷以致其不能在被感染細(xì)胞中自主復(fù)制的病毒載體。另外，在基因?qū)霑r(shí)，也可使用提高基因?qū)胄实奈镔|(zhì)例如retronectin(注冊(cè)商標(biāo)，由TAKARA BIO INC.制造)。市售腺病毒載體的實(shí)例包括Knockout Adenoviral RNAi 系統(tǒng)(由Clonetech制造)，市售逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例分別包括pSINsi載體(由TAKARA BIO INC.制造)和pSIREN-RetroQ載體(由Clonetech制造)。在病毒載體的情況下，可利用病毒感染細(xì)胞的能力將其導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。本發(fā)明的方法中，在T細(xì)胞上實(shí)施抑制PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的方法。更確切地說(shuō)，在步驟(b)中，例如，可使用輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞、調(diào)控T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、幼稚T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、表達(dá)TCRa和β鏈的α β T細(xì)胞或表達(dá)TCR γ和δ 鏈的Y S T細(xì)胞，或包括這些細(xì)胞的細(xì)胞群體、血液(外周血、臍帶血等)或骨髓液。這些 T細(xì)胞可得自哺乳動(dòng)物，或可得自人或非人哺乳動(dòng)物。可通過(guò)定量測(cè)定PD-Ll和/或PD-L2蛋白，或定量測(cè)定轉(zhuǎn)錄自PD-Ll和/或PD-L2 基因的RNA來(lái)確證對(duì)PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的抑制?？稍诿恳徊襟E的之前和之后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用下述方法評(píng)價(jià)本發(fā)明方法中T細(xì)胞的功能增強(qiáng)細(xì)胞因子測(cè)定法、抗原特異性細(xì)胞測(cè)定法(四聚體測(cè)定法)、增殖測(cè)定法、溶細(xì)胞性細(xì)胞測(cè)定法或者使用重組腫瘤相關(guān)抗原或免疫原性片段或抗原衍生肽的體內(nèi)遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試。用于測(cè)量免疫應(yīng)答的增加的其它方法的實(shí)例包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試、 使用肽主要組織相容性基因復(fù)合體四聚體的流式細(xì)胞術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法、細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)、直接細(xì)胞毒性測(cè)定法、通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)細(xì)胞因子mRNA的測(cè)定法、或當(dāng)前用于測(cè)量T細(xì)胞反應(yīng)的測(cè)定法 (例如有限稀釋法)。與其中不抑制PD-Ll和/或PD-L2表達(dá)的對(duì)照T細(xì)胞相比，本發(fā)明的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞在T細(xì)胞功能方面增強(qiáng)了。與對(duì)照T細(xì)胞相比，本發(fā)明的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞在例如IFN-Y的產(chǎn)量上增加了。與對(duì)照T細(xì)胞相比，本發(fā)明的T細(xì)胞在IFN-Y 產(chǎn)量方面增加達(dá)10 %或更多，優(yōu)選20 %或更多，更優(yōu)選30 %或更多。本發(fā)明一方面的實(shí)例除包括對(duì)PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)的抑制之外，還包括增強(qiáng)進(jìn)一步T細(xì)胞功能的方法。例如，將編碼識(shí)別所需抗原的TCR的基因?qū)隩細(xì)胞，使得有可能獲得被賦予針對(duì)所述抗原的特異性和其效應(yīng)子功能經(jīng)改善的T細(xì)胞。所述抗原的實(shí)例包括但不具體限于腫瘤抗原、微生物和病毒衍生抗原。關(guān)于針對(duì)多種抗原的TCR，已知其氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的基因的核苷酸序列，基于載體信息和載體向T細(xì)胞的導(dǎo)入構(gòu)建用于TCR表達(dá)的載體，使得有可能制備發(fā)揮抗原特異性作用的T細(xì)胞。