專利名稱：：在藥物遞送中有用的中空金納米球(HAuNSs)和裝載HAuNSs的微球體的制作方法在藥物遞送中有用的中空金納米球(HAuNSs)和裝載HAuNSs的微球體相關(guān)申請的交叉引用本專利申請要求美國專利申請系列號61/158，570和61/233，566的優(yōu)先權(quán)，其整體引入本文作為參考。關(guān)于聯(lián)邦贊助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明在由美國國家癌癥研究所(NationalCancerInstitute)(NCI)授予的ROlCA119387，用于靶向光學(xué)成像的近紅外熒光納米顆粒(Near-InfraredFluoresenceNanoparticlesforTargetedOpticalImaging)下由政府支持進行。政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。聯(lián)合研究協(xié)議各方的名稱無。光盤上所提交的資料通過引用并入無。
背景技術(shù)：
：目前在市場上作為用于治療劑的藥物遞送平臺的納米載體是由脂質(zhì)和/或合成聚合物組成的有機納米顆粒。這些納米載體包括脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米球。Davis，S.S.，ComingofAgeofLipid-basedDrugDeliverySystems,56(9),1241-2,AdvDrugDelivRev(2004)。此外，某些聚合藥物遞送系統(tǒng)在臨床試驗中。Nishiyama，N.等K,CurrentState,Achievements,andFutureProspectsofPolymericMicellesasNanocarriersforDrugandGeneDelivery,112(3)，630-48，PharmacolTher(2006)；Li,C.等人，Polymer-DrugConjugates:RecentDevelopmentInClinicalOncology,60886-98,Adv.DrugDeliv.Rev.(2008)。雖然在使用有機納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)中已取得進展，但在基于無機納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)中取得少得多的進展。盡管在受控藥物遞送中具有進步，仍需要用于激活、高分辨率控制藥物釋放的可靠方法。無機納米顆粒具有作為藥物載體提供的幾個優(yōu)點。無機納米顆粒可以制備至確定大小且展示在醫(yī)藥中有用的多種功能，例如充當放熱反應(yīng)器和造影劑。另一方面，有機納米顆粒例如脂質(zhì)體和聚合物納米球僅充當藥物儲庫。進一步地，在藥物遞送中有用的現(xiàn)有技術(shù)無機納米顆粒需要細胞毒性表面活性劑用于穩(wěn)定性。例如，諸如使桿狀金顆粒從水溶液中結(jié)晶通常所需的其他添加劑是細胞毒性的。此外，藥物的腫瘤攝取通常是無效的，因為對于實心金納米顆粒的藥物有效負載相對低。另外，現(xiàn)有技術(shù)遞送系統(tǒng)不能調(diào)節(jié)藥物釋放的時機(使之減緩或加速)，因為普通實心球形顆粒在近紅外區(qū)域中不有效地將光能轉(zhuǎn)換成熱。發(fā)明概述提供了包括多個微球體(“MS”)的藥物遞送系統(tǒng)，其中每個微球體包含至少一種藥物產(chǎn)品和多個中空金納米球(“HAuNS”)。藥物產(chǎn)品(例如抗癌劑)的釋放通過由近紅外(“NIR”)激光介導(dǎo)的光熱效應(yīng)和中空金納米球來調(diào)節(jié)。此外，本文提供了用于NIR光介導(dǎo)的藥物釋放的藥物俘獲(drugentrapment)法。在第一種方法中，帶正電或帶負電的藥物通過靜電作用與中空金納米球(“HAuNS”)直接形成復(fù)合物。在第二種方法中，親水性(水溶性)或疏水性(脂溶性)藥物連同HAuNS—起摻入聚合基質(zhì)內(nèi)。附圖簡述圖IA顯示了HAuNS的吸收光譜，顯示了調(diào)諧至NIR區(qū)的等離振子共振峰(λmax=808nm)。圖IB提供了HAuNS的TEM圖像，揭示中空納米球的形態(tài)。條(bar):20nm。圖IC提供了裝載PTX的、埋入HAuNS的微球體(PTX/HAuNS-MS)和僅包含PTX的微球體(PTX-MS)的SEM圖像。在PTX/HAuNS-MS中HAuNS的存在導(dǎo)致具有比不含HAuNS的PTX-MS更光滑的表面的微球體。條10Mm。圖ID是PTX/HAuNS-MS的TEM照片，顯示了在聚合基質(zhì)內(nèi)分散的HAuNS簇。圖2A提供了PTX/HAuNS-MS、純PTX、以及PLGA和PTX的物理混合物(5%PTX,w/w)的DSC溫譜圖。在代表PTX熔點的223°C的吸熱峰存在于PTX和MS的物理混合物中，但不在PTX/HAuNS-MS中，暗示PTX在分子水平溶解于PLGA聚合物中。圖2B提供了在暴露于4.5ff/cm2輸出功率的OTR光后，包含HAuNS和HAuNS-MS的水溶液的溫度變化比較。裝載HAuNS的PLGAMS能夠使水的溫度升高至與4.2xl010納米顆粒/mL濃度的HAuNS相同的程度。圖3A和圖;3B是OTR光觸發(fā)的來自PTX/HAuNS-MS的PTX釋放結(jié)果，包括在其間用OTR激光照射微球體的5分鐘時期。圖3A提供了在W(0)>4W(*)和2W(ο)的OTR輸出功率下、來自PTX/HAuNS-MS(制劑B)的PTX釋放概況，以及在7W(Δ)的OTR輸出功率下和無OTR暴露(·)下來自PTX-MS(制劑E)的PTX釋放概況。圖分別提供了在4W(Δ)禾口2W()的OTR輸出功率下來自包含4.7xl010HAuNS/mgPLGA的PTX/HAuNS-MS(制劑C)的PTX釋放數(shù)據(jù)，以及在4W(+)和2W(X)的OTR輸出功率下來自包含9.乜109HAuNS/mgPLGA的PTX/HAuNS-MS(制劑B)的PTX釋放數(shù)據(jù)。斑點(spot)大小是直徑10mm。圖4A1、A2、B1、B2和B3顯示了在肌R照射存在和不存在下的細胞毒性。MDA-MB321或U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞與各種MS制劑一起孵育72小時。對于OTR處理，細胞用OTR激光以2W的輸出功率照射4次，各3分鐘。細胞與PTX/HAuNS-MS、PTX-MS和HAuNS-MS—起孵育。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為一式三份測量的平均值+/_標準差。*P<0.01與所有其他處理組比較。#p<0.01與所有其他處理組比較，除用HAuNS-MS處理的細胞外。圖5A描述了各種處理對在裸鼠中生長的U87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗瘤活性。當腫瘤體積達到100mm3時，微球體以單次劑量進行瘤內(nèi)注射。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為腫瘤體積的平均值+SD(n=4-5)。圖5Β描述了各種處理對在裸鼠的乳房脂肪墊(fatpats)中接種的MDA-MB-231人乳腺癌的抗瘤作用。當腫瘤體積測量為200mm3時，藥物以單次劑量進行瘤內(nèi)注射。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為腫瘤體積的平均值+SD(n=5)。箭頭指出在其時取出腫瘤用于組織學(xué)分析的時間，并且(a-c)對應(yīng)于圖5C中所示的照片a-c。圖5C、OT和5E是來自用PTX/HAuNS-MS以6.0mg當量PTX/kg(2.82XIO10HAuNS顆粒/小鼠)的高劑量加上激光照射處理的小鼠在不同時間取出的腫瘤組織的顯微照片。腫瘤最初被灼燒，但逐漸愈合且變成瘢痕。在瘢痕組織中未發(fā)現(xiàn)顯微鏡可見的腫瘤細胞。圖6描述了PTX/HAuNS-MS的假設(shè)結(jié)構(gòu)和所提議的OTR觸發(fā)的來自微球體的藥物釋放機制。PTX均勻地分散在聚合物的聚合基質(zhì)中，而HAuNS主要分散在微球體中的內(nèi)部水相中。圖7A和7B顯示了在近紅外光照射后埋入PLGA微球體(MS)中的中空金納米球(HAuNS)介導(dǎo)的來自微球體的紫杉醇(PTX)可控制釋放的表面等離振子共振吸收。圖8A和8B是在近紅外區(qū)域中具有強表面等離振子吸收的本文所述中空金納米球的舉例說明，所述中空金納米球與藥物例如多柔比星形成穩(wěn)定復(fù)合物且具有極高有效負載。藥物(如所示的D0X)在近紅外光照射后細胞內(nèi)釋放。圖9A、9B、9C、9D1和9D2大體地顯示裝載DOX的中空金納米球(DOXfflAuNS)的制造和表征。具體而言，圖9A是HAuNS合成以及簡單(plain)和裝載DOX的HAuNS(DOXiHAuNS和DOXOPEG-HAuNS)的TEM圖像的示意圖。圖9B是HAuNS和PEG-HAuNS的吸收光譜。圖9C顯示了游離D0X、HAuNS和DCKOHAuNS的吸收光譜。圖9D1和9D2顯示了DOX和HAuNS的最初物理混合物(紫色)以及在M小時孵育后DOX和HAuNS的復(fù)合物的吸收光譜。對于DOXOHAuNS觀察到顯著熒光猝滅。圖10A、10B1、10B2、10C和IOD顯示了Langmuir吸附等溫線，顯示通過HAuNS和具有各種PEG:Au摩爾比的PEG-HAuNS的DOX吸附。吸收的DOX針對溶液中的DOX起始量進行繪制。圖IOBl和10B2顯示了在最大限度DOX裝載的DOXOHAuNS和D0X@PEG-HAuNS之間的DOX有效負載(圖10B1)和顆粒大小(圖10B2)的比較。低PEG密度增加DOX有效負載。聚乙二醇化穩(wěn)定裝載DOX的HAuNS。顆粒大小在溫水浴超聲處理后通過動態(tài)光散射進行測量。圖10C顯示DCKOHAuNS和D0X@PEG_HAuNS在各種介質(zhì)中的穩(wěn)定性。圖11A、IlBUlC和IlD描述了NIR光觸發(fā)的來自DCKOHAuNS和D0X@PEG_HAuNS的DOX釋放。圖IlA顯示了在OTR激光存在和不存在下的DOX釋放概況。用OTR激光照射引起在OTR暴露(5分鐘、紅線)過程中的快速DOX釋放，并且當激光被切斷時，釋放被關(guān)閉。圖IlB顯示了在OTR激光照射前和后DOXOHAuNS的吸收光譜。顯示了(a)在激光照射前D0X@HAuNS、(b)在上清液中收集的釋放的D0X、和(c)在DOX完全釋放后的DOXOHAuNS的水溶液。圖IlC顯示了pH對在PEG-HAuNS上的DOX保留的作用。圖IlD是在不同pH下OTR光觸發(fā)的DOX釋放的比較。圖12A和12B顯示了在MDA_MB_231乳腺癌細胞中DOXfflAuNS和游離DOX的攝取。圖12A顯示了在1小時和48小時孵育后DOXOHAuNS的細胞攝取。使用暗場聚光器顯現(xiàn)HAuNS的反射。來自DOXOHAuNS的熒光信號的紅色局限于細胞質(zhì)中的斑點中。