專利名稱：基于作為細(xì)胞因子活性的活化劑或抑制劑的硫酸化透明質(zhì)酸的新的用于局部應(yīng)用的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
許多年來，科學(xué)/專利文獻(xiàn)已經(jīng)研究和描述了硫酸化透明質(zhì)酸，其以透明質(zhì)酸 (HA)為原料按照現(xiàn)有技術(shù)(EP0940410B1和EP0702699B1)中所述的那樣適宜硫酸化而獲得，抗凝作用歸因于此。HAS還可以通過使HA的葡糖胺脫乙?；?、隨后硫酸化而獲得 (定義為HA-賂)(EP0971961B1)，用于生產(chǎn)手術(shù)物品和藥物組合物。專利EP0754460B1和 EP1385492B1也是已知的，其中描述了 HAS在病理學(xué)情況如ARDS(嚴(yán)重的呼吸功能不全)、 風(fēng)濕關(guān)節(jié)病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的用途。本發(fā)明的目的涉及MS作為細(xì)胞因子活性調(diào)節(jié)劑的新的和出人意料的皮膚應(yīng)用，因?yàn)樯暾埲艘呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了 HAS調(diào)節(jié)特定細(xì)胞因子(促炎和抗炎)的活性的獨(dú)特能力，它已經(jīng)研究了其作用機(jī)制并揭示了兩類硫酸化產(chǎn)品(HAS和HA-NS) 之間的主要差異，但最重要的是，申請人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)了對不同類型和品系的皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水泡性口炎(vesicular stomatitis)病毒的出乎意料高的活性。最后，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及HAS作為具有抗炎和激素性質(zhì)的藥物的皮膚吸收促進(jìn)劑的用途。自1970年以來，科學(xué)家已經(jīng)理解選擇的淋巴樣細(xì)胞群體可以產(chǎn)生不可同化為抗體的蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子并將其釋放入循環(huán)床(circulatory bed)中，其用術(shù)語“細(xì)胞因子” 進(jìn)行定義。它們代表了一類新的能夠作用于身體多個(gè)區(qū)域中不同細(xì)胞靶標(biāo)的“激素”。有關(guān)這些蛋白質(zhì)的合成和生物/生化功能的科學(xué)知識的進(jìn)展已經(jīng)改變了同一科學(xué)世界的免疫系統(tǒng)(I.S.)的“舊”觀點(diǎn)并已經(jīng)開啟了在理解其大量功能方面的新眼界，由此創(chuàng)造了局部和/或全身治療不同病理學(xué)情況的新前途，也包括有關(guān)癌癥免疫療法的新的治療可能性。I. S.的中央細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，它占全部白細(xì)胞的約20%，根據(jù)其不同功能形成了 3組B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和殺傷性淋巴細(xì)胞。許多細(xì)胞因子是淋巴細(xì)胞和/或單核細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)，能夠?qū)蛊渌策h(yuǎn)離其產(chǎn)生部位的細(xì)胞/組織起作用。事實(shí)上它們具有免疫功能，并且就不同I. S.細(xì)胞或在由I. S.引發(fā)的反應(yīng)級聯(lián)中所涉及的靶細(xì)胞而言在其它細(xì)胞因子的合成中還具有調(diào)節(jié)功能。迄今為止已經(jīng)研究了大量不同的細(xì)胞因子，它們還具有大量不同的簡稱，但是申請人所具體研究的那些是白細(xì)胞介素1和2、白細(xì)胞介素6、7和12，下文定義為IL-1、 IL-2、IL-6、IL-7和IL-12，它們和TNF—起被定義為具有炎性性質(zhì)的細(xì)胞因子，而白細(xì)胞介素IO(IL-IO)相反，其為具有強(qiáng)抗炎特性的細(xì)胞因子。所研究的第一種細(xì)胞因子明確地是IL二1:其以兩種形式α和β存在，它是促炎過程(全身和/或皮膚)的有力誘導(dǎo)物。它主要由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在細(xì)菌刺激物或就其它因子、包括其它細(xì)胞因子而言的刺激后產(chǎn)生；它也從外周嗜中性粒細(xì)胞、 內(nèi)皮、上皮和平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚朗格漢斯細(xì)胞、破骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和許多其它類型的細(xì)胞中分泌。這兩種形式均與相同的受體結(jié)合并具有極為類似(如果不等同的話) 的生物活性。其促炎功能的多數(shù)與其它細(xì)胞因子如IL-6和IL-8的刺激相關(guān)，其本身的合成可以由細(xì)胞因子如TNF、干擾素、細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒和不同類型的其它抗原所誘導(dǎo)。它在敗血癥性休克中有涉及，但是還應(yīng)當(dāng)指出近期研究已經(jīng)證明IL-I能夠激活一些癌基因的表達(dá)，因而能夠參與瘤形成的發(fā)病。因此，IL-I與其它細(xì)胞因子聯(lián)合代表了炎性過程的主要介質(zhì)之一它實(shí)際上刺激T-細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和刺激B-細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白。它還在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病的發(fā)病中有涉及實(shí)際上已經(jīng)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或骨關(guān)節(jié)病患者的滑液中發(fā)現(xiàn)了大量IL-1。它還在大量具有普遍皮膚性質(zhì)的病理學(xué)情況如通常的皮炎、特應(yīng)性皮炎和銀屑病中具有活性。