因此，同時(shí)將用于抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入T細(xì)胞，或?qū)⑺鰳?gòu)建體摻入用于TCR表達(dá)的載體中，使得有可能增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞的效應(yīng)子功能。當(dāng)將包含α和β鏈的TCR在T細(xì)胞中人工表達(dá)時(shí)，得自所述T細(xì)胞自身?yè)碛械膬?nèi)源TCR基因的α和β鏈之間的錯(cuò)配等，可阻礙所需抗原特異性的賦予。例如，完成導(dǎo)入的 TCR基因的密碼子轉(zhuǎn)換，或利用siRNA敲減內(nèi)源TCR基因(其在WO 2008/1530 中公開(kāi))， 使得有可能制備獲得了高抗原特異性的T細(xì)胞。也可利用本發(fā)明的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法制備這樣的T細(xì)胞。(2)使用本發(fā)明具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞的治療方法或預(yù)防方法本發(fā)明的治療方法或預(yù)防方法具有的特征為給活體施用通過(guò)(1)中的本發(fā)明用于增強(qiáng)功能的方法制備的T細(xì)胞。更確切地說(shuō)，本發(fā)明的治療方法或預(yù)防方法包括下述步驟(c)給活體施用步驟(b)中獲得的功能增強(qiáng)的T細(xì)胞。不特定限制本發(fā)明功能增強(qiáng)的T 細(xì)胞所施予的疾病，只要它是對(duì)所述T細(xì)胞顯示敏感性的疾病即可，其實(shí)例包括癌癥(白血病、實(shí)體瘤，等等)、肝炎、流感、傳染病，其起因是病毒例如HIV、細(xì)菌或真菌，例如結(jié)核病、 MRSA、VRE、深部真菌病。另外，也可將本發(fā)明的細(xì)胞用于骨髓移植、或輻射后傳染病的預(yù)防、 或?yàn)榫徑鈴?fù)發(fā)性白血病的供體淋巴細(xì)胞輸注。此外，所述細(xì)胞增強(qiáng)調(diào)控T細(xì)胞的功能，并可用于預(yù)防或治療自身免疫性疾病中。在本發(fā)明的方法中，可皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)(包括通過(guò)留置導(dǎo)管進(jìn)行的方法)、瘤內(nèi)、給受試者施用功能增強(qiáng)的T細(xì)胞或?qū)⑵涫┯玫絺魅肓馨凸芾?。在本發(fā)明的治療方法或預(yù)防方法中，待施用的功能增強(qiáng)的T細(xì)胞可為活體自身的細(xì)胞，或可為交叉衍生的細(xì)胞。在首次施用本發(fā)明的功能增強(qiáng)的T細(xì)胞之前，或在治療起始后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上， 可使用抗原特異性細(xì)胞測(cè)定法、增值測(cè)定法、溶細(xì)胞性細(xì)胞測(cè)定法、或使用重組腫瘤相關(guān)抗原或免疫原性片段或抗原衍生肽的體內(nèi)遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試，在活體中評(píng)價(jià)本發(fā)明實(shí)施中所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。用于測(cè)量免疫應(yīng)答的增加的其它方法的實(shí)例包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)試、使用肽主要組織相容性基因復(fù)合體四聚體的流式細(xì)胞術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法、細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)、直接細(xì)胞毒性測(cè)定法、通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)細(xì)胞因子mRNA的測(cè)量，或當(dāng)前用于測(cè)量T細(xì)胞反應(yīng)的測(cè)定法 (例如有限稀釋法)。此外，可通過(guò)活體具有的腫瘤質(zhì)量、直徑或惡性程度，受試者的感染病毒量或感染細(xì)菌量，或者受試者的存活率或存活期，來(lái)評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的方法中，待施予活體的功能增強(qiáng)的T細(xì)胞量的實(shí)例包括但不具體限于，每成年人每天優(yōu)選1 XIO6至1 X IO12個(gè)細(xì)胞/天，更優(yōu)選1 X IO7至5 X IO11個(gè)細(xì)胞/天， 進(jìn)一步優(yōu)選1 X IO8至2 X IO11個(gè)細(xì)胞/天。(3)用于疾病的包含本發(fā)明功能增強(qiáng)的T細(xì)胞的治療劑通過(guò)(1)中本發(fā)明用于增強(qiáng)功能的方法制備的功能增強(qiáng)的T細(xì)胞和包含所述T細(xì)胞作為活性成分的組合物可用作治療劑，用于對(duì)所述T細(xì)胞敏感的疾病(例如，前述的癌癥、肝炎或傳染病)?？扇缦轮苽浔景l(fā)明的治療劑，例如通過(guò)將通過(guò)本發(fā)明方法制備的T細(xì)胞作為活性成分，與例如已知的有機(jī)或無(wú)機(jī)的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑等(按照制藥領(lǐng)域中已知的方法， 其適合于胃腸外施用)混合。另外，其可按照本發(fā)明(2)中的治療方法使用。