圖12B顯示了用OTR激光(1.0ff/cm2,3分鐘/處理，在2小時內(nèi)4次處理，孵育8小時)處理的游離DOX和DOXfflAuNS的細胞攝取。細胞核用DAPI進行復(fù)染。來自DOXfflAuNS中DOX的紅色熒光信號在OTR激光照射后局限于細胞核，指示在OTR暴露后來自DOXOHAuNS的DOX細胞內(nèi)釋放。圖13A和1顯示了作為DOX濃度(圖13A)和Au濃度(圖13B)函數(shù)的細胞存活。MDA-MB-231細胞不暴露于OTR光或用OTR光(2ff/cm2,3分鐘/處理，在2小時內(nèi)4次處理)照射。使用MTT測定來測定細胞活力。數(shù)據(jù)代表一式三份實驗的平均值+/_標準差。圖14A和14B是在NIR激光照射前和后DOXfflAuNS的TEM圖像。用NIR光照射引起小部分HAuNS顆粒的斷裂(箭頭)。圖15A、15B、15C和15D顯示了在中空金納米球(HAuNS)和實心金納米顆粒(AuNP)之間的比較。圖15A是在HAuNS和實心AuNP之間的DOX有效負載比較。圖15B是在反復(fù)NIR激光暴露下來自DOXfflAuNS(藍線)和DOXOAuNP(粉線)的DOX釋放。圖15C是在AuNP、DOXiAuNP和DOXOHAuNS間的吸收光譜比較。圖15D是在暴露于5.0ff/cm2輸出功率下的NIR光10分鐘期間測量的溫度變化。所有納米顆粒具有0.7X1011顆粒/mL的相同濃度。圖16A和16B顯示了關(guān)于(A)帶正電的藥物(即D0X)和(B)帶負電的藥物由HAuNS俘獲的機制。圖17A和圖17B顯示了關(guān)于脂溶性藥物(即PTX)(圖17A)和親水性藥物(即Dox)從PLGA微球體(圖17B)的OTR光誘導(dǎo)藥物釋放的可能機制。圖18顯示了裝載有Dox和HAuNS的PLGA微球體的熒光顯微照片。發(fā)明詳述本文呈現(xiàn)的是包括多個生物可降解和生物相容性微球體(“MS”)的藥物遞送系統(tǒng)，其中每個微球體包含至少一種藥物產(chǎn)品和多個中空金納米球(“HAuNS”)。微球體的直徑可以是約100nm-200nm。HAuNS直徑可以是約20nm-約80nm，并且中空金納米球的殼厚度可以是約2nm-約8nm。等離子體共振吸收峰可以通過控制HAuNS的金殼直徑和厚度進行調(diào)諧。通過改變鈷納米顆粒(其充當模板)的大小、鈷納米顆粒與氯金酸的比、氧從反應(yīng)混合物中的去除、和反應(yīng)混合物的攪拌速率，可以控制HAuNSs的直徑和厚度。在其他參數(shù)中，通過控制有機溶劑與水溶液的比、攪拌速率、表面活性劑的選擇、所使用的聚合物的分子量和濃度，可以控制微球體的直徑。如圖6中所示，微球體可以包含藥物(在本文中有時也稱為治療劑或藥物產(chǎn)品)、和HAuNSs作為光熱偶聯(lián)劑。微球體通過OTR光介導(dǎo)，且如下所述已就藥物釋放特性包括體外細胞毒性和體內(nèi)抗瘤活性加以評估。HAuNS展示在近紅外(NIR)區(qū)域中的表面等離振子吸收。由近紅外(NIR)激光和中空金納米球(HAuNS)介導(dǎo)的光熱效應(yīng)調(diào)節(jié)抗癌劑的釋放。微球體(有時也稱為“MS”)可以由聚合材料制成，且有時由生物可降解、生物相容性聚丙交酯共乙交酯共聚物(有時稱為“PLGA”)制造。可以用作聚合材料用于制備微球體的其他生物可降解的聚合材料包括但不限于聚乳酸、聚乙醇酸、聚二β烷酮、聚三亞甲基碳酸酯、聚ε-己內(nèi)酯、同聚物及其共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈等。本文呈現(xiàn)的含HAuNS微球體具有類似于簡單HAuNS那種的OTR光誘導(dǎo)的熱效應(yīng)。(圖6)。具體而言，當微球體用OTR光照射時，藥物可以從包含藥物和HAuNS的微球體中快速且反復(fù)地釋放。當OTR光被切斷時，藥物釋放是微不足道的。通過OTR激光輸出功率、激光照射的持續(xù)時間、處理頻率、和埋入微球體內(nèi)的HAuNS濃度，可以容易地控制來自微球體的藥物釋放。此外，本文提供的是用于OTR光介導(dǎo)的藥物釋放的藥物俘獲的2種方法。在第一種方法中，帶正電或帶負電的藥物通過靜電作用與中空金納米球(HAuNS)直接復(fù)合。在第二種方法中，親水性(水溶性)或疏水性(脂溶性)藥物連同HAuNS—起摻入聚合基質(zhì)內(nèi)。圖16描述了關(guān)于荷電藥物對于HAuNS的俘獲機制。圖17描述了脂溶性和水溶性藥物在聚合納米顆粒/微粒中的俘獲，以及關(guān)于脂溶性藥物(即紫杉醇(“ΡΤΧ”))和水溶性藥物(即多柔比星“Dox”))的、OTR光誘導(dǎo)的來自PLGA微球體的藥物釋放的可能機制。在圖17A中，PTX均勻地分散在PLGA聚合物的聚合基質(zhì)中，而HAuNS主要分散在微球體中的內(nèi)部水相中。在圖17B中，Dox和HAuNS都分散在內(nèi)部水相中。在肌R照射后，HAuNS產(chǎn)生強光熱效應(yīng)，快速升高內(nèi)部水滴和微球體中的微環(huán)境的溫度。對于分散在聚合基質(zhì)中的PTX，增加的局部溫度導(dǎo)致藥物在聚合基質(zhì)中的擴散系數(shù)和聚合物鏈的柔性的增加，導(dǎo)致加速的藥物釋放。相似機制對于在微球體中的內(nèi)部水相中的Dox釋放發(fā)生。圖18顯示了使用復(fù)乳技術(shù)制備的包含Dox和HAuNS的PLGA微球體的熒光顯微照片。紅色熒光指示在微球體內(nèi)Dox的存在。與本文呈現(xiàn)的藥物遞送系統(tǒng)和方法結(jié)合有用的帶正電的藥物包括但不限于鹽酸多柔比星、鹽酸柔紅霉素、順鉬、吉西他濱、阿糖胞苷、鹽酸米托蒽醌、硫酸長春新堿、硫酸長春堿、硫酸博來霉素、鹽酸依立替康、鹽酸托泊替康、頭孢替安、拉米夫定、鹽酸四環(huán)素、鹽酸莫西沙星等。與本文呈現(xiàn)的藥物遞送系統(tǒng)和方法結(jié)合有用的帶負電的藥物包括但不限于氨甲蝶呤鈉、B卜菲爾(Porfilmer)鈉、頭孢尼西(Sefonicid)鈉、兩性霉素B、氫化可的松琥珀酸鈉、磺胺乙酰鈉、頭孢米諾鈉、前列腺素E1、氨芐青霉素鈉、替卡西林二鈉等?？梢耘c本文描述的方法和藥物遞送系統(tǒng)結(jié)合使用的代表性脂溶性藥物包括但不限于紫杉醇、多西他賽、它莫西芬(Tamosifen)、美法侖、依托泊苷、硼替佐米、喜樹堿、環(huán)巴胺(Cyclopamine)、卡鉬、奧沙利鉬、伊馬替尼、環(huán)孢素、格爾德霉素、17-(烯丙氨基)_17_脫甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、纈沙坦、辛伐他汀、奧氮平等?？梢耘c本文描述的藥物遞送系統(tǒng)和方法結(jié)合使用的水溶性藥物包括但不限于鹽酸柔紅霉素、順鉬、吉西他濱、阿糖胞苷、鹽酸米托蒽醌、硫酸長春新堿、硫酸長春堿、硫酸博來霉素、鹽酸依立替康、鹽酸托泊替康、桂哌齊特、馬來酸鹽、阿卡波糖、氯吡格雷、阿奇霉素寸。此外，藥物遞送系統(tǒng)可與可以連同HAuNS—起裝載到聚合基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)/肽藥物結(jié)合使用。蛋白質(zhì)/肽藥物產(chǎn)品包括但不限于胸腺素、胰島素等。重要的是，水溶性MRI造影劑例如DTPA-Gd可以連同HAuNS和治療劑一起裝載到聚合基質(zhì)內(nèi)，以幫助監(jiān)控在OTR激光照射后來自聚合納米顆粒/微粒的藥物分布和釋放。組合藥物遞送可以通過將超過一種藥物裝載至HAuNS或裝載HAuNS的微球體來實現(xiàn)。藥物遞送策略一般針對增加在靶位置的藥物濃度，降低全身毒性，且允許與常規(guī)藥物遞送系統(tǒng)比較對藥物釋放的更大時間控制。當無論是天然還是合成的聚合物與藥物或其他活性劑以使得活性劑以預(yù)定方式從材料中釋放的方式組合時，受控的藥物遞送發(fā)生?；钚詣┑尼尫趴梢栽陂L時期內(nèi)是恒定的。它可以是周期性的，或它可以通過環(huán)境或其他外部事件觸發(fā)。在控制藥物遞送后的主要目的是實現(xiàn)更有效的治療，同時消除關(guān)于劑量不足和劑量過多的可能性。關(guān)于藥物遞送的主要挑戰(zhàn)是在空間和時間上控制藥物釋放。通過內(nèi)部或外部刺激例如pH、酶、磁力、超聲和熱觸發(fā)的藥物遞送近來已吸引許多注意力。參見例如，Lee，E.S.^A,Nanomed.2008,J,31-43；Lai,C.Y.等人，125，4451-4459,7；Am.Chem.Soc.2003，；P.Meers，於，265-272，DrugDeliver.Rev.2001；Ankareddi，I.^A,2,431-434,Nanotech.2007；Derfus,Α.等人，19，3932-3936，Adv.Mater.2007；DeGeest,B.等)κ,3，狐-職，Small2007；Deckers,D.等人,60，1153-1166,^/κ.DrugDeliver.Rev.2008；Kim,H.J.等人，18,3083-3088,Adv.Mater.2006；Needham,D.等人，53，285-305，DrugDeliver.Rev.2001。光觸發(fā)的藥物釋放是用于藥物遞送的一種方法。這些時空控制的遞送系統(tǒng)在光化學(xué)機制的基礎(chǔ)上響應(yīng)光。參見，Zhang，Z.Y.，等人，10，1150-1152，Bioconjug.Chem.(1999)；Wijtmans,Μ.等人，J.，128，11720—11726，Am.Chem.Soc.(2006)；Alvarez-Lorenzo,C.等人，85,848-860Photochem.Photobiol.(2009)。這些系統(tǒng)局限于體外使用，因為用于激活藥物釋放的紫外線/可見光無法穿透皮膚。相反地，通過金納米顆粒介導(dǎo)的光熱現(xiàn)象通過本文描述的藥物遞送系統(tǒng)使用。金納米結(jié)構(gòu)例如金納米殼、中空金納米球(HAuNS)和金納米棒可以在癌細胞的光熱消除(photothermalablation)中使用。參見例如，Hirsch，等人，100，13549-13554,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003);Loo，等人，3，33-40，Technol.CancerRes.Treat.(2004);ff.Lu,等人，15，876-886，Clin.CancerRes.(2009);Melancon，等人，7，1730_1739，Mol.CancerTher.(2008);Huang，等人，128,2115-2120，J.Am.Chem.Soc.(2006);Takahashi，等人，35,500-501,ChemLett(2006)。貴金屬納米顆粒展示在近紅外(NIR)波長(700-850nm)處的強光學(xué)消光，這是由于在通過電磁場激發(fā)后其自由電子的局限表面等離振子共振。OTR光的吸收導(dǎo)致共振和熱能向周圍介質(zhì)或組織的轉(zhuǎn)移。OTR光(700-850nm)可以容易地穿透皮膚且深入組織內(nèi)，因為光在NIR區(qū)域中的組織吸收是最低的。