最后，它參與血管損害如靜脈血栓形成的建立，并且存在于具有動(dòng)脈/動(dòng)脈硬化(arterioschlerotic)類型病理學(xué)情況的所有血管中。對于該細(xì)胞因子，受體拮抗劑目前已經(jīng)用于臨床(并且還處于實(shí)驗(yàn)中)，因?yàn)樽钄嘣撌荏w被證明是治療其中IL-I是主角之一的這些病理學(xué)情況的有效方式。TNF:壞死因子是促講急件全身炎件期的細(xì)胞因子集合的一部分。因此，TNF在極大量的過程如細(xì)胞增殖、分化和凋亡、癌發(fā)生和病毒復(fù)制中有涉及。它主要由巨噬細(xì)胞和一系列其它細(xì)胞類型、包括肥大細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生。其合成可以由細(xì)菌內(nèi)毒素、其它細(xì)胞因子如IL-2、 干擾素和IL-I刺激并可以被類固醇抑制。通過作用于多種器官和系統(tǒng)(通常與其它細(xì)胞因子一起)，其參與多種發(fā)病過程的建立和調(diào)節(jié)-它調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)和重要細(xì)胞因子如IL-I和IL-6的表達(dá)，由此導(dǎo)致在皮膚病理學(xué)情況如白斑、濕疹、銀屑病和通常的皮炎中有涉及；-它刺激滑膜細(xì)胞中膠原酶的合成，并且由于此原因，已經(jīng)在患有關(guān)節(jié)病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的滑液中發(fā)現(xiàn)了大量TNF ；-它激活破骨細(xì)胞并因此誘導(dǎo)骨重吸收(骨質(zhì)疏松癥)；-它強(qiáng)烈吸引嗜中性粒細(xì)胞并幫助它們將自身附著在內(nèi)皮細(xì)胞上以外滲；-它刺激具有氧化作用的分子的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生；-它在參與形成靜脈血栓形成、動(dòng)脈硬化和脈管炎的發(fā)病的心循環(huán)系統(tǒng)的特定病理學(xué)情況中有涉及。TNF能夠使其自身與在除紅細(xì)胞以外的所有體細(xì)胞中表達(dá)的兩種受體TNF-Rld 型TNF的受體)和TNF-R2 (2型TNF的受體)結(jié)合。簡言之，TNF促進(jìn)全身和皮膚二者的炎性應(yīng)答，由此激發(fā)大量也具有自身免疫性質(zhì)的病理學(xué)情況，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、節(jié)段性回腸炎、銀屑病和哮喘。迄今為止，科學(xué)研究已經(jīng)試圖使抑制TNF合成和/或阻斷其受體的 “生物”藥物(例如單克隆抗體)完美。IL-2 這是一種高度促炎的致動(dòng)脈粥樣化的細(xì)胞因子，主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其合成被類固醇和環(huán)胞菌素抑制。IL-2在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中具有重要作用它實(shí)際上刺激外周白細(xì)胞中的IFN合成并誘導(dǎo)IL-I和TNF產(chǎn)生。IL-2還可以破壞血腦屏障和腦血管內(nèi)皮的完整性，從而引起神經(jīng)精神障礙如定向障礙和抑郁。因此，有大量已經(jīng)與IL-2的異常產(chǎn)生相關(guān)的病理學(xué)情況，例如霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡。IL-6 由許多細(xì)胞類型、尤其是I. S.產(chǎn)生，它與TNF是炎性過程急性期的化學(xué)介質(zhì)集合的最重要成員之一，因此在具有強(qiáng)炎性組分的病理學(xué)情況如哮喘(其中它參與炎性過程的出現(xiàn)和維持)、慢性腸炎(節(jié)段性回腸炎)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病中有涉及。實(shí)際上，正如以前所確定的那樣，細(xì)胞因子如TNF、IL-1和IL-6已經(jīng)證明在變性關(guān)節(jié)性骨關(guān)節(jié)病過程中有高度涉及，因?yàn)樗鼈冊谡{(diào)節(jié)金屬蛋白酶(負(fù)責(zé)軟骨降解)的表達(dá)、前列腺素的產(chǎn)生和破骨活化中起主要作用，并且由于此原因，在患有關(guān)節(jié)病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(R.A.)的患者的滑液中已經(jīng)記錄到了高水平的細(xì)胞因子。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)刺激了上述白細(xì)胞介素的抑制劑和/或受體拮抗劑作為關(guān)節(jié)病病理學(xué)情況的新治療策略的用途。最后，近期研究已經(jīng)將癌癥與壽命相聯(lián)系，并揭示了一些腫瘤是如何受到患者的細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的類型/數(shù)量情況的影響的簡言之，近期證據(jù)已經(jīng)將IL-10的低產(chǎn)生特性和IL-6的高分泌與受腫瘤病理學(xué)情況侵害的患者的臨床存活的惡化聯(lián)系，而能夠產(chǎn)生和維持高水平IL-10的基因型可以有利于存活(Caruso C.等人，Ann N. Y. Acad. SCI.，2004， 1028 :1-13)。ILzZ 主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，它也由胸腺和角質(zhì)形成細(xì)胞分泌。 IL-7誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如IL-l、IL-6和TNF的合成，由此參與一些皮膚疾病(例如銀屑病和皮膚淋巴瘤)和骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)的發(fā)病，實(shí)際上已經(jīng)在患有R.A.的患者中發(fā)現(xiàn)了高水平的 IL-7。IL-12 這種蛋白質(zhì)還在調(diào)節(jié)I. S.功能中起重要作用。實(shí)際上，它對淋巴細(xì)胞的分化起作用，它誘導(dǎo)干擾素和TNF的合成，并且其產(chǎn)生可以被IL-10抑制。該蛋白質(zhì)的過度產(chǎn)生引起了具有自身免疫性質(zhì)的疾病如結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、腦脊髓炎、銀屑病和多發(fā)性硬化的發(fā)病(Brahmachari S.