實(shí)施例以下將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明并非僅限于下述實(shí)施例的范圍。實(shí)施例1在⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞中PD-Ll的表達(dá)的確證根據(jù)WO 2007/032255,制備 HLA-AM 限制性 MAGE-A 4143_151_ 特異性細(xì)胞毒性 CD8陽(yáng)性 T 細(xì)胞克隆 2- (Miyahara Y，和另外 13 人，Clin. Cancer Res.，第 11 卷，第 5581-5589 頁(yè)Q005)，在下文中，被稱作⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞克隆2-28)和MAGE-A4143_151肽。將所述⑶8 陽(yáng)性T細(xì)胞克隆2- 在37°C下與自身類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(LCL)共培養(yǎng)，所述LCL已用 80Gly X射線照射并且已經(jīng)用MAGE-A4143_151肽脈沖，在0天、1天、2天和3天后用抗人PD-Ll 抗體(BD bioscience制造)將細(xì)胞表面的PD-Ll染色，并用流式細(xì)胞術(shù)分析。圖1顯示用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。培養(yǎng)1天后PD-Ll的表達(dá)最高。實(shí)施例2通過(guò)RNA干擾抑制⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞的PD-Ll和PD-L2的表達(dá)將具有SEQ ID NO :1所述序列的對(duì)PD-Ll特異的siRNA、具有SEQ ID NO :2所述序列的對(duì)PD-L2特異的siRNA或陰性對(duì)照siRNA(全部由hvitrogen制造)通過(guò)電穿孔導(dǎo)入CD8陽(yáng)性T細(xì)胞克隆2-沘。將其中導(dǎo)入有針對(duì)PD-Ll的siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)3天，然后在37°C下與經(jīng)80Gly X 射線照射和經(jīng)MAGE-A4143_151肽脈沖的自身LCL共培養(yǎng)。第二天，用抗人PD-Ll抗體將其染色，用流式細(xì)胞儀分析在細(xì)胞表面的PD-Ll的表達(dá)。關(guān)于其中導(dǎo)入有針對(duì)PD-L2的siRNA的細(xì)胞，在導(dǎo)入后的2天和3天后，用抗人 PD-L2抗體(BD bioscience制造)將所述細(xì)胞染色并用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中的PD-L2的表達(dá)。分別地在圖2中顯示PD-Ll的分析結(jié)果，和在圖3中顯示PD-L2的分析結(jié)果。在其中不導(dǎo)入siRNA的細(xì)胞(不經(jīng)處理)和其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞(si對(duì)照)中，未見(jiàn)對(duì)PD-Ll或PD-L2表達(dá)的抑制。在其中導(dǎo)入有對(duì)PD-Ll特異的siRNA的細(xì)胞(si PD-L1) 和其中導(dǎo)入有對(duì)PD-L2特異的siRNA的細(xì)胞(si PD-L2)中，分別發(fā)現(xiàn)對(duì)PD-Ll和PD-L2的表達(dá)的抑制。實(shí)施例3通過(guò)RNA干擾促進(jìn)表達(dá)PD-Ll和PD-L2的⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ通過(guò)電穿孔將陰性對(duì)照siRNA、具有SEQ ID NO :3所述序列的對(duì)PD-I特異的 siRNA (Invitrogen制造)、具有SEQ ID NO :1所述序列的對(duì)PD-Ll特異的siRNA或具有SEQ ID N0:2所述序列的對(duì)PD-L2特異的siRNA，導(dǎo)入⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞克隆2-觀。在培養(yǎng)3天后，將此細(xì)胞與其中已用MAGE-A4143_151肽脈沖自身LCL的細(xì)胞以4 1或2 1比例混合， 在37°C下共培養(yǎng)所述混合物，在第二天通過(guò)ELISA方法測(cè)量各培養(yǎng)上清液中的IFN-γ的濃度。圖4中顯示各細(xì)胞上清液中IFN- γ的濃度。與其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比，在其中導(dǎo)入有對(duì)PD-I特異的siRNA的細(xì)胞(siPD-Ι)中，在用兩種混合比例的培養(yǎng)時(shí)未見(jiàn)IFN-γ濃度的改變。與其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)PD-I特異的siRNA的細(xì)胞相比，分別在其中導(dǎo)入有對(duì)PD-Ll特異的siRNA的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì) PD-L2特異的siRNA的細(xì)胞中，明顯見(jiàn)到IFN- γ濃度的增加。 實(shí)施例4通過(guò)RNA干擾促進(jìn)表達(dá)PD-Ll和PD-L2的⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞表達(dá)IFN- γ