R.Weissleder,19,316-317,Nat.Biotechnol.(2009)。例如，埋入溫度敏感的水凝膠內(nèi)的SiO2-Au納米殼證實受調(diào)節(jié)的藥物遞送概況。M.Bikram，等人，123，219-227，J.ControlledRel.(2007)。然而，這種系統(tǒng)仍未轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于體內(nèi)應(yīng)用的可注射膠體遞送媒介物。類似地，包含膠體金聚集物的構(gòu)建的多層聚電解質(zhì)微殼已用于OTR觸發(fā)的葡聚糖釋放。Bedard，等人，2，1807-1816，ACSNano(2008)。此外，已顯示了觸發(fā)來自包含HAuNS的脂質(zhì)體的染料分子釋放的飛秒脈沖的激光。G.mi，等人，130,8175-8177,J.Am.Chem.Soc.(2008)。然而，先前未顯示治療上顯著的抗癌藥的釋放，也未執(zhí)行這些遞送系統(tǒng)的體內(nèi)評估。中空金納米球是在NIR區(qū)域中具有等離振子吸收的一類金納米顆粒，其展示適合于光熱消除(PTA)療法的強光熱偶聯(lián)特性。小尺寸(直徑30-50nm)、二氧化硅核的不存在、球形形狀、強和可調(diào)諧的(520-950nm)吸收帶、以及穩(wěn)定其他金納米顆粒所需的細胞毒性表面活性劑的需要缺乏的獨特組合使得HAuNS成為作為體內(nèi)分子療法的有用可選物。金納米顆粒(“AuNP”)大體上提供了獨特的化學(xué)和物理特性，包括其功能多樣性、生物相容性和低毒性。Templeton，A.C.等)κ,Monolayer-ProtectedClusterMolecules,33(1),27-36,AccChemRes(2000)；De,Μ.等k，ApplicationsofNanoparticlesinBiology,20(22)，4225-4241，AdvMater(2008)；Bhattacharya,R.等)κ,BiologicalPropertiesOf"Naked"MetalNanoparticles,m(11),1289-306,AdvDrugDelivRev(2008)；Connor,E.E.^Jk,GoldNanoparticlesAreTakenUpByHumanCellsButDoNotCauseAcuteCytotoxicity,1(3),325—7,Small(2005)。此外，金納米顆粒將吸收在幾乎不由組織吸收的近紅外光譜區(qū)中的光。所吸收的光能引起金顆粒振動且作為熱消散到周圍區(qū)域內(nèi)。微小金顆粒可以進行官能化從而與腫瘤細胞特異性結(jié)合。因此，僅包含金顆粒的細胞被殺死。雖然金納米顆粒(“AuNPs”)目前用于生物傳感和診斷，但金納米顆粒也已作為用于各種藥物遞送到其靶內(nèi)的潛在納米載體加以研究。Cheng，Μ.Μ.等人，NanotechnologiesforBiomolecularDetectionandMedicalDiagnostics,10(1),11-9,CurrOpinChemBiol(2006)；Rosi,N.L.等K,NanostructuresinBiodiagnostics,105(4)，1547-62，ChemRev(2005)；Baptista,P.等K,GoldNanopartidesfortheDevelopmentofClinicalDiagnosisMethods,391(3),943-50,AnalBioanalChem(2008)。AuNPs的有效負載可以包括小藥物分子或大生物分子，例如蛋白質(zhì)、DNA或RNA。Gibson,J.D.^Jk,Paclitaxel-FunctionalizedGoldNanoparticles,129(37)，11653-61，JAmChemSoc(2007)；Cheng,Y.等}κ,HighlyEfficientDrugDeliveryWithGoldNanoparticleVectorsForInVivoPhotodynamicTherapyofCancer,130(32)，10643—7，JAmChemSoc(2008)；Kim,C.K.φA,EntrapmentOfHydrophobicDrugsInNanoparticleMonolayersWithEfficientReleaseIntoCancerCells,131(4)，1360-1，JAmChemSoc(2009);Chithrani,B.D.^kMucidatingTheMechanismOfCellularUptakeAndRemovalOfProtein—CoatedGoldNanoparticlesOfDifferentSizesAndShapes,7(6)，1542-50，NanoLett(2007)；Visaria,R.K.等,EnhancementOfTumorThermalTherapyUsingGoldNanoparticle-AssistedTumorNecrosisFactor-AlphaDelivery,5(4),1014-20,Mol.CancerTher.(2006);Ghosh，P.S.^AEfficientGeneDeliveryVectorsByTuningTheSurfaceChargeDensityOfAminoAcid-FunctionalizedGoldNanoparticles,J(11),2213-8,ACSNano(2008);Lee,J.S.^Jk,Gold,Poly(Beta-AminoEster)NanopartidesForSmallInterferingRNADelivery,9(6)，2402-6,NanoLett(2009);Elbakry,A.等)K，Layer-By-LayerAssembledGoldNanoparticlesforsiRNADelivery,^(5)，2059-64，NanoLett,(2009)。進一步地，金納米顆粒作為藥物載體用于多柔比星(DOX)遞送的用途已顯示在體外用這種方法增強的細胞毒性效應(yīng)。Dhar，S.等k，NaturalGumReduced/StabilizedGoldNanoparticlesForDrugDeliveryFormulations，14(33),10244-50,Chemistry(2008)；Kumar,S.A.^Jk,FacileBiosynthesis,SeparationAndConjugationOfGoldNanoparticlesToDoxorubicin,19(49),Nanotechnology(2008)。事實上，HAuNS的有效主動靶向和使用HAuNS在小動物中實體瘤的選擇性PTA已針對表皮生長因子受體(EGFR)和在黑素瘤中超表達的黑皮質(zhì)素1型受體。Melancon，Μ.P.,等人，InVitroAndInVivoTargetingOfHollowGoldNanoshellsDirectedAtEpidermalGrowthFactorReceptorForPhotothermalAblationTherapy,7(6),1730-1739；MolCancerTherCZ·、-’Ux，l，等J^，TargetedPhotothermalAblationOfMurineMelanomasWithMelanocyteStimulatingHormoneAnalog—ConjugatedHollowGoldNanospheres,15(3),876-86,ClinCancerRes(2009)。在靜脈內(nèi)注射后，這些HAuNS展示極佳的膠體穩(wěn)定性、增強的腫瘤攝取和針對人腫瘤異種移植物有效的PTA效應(yīng)。同上。另一方面，盡管NIR光可以穿透幾厘米的組織，但由于光散射和吸收，它的能量隨著它傳送更深入組織內(nèi)而逐步減少。某些腫瘤細胞將不可避免地接受亞最佳的激光暴露且可能不被消除。我們假設(shè)HAuNS的獨特光熱轉(zhuǎn)換特性可以用于調(diào)節(jié)抗癌藥的遞送，從而使得有可能在單次設(shè)置中使用二次沖擊法(two-punchapproach)實現(xiàn)顯著增強的抗瘤功效。在下文描述的工作中，我們研究了使用HAuNS作為用于DOX的納米載體的效用，和裝載DOX的HAuNS(DOXOHAuNS)用于抗癌治療的潛在應(yīng)用。作為用于藥物遞送的納米載體的HAuNS。這種方法在幾個方面是有利的。首先，由于HAuNS獨特的物理化學(xué)特征，HAuNS展示特別高的藥物裝載能力和穩(wěn)定性(如通過DOX遞送的研究示例的)。特別地，納米顆粒的中空內(nèi)部允許用于DOX附著的有效表面積的顯著增加，導(dǎo)致與相同大小、表面電荷和重量的實心AuNP比較在DOX有效負載方面的3.5倍增加。其次，由于其在NIR區(qū)域中的強表面等離振子吸收，HAuNS介導(dǎo)強光熱效應(yīng)。將這種特性開發(fā)用于來自DOXOHAuNS的DOX的受控釋放，其使用OTR光作為外部刺激以觸發(fā)藥物釋放。第三，將細胞殺死的雙重模型整合到單個納米裝置內(nèi)，即由HAuNS介導(dǎo)的光熱消除和在OTR激光照射后從HAuNS釋放的DOX的抗瘤活性。這種“二次沖擊”法預(yù)期顯著增加細胞殺死的可能性且潛在克服對于化學(xué)治療劑的抗性，使得其成為關(guān)于癌癥治療的有希望的方法。如本文下文描述的，在體外，將與裝載有紫杉醇(“PTX”)和中空金納米球("HAuNS")的微球體一起孵育的癌細胞用OTR光照射，顯示比與單獨的微球體一起孵育的細胞或用單獨的OTR光照射的細胞顯著更大的細胞毒性效應(yīng)，這是由于OTR光觸發(fā)的藥物釋放。具體地如本文描述的，與用裝載HAuNS的微球體(無PTX)和OTR照射或用單獨的裝載PTX/HAuNS的微球體處理的腫瘤比較，用這些裝載PTX/HAuNS的微球體的瘤內(nèi)注射、隨后為OTR照射處理在裸鼠中的人U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤和MDA-MB-231乳腺腫瘤異種移植物，導(dǎo)致顯著的腫瘤生長延遲。因此，本文提供了新的治療方法，其中OTR光可以用于同時調(diào)節(jié)藥物釋放和誘導(dǎo)光熱細胞殺死。實施例I實驗試劑PLGA(丙交酯乙交酯=50:50，粘度=0.20dl/g)購自DURECTCorp.(Cupertino,CA)ο聚乙烯醇(PVA；MW25000，88摩爾％水解的)購自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。PTX由YunnanHandeBio-TechCo.，Ltd.(Houston,TX)提供。脫水檸檬酸三鈉(>99%)、氯化鈷六水合物(99.99%)、硼氫化鈉(99%)和氯金酸三水合物(ACS試劑級別)購自FisherScientific(Pittsburgh，PA)且如接受時使用。3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)和Tween80購自Sigma-Aldrich(St.Louis,M0)。