等人，Minerva Med. ,2008,99(2) :105-118)。IL-10 主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，它是具有抗炎性質(zhì)的細(xì)胞因子，能夠抑制由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2和干擾素的合成。IL-10的抗炎作用還通過在用細(xì)菌內(nèi)毒素刺激的巨噬細(xì)胞中抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF合成的能力而顯示出來。IL-10缺乏與諸如糖尿病和慢性腸炎如節(jié)段性回腸炎的病理學(xué)情況相關(guān)。近期研究已經(jīng)使得IL-10還作為治療紅斑狼瘡的新治療手段進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在患有諸如白斑、銀屑病、濕疹和皮炎的病理性情況的患者的皮膚組織中已經(jīng)觀察到低的IL-10水平。應(yīng)當(dāng)指出在用于治療炎癥和器官排斥的常規(guī)免疫抑制治療期間，皮質(zhì)類固醇和環(huán)胞菌素均增加這種白介素的產(chǎn)生和/或從相關(guān)感受態(tài)細(xì)胞中的釋方文(Zhou X.等人，Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders，2005，5 065475)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還已經(jīng)證明了在人滑膜細(xì)胞上其有效減少由TNF 體外所誘導(dǎo)的前列腺素和環(huán)加氧酶的釋放，由此顯示了 IL-10減輕牽涉受骨關(guān)節(jié)性變性 (osteoarthrosic degeneration)影響的關(guān)節(jié)的炎性過程的能力(Alaaeddine N.等人， Arthritis & liheumatism，1999，42 :710-718)。近期研究已經(jīng)證實(shí)了其在支氣管高反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中對哮喘病理學(xué)情況的治療功效，顯示了該細(xì)胞因子是如何在減輕炎癥(其表征哮喘患者的氣道)中具有高治療潛能的，其中已經(jīng)在支氣管清洗液中和/或在血清水平和/或組織水平上發(fā)現(xiàn)了高濃度的1順、11^-1、11^-5、11^-6和IL-8 (Stankiewicz W.等人， Mediators of Inflammation，2002，11 :307-312)。對該白細(xì)胞介素而言，因此已經(jīng)推定了維持免疫自穩(wěn)的調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子的重要作用。哮喘可以是一種使人極度無力的疾病，世界上有大約2億人患有該疾病，其中每年有超過5，000人死亡。它是一種基于I. S.對環(huán)境因素的扭曲應(yīng)答、因而與用于肥大細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞以及I. S.的其它類型細(xì)胞的生長和分化的促炎細(xì)胞因子的加劇產(chǎn)生相關(guān)的
5病理學(xué)情況。這種免疫系統(tǒng)活性失衡的原因仍然無法完全知曉，但是，存在遺傳因素、環(huán)境因素、病毒因素和其它營養(yǎng)因素，它們以不同方式導(dǎo)致該病理學(xué)情況的發(fā)展。因此，發(fā)現(xiàn)一種用于其預(yù)防和/或治療的、允許中止或減少類固醇使用(常規(guī)的治療療法)的有效治療 (全身和/或局部治療)可以代表用于更嚴(yán)重形式(因?yàn)槠錈o論如何將能夠減少類固醇的使用)和較不嚴(yán)重情況(因?yàn)榭梢酝耆兄诡惞檀贾委?的有效解決方案。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是HAS作為細(xì)胞因子活性調(diào)節(jié)劑的新的和出人意料的局部用途，因?yàn)樯暾埲艘呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了其調(diào)節(jié)特定細(xì)胞因子的活性的獨(dú)特能力，它已經(jīng)研究了其作用機(jī)制并揭示了現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中已知的各類硫酸化產(chǎn)品之間的主要差異，但最重要的是，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了對不同類型和品系的皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水泡性口炎病毒的出乎意料的活性。最后，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及HAS作為具有普遍抗炎性質(zhì)的藥物的皮膚吸收促進(jìn)劑、 作為纖維蛋白溶解劑以及作為高度水化劑(hydrating agent)用于所有以干燥、刺激和發(fā)紅、炎癥和脫皮為特征的皮膚病理學(xué)情況的治療療法的用途。按照EP 702699 Bl中所述的方法制備了適于本發(fā)明的目的的硫酸化透明質(zhì)酸 硫酸化以HA為原料通過復(fù)合物S03_吡啶進(jìn)行并涉及多糖鏈中存在的醇羥基，所述HA來自任意來源，例如通過從雞冠花中經(jīng)發(fā)酵或生物技術(shù)而提取，并且具有400-3X 106Da、 特別是 1 X IO4Da-I X IO6Da,甚至更特別是 10，000-50，OOODa, 150，000-250, OOODa 和 500，000-750, OOODa 的分子量。所獲得的衍生物維持了未經(jīng)改變的原料聚合物的所有物理特征，特別是原料HA 的分子量沒有因硫酸化過程而降低，因而使得原料多糖的所有物理化學(xué)特征得以維持。硫酸化涉及二糖單元的各個(gè)羥基，因此能夠通過改變現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中作為已知介紹的so3_吡啶的量來獲得從0. 5至3. 5的不同的硫酸化度(指就每個(gè)二糖單元而言的硫酸基的數(shù)目)。在所有所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中使用的衍生物通常具有的硫酸化度為1或3，在下文中定義為HASl和HAS3。