將陰性對(duì)照siRNA、對(duì)PD-I特異的具有SEQ ID NO 3所述序列的siRNA、對(duì)PD-Ll 特異的具有SEQ ID NO :1所述序列的siRNA或?qū)D-Ll特異的具有SEQ ID NO :2所述序列的siRNA，通過(guò)電穿孔導(dǎo)入MAGE-Al6,-特異性⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞克隆5，將其培養(yǎng)3天。將此細(xì)胞與其中已用MAGE-Alf^6肽脈沖自身LCL的細(xì)胞以2 1混合，在37°C下培養(yǎng)所述混合物，在第二天通過(guò)ELISA方法測(cè)量各培養(yǎng)上清液中的IFN-Y濃度。
圖5中顯示各細(xì)胞上清液中IFN- γ的濃度。在其中導(dǎo)入有陰性對(duì)照SiRNA的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)PD-I特異的siRNA的細(xì)胞中，未見(jiàn)IFN-Y的表達(dá)。在其中導(dǎo)入有對(duì)PD-Ll 特異的siRNA的細(xì)胞和其中導(dǎo)入有對(duì)PD-L2特異的siRNA的細(xì)胞中，明顯見(jiàn)到IFN- γ的表達(dá)。實(shí)施例5針對(duì)抑制PD-Ll和PD-L2的表達(dá)選擇siRNA將各自具有SEQ ID NO :8或9 (sh831、sh832)所述序列的對(duì)PD-Ll特異的siRNA， 或各自具有SEQ ID NO :10或Il(sh833、sh834)所述序列的對(duì)PD-L2特異的siRNA(全部由 TAKARA BIO INC.制造)或?qū)嵤├?中使用的陰性對(duì)照siRNA，通過(guò)電穿孔導(dǎo)入LCL，在37°C 下將其培養(yǎng)2天，從每個(gè)細(xì)胞中提取出總RNA，通過(guò)利用QuanTitect SYBR PCR Kit(QIAGEN 制造)的實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量PD-Ll和PD-L2的表達(dá)，選擇具有強(qiáng)的表達(dá)抑制能力的siRNA。分別地，SEQ ID Nos. 12和13中顯示用于測(cè)量PD-Ll表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR的引物序列，SEQ ID Nos. :14和15中顯示用于測(cè)量PD-L2的表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR的引物序列，SEQ ID Nos. 16和17中顯示作為表達(dá)的測(cè)量對(duì)象的人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的實(shí)時(shí)RT-PCR的引物序列。圖6中顯示PD-Ll的實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果，圖7中顯示PD-L2的實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果。在所述圖中，縱坐標(biāo)顯示與人GAPDH的表達(dá)相關(guān)的PD-Ll或PD-L2的表達(dá)的比例。根據(jù)此結(jié)果，選擇了 SEQ ID NO :9中顯示的sh832作為對(duì)PD-Ll特異的siRNA，和選擇SEQ ID NO 11中顯示的sh8;34作為對(duì)PD-L2特異的siRNA。實(shí)施例6表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型TCR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備根據(jù)WO 2008/153029，制備pMS_Ma2和pMS-PM。這些載體包括基于MSCV (鼠干細(xì)胞病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。此外，那些載體包含分別編碼識(shí)別腫瘤抗原MAGE-A4 的TCR α和β鏈的基因，在這些基因中，轉(zhuǎn)換密碼子使得表達(dá)不受后述的用siRNA對(duì)TCR 的RNA干擾抑制(在下文中，其中密碼子經(jīng)轉(zhuǎn)換的基因被稱作密碼子轉(zhuǎn)換型)。實(shí)施例7表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型TCR和siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備從實(shí)施例6中制備的pMS_Ma2中用MluI和BglII切下密碼子轉(zhuǎn)換型TCRa基因，并制備出 TCRa -Mlul/Bglll。