二氯甲烷得自BaxterHealthcareCorp.(Deerfield,IL)0細胞系U87(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤)和MDA-MB-231(人乳腺癌)細胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)0將細胞維持在37°C、在包含5%CO2的增濕大氣中、在達爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基/營養(yǎng)素混合物F-12Ham和10%胎牛血清(LifeTechnologies,Inc.，GrandIsland,NY)中。HAuNS的合成和表征HAuNS根據(jù)先前報道的程序進行合成。參見例如，W.Lu，等人，15,876-886，Clin.CancerRes.(2009);Μ·Ρ·Melancon，7，1730_1739，Μο1·CancerTher.(2008)。簡言之，在包含2.8mL檸檬酸鈉(0.1mol/L)的去離子水中，通過用硼氫化鈉(4.5mL，1mol/L)還原氯化鈷(1mL,0.4mol/L)首先合成鈷納米顆粒。通過將氯金酸加入包含鈷納米顆粒的溶液內(nèi)獲得HAuNS。在BrooWiaven粒度分析儀(Holtsville，NY)上，使用動態(tài)光散射測定HAuNS的尺寸。在BeckmanCoulter光譜儀(Fullerton，CA)上記錄紫外線可見的光譜學(xué)。用JEM1010透射電子顯微鏡(TEM)(Peabody，ΜΑ)檢查HAuNS的形態(tài)。基于在808nm的吸光度和ε=8.3χIO9L/mol/cm(1.37χ10_"mL/顆粒/cm)的消光系數(shù)估計納米顆粒的濃度。PLGA微球體的制備和表征修飾的水包油包水(W1/0/W2)復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法用于制備包含PTX和HAuNS的PLGA微球體(PTX/HAuNS-MS)。通過使包含HAuNS的水溶液(0.08mL)與包含PLGA(240mg)和PTX(12.6mg)的二氯甲烷(0.8mL)混合形成第一種乳劑，其隨后注入充當外部水相的聚乙烯11(2%PVA,8.0mL)的水溶液內(nèi)。W1/0/W2乳劑使用來自KinematicaAG(Lucerne，瑞士)WPOLYTRONPT-MR3000臺式勻漿器以15，OOOrpm獲得。在有機溶劑完全蒸發(fā)后形成微球體，用水洗滌3次，并且冷凍干燥。僅包含PTX的微球體(PTX-MS)和僅包含HAuNS的微球體(HAuNS-MS)也使用相同程序進行制備。用JSM-5910掃描電子顯微鏡(JE0L，USA，Inc.，Peabody,MA)檢查微球體的大小和形態(tài)。在來自TAInstruments(NewCastle,DE)的Q2000系統(tǒng)上執(zhí)行示差掃描量熱法(DSC)0將飛mg的樣品首先在-20°C保持等溫5分鐘，并且隨后以20°C/分鐘的速率加熱至300°C。所有DSC測試使用鋁盤和50mL/分鐘的隊吹掃。為了測量含HAuNS的微球體的光熱效應(yīng)，將808-nmOTR激光通過包含HAuNS或含HAuNS的微球體(100μι)的石英比色杯遞送。將熱電偶與激光路徑垂直插入溶液內(nèi)。溫度在15分鐘期間進行測量。磷酸緩沖鹽水用作對照。激光器是連續(xù)波GCSLX-05-1600m-l纖維偶聯(lián)的二極管激光器(ChinaDahengGroup，Beijing，中國)。5_m，600_Mm核BioiTexLCM-001光導(dǎo)纖維(Houston，TX)用于將激光從激光器部件轉(zhuǎn)移到靶。這種纖維具有安裝在輸出端的透鏡，其允許通過改變從輸出端到靶的距離改變激光斑點大小。使用手提式光功率計(型號840-C；Newport,Irvine，CA)獨立地校準輸出功率，并且發(fā)現(xiàn)其對于6.5mm廣4.5W/cm2)的斑點直徑和2-amp電源電流是1.5W。PTX和HAuNS裝載和包封效率在微球體中的PTX量通過Agilent1100kries高效液相色譜(HPLC)(SantaClara,CA)進行測定，其根據(jù)報道的程序J.樸11，等人，8，2450-M56，BiOmaCrOmOl.(2007)使用。PTX裝載表示為在干微球體中的PTX含量(w/w)。俘獲效率(EE)表示為實際PTX裝載相對于理論PTX裝載的百分率。通過測量微球體在808nm的吸光度來測定關(guān)于HAuNS的裝載效率。用在水溶液中已知濃度的HAuNS構(gòu)建標準曲線。NIR光觸發(fā)的來自PLGA微球體的PTX釋放釋放研究在室溫執(zhí)行。將在包含Tween-80(0.1%，w/v)的PBS(0.01M,2.0mL,PH7.4)中的PTX/HAuNS-MS(20mg)溶液置于試管中。距離試管中心5cm固定激光探頭(10mm斑點直徑)。將樣品用808-nmOTR光以2_10W的輸出功率在5分鐘期間進行照射(Diomed15plus，Cambridge，UK)。在各個時間，從試管中抽取等分試樣，并且以5000rpm離心5分鐘，并且所釋放的游離PTX通過HPLC進行定量。體外細胞毒性將細胞(ι.οXIO4)在96孔板中種植并且孵育M小時，以允許細胞與孔的表面附著。將細胞隨后暴露于0.01-10.0mg/mLPTX/HAuNS-MS、HAuNS-MS或PTX-MS。將微球體處理的細胞用OTR光以2W的輸出功率(每次3分鐘持續(xù)時間，在照射之間間隔1小時)和10mm的斑點直徑照射4次。將未用OTR激光照射的微球體處理的細胞用作對照。所有細胞在37°C孵育72小時。根據(jù)制造商推薦的程序，使用MTT細胞毒性測定來測定細胞存活。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為一式三份測量的平均值士標準差。為了評估PTX的細胞毒性效應(yīng)和微球體的光熱效應(yīng)的相對貢獻，比較HAuNS-MS(不含藥物)、PTX/HAuNS-MS、包含在不存在細胞的情況下用激光預(yù)處理的PTX/HAuNS_MS的培養(yǎng)基、和在MDA-MB-231細胞的存在下用激光處理的PTX/HAuNS-MS的細胞毒性活性。微球體的濃度是0.02、1.0,2.0和8.0mg/mLoOTR光以2W的輸出功率和10mm的斑點直徑(2.55W/cm2)遞送5分鐘的時期。如前所述使用MTT測定來測定細胞存活。通過HPLC測量在激光照射后和在孵育72小時后培養(yǎng)基中的PTX濃度。體內(nèi)抗瘤活性涉及動物的所有實驗依照hstitutionalAnimalCareandUseCommittee的指導(dǎo)執(zhí)行。雌性裸鼠(nu/nu；18-22g；6-8周齡；Harlan，Indianapolis，IN)用異氟烷吸入進行麻醉，并且用U87細胞(在0.1mlPBS中的5XIO6細胞)進行皮下接種。當腫瘤體積達到約100mm3時，將小鼠隨機分配到4個組內(nèi)(n=4-5)。組1和2接受20_μPTX/HAuNS-MS(PTX1.0mg/kg；4.7XIO9HAuNS顆粒/小鼠；制劑Α)的瘤內(nèi)注射。組3接受20_μHAuNS-MS(4.7XIO9HAuNS顆粒/小鼠；制劑D)的瘤內(nèi)注射。組4接受20_μ鹽水的瘤內(nèi)注射。來自組1、3和4的小鼠中的腫瘤用OTR光以1.5W的輸出功率照射5分鐘(1次處理/天，對于每個腫瘤總共4次處理)。對于NIR處理，距離腫瘤4cm固定激光探頭(10mm斑點直徑)。通過測量2個直交的腫瘤直徑每周測定腫瘤生長2-3次。根據(jù)公式GXf)/計算腫瘤體積，其中a和力分別是腫瘤的長和短直徑。處理對腫瘤生長的作用表示為生長延遲，定義為以處理組中的腫瘤從100mm3生長到500mm3的天數(shù)表示的時間。在荷瘤雌性裸鼠中進一步研究抗瘤功效，所述腫瘤來自在哺乳動物脂肪墊中正位接種的人乳腺癌MDA-MB-231細胞(在0.1mlPBS中的5XIO6細胞)。當腫瘤體積達到約200mm3時，將小鼠隨機分配到5個組內(nèi)(n=5)。組1_3中的小鼠分別接受1.0mg/kg(4.7XIO9HAuNS顆粒/小鼠，低劑量)、6.0mg/kg(2.82XIO10HAuNS顆粒/小鼠，高劑量)、和6.0mg/kg(2.82XIO10HAuNS顆粒/小鼠，高劑量)當量PTX劑量下的PTX/HAuNS-MS(制劑A)的瘤內(nèi)注射。組4接受4.7XIO9HAuNS顆粒/小鼠(低劑量)劑量下的HAuNS-MS(制劑D)的瘤內(nèi)注射。組5接受鹽水的瘤內(nèi)注射。組1、2和4中的腫瘤也用OTR激光以1.5W的輸出功率照射5分鐘(2次激光處理/天，連續(xù)4天；總共8次處理)。使用如上所述的相同方案，每周測量腫瘤生長。腫瘤生長延遲定義為以處理組中的腫瘤從200mm3生長到1000mm3的天數(shù)表示的時間。對于組織學(xué)評估，將腫瘤取出且冷凍切片用于蘇木精和伊紅染色。在配備kissAxioCamMRc5彩色照相機(Thornwood，NY)的ZeissAxioObserver.Zl顯微鏡下檢查切片。數(shù)據(jù)分析通過斯氏t檢驗分析腫瘤生長延遲(對于U87腫瘤從100mm3生長到500mm3或?qū)τ贛DA-MB-231腫瘤從200mm3生長到1000mm3所需的天數(shù))中的平均差異，其中P<0.05視為統(tǒng)計上顯著的。裝載HAuNS和PTX的PLGA微球體的合成和表征通過鈷納米顆粒介導(dǎo)的氯金酸的還原制備HAuNS。HAuNS的吸收光譜顯示調(diào)諧至肌R區(qū)域(λ_=808nm)的等離子體共振峰(圖1A)。TEM圖像揭示HAuNS的近球形形態(tài)(圖1B)。HAuNS的平均直徑和Au殼的厚度分別為36nm和4nm,如從TEM圖像測量的。這與通過動態(tài)光散射測定的平均直徑一致，這獲得34nm的平均直徑。然而，本文描述的HAuNS的合適直徑范圍可以為約20nm-約80nm，并且Au殼的厚度可以為約2nm-約8nm。當HAuNS在室溫懸浮于純水中時，在1個月期間未觀察到在UV可見光譜中的明顯聚集或改變。表1概括了在各種微球體制備中使用的參數(shù)。表1.用于PLGA微球體的制備參數(shù)在有機相中的PLGA濃度是30%(w/v)。在外部水相中的聚乙烯醇濃度是2%(w/ν)。理論PTX裝載對于所有制劑是5%(w/w)0HAuNS，中空金納米球；EE，包封效率；PTX，紫杉醇；MS，微球體。將PTX容易地裝載到PLGA微球體內(nèi)，由于其疏水性質(zhì)，包封效率(EE)接近于100%。超過90%的HAuNS通過復(fù)乳法包封入微球體內(nèi)(表1)。圖IC和ID顯示PTX/HAuNS微球體的SEM和TEM照片。微球體的大小是1-10Mm.微球體的所有制劑具有致密質(zhì)地和無孔表面。HAuNS向由PLGA形成的裝載PTX的微球體內(nèi)的引入導(dǎo)致比不含HAuNS的那些更光滑的表面(在圖IC中比較制劑A和C)。這種現(xiàn)象類似于鋼筋在混凝土中發(fā)揮的作用，因為HAuNS納米顆粒使得PLGA微球體更致密和更硬。