HA的所有游離羧基可以與有機(jī)和/或無機(jī)來源的陽離子成鹽。兩種硫酸化度的HAS均溶于水，它們還可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行滅菌，雖然采用高壓滅菌器的滅菌是優(yōu)選的。申請人:描述和要求保護(hù)了 HAS在制備用于局部應(yīng)用的藥劑中的新用途，所述藥劑 用于預(yù)防和/或治療與免疫缺陷和特別是IL-10缺乏相關(guān)的皮膚病理性情況， 例如白斑、濕疹、銀屑病和通常的皮炎，刺激抗炎細(xì)胞因子的合成； 用于通過吸入來預(yù)防和/或局部治療與IL-I、IL-6和TNF活化相關(guān)的哮喘； 用于預(yù)防和/或治療與血管內(nèi)皮和/或血管壁損害相關(guān)的皮膚病理學(xué)情況和隨后的凝塊和水腫形成，所述血管內(nèi)皮和/或血管壁損害歸因于例如創(chuàng)傷、表面性質(zhì)和/或中等深度的血管出血； 用于預(yù)防和/或皮膚治療與IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12和TNF增加/ 活化相關(guān)的皮膚疾病，例如皮炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、白斑、日光性皮炎、蕁麻疹、所有的皮膚刺激(還包括齒齦的)和濕疹； 用于預(yù)防和/或治療具有自身免疫性質(zhì)的疾病，例如銀屑病、哮喘以及系統(tǒng)性 (LES)和盤狀紅斑狼瘡的皮膚表現(xiàn)；
用于預(yù)防和/或局部治療皮膚瘤形成，例如基底細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚淋巴瘤、蕈樣真菌病(mycosis fungoides)和光化性角化??； 用于預(yù)防和/或局部治療與TNF、IL-I和IL_6活化相關(guān)的血管病理學(xué)情況，例如脈管炎和硬皮??；申請人:實(shí)際上還已經(jīng)在下文所述的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了 · HAS能夠刺激新mRNA的產(chǎn)牛和具有抗炎件質(zhì)的細(xì)胞因子(例如IL-10)的蛋白質(zhì)合成，由此增加了細(xì)胞和因而整個(gè)生物體的免疫防御能力。上述細(xì)胞因子的抗炎作用通過抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF合成的能力而顯示出來，IL_1、IL_6、IL_8、IL-12和 TNF是在各種皮膚病理學(xué)情況中涉及的高度促炎蛋白質(zhì)。 在其中未引起免疫應(yīng)答的情況中和特別是其中細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子級聯(lián)來應(yīng)答的炎性應(yīng)激事件中，HAS在減少新mRNA的合成和顯著減少IL_2、IL_7和IL-12的蛋白質(zhì)合成方面是有效的尤其在這種情況中，所提供的數(shù)據(jù)顯示了 HAS的較高作用?！?HAS有效抑制了 TNF、IL-I和IL-6與其警體的結(jié)合。這些結(jié)果具有基礎(chǔ)重要性，因?yàn)樗鼈冏C明了硫酸化產(chǎn)品的行為與對上述促炎蛋白質(zhì)的受體具有特異性的單克隆抗體的行為完全相似，因此，能夠阻斷它們的功能但同時(shí)不具有這種抗體特異性。這種受體阻斷代表了拮抗TNF、IL-I和IL-6因子的促炎和腫瘤效應(yīng)的最有效方式，從而開啟了臨床實(shí)驗(yàn)的新眼界，考慮到TNF、IL-I和IL-6在大量系統(tǒng)性和皮膚疾病的出現(xiàn)和進(jìn)展中所起的作用，使得能夠?qū)⒅委熀?或預(yù)防極大量病理學(xué)情況的新治療手段變得完美。申請人:還描述和要求保護(hù)了 HAS在制備用于局部應(yīng)用的藥劑中的新用途，所述藥劑 用于預(yù)防和/或治療唇單純性皰疹和生殖器皰疹； 用于預(yù)防和/或治療水泡性口炎病毒； 用于預(yù)防和/或治療巨細(xì)胞病毒。申請人:實(shí)際上已經(jīng)在下文所述的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了 HAS對不同類型病毒的強(qiáng)效抗病
毒作用 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了 HASl和HAS3對1型和2型單純皰疹病毒和對水泡性口炎病毒 (VSV)的抗病毒作用。第一種形式(極其廣泛)負(fù)責(zé)通常影響面部皮膚(唇、鼻孔)的特征性發(fā)熱小囊泡的出現(xiàn)它還稱作唇單純性皰瘡。由唇皰疹引起的感染可以容易地再次出現(xiàn)，因?yàn)椴《驹诩?xì)胞內(nèi)存活并且無法用有效的藥物來確切清除。第二種形式是生殖器感染， 也稱作生殖器皰瘡。兩種形式都通過身體或性接觸而感染。由于病毒體位于神經(jīng)節(jié)中，在神經(jīng)節(jié)中它們可以長期保持休眠，所以皰疹感染具有與免疫系統(tǒng)的應(yīng)激事件對應(yīng)的復(fù)發(fā)特征并且通常在原發(fā)部位再次出現(xiàn)。水泡性口炎病毒是RNA-病毒，它攻擊哺乳動(dòng)物并在實(shí)驗(yàn)室中用于研究RNA-病毒生命周期的發(fā)展。HA-NSl與HASl之間的比較再次顯示并非所有的硫酸化透明質(zhì)酸都是等效的，因?yàn)橐呀?jīng)證明HA-NSl完全沒有活性，而HASl和3均顯示出對單純皰疹和對VSV的非常強(qiáng)的抗病毒活性。所測試的樣品中沒有一者被證明對宿主細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，實(shí)際上，所得的最低細(xì)胞毒性濃度等于在臨床實(shí)踐中通常用于治療皰疹的參比藥物的最低細(xì)胞毒性濃度，并且在平均水平上已經(jīng)證明比在抑制病毒復(fù)制中被揭示具有活性的那些高100倍。 對HASl和HAS3獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)揭示了清楚的和顯著的對巨細(xì)胞病毒的抗病毒結(jié)果這是一種特殊類型的病毒，其進(jìn)入我們生物體的一些類型的細(xì)胞中，在那里它寄生性地自我復(fù)制，導(dǎo)致它們死亡。它與唇皰疹和生殖器皰疹、水痘和傳染性單核細(xì)胞增多屬于同一科。上皮細(xì)胞、粘膜、淋巴結(jié)是多發(fā)性原發(fā)感染的部位。它終生以潛伏態(tài)保留在外周血、腎小管上皮和唾液腺上皮中。在免疫受損的患者(例如受AIDS侵害的那些以及處于免疫抑制療法中的移植患者)中發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重形式。