將 siRNA 簇 PDL1-PDL2-TCR a -TCRβ (SEQ ID NO :4 中顯示的人工合成基因)用BglII和NotI消化，并聯(lián)同TCRa -Mlul/Bglll克隆至pMS-PM的 MluI-NotI位點(diǎn)，以制備MS-aPbl-siPDL_l/2_siTCR載體(載體1)。所述載體1表達(dá)密碼子轉(zhuǎn)換型TCR，并可表達(dá)SEQ ID Nos. :9、11、18和19中顯示的針對(duì)PD_L1、PD_L2、TCR α和 TCR^的siRNA。在它們之中，針對(duì)TCRa和TCR^的siRNA抑制內(nèi)源野生型TCR的表達(dá)， 并不抑制所述密碼子轉(zhuǎn)換型TCR的表達(dá)。此外，制備SEQ ID NO :5中顯示的siRNA簇PDL1-PDL2人工合成基因、SEQ ID NO: 6中顯示的siRNA簇PDLl人工合成基因和SEQ ID NO 7中顯示的siRNA簇PDL2人工合成基因，然后與在載體1中一樣地制備MS-aPbl-siPDL_l/2載體(載體2、、MS_aPbl_siPDL_l 載體(載體幻和MS-aPbl-siPDL_2載體(載體4)。表1顯示各個(gè)載體表達(dá)的基因的概況。[表1]
權(quán)利要求
1.一種用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，包括抑制所述T細(xì)胞的程序性死亡-ι配體 1 (PD-Ll)和/或程序性死亡-1配體2 (PD-L2)的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中所述T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞或者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞、 調(diào)控T細(xì)胞或Thl7細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中所述功能增強(qiáng)是T細(xì)胞干擾素-Y (IFN-y)的產(chǎn)生增強(qiáng)。
5.權(quán)利要求1的用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，其中通過(guò)針對(duì)PD-Ll和/或PD-L2的 siRNA抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)。
6.一種具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其在PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)方面受到抑制。
7.權(quán)利要求6的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中所述T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞、 調(diào)控T細(xì)胞或Thl7細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中所述功能增強(qiáng)是T細(xì)胞干擾素-Y (IFN-y)的產(chǎn)生增強(qiáng)。
10.權(quán)利要求6的具有經(jīng)增強(qiáng)的功能的T細(xì)胞，其中通過(guò)針對(duì)PD-Ll和/或PD-L2的 siRNA抑制PD-Ll和/或PD-L2的表達(dá)。
11.一種用于對(duì)權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的具有經(jīng)增強(qiáng)功能的T細(xì)胞顯示敏感性的疾病的治療劑，其包含所述T細(xì)胞作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于增強(qiáng)T細(xì)胞功能的方法，該方法的特點(diǎn)是抑制所述T細(xì)胞中的程序性死亡-1配體1(PD-L1)和/或程序性死亡-1配體2(PD-L2)的表達(dá)。也公開(kāi)了通過(guò)所述功能增強(qiáng)方法制備的功能增強(qiáng)的T細(xì)胞。還公開(kāi)了包含所述功能增強(qiáng)的T細(xì)胞的治療劑。所述T細(xì)胞可增強(qiáng)對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答，和可用于對(duì)癌癥有效的免疫療法以及傳染病和自身免疫性疾病的治療或預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K35/14GK102428179SQ20108002017
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者加藤郁之進(jìn), 巖村康一, 峰野純一, 池田裕明, 珠玖洋 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人三重大學(xué), 寶生物工程株式會(huì)社