^u，等人，288，315-323，Int.J.Pharm.(2005)。PTX/HAuNS-MS的TEM照片揭示HAuNS簇在PLGA聚合基質(zhì)中的分散(圖1D)。關(guān)于單獨的PTX以及PTX和簡單PLGA微球體的混合物的DSC溫譜圖展示在約210°C僅在降解前的單個熔融吸熱峰。此外，PTX溫譜圖顯示在、5°C的吸熱脫水峰(圖2A)。這些數(shù)據(jù)與文獻中關(guān)于水合結(jié)晶PTX的數(shù)據(jù)一致。參見例如，R.T.Liggins，等人，86，1458-1463，J.Pharm.Sci.(1997)。吸熱脫水和熔融峰在PTX/HAuNS-MS中缺失，暗示PTX分子分散在PLGA聚合基質(zhì)中。HAuNS和HAuNS-MS的水懸浮液對于OTR光的連續(xù)暴露導(dǎo)致其溫度的快速升高。在1.5WΓ4.5ff/cm2)的激光輸出功率和4.2X101°顆粒/mL的當量HAuNS濃度下，2種懸浮液(HAuNS和HAuNS-MS)的溫度在暴露5分鐘后都升高23.3°C。在4.2XIO11顆粒/mL的更高HAuNS濃度下，水溶液在小于5分鐘內(nèi)達到沸點。相比之下，當PBS暴露于激光時，未觀察到顯著的溫度變化(圖2B)。在肌R光照射后，以50mg/mL濃度在PBS中的簡單PLGA-MS也不引起溫度變化(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果指示裝載HAuNS的PLGA-MS能夠使水的溫度升高至與4.2X101°顆粒/mL濃度下的單獨HAuNS相同的程度，并且HAuNS包封入PLGA-MS內(nèi)沒有不利地影響OTR光的吸收和HAuNS的光熱轉(zhuǎn)換能力。NIR光觸發(fā)的來自PTX/HAuNS-MS的PTX釋放圖3顯示了來自由PLGA制備的PTX/HAuNS-MS(制劑A和B)和PTX-MS(制劑C)的PTX釋放的表征。使用OTR激光在5分鐘期間反復(fù)照射微球體懸浮液(10mg/mL)，隨后為伴隨激光關(guān)閉的1.5小時間隔。圖3指示了在其間微球體使用OTR激光照射的時間段。在OTR照射后觀察到來自PTX/HAuNS-MS的PTX釋放方面的快速增加，并且當OTR照射被切斷時，PTX釋放顯著減慢。在7-W輸出功率下第一次NIR暴露5分鐘后，定義為所釋放的PTX與總俘獲PTX的百分比的累積釋放從3.2%增加到12.6%。然而，在無肌R光暴露的后續(xù)1.5小時孵育過程中，僅釋放約的PTX(從12.6%到13.9%)。在第二次5分鐘OTR暴露過程中，PTX釋放率快速升高，在累積釋放方面具有8%(從13.9%到21.9%)增加。對于第三次和第四次NIR暴露循環(huán)，在累積PTX釋放方面分別存在7.4%和6.2%增加。相比之下，在隨后3個孵育期的各自中，在無NIR光暴露的1.5小時時期過程中，釋放小于1%的PTX。當PTX/HAuNS-MS暴露于OTR激光4次、每次5分鐘時，在實驗整個過程中積累的PTX釋放達到40%。相比之下，進行相同處理方案的PTX-MS(無HAuNS)在整個實驗時期展示<7%的累積釋放。無激光照射的PTX-MS具有僅3.6%的積累釋放(圖3A)。藥物釋放隨著增加的OTR激光功率而增加。在第一次NIR光暴露過程中，在7W、4W和2W的輸出功率下，分別地從PTX/HAuNS-MS中釋放9.4%、7.5%和2.1%的PTX(圖3A)。釋放的PTX量也隨著微球體中增加的HAuNS裝載而增加。在OTR激光暴露后，與從包含較低濃度HAuNS的那些相比，更多的PTX從包含較高濃度HAuNS的PTX/HAuNS-MS中釋放。例如，在第一次NIR光照射過程中，在4W輸出功率下，17.2%的PTX從PTX/HAuNS-MS(制劑B)中釋放。相比之下，9.4%的PTX從包含少5倍HAuNS的PTX/HAuNS-MS(制劑A)中釋放(圖3B)。體外細胞毒性在MDA-MB-231和U87細胞中帶有或沒有OTR照射的PTX/HAuNS-MS的細胞毒性效應(yīng)顯示于圖4中。在與OTR照射組合的PTX/HAuNS-MS的細胞殺死效應(yīng)和單獨的PTX/HAuNS-MS的該效應(yīng)之間存在顯著差異。例如，當MDA-MB-231細胞與1mg/mL和10mg/mL濃度下的PTX/HAuNS-MS一起孵育時，分別地80.6%和81.6%的細胞在孵育72小時后是活的。然而，當細胞與相同微球體濃度下的PTX/HAuNS-MS—起孵育且用OTR照射時，分別地僅38.8%和3.9%的細胞是存活的(圖4A)。此外，當細胞與0.05-6.0mg/mL微球體濃度下的HAuNS-MS(無PTX)—起孵育時，超過60%的細胞是活的，不管細胞是否用OTR激光照射。僅在測試的最高微球體濃度(10mg/mL)下對于HAuNS-MS觀察到顯著細胞殺死。對于U87細胞觀察到相似發(fā)現(xiàn)(圖4A)。為了進一步研究在光熱效應(yīng)和PTX的細胞毒性效應(yīng)之間是否存在協(xié)同作用，我們進行了針對MDA-MB-231細胞的細胞毒性研究，其中使用用PTX/HAuNS-MS預(yù)孵育且用NIR激光處理的培養(yǎng)基。如圖4B中所示，當微球體的濃度大于1.0mg/mL時，用OTR激光以2W照射PTX/HAuNS-MS5分鐘引起培養(yǎng)基中的游離PTX濃度的顯著增加(圖4B，左上)。用單獨的PTX/HAuNS-MS以0.02、1.0、2.0和8.0mg/mL處理分別引起0.03士2.6%U4.3士1.3%,6.6士1.5%、22.2士4.8%細胞殺死。相比之下，當培養(yǎng)基中的PTX/HAuNS-MS用■R激光預(yù)照射時，被殺死的細胞百分比分別增加至2.3士9.1%、21.2士7.8%、27.4士8.1%、50.2士4.7%。細胞殺死方面的顯著增強不涉及光熱殺死效應(yīng)，因為PTX/HAuNS-MS在不存在細胞的情況下進行照射。然而，當PTX/HAuNS-MS在MDA-MB-231細胞的存在下用OTR激光進行照射時，被殺死的細胞百分比在0.02、1.0,2.0和8.0mg/mL的PTX/HAuNS-MS濃度下分別為10.6士9.4%,53.2士8.2%,64.3士0.9%,78.4士6.9%當細胞用HAuNS-MS(無PTX)和OTR激光在相同條件下處理時，被殺死的細胞百分比在0.02、1.0,2.0和8.0mg/mL的HAuNS-MS濃度下分別為7.4士5.3%U1.4士4.8%U9.8士9.7%禾口78.4士1.0%(圖4B,右上)。在用PTX/HAuNS-MS和OTR激光預(yù)處理的那些和連同PTX/HAuNS_MS和細胞一起照射的那些之間，在與MDA-MB-231細胞一起孵育3天后，在培養(yǎng)基中的游離PTX濃度方面不存在顯著差異(圖4B，底部)。2.4.體內(nèi)抗瘤活性圖5A顯示在各種微球體的瘤內(nèi)注射后的U87腫瘤生長曲線。對于用PTX/HAuNS-MS加上OTR光照射、PTX/HAuNS-MS、HAuNS-MS加上OTR光照射、和鹽水加上OTR光照射處理的小鼠，表示為腫瘤從100mm3生長到500mm3的天數(shù)的腫瘤生長延遲分別為27.5士3.8(n=4)、21.5士1.7(n=4)、19.0士3.5(n=4)和14.8士1.8(n=5)天。與用HAuNS-MS(無PTX)加上激光(P=0.045)、PTX/HAuNS-MS且無激光(p=0.016)、和鹽水加上激光(p=0.003)比較，用PTX/HAuNS-MS和OTR激光處理引起顯著生長延遲。在用微球體以各種劑量處理后的平均MDA-MB-231腫瘤生長曲線呈現(xiàn)于圖5B中。對于用PTX/HAuNS-MS加上激光(低劑量)、HAuNS-MS加上OTR激光(低劑量)、PTX/HAuNS-MS(高劑量)、和鹽水處理的小鼠，腫瘤生長延遲分別為25.0士3.5,19.8士4.0,15.8士6.1和10.2士2.8天。類似于應(yīng)用U87腫瘤的發(fā)現(xiàn)，與用鹽水(ρ<0.0001)或HAuNS-MS加上OTR激光(P=0.037)處理比較，用組合的PTX/HAuNS-MS和激光以較低劑量的微球體(1.0mg當量PTX/kg，4.7X109HAuNS顆粒/小鼠)處理引起顯著生長延遲。在更高劑量的PTX/HAuNS-MS(6.0mg當量PTX/kg、2.82X101°HAuNS顆粒/小鼠)下，NIR激光照射在處理開始后的前3周中引起組織灼燒和廣泛壞死。然而，灼燒的組織逐漸愈合，并且到處理后20天時，所有腫瘤已完全消失，僅留下瘢痕組織。組織學(xué)檢查證實在留下的瘢痕組織中不存在腫瘤細胞(圖5C)。相比之下，用相同劑量的PTX/HAuNS-MS但無OTR激光照射處理的小鼠顯示最低限度的抗瘤活性；以腫瘤從200mm3生長到1000mm3的天數(shù)測量的腫瘤生長延遲與用鹽水對照處理的小鼠中的該延遲并無顯著不同(P=0.056)(圖5B)。盡管在過去數(shù)十年內(nèi)取得進步，但藥物釋放特征的空間和時間控制仍是挑戰(zhàn)。HAuNS是具有極佳膠體穩(wěn)定性的納米顆粒，尺寸小(直徑一般為35-40nm)，且在肌R區(qū)域中展示可調(diào)諧和強的吸收帶。例如，在用于增強的光熱消除療法的全身施用后，用單克隆抗體或肽包被的HAuNS可以用于靶向?qū)嶓w瘤。W.Lu，等人，15，876-886，Clin.CancerRes.(2009)；Μ.P.Melancon，等人，7，1730-1739，Mol.CancerTher.(2008)。然而，通過將HAuNS摻入微球體(例如PLGA微球體)內(nèi)，HAuNS的較小尺寸和強表面等離子體吸收導(dǎo)致高度響應(yīng)OTR激光照射的藥物遞送系統(tǒng)。不同類型的藥物可以用于本文描述的組合HAuNS-MS藥物遞送系統(tǒng)中?？梢允褂檬杷运幬锖涂扇苄运幬铩４送?，可以使用具有正電荷和負電荷的藥物。紫杉醇(“PTX”)是可以摻入含HAuNS的PLGA微球體內(nèi)的疏水性藥物的示例，并且證實了OTR光觸發(fā)的高度疏水性藥物釋放。PTX是廣泛使用的抗癌劑，具有針對乳腺癌、卵巢癌、肺癌、和頭頸癌的抗瘤功效。E.K.Rowinsky，等人，82，1247-1259，J.Natl.CancerInst.(1990);Q.Chu，等人，50，355-374，LungCancer.(2005);D.Schrijvers，等人，17，218-224,Curr.Opin.Oncol.(2005)；Ε.Saloustros，等人，9，2603-2016，Exp.Opin.Pharmacother.(2008)。在本文呈現(xiàn)的藥物遞送系統(tǒng)中有用的微球體尺寸取決于如何應(yīng)用微球體。如果微球體預(yù)期用于抗癌劑(即紫杉醇)的細胞內(nèi)遞送，那么較小尺寸(<iym)的藥物/埋入HAuNS的顆?？梢詫?dǎo)致更有效的細胞攝取。如果預(yù)期應(yīng)用是用于瘤內(nèi)遞送，那么用較大尺寸(<1μm)的微球體在胞間隙中釋放抗癌藥可能是足夠的。不同尺寸的藥物/埋入HAuNS的顆粒的細胞攝取和抗瘤功效可以改變不同應(yīng)用。藥物釋放的詳細機制、特別是HAuNS介導(dǎo)的光熱應(yīng)答對聚合物鏈的移動性和對于疏水性藥物的滲透性的作用取決于具體應(yīng)用。