治療療法在于施用藥物如更昔洛韋、纈更昔洛韋和膦甲酸(病毒DNA合成抑制劑)。同樣在這種情況中，已經(jīng)證明HA-NSl在抑制病毒增殖方面是無活性的，由此證實(shí)了兩種類型的硫酸化產(chǎn)品之間抗病毒能力的絕對多樣性。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及HAS作為纖維蛋白溶解劑用于降解纖維蛋白凝塊的用途，纖維蛋白凝塊在毛細(xì)血管和/或小血管的內(nèi)皮和/或壁由于中/小實(shí)體的機(jī)械創(chuàng)傷和 /或出血而破損后在皮膚水平(表面和/或深部)上形成。在下述實(shí)驗(yàn)中，申請人實(shí)際上已經(jīng)證明了 · HAS在凝塊和血栓的纖維蛋白溶解/清創(chuàng)術(shù)中與纖溶酶一樣有效。纖溶酶是一種重要的塵，其屬于能夠降解許多血漿蛋白質(zhì)、特別是血栓和凝塊中的纖維蛋白的水解酶集合。纖維蛋白的降解稱作纖維蛋白溶解。纖溶酶缺乏可導(dǎo)致血栓形成，因?yàn)檠ㄎ醋銐虻亟到?。?yīng)當(dāng)灃意抗凝過稈與纖維蛋白溶解過稈之間的巨大差異在前一種情況中，抗凝劑必須防止凝結(jié)物形成，在后一種情況中，纖維蛋白溶解劑在另一方面必須介入凝結(jié)物已經(jīng)存在并且因此必須降解以使其完全消除的情況。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及HAS作為藥物、例如具有抗炎性質(zhì)的藥物的皮膚吸收促進(jìn)劑以及最后作為高度水化劑用于所有以干燥、苔癬化、刺激、瘙癢和發(fā)紅、炎癥和脫皮為特征的皮膚病理學(xué)情況的治療療法的新用途。申請人:實(shí)際上已經(jīng)證明了 透明質(zhì)酸的硫酸化顯著增加了皮膚吸收，因此，· HAS的水化能力已經(jīng)被證明顯著高于未硫酸化HA的水化能力，因此就HA和局部用對照制劑而言使得經(jīng)處置皮膚表面的粗糙度顯著減輕，由此揭示了其有效治療和保護(hù)以干燥、刺激、苔癬化、瘙癢和發(fā)紅、炎癥和脫皮為特征的皮膚表面以及所有其它使皮膚對外部物質(zhì)更加敏感的皮膚病理學(xué)情況的能力?！?HAS是強(qiáng)有力的和有效的藥物皮膚吸收促進(jìn)劑。HAS如此有效地穿透皮膚厚度的能力是這種令人驚奇的和出人意料的新性質(zhì)得以建立的科學(xué)基礎(chǔ)，這使得能夠?qū)⑵浜芯哂胁煌再|(zhì)的藥理學(xué)物質(zhì)如非類固醇抗炎類型(特別是雙氯芬酸、酮洛芬和布洛芬)或類固醇類型、激素、血管擴(kuò)張劑、膽堿能藥、抗生素等的制劑配制成各種形式，優(yōu)選凝膠劑、 霜?jiǎng)┗蛸N劑，用于皮膚和/或透皮吸收。最后，申請人描述了含有作為唯一活性成分的或與其它藥理學(xué)和/生物學(xué)活性劑如類固醇、激素、蛋白質(zhì)、營養(yǎng)因子、維生素、非類固醇抗炎藥(FANS)如雙氯芬酸、酮洛芬或布洛芬或其鹽、局部用化療藥、抗生素、抗病毒藥、局部麻醉藥、抗凝血藥和/或纖維蛋白溶解劑和/或酶如膠原酶和/或透明質(zhì)酸酶和/或其它蛋白酶聯(lián)合的HAS的各種局部藥物制劑/組合物的制備；其可以用聚合物如透明質(zhì)酸及其衍生物、羧甲基纖維素(CMC)和/或其它天然(例如膠原蛋白)或合成性質(zhì)的聚合物來配制。所述藥物組合物可以配制成軟膏劑、脂質(zhì)體凝膠劑(Iipogel)、水凝膠、唇膏、霜?jiǎng)?、陰道珠和探條、泡沫劑、粘膜凝膠劑、眼用制劑、陰道灌洗液、漱口液、用于皮膚和/或透皮吸收的貼劑(尤其是FANS和激素的)、溶液劑，因此可以通過局部應(yīng)用或通過吸入施用它來治療呼吸系統(tǒng)病理學(xué)情況如哮喘。特別關(guān)注在用于治療皮膚血腫的藥劑的配方中含有酶如透明質(zhì)酸酶的組合物以及含有非類固醇抗炎藥或激素的那些，它們是凝膠劑、霜?jiǎng)┖陀糜谒幬锲つw和/或透皮吸收的貼劑。純粹為了描述和非限制性的目的，提供了 1度和3度HAS的制備和含有其的藥物制劑的一些實(shí)施例以及通過體外實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。實(shí)施例1平均分子量等于200KD(范圍為150, 000至250, OOODa)的誘明質(zhì)酸(HA)的四丁某銨鹽的制各將5. OOg發(fā)酵來源的透明質(zhì)酸鈉鹽O00KD)溶于250ml水中，將所得溶液滲濾通過預(yù)填充有IOOcm3四丁基銨(TBA)形式的Dowex樹脂的玻璃柱。收集HA-TBA鹽的洗脫溶液并冷凍干燥。得到7. 50g產(chǎn)物。實(shí)施例2以平均分子量為200KD和硫等干毎個(gè) 單元3個(gè)硫酸某的HA為原料合成硫酸化HA方法A將10. Og按照實(shí)施例1制備的平均分子量為200KD的透明質(zhì)酸的TBA鹽溶于300ml 二甲亞砜(DMSO)中；將沈· Og復(fù)合物S03_吡啶(三氧化硫和吡啶，下文縮寫為PySO3)分散于150ml DMSO中，然后加入到HA的溶液中。于21°C機(jī)械攪拌20小時(shí)后，通過添加0. 1體積的水中止反應(yīng)；通過在添加2體積乙醇后沉淀分離粗反應(yīng)產(chǎn)物。將所得固體分散于150ml 水中，用NaOH IM使pH呈中性。通過截?cái)嘀禐?2-14，OOODa的膜使混合物中的水徹底透析出。將經(jīng)透析的產(chǎn)物冷凍干燥。得到9. 7g硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元3個(gè)硫酸基的產(chǎn)物 (收率=88% )。方法B將32. Og按照實(shí)施例1制備的平均分子量為200KD的透明質(zhì)酸的TBA鹽溶于900ml N-甲基-吡咯烷酮(NMP)中；將IOOg PySO3分散于600mlNMP中，然后加入到HA的溶液中。 于21 士 1°C機(jī)械攪拌20小時(shí)后，通過添加0. 5體積的水中止反應(yīng)；pH開始低于2. 5，通過添加NaOH(溶液)使pH呈中性。通過添加2. 5體積甲醇沉淀分離反應(yīng)粗產(chǎn)物，用2體積的甲醇/水混合物8/2洗滌。將固體再次溶解，采用截?cái)嘀禐?2-14，OOODa的膜使水徹底透析出。得到30. 4g硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元3個(gè)硫酸基的產(chǎn)物(收率=86% )。實(shí)施例3以平均分子量為200KD和硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元1個(gè)硫酸基的HA為原料合成硫酸化HA采用實(shí)施例1中所述的操作，制備10. Og HA的TBA鹽，將其溶于350mlDMS0中。