如上所述，圖6描述了所提議的OTR光觸發(fā)的來自PLGA微球體的藥物釋放機制以及包含HAuNS和PTX的微球體的假設(shè)結(jié)構(gòu)。因為微球體通過W1/0/W2復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法進行制備，所以預(yù)期連同PLGA聚合物一起溶解于有機相中的PTX將均勻地分布在聚合物內(nèi)，而溶解于有機水相中的HAuNS納米顆粒將分散在微球體內(nèi)的水相中(圖6)。在圖6中描述的PTX/HAuNS微球體的結(jié)構(gòu)特征得到TEM研究和DSC分析的支持，所述TEM研究顯示在微球體內(nèi)的HAuNS簇形成，這可能是由于包含高局部濃度的HAuNS的內(nèi)部水滴(圖1D)，所述DSC分析揭示脂溶性PTX在分子水平分散在PLGA聚合物中(圖2A)。從PTX/HAuNS-MS微球體中回收的HAuNS具有與圖IA中所示的HAuNS相同的吸收特性(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，包封過程不影響HAuNS的光學(xué)特性。體外研究證實含HAuNS的微球體能夠與相同濃度下的簡單HAuNS—樣多地升高水溶液的溫度(圖2B)。重要的是，所生成的熱對于觸發(fā)PTX釋放是足夠的。通過控制肌R激光輸出功率、激光照射的持續(xù)時間和頻率、和微球體中的HAuNS有效負載，可以容易地調(diào)節(jié)來自包含HAuNS的微球體的PTX釋放(圖3)。這些結(jié)果指示來自PTX/HAuNS-MS的PTX釋放直接起因于通過埋入微球體中的HAuNS介導(dǎo)的光熱效應(yīng)。由于在NIR照射后微球體局部溫度的快速升高，聚合物鏈變得越來越更具柔性，導(dǎo)致來自PLGA聚合基質(zhì)的PTX藥物分子的釋放增加(圖6)。體外細胞毒性研究證實當細胞用OTR激光照射時，PTX/HAuNS-MS的抗瘤作用增強。用PTX/HAuNS-MS加上OTR照射觀察到顯著的細胞殺死，但用單獨的PTX/HAuNS-MS或單獨的PTX-MS則并非如此，指示在不存在OTR光的情況下從含PTX微球體釋放的PTX量不足以殺死腫瘤細胞。此外，PTX/HAuNS-MS加上NIR照射，但不是HAuNS-MS加上OTR激光，引起在高達6mg/mL(0.3mg當量PTX/mL)的微球體濃度下的顯著細胞毒性，指示從PTX/HAuNS-MS釋放的PTX主要負責(zé)用PTX/HAuNS-MS加上OTR在這些濃度下實現(xiàn)的細胞殺死。在更高濃度的HAuNS-MS(彡10mg/mL)下，通過HAuNS介導(dǎo)的光熱效應(yīng)足以消除腫瘤細胞(圖4A)。進一步的研究暗示在1.0和2.0mg/mL的微球體濃度下，與用HAuNS-MS加上激光(純光熱殺死效應(yīng))和用包含預(yù)暴露于OTR激光的PTX/HAuNS-MS的培養(yǎng)基(藥物的純細胞毒性效應(yīng))實現(xiàn)的組合細胞殺死效應(yīng)比較，用PTX/HAuNS-MS加上OTR激光處理引起更大的細胞殺死效應(yīng)(圖4B)。因為在不存在細胞的情況下用PTX/HAuNS-MS照射的培養(yǎng)基和在細胞的存在下用PTX/HAuNS-MS照射的培養(yǎng)基之間，在72小時細胞孵育后的藥物濃度方面不存在差異，所以用HAuNS加上激光所觀察到的增強的細胞殺死可以歸于在PTX和通過PTX/HAuNS-MS介導(dǎo)的光熱效應(yīng)之間的協(xié)同作用。用PTX/HAuNS-MS、隨后為OTR照射的增強的抗瘤活性在體內(nèi)實驗?zāi)[瘤模型中也得到證實。用組合的PTX/HAuNS-MS和OTR激光比用單獨的PTX/HAuNS-MS(低PTX釋放率和無光熱效應(yīng))或用HAuNS-MS加上OTR激光(光熱效應(yīng)但無PTX)實現(xiàn)針對皮下接種的U87腫瘤顯著更高的抗瘤活性(圖5A)。在正位接種的乳房MDA-MB-231腫瘤模型中觀察到相似發(fā)現(xiàn)(圖5B)。值得注意的是，在高劑量的PTX/HAuNS-MS(6.0mg當量PTX/kg)下，用與OTR激光組合的PTX/HAuNS-MS實現(xiàn)腫瘤的治愈，而在相同劑量下單獨的PTX/HAuNS-MS具有很少的抗瘤效應(yīng)。在用組合的PTX/HAuNS-MS和OTR處理的腫瘤中增強的抗瘤活性最可能是通過OTR光誘導(dǎo)的來自微球體的PTX釋放的細胞毒性效應(yīng)和通過埋入微球體中的HAuNS介導(dǎo)的光熱效應(yīng)的結(jié)果。包括可注射微球體的新的聚合藥物遞送系統(tǒng)已開發(fā)用于PTX的局部遞送，以便滿足在PTX的臨床使用中遇到的挑戰(zhàn)，即超敏反應(yīng)和累積毒性。J.K.Jackson,Τ.Hung,K.Letchford,H.Μ.Burt,//i.J.Pharm.2007，J忍，6-17。由于在PTX和疏水性PLGA聚合物之間的疏水作用，來自這種常用的生物可降解聚酯的PTX釋放已證明是極慢的。為了增強來自PLGA微球體的PTX釋放，PLGA與低分子量的兩親二嵌段共聚物摻和。這導(dǎo)致在突釋效應(yīng)(bursteffect)中的高達20倍增加。因此，來自PLGA微球體的PTX釋放是無法控制和無法預(yù)測的，并且僅小部分的藥物最終被釋放，限制此類方法的治療功效。在這個研究中，我們證實不僅OTR光可以以受控方式調(diào)節(jié)來自PLGA微球體的PTX釋放，而且該方法顯著增強PTX-PLGA微球體在體內(nèi)的抗瘤功效。在體內(nèi)用光調(diào)節(jié)的藥物釋放增強抗瘤效應(yīng)的可行性是新的、可行的一種。此外，使光熱消除療法與OTR光調(diào)節(jié)的藥物釋放組合存在治療優(yōu)點。Sanchez-Iglesias等人近來描述了包含由金屬鎳薄層和聚N-異丙基丙烯酰胺(pNIPAM)殼覆蓋的金納米顆粒核心的新的膠體復(fù)合物。這些作者顯示pNIPAM殼可以作為溫度的函數(shù)而膨脹或崩潰，從而允許各種類型分子的捕獲和釋放。A.Sanchez-Iglesias,等人，3，3184-3190，ACSNano(2009)。相反地，通過將中空金納米球摻入生物可降解的PLGA微球體內(nèi)，可以用OTR光調(diào)節(jié)光熱效應(yīng)，這是允許光滲透深入軟組織內(nèi)廣5cm)的最佳波長。因此，本文呈現(xiàn)的使用OTR光作為外部刺激的藥物遞送系統(tǒng)和調(diào)節(jié)藥物釋放的方法可以提供在OTR照射后容易實現(xiàn)的快速和反復(fù)的藥物釋放。由于NIR穿透深層組織的能力，用OTR光調(diào)節(jié)藥物釋放可以在癌癥和其他疾病的治療中具有用途。此外，具體地，用于抗癌治療的微球體的瘤內(nèi)施用證明包含HAuNS和抗癌劑的微球體可以用于化學(xué)栓塞應(yīng)用中，其中需要響應(yīng)肌R激光束的抗癌藥的可控制和反復(fù)釋放。實施例II材料與實驗試劑D0X、甲氧基-PEG-SH(麗，5，000),PBSCpH7.4)和用于MTT測定的細胞毒性試劑盒得自Sigma-AldrichCSt.Louis，M0)。脫水檸檬酸三鈉(>99%)、氯化鈷六水合物(99.99%)、硼氫化鈉(99%)和氯金酸三水合物(ACS試劑級別)購自FisherScientific(Pittsburgh,PA)且如接受時使用。二氯甲烷(ACS級別)得自BaxterHealthcareCorp.(Deerfield，IL)。具有41.5nm平均直徑的金納米顆粒購自BBInternational(Madison，WI)。細胞培養(yǎng)將MDA-MB-231(人乳腺癌)細胞維持在37°C、在包含5%CO2的增濕大氣中、在達爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基和10%胎牛血清(LifeTechnologies,Inc.，Grandisland,NY)中。HAuNS的合成和PEG與HAuNS的綴合HAuNS根據(jù)先前報道的方法進行合成。Lu，W.,等}κ,TargetedPhotothermalAblationofMurineMelanomaswithMelanocyteStimulatingHormoneAnalog—ConjugatedHollowGoldNanospheres,15(3)，876-86(ClinCancerRes2009)。簡言之，通過使包含4.5mL1mol/L硼氫化鈉、2.8mL0.1mol/L檸檬酸鈉和1.0mL0.4mol/L氯化鈷的去離子水脫氧，首先合成鈷納米顆粒。在將氯金酸加入包含鈷納米顆粒的溶液內(nèi)后，鈷立即將金離子還原到鈷納米顆粒的表面上，而同時它氧化為氧化鈷。通過空氣進一步氧化任何剩余的鈷核心，得到最終產(chǎn)物HAuNS。在BrooWiaven90plus粒度分析儀(Holtsville，NY)上，使用動態(tài)光散射測定HAuNS的尺寸。在BeckmanCoulterDU-800UV-可見光譜儀(Fullerton，CA)上記錄UV可見的光譜學(xué)。使用JEM1010透射電子顯微鏡(JEOLUSA,Peabody，MA)檢查HAuNS的形態(tài)。通過我們先前報道的方法估計HAuNS的濃度。Melancon，Μ.P.等X，InvitroandinvivoTargetingOfHollowGoldNanoshellsDirectedAtEpidermalGrowthFactorReceptorForPhotothermalAblationTherapy,7(6),1730-1739，MolCancerTher(2008)。PEG修飾的HAuNS(PEG-HAuNS)根據(jù)我們先前的研究進行制備。Lu，W.，等人，TargetedPhotothermalAblationOfMurineMelanomasWithMelanocyteStimulatingHormoneAnalog-ConjugatedHollowGoldNanospheres,15(3),876-86,ClinCancerResΓ2009)簡言之，將HAuNS(5.OXIO12顆粒/mL)加入包含具有各種濃度的PEG-SH的氬吹掃的水溶液中。允許反應(yīng)在室溫進行過夜。對于純化，反應(yīng)混合物以14，000rpm離心20分鐘，并且用去離子水重懸浮所得到的團塊。該過程重復(fù)2次以去除未反應(yīng)的PEG分子。DOX裝載到HAuNS和PEG-HAuNS上將游離DOX的水溶液的等分試樣(1.0mM，0.02-0.3mL)加入HAuNS或PEG-HAuNS(1.0XIO11顆粒，0.1mL)的水溶液內(nèi)，并且使混合物在室溫攪拌M小時。在離心(14，000rpm,20分鐘)后，將沉淀物用PBS進行洗滌且離心，并且重復(fù)洗滌循環(huán)直至上清液變得無色。將收集的所有上清液合并在一起，并且通過分光光度法在洲7nm測定在上清液中的游離DOX量。DOX裝載能力(LC)使用2種方法進行評估。第一種方法根據(jù)等式1通過測定上清液中的未結(jié)合DOX量間接測量所附著的D0X。第二種方法根據(jù)等式2在用二甲亞砜從干燥HAuNS中提取DOX后直接定量與HAuNS附著的D0X。LCfia=(使用的總DOX-在上清液中的DOX)/(使用的總Au+使用的總DOX-在上清液中的D0X)X100%等式1。LCia=從HAuNS中提取的總DOX/總顆粒重量X100%等式2。來自HAuNS和PEG-HAuNS的DOX釋放釋放研究在室溫執(zhí)行。將DOXfflAuNS或D0X@PEG-HAuNS(1.0XIO12顆粒/mL)分散在5-mL試管中的2.0mLPBS(10mM,pH7.4)中。將激光探頭(10-mm斑點直徑)置于距離試管中心側(cè)部5.0cm上。以預(yù)定時間間隔將樣品用以2.0W/cm2的輸出功率集中于808nm的OTR激光照射3分鐘(Diomed15plus,Cambridge,UK)D將納米顆粒溶液進行離心(14,000rpm，20分鐘)，并且在OTR激光照射前和后取出上清液用于DOX分析。用分光光度法測定上清液中的DOX濃度。DOXiHAuNS和D0X@PEG_HAuNS的細胞攝取將MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移且在M孔板中在20_mm玻璃蓋玻片上培養(yǎng)且允許生長2天。隨后用包含游離D0X、D0X@HAuNS或D0X@PEG-HAuNS的1mL新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在孵育1小時或48小時后，移取蓋玻片上的細胞單層，用PBS反復(fù)沖洗，并且隨后安裝用于顯微鏡檢查。在配備暗場聚光器WkissAxioObserver.Zl熒光顯微鏡(CarlZeissMicroimagingGmbH,USA)下檢查細胞熒光和暗視野光散射圖像。在分開的實驗中，將在20-mm玻璃蓋玻片上培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞用OTR激光(1.Off/cm2,3分鐘/處理，在2小時中4次處理)進行照射。細胞核用DAPI進行染色。細胞熒光和光散射圖像如先前段落中所述獲得。DOX-HAuNS和DOX-PEG-HAuNS的細胞毒性將總共2.OXIO4細胞置于96孔板中且孵育M小時，以允許細胞附著。使細胞暴露于具有各種DOX濃度的游離D0X、DOXiHAuNS或D0X@PEG-HAuNS。細胞用或不用NIR激光以2W/cm2的輸出功率(3分鐘/處理，在2小時中4次處理)進行照射。隨后細胞在37°C孵育進一步的48小時。根據(jù)制造商建議的程序使用MTT測定測量細胞存活效率。所報道的數(shù)據(jù)代表一式三份測量的平均值。在分開的實驗中，使細胞暴露于具有各種Au濃度的HAuNS，并且隨后在相同條件下用或不用OTR激光進行照射。在37°C孵育48小時后測量細胞存活效率。測試能夠介導(dǎo)癌細胞的光熱消除和在近紅外(OTR)光照射后的藥物釋放的雙功能中空金納米球(撤11賂，40-歷直徑)。高達按重量計63%的DOX(1.7μδDOX/^gAu)可以被裝載至聚乙二醇(PEG)包被的HAuNS，因為DOX被包被至HAuNS的外和內(nèi)表面。用OTR激光照射誘導(dǎo)光熱轉(zhuǎn)換，這觸發(fā)來自裝載DOX的HAuNS的快速DOX釋放。DOX的釋放也是ph依賴性的，在較低ph下在水溶液中具有更多釋放的D0X。當用OTR光照射與裝載DOX的HAuNS—起孵育的MDA-MB-231細胞時，觀察到明顯更大的細胞殺死，這可歸于HAuNS介導(dǎo)的光熱消除和所釋放的游離DOX的細胞毒性。如圖8中所示，在近紅外區(qū)域中具有強表面等離振子吸收的中空金納米球以極高有效負載與多柔比星形成穩(wěn)定復(fù)合物，并且DOX在近紅外線照射后在細胞內(nèi)釋放。根據(jù)khwartzberg等人的方法，在氯金酸的存在下通過鈷納米顆粒的犧牲直流置換(sacrificialgalvanicreplacement)合成HAuNS。Schwartzberg,A.Μ.等人，Synthesis，Characterization，AndTunableOpticalPropertiesOfHollowGoldNanospheres,110(40),19935-19944(JPhysChem2006)所得到的HAuNS的平均直徑是38.5士1.7nm，如通過動態(tài)光散射法測定的。透射電子顯微鏡檢查(TEM)揭示HAuNS的形態(tài)(圖9A)，且指示它們具有43士4.6nm的平均直徑和4.0nm的平均Au殼厚度。通過聚乙二醇(PEG)的表面修飾導(dǎo)致HAuNS的平均直徑從38.5士1.7nm到48.6士1.3nm的適度增加。與HAuNS比較，PEG-HAuNS具有顯著增加的膠體穩(wěn)定性當PEG-HAuNS在3個月期間在室溫貯存于水中時，未觀察到聚集。吸收光譜顯示關(guān)于HAuNS和PEG-HAuNS的等離子體共振峰調(diào)諧至OTR區(qū)域廣800nm)(圖9B)。因此，PEG修飾不影響HAuNS特有的譜，但的確增強其物理穩(wěn)定性。通過HAuNS或PEG-HAuNS溶液與DOX在室溫M小時的簡單混合，并且隨后重復(fù)洗滌以去除未結(jié)合的D0X，容易地形成DOXfflAuNS和D0X@PEG-HAuNS的復(fù)合物。TEM圖像明確顯示具有覆蓋DCKOHAuNS和DOXOPEG-HAuNS表面的約4_6nm厚度的DOX層，這在DOX包被前在HAuNS和PEG-HAuNS中不存在(圖9A)。在DOX吸收后HAuNS的顏色從淺綠色變成棕紅色。DOXOHAuNS展示在DOX特有的490nm處的UV-Vis吸收峰和在HAuNS特有的、00nm處的寬OTR等離振子吸收峰(圖9C)。在混合后M小時，與DOX未結(jié)合時的DOX和HAuNS(0小時)混合后立即的吸光度峰強度比較，在UV-可見區(qū)域中的DOX吸光度峰強度顯著減少(圖9D)。此外，與展示強熒光發(fā)射的游離DOX比較，在DOXOHAuNS中來自DOX的熒光信號幾乎完全猝滅(圖9D，插圖)，這是已知在熒光團與緊密接近的金屬納米顆粒表面附著時出現(xiàn)的現(xiàn)象°Fan,C.,^Jk,BeyondSuperquenching:Hyper~EfficientEnergyTransferfromConjugatedPolymerstoGoldNanoparticles,100(11),6297-301,ProcNatlAcadSciUSA(2003)。這些結(jié)果指示在M小時孵育后DOX與HAuNS和PEG-HAuNS緊密結(jié)合。圖10A顯示了通過HAuNS和PEG-HAuNS對于DOX吸附的在室溫的Langmuir吸附等溫線。在HAuNS上的PEG修飾顯著影響DOX的吸收效率。在較低PEG包被密度(PEG:Au摩爾比=0.008:1)下，HAuNS的PEG化導(dǎo)致較高的DOX裝載。然而，DOX的裝載效率隨著增加的PEG包被密度而降低。這可以如下解釋由于增加的膠體穩(wěn)定性而增加的表面積，且從而在小量PEG引入HAuNS表面時減少的在HAuNS中形成的聚集物群體。然而，對于過量PEG修飾，在HAuNS和DOX之間的相互作用被阻礙，這是因為PEG的位阻阻止DOX分子接近HAuNS的表面。在較高的PEG包被密度(PEG:Au摩爾比=0.04:1和0.125:1)下對PEG-HAuNS的DOX吸收的飽和暗示，HAuNS的表面在此類條件下被DOX和PEG分子完全占據(jù)，而在較低PEG包被密度(PEG:Au摩爾比=0.008:1)下，DOX吸收等溫線直到180Pg的起始DOX量也未達到平臺。DOX有效負載的進一步增加對于這種具體制劑是可能的。在起始DOX-HAuNS混合物中180μδ的DOX量下，與HAuNS吸附的藥物含量對于HAuNS、PEG-HAuNS(PEG:Au摩爾比=0.0081)和PEG-HAuNS(PEG:Au摩爾比=0.125:1)分別為41%、63%和27%，這對應(yīng)于在DOX和金之間0.69、1.7和0.37的重量比(圖10B)。對于HAuNS和PEG-HAuNS的DOX裝載導(dǎo)致納米顆粒尺寸的增加，暗示DOX的存在減少這些納米顆粒的膠體穩(wěn)定性。具有較高PEG密度的DOXfflAuNS比具有較低PEG密度的DOXfflAuNS更穩(wěn)定，具有較低PEG密度的DOXfflAuNS又比不含PEG包被的HAuNS更穩(wěn)定(圖10B)。在我們的研究的下述描述中，“PEG-HAuNS”指具有0.008:1的PEG:Au摩爾比的PEG-HAuNS，除非另有說明。除膠體穩(wěn)定性外，我們還檢查了在HAuNS和PEG-HAuNS上吸附的DOX的穩(wěn)定性。在第一個2天時期內(nèi)15%-20%的起始釋放后，在第二個2天時期內(nèi)在水、磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.0)或包含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基中未觀察到來自DOXOHAuNS或D0X@PEG-HAuNS的DOX進一步釋放(圖10C)。這些結(jié)果指示DOX與HAuNS和PEG-HAuNS穩(wěn)定吸附。為了研究DOX與HAuNS結(jié)合的機制，通過乙?；Ｗo基團封閉DOX中的氨基基團。DOX-乙酰胺與HAuNS的結(jié)合減少至接近零(圖10D)，暗示DOX的氨基基團對于其在HAuNS上的高有效負載是關(guān)鍵。根據(jù)合成方案，HAuNS通過在PBS溶液(pH7.4)中具有-25mAζ電位的帶負電的檸檬酸鹽得到穩(wěn)定。另一方面，DOX在pH7.4是帶正電的。因此，DOX經(jīng)由靜電作用吸附到HAuNS上。與共價綴合法比較，在藥物分子和納米載體之間的復(fù)合物形成是有利的，這是由于容易制造和放大、低成本和可預(yù)測的釋放概況。Gibson，J.D.等Jk,Paclitaxel-FunctionalizedGoldNanoparticles,129(37),11653-6,JAmChemSoc(2007)；Peer,D.^ANanocarriersasanEmergingPlatformForCancerTherapy,2(12)，751-60，NatNanotechnol(2007)。來自DOXfflAuNS和DOXOPEG-HAuNS的DOX釋放可以通過使用NIR激光容易地加以控制。在以4.0W/cm2輸出功率的第一次NIR激光照射(在1小時開始)5分鐘后，定義為表示為百分率的所釋放DOX與總裝載DOX的比的累積釋放對于DOXOHAuNS從4.增加到22.2%，并且對于DOXOPEG-HAuNS從4.1%增加到31.9%DOX(圖11A)。當NIR激光在接下來的1小時孵育期間被切斷時，DOX的釋放顯著減少或幾乎完全停止。當激光處理方案在2小時開始重復(fù)時，觀察到相似結(jié)果。然而，在第二個處理循環(huán)過程中存在更少釋放的D0X。到第三個處理循環(huán)時(在3小時開始)，幾乎沒有釋放的D0X。這些數(shù)據(jù)暗示，來自DOXOHAuNS和D0X@PEG-HAuNS的DOX釋放可以通過外部NIR激光觸發(fā)。在DOXfflAuNS(1.OXIO12顆粒/mL)的OTR激光照射后，在約490nm的峰吸收強度顯著增加，指示來自納米復(fù)合物的游離DOX釋放。