將 10. Og復(fù)合物PySO3分散于100ml DMSO中，然后加入到HA的溶液中。于21 °C機(jī)械攪拌20小時(shí)后，通過添加0. 1體積的水中止反應(yīng)；通過在添加2. 5體積乙醇后沉淀分離粗反應(yīng)產(chǎn)物。 將所得固體分散于150ml水中，用lmoles/1 NaOH使pH呈中性。通過截?cái)嘀禐?2-14，OOODa的膜使混合物中的水徹底透析出。將經(jīng)透析的產(chǎn)物冷凍干燥。得到7. Mg硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元1. 0個(gè)硫酸基的產(chǎn)物(收率=93% )。實(shí)施例4以具有低分子量(平均MW為IOKD,范圍為5, 000至30, OOODa)和硫酸化度等于每個(gè) 單元3個(gè)硫_某的HA力原料合成硫HA采用實(shí)施例1中所述的操作，制備12. 4g低分子量HA的TBA鹽，將其溶于300ml NMP中。將40g PySO3分散于100ml NMP中，然后加入到HA的溶液中。于21°C機(jī)械攪拌20 小時(shí)后，通過添加0.5體積的水中止反應(yīng)。pH開始低于2. 5，通過添加4M NaOH使pH呈中性。通過添加2.5體積甲醇沉淀分離反應(yīng)粗產(chǎn)物，用2體積的甲醇/水混合物8/2洗滌。將固體再次溶解，采用截?cái)嘀禐?，500Da的膜使水徹底透析出。得到12. Og硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元3. 0個(gè)硫酸基的產(chǎn)物(收率=85% )。實(shí)施例5■棚好影口蘭仆庶軒■ 前標(biāo)1賴醜白句HA力臓☆成細(xì)化HA采用實(shí)施例1中所述的操作，將12. 4g HA的TBA鹽溶于300ml DMSO中。將16. Og PySO3分散于100ml DMSO中，然后加入到HA的溶液中。于21°C機(jī)械攪拌20小時(shí)后，通過添加0. 1體積的水中止反應(yīng)；通過在添加2. 5體積乙醇后沉淀分離反應(yīng)粗產(chǎn)物。將所得固體分散于150ml水中，用lmoles/1 NaOH使pH呈中性。通過截?cái)嘀禐?，500Da的膜使混合物中的水徹底透析出。將經(jīng)透析的產(chǎn)物冷凍干燥。得到9.0 硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元 1. 0個(gè)硫酸基的產(chǎn)物(收率=90% )。實(shí)施例6以分子量為500-730KD和硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元3個(gè)硫酸基的HA為原料合成硫酸化HA將21. Og提取來源的透明質(zhì)酸鈉鹽(500-730KD)溶于1. 5升水中，將所得溶液滲濾通過預(yù)填充有450cm3TBA形式的Dowex樹脂的玻璃柱。收集HA-TBA鹽的洗脫溶液并冷凍干燥。得到32. Og產(chǎn)物，將其溶于1. 35升NMP中；將IOOg PySO3分散于650ml NMP中，然后加入到HA的溶液中。于23士 1°C機(jī)械攪拌20小時(shí)后，通過添加0. 5體積的水中止反應(yīng)。 PH開始低于2. 5，通過添加NaOH(濃度為4moles/l的溶液)使pH呈中性。通過添加2. 5 體積甲醇沉淀分離反應(yīng)粗產(chǎn)物，用3. 5體積的甲醇/水混合物8/2洗滌。將固體再次溶解， 采用截?cái)嘀禐?2-14，OOODa的膜使水徹底透析出。得到30. 3g硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元 3個(gè)硫酸基的產(chǎn)物(收率=83% )。實(shí)施例7以分子量為500-730KD和硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元1個(gè)硫酸基的HA為原料合成硫酸化HA將21. Og提取來源的透明質(zhì)酸鈉鹽(500-730KD)溶于1. 5升水中，將所得溶液滲濾通過預(yù)填充有450cm3TBA形式的Dowex樹脂的玻璃柱。收集HA-TBA鹽的洗脫溶液并冷凍干燥。得到32. Og產(chǎn)物，將其溶于1. 65升NMP中；將40g PySO3分散于350ml NMP中，然后加入到HA的溶液中。于25士 1°C機(jī)械攪拌20小時(shí)后，通過添加0. 5體積的水中止反應(yīng)。 PH開始低于2. 5，通過添加NaOH(濃度為4moles/l的溶液)使pH呈中性。通過添加3. 5體積甲醇沉淀分離反應(yīng)粗產(chǎn)物，用3. 5體積的甲醇/水混合物8/2洗滌。將固體再次溶解， 采用截?cái)嘀禐?2-14，OOODa的膜使水徹底透析出。得到22. 5g硫酸化度等于每個(gè)重復(fù)單元 1. 0個(gè)硫酸基的產(chǎn)物(收率=87% )。實(shí)施例81度和3度HAS對IL-10和IL-12基因表汰的調(diào)節(jié)作用的評價(jià)以20，000個(gè)細(xì)胞/孔的濃度將以前在體外擴(kuò)展并于37°C用含有10% FCS的DMEM 介質(zhì)維持在培養(yǎng)物中的人滑膜細(xì)胞進(jìn)行接種(滑膜細(xì)胞是能夠產(chǎn)生不同類型細(xì)胞因子的細(xì)胞，因此通常用于這種類型的實(shí)驗(yàn)測試)。然后將如實(shí)施例1-3中所述制備的1度硫酸化 HA (HASl)和3度硫酸化HA (HAS3)以0. 1和0. 5mg/ml的濃度(對兩種樣品而言)加入到培養(yǎng)介質(zhì)中，而對照處理通過平均分子量(MW)為200KD的未硫酸化HA表示。處理3天后，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來評價(jià)IL-10和IL-12的基因表達(dá)采用“Trizol ”方法按照供應(yīng)商(TRIZ0L試劑，LIFE Techonologies,GIBCO BRL)的指示提取細(xì)胞RNA。簡言之，通過添加1. Oml Trizol 裂解細(xì)胞，通過測定其在260nm的吸光度對總RNA進(jìn)行定量。采用軟件ft~imer3 (Roche Molecular Diagnostics,Pleasanton,CA,USA)針對每種待擴(kuò)增的基因選擇適當(dāng)?shù)囊?。通過采用 Rotor-gene TM5500 (Corbett research，Sydney，澳大利亞)進(jìn)行的實(shí)時(shí) PCR評價(jià)了基因表達(dá)。采用引物在 300nm 和 SYBR Green (Invitroge, Carlsbad, CA, USA)以在 95°C 15 秒和在60°C 1分鐘后的40個(gè)循環(huán)進(jìn)行了 PCR反應(yīng)。通過軟件自動(dòng)測定了“熒光閾值(Ct) ” 的值，評價(jià)了 92-110%的所研究基因的擴(kuò)增系數(shù)。對每種cDNA樣品而言，基因表達(dá)值以管家基因(即代表對照基因的肌動(dòng)蛋白的基因，因?yàn)樗嬖谟诿總€(gè)細(xì)胞中并且不受HAS 的影響)的ct與所關(guān)注基因(即IL-10和IL-12的基因)的ct的比表示，因此，管家基因 ct/基因ct倌表示在縱坐標(biāo)軸上，其因此表示所研究的基因表達(dá)的mRNA的量。所得結(jié)果顯示在

圖1和2中ai 用HASl和HAS3處理人滑膜細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-10的基因表達(dá)相對于用未硫酸化HA處理的對照而言顯著增加。圖 2 仍然是在本實(shí)驗(yàn)中，HAS的兩種硫酸化度(1度和3度)被證明能夠顯著減少IL-12 的基因表達(dá)，相對于用未硫酸化HA處理的對照而言使其mRNA合成減半。因此，硫酸化透明質(zhì)酸被證明 對以前所述的其中IL-10被證明對疾病(如哮喘、白斑和其中牽涉IL-10的所有炎癥)的解決和/或改善具有基礎(chǔ)重要性的那些病理學(xué)情況而言，能夠刺激用于合成抗炎細(xì)胞因子的新mRNA產(chǎn)生，因而增加細(xì)胞和由此整個(gè)生物體的防御能力。眷有效減少高度促炎細(xì)胞因子IL-12的新mRNA合成，證明是能夠干預(yù)在使人無力的疾病如銀屑病和所有以前描述的那些的發(fā)病中有牽涉的蛋白質(zhì)的表達(dá)的有效抗炎劑。實(shí)施例9TNF與其在單核細(xì)胞系中表達(dá)的受體結(jié)合的抑制不同麗倌的1度和3度HAS的功效評價(jià)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以評價(jià)測試樣品(按照實(shí)施例1-4制得)在抑制TNF與其通過通常在體外用于該類型實(shí)驗(yàn)的I. S.細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的能力方面的功效，該實(shí)驗(yàn)采用碘化細(xì)胞因子組分進(jìn)行以便在放射性配體結(jié)合分析中進(jìn)行評價(jià)。
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如Baglioni C.等人，J Biol Chem，1985，260 :13395-13397 中所述進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)操作。簡言之，使用淋巴瘤U937的人組織細(xì)胞系，其特征是對TNF的細(xì)胞毒活性敏感和表達(dá)其相關(guān)受體的單核細(xì)胞。最初將細(xì)胞與125I-TNFO. 028nM(攜帶在水中)、同時(shí)與待分析樣品(lmg/ml的濃度，該濃度被證明是引起最大抑制的最低濃度)一起在溫育緩沖液中于 4°C溫育3小時(shí)，所述溫育緩沖液由50mM Tris-HCL pH 7. 4,0. 5mM EDTA組成。在溫育結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞與酞酸二丁酯/酞酸二壬酯2/1—起離心，將所得沉淀物在 Y-計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。所得結(jié)果顯示在圖3中所得結(jié)果顯示了對1度和3度二者而言具有中和低麗的HAS在完全(100% )抑制TNF與其受體結(jié)合方面的功效。這些結(jié)果具有基礎(chǔ)重要性，因?yàn)樗鼈冏C明了硫酸化產(chǎn)物的行為與對TNF受體具有特異性的單克隆抗體完全相似，因此能夠阻斷其功能。這種受體阻斷因此代表了拮抗TNF因子的促炎和腫瘤效應(yīng)的最有效方式。實(shí)施例10
_4] 細(xì)胞,因子IL-I在成纖維細(xì)胞,系中表汰的等體結(jié)合的抑制不同MW倌的3度 HAS的功效評價(jià)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以評價(jià)測試樣品(按照實(shí)施例1-3和4制得)在抑制IL-I與其通過通常在體外用于該類型實(shí)驗(yàn)的小鼠3T3細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的能力方面的功效，該實(shí)驗(yàn)采用碘化細(xì)胞因子組分進(jìn)行以便在放射性配體結(jié)合分析中進(jìn)行評價(jià)。如Chin J等人，J Exp Med, 1987，165 :70-86中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。簡言之，使用鼠成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞系，它對IL-I的細(xì)胞毒活性敏感并表達(dá)其相關(guān)受體。最初將細(xì)胞與125I-IL-IlOpM(攜帶在水中)、同時(shí)與待分析樣品(lmg/ml的濃度， 該濃度被證明是引起最大抑制的最低濃度)一起在溫育緩沖液中于37°C溫育2小時(shí)，所述溫育緩沖液由含有20mM HEPESpH 7. 2和BSA的RPMI 1640組成。在溫育結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后溶于2. 5M NaOH中，在Y -計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。所得結(jié)果顯示在圖4中所得結(jié)果顯示了 HAS(具有中和低MW)在以30%抑制IL-I與其受體結(jié)合方面的功效。這些結(jié)果是極其重要的，因?yàn)樗鼈冏C明了硫酸化產(chǎn)物的行為與對所討論細(xì)胞因子的受體具有特異性的單克隆抗體完全相似，因此能夠阻斷其功能。這種受體阻斷代表了拮抗 IL-I的促炎和腫瘤效應(yīng)的最有效方式，如前文所述的那樣。實(shí)施例11細(xì)朐,因子IL-6不同麗倌的3 it HAS