DOXOHAuNS的顏色從褐色變成綠色，這是由于DOX與DOXOHAuNS的分開(圖11B)。在游離DOX的離心去除后，剩余的HAuNS溶液展示類似于在OTR激光照射前但在較低強度下獲得的DOXOHAuNS的吸收光譜，并且具有在490nm的DOX特征峰吸收的喪失(圖11B)。在OTR激光照射后在800nm減少的峰強度可以歸于小部分的HAuNS顆粒的斷裂(數(shù)據(jù)未顯示)。因為DOX經(jīng)由靜電作用與HAuNS附著，所以預(yù)期來自DOXOHAuNS和DCKOPEG-HAuNS的DOX釋放將是pH依賴性的。實際上，雖然在pH10的PBS中不存在從D0X@PEG-HAuNS釋放的D0X，并且在孵育2天后在室溫在pH7.4的PBS中僅11%釋放的D0X，但DOX釋放在pH5.0達到且在pH3.0達到57%(圖11C)。所觀察到的pH依賴性歸于在DOX上-NH2基團增加的質(zhì)子化引起的較低PH下DOX增加的親水性和更高的可溶性，這減少了在DOX和HAuNS之間的相互作用。當pH降低時，在HAuNS表面上的C00_基團也變得質(zhì)子化。因此，在DOX和HAuNS之間的靜電作用減少。來自HAuNS或PEG-HAuNS的pH依賴性藥物釋放可以開發(fā)用于藥物遞送應(yīng)用腫瘤的細胞外組織以及細胞內(nèi)溶酶體和內(nèi)體的微環(huán)境是酸性的，并且這種酸度可以促進來自基于HAuNS的遞送媒介物(vehicle)的主動藥物釋放。NIR激光照射增加從在不同pH水平的PBS中孵育的DOXOHAuNS或D0X@PEG-HAuNS釋放的DOX量；培養(yǎng)基的pH越低，釋放的DOX越少。例如，在4.0W/cm2下的5分鐘連續(xù)NIR激光照射后，當納米顆粒在pH7.4、pH5.0和pH3.0的PBS中孵育時，分別地從D0X@HAuNS中釋放多14.6%、16.7%和5.的DOX(圖11D)。在pH5.0用OTR光實現(xiàn)較高DOX釋放的能力是有利的，因為腫瘤細胞的細胞內(nèi)溶酶體環(huán)境具有約5.0的pH。Ji,X.等)\，BifunctionalGoldNanoshellswithaSuperparamagneticIronOxideSilicaCoreSuitableforBothMRImagingAndPhotothermalSera/yo777(17)，6245-6251，JPhysChemC(2007)。為了解釋所觀察到的DOX對于HAuNS的高裝載能力且進一步評估HAuNS作為藥物載體的優(yōu)點，我們比較了在具有相似尺寸廣40nm)和表面電荷(ζ電位-25mA)的HAuNS和AuNPs之間的DOX裝載效率和藥物釋放行為。具有相同當量Au濃度的HAuNS或AuNPs與DOX(1.0mM的終濃度)一起孵育?；?.0μδAu,DOX有效負載從在AuNPs中的0.2Pg增加到在HAuNS中的0.7Pg，增加3.5倍(圖15Α)。這種增加可以通過與AuNPs比較HAuNS更大的表面積加以解釋。假定HAuNS的殼厚度是4.0nm,并且HAuNS和AuNP的直徑都是40nm,估計每個實心AuNP在重量基礎(chǔ)上等價于2個中空HAuNS。這意味著，如果所有DOX分子都包被在HAuNS的外表面上，HAuNS應(yīng)具有AuNPs的2倍DOX有效負載。發(fā)現(xiàn)3.5倍高的DOX與HAuNS結(jié)合的事實暗示HAuNS的內(nèi)表面也由DOX包被。事實上，當計數(shù)內(nèi)和外表面積時，估計HAuNS具有AuNPs3.2倍高的表面積。TEM顯示HAuNS的殼是多孔的(圖9A)，這使得DOX分子能夠擴散到核心內(nèi)且與HAuNS的內(nèi)表面結(jié)合。除在HAuNS和AuNP之間的DOX裝載能力中的顯著差異外，DOXiHAuNS也展示NIR光觸發(fā)的DOX釋放的獨特特征。相比之下，當DOX包被的AuNP用OTR光照射時，未觀察到DOX釋放(圖15B)。這是因為與DOXOHAuNS不同，對于DOXOAuNP在NIR區(qū)域中不存在等離振子吸收(圖15C)。當具有0.7XIO11顆粒/mL的相同納米顆粒濃度的HAuNS、DOXiHAuNS和DOXOPEG-HAuNS水溶液暴露于NIR光(5.0ff/cm2,10分鐘)時，溫度分別增加39°C、27°C和30°C。相比之下，當PBS或AuNP溶液暴露于OTR激光時，未觀察到顯著的溫度變化(圖15D)。因此，在NIR光的存在下通過HAuNS介導(dǎo)的溫度升高可以負責(zé)OTR激光觸發(fā)的來自DOXiHAuNS和D0X@PEG-HAuNS的DOX釋放。將DCKOHAuNS和D0X@PEG_HAuNS內(nèi)化到MDA-MB-231細胞內(nèi)且保持在內(nèi)溶酶體區(qū)室中。在1小時孵育后，DOXOHAuNS顯示來自DOX的強紅色熒光信號，盡管用與HAuNS結(jié)合的DOX的猝滅效應(yīng)。熒光信號局限于遍及細胞質(zhì)分散的斑點。得自暗視野成像的白色亮點指示HAuNS的存在，這在很大程度上與DOX共定位(圖12A)。這些結(jié)果暗示HAuNS連同DOX一起由癌細胞吞噬且分布至內(nèi)溶酶體囊泡。在48小時后，DOX和HAuNS保持俘獲在內(nèi)溶酶體囊泡中(圖12A)。這個觀察與我們的下列早期發(fā)現(xiàn)形成對比D0X可以在、H5從DOXOHAuNS中釋放。可能是在內(nèi)溶酶體的微環(huán)境中，在藥物分子具有擴散到囊泡外的機會前，分開的DOX與HAuNS再附著。與DOXOHAuNS形成對比，游離DOX由腫瘤細胞吸收且在孵育后1小時分布至細胞核(圖12B)。OTR激光照射(1.0ff/cm2,3分鐘/處理，在2小時期間4次處理)引起來自DOXOHAuNS的DOX釋放，并且DOX分布至細胞核(圖12B)。因此，通過NIR激光照射控制來自DOXfflAuNS和D0X@PEG-HAuNS的細胞內(nèi)DOX釋放是可能的。DOXiHAuNS和D0X@PEG_HAuNS以劑量依賴性方式針對MDA-MB-231細胞是細胞毒性的。約33.5%和39.5%細胞分別被10Pg/mL當量DOX濃度下的DOXOHAuNS和D0X0PEG-HAUNS殺死(圖13A)。然而，游離DOX展示更高毒性，其中77.4%細胞在相同藥物濃度下被殺死。應(yīng)用DOXfflAuNS和D0X@PEG-HAuNS的較低細胞殺死能力可以歸于在DOX和HAuNS之間形成的相對穩(wěn)定的復(fù)合物和在細胞內(nèi)延遲的DOX釋放。在OTR激光照射(2ff/cm2,3分鐘/處理，在2小時期間4次處理)后，10Pg/mL當量DOX濃度下的DOXOHAuNS和D0X@PEG-HAuNS都顯示針對癌細胞顯著增強的細胞殺死效應(yīng)，分別具有約83.5%和86.4%被殺死的細胞(圖13A)。HAuNS對于范圍為0.04Pg/mL-160Pg/mL的Au濃度不是細胞毒性的(圖13B)。這與一般而言基于Au的納米顆粒是完全耐受的文獻發(fā)現(xiàn)一致。De，M.等人，ApplicationsofNanoparticlesinBiology,20(22)，4225-4241，AdvMater(2008)；Bhattacharya,R.^ΑBiologicalpropertiesof"Naked〃MetalNanoparticles,60(11),1289-306,AdvDrugDelivRev(2008)。當與HAuNS—起孵育的細胞用NIR激光以大于16μgAu/mL的Au濃度處理時，簡單未裝載的HAuNS展示顯著的細胞殺死效應(yīng)(>69%被殺死的細胞)(圖13B)。這些結(jié)果指示HAuNS在大于16μgAu/mL的濃度下產(chǎn)生顯著的光熱消除。在5.9Pg/mL的Au濃度(10Pg/mL當量D0X)下，用組合的DOXOPEG-HAuNS和NIR激光處理殺死86.4%的細胞。相比之下，用組合的HAuNS和OTR激光處理殺死僅40.6%的癌細胞(圖13B)。在較低濃度下DOXfflAuNS和D0X@PEG-HAuNS增強的細胞毒性主要起因于在NIR激光照射后釋放的D0X。因此，在較高濃度的DOXfflAuNS和D0X@PEG-HAuNS下，光熱消除和DOX的細胞毒性活性促成癌細胞的殺死。權(quán)利要求1.包含微球體的藥物遞送系統(tǒng)，所述微球體包含多個中空金納米球和藥物產(chǎn)品，其中在NIR照射后，所述藥物產(chǎn)品從所述微球體中釋放。2.權(quán)利要求1的藥物遞送系統(tǒng)，其中所述藥物產(chǎn)品是帶正電或帶負電的，且與所述中空金納米球直接形成復(fù)合物。3.權(quán)利要求1的藥物遞送系統(tǒng)，其中所述微球體由聚合材料制成。4.權(quán)利要求1的藥物遞送系統(tǒng)，其中所述藥物產(chǎn)品是親水或疏水的，并且在聚合基質(zhì)中與所述多個中空金納米球一起摻入所述微球體內(nèi)。5.制備近紅外介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)的方法，其包括在微球體內(nèi)形成疏水性藥物產(chǎn)品和中空金納米球的聚合基質(zhì)的步驟，其中所述中空金納米球定位于內(nèi)部水相內(nèi)，并且所述藥物產(chǎn)品均勻地分散在所述微球體內(nèi)。6.制備近紅外介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)的方法，其包括在微球體內(nèi)形成親水性藥物產(chǎn)品和中空金納米球的聚合基質(zhì)的步驟，其中所述中空金納米球和親水性藥物產(chǎn)品定位于內(nèi)部水相內(nèi)。7.制備近紅外介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)的方法，其包括在微球體內(nèi)形成親水性和疏水性藥物產(chǎn)品和中空金納米球的聚合基質(zhì)的步驟，其中所述中空金納米球和親水性藥物產(chǎn)品定位于內(nèi)部水相內(nèi)，并且所述疏水性藥物產(chǎn)品均勻地分散在所述微球體內(nèi)。8.在用于OTR光介導(dǎo)的釋放的藥物俘獲中有用的聚合微球體，其中所述微球體包括多個中空金球和一種或多種藥物產(chǎn)品，并且所述中空金球和藥物產(chǎn)品裝載在聚合基質(zhì)中。9.對于OTR光介導(dǎo)的釋放有用的HAuNS-藥物復(fù)合物，其中藥物產(chǎn)品通過靜電作用與HAuNS直接復(fù)合。全文摘要包含由聚合材料制成的多個微球體的近紅外介導(dǎo)的藥物遞送系統(tǒng)，每個球包含多個中空金納米球連同藥物產(chǎn)品，其中在NIR照射后，藥物產(chǎn)品從微球體中釋放。文檔編號A61K49/00GK102421418SQ201080020224公開日2012年4月18日申請日期2010年3月9日優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日發(fā)明者李C.,尤J.申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評議會