的功效評價(jià)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以評價(jià)測試樣品(按照實(shí)施例1-3和4制得)在抑制IL-6與其在通常在體外用于該類型實(shí)驗(yàn)的人骨髓瘤U266中表達(dá)的受體結(jié)合的能力方面的功效，該實(shí)驗(yàn)采用碘化細(xì)胞因子組分進(jìn)行以便在放射性配體結(jié)合分析中進(jìn)行評價(jià)。如Taga T.等人，J Exp Med, 1987，166 :967-981 中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。簡言之，使用人骨髓瘤U266細(xì)胞系，它對IL-6的細(xì)胞毒活性敏感并表達(dá)其相關(guān)受體。最初將細(xì)胞與125I-IL-60.08nM(攜帶在水中)、同時(shí)與待分析樣品(lmg/ml的濃度，該濃度被證明是引起最大抑制的最低濃度)一起在溫育緩沖液中于4°C溫育16小時(shí)，所述溫育緩沖液由含有25mM HEPESpH 7. 1和10% BSA的RPMI 1640組成。在溫育結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌，于9，OOOrpm離心，將沉淀物在Y -計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。所得結(jié)果顯示在圖5中所得結(jié)果顯示了具有中和低MW的HAS在完全(100%)抑制IL-6與其受體結(jié)合方面的功效。這些結(jié)果因此證明了硫酸化產(chǎn)物的行為在這種情況中也是與對所討論細(xì)胞因子的受體具有特異性的單克隆抗體完全相似的，因此能夠阻斷其功能。這種受體阻斷代表了拮抗IL-6的促炎效應(yīng)的最有效方式。實(shí)施例12在人PBMC中1度和3度HAS對細(xì)胞因子IL_2、IL_7、IL-10和IL-12的蛋白質(zhì)合成的抑制作用評價(jià)對這些實(shí)驗(yàn)而言，采用來自各供體的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)用于評價(jià)HAS對上文所列細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，使用了 -未硫酸化HA (平均 MW :200KD)；-HASl和HAS3 (如實(shí)施例1-3中所述制得)。采用產(chǎn)品Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)并按照供應(yīng)商指示的方案進(jìn)行了 PBMC 分離(BeyumA.，Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl，1968，97 :77-89)。在第 0 天，將100，000個(gè)細(xì)胞在每孔200 μ 1培養(yǎng)基RPMI 1640中鋪板(使用96孔板)，所述培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了 10%胎牛血清、HEPES 10mM、谷氨酰胺2mM、1 %青霉素-鏈霉素100U/ml。 在未經(jīng)處理或用脂多糖LPS (10 μ g/ml)(高度促炎)或用植物凝集素PHA (10 μ g/ml)(能夠刺激淋巴細(xì)胞自身分裂的物質(zhì))刺激的PBMC上評估了所有樣品的作用，上述兩種試劑均能夠刺激細(xì)胞因子合成。將細(xì)胞單獨(dú)地用三種化合物以0. lmg/ml或lmg/ml的濃度處理。于 370C (5% CO2)溫育24小時(shí)后，從各孔取100 μ 1上清液以分析IL-2、IL-7、IL-10和IL-12 的產(chǎn)生。通過技術(shù)、采用Custom Human 9-Plex Array培養(yǎng)板按照供應(yīng)商
在技術(shù)卡片中指示的方案對炎癥介質(zhì)進(jìn)行定量。所得結(jié)果顯示在圖6-9中這些圖清楚地顯示當(dāng)未刺激細(xì)胞時(shí)和當(dāng)與之相反通過特異性的和強(qiáng)有力的炎性因子和/或有絲分裂原刺激它們時(shí)，1度和3度HAS能夠顯著減少IL-2、IL-7和IL-12就單核細(xì)胞而言的合成。因此，HAS被證明是具有精確藥理學(xué)特征的分子，在其中免疫應(yīng)答未受刺激的情況中和特別是其中免疫細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子級聯(lián)進(jìn)行應(yīng)答的炎性應(yīng)激事件中能夠調(diào)控/調(diào)節(jié)具有顯著抗炎活性的細(xì)胞因子的合成，尤其是，在這種情況中，所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示了較強(qiáng)的HAS調(diào)控作用。另一方面，圖9證實(shí)了用于IL-10產(chǎn)生的明顯刺激物也是用于屬于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的。因此，再次證實(shí)HAS能夠調(diào)控細(xì)胞因子合成、刺激抗炎細(xì)胞因子和抑制促炎細(xì)胞因子的合成。實(shí)施例131度和3度HAS相對于HA-NS的抗病毒作用的評價(jià)1型單純皰瘡病毒、2型單純皰瘡病毒、水皰性口炎病毒
通過在來自肌肉/皮膚胚胎組織成纖維細(xì)胞中評價(jià)1型單純皰疹病毒 (HSV-1 :K0S,F和McIntyre品系)和2型單純皰疹病毒(HSV-2 =G, 196和Lyons品系)所導(dǎo)致的致細(xì)胞病性的抑制測定了所測試樣品的活性。而且，相對于受水泡性口炎病毒(水皰性口炎病毒VSV)感染的&SM細(xì)胞再次測試了抗病毒活性。HSV-I是優(yōu)先感染口腔粘膜的病毒，而 HSV-2 攻擊生殖器粘膜。如 Baba M.等人，ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER.，1988， 32 :1742-1745中所述進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)操作。簡言之，使匯合的細(xì)胞培養(yǎng)物在樣品HS-NSl (EP0971961)、如實(shí)施例1_3中所述制備的HASl和HAS3的存在下與感染劑量的上文列出的病毒接觸。于37°C溫育1小時(shí)后，將培養(yǎng)介質(zhì)用僅含有待測試樣品的新鮮介質(zhì)替換。在溫育的第2天測試病毒的致細(xì)胞病性。通過測定“受感染”細(xì)胞中DNA和RNA合成的抑制評價(jià)了病毒致細(xì)胞病原性的抑制的測定，接受如上文所述的處置將細(xì)胞接種在微孔中含有不同濃度的待測試樣品和2. 5 μ Ci 3Η-胸苷和3Η-尿苷/ml的培養(yǎng)基中。于37°C 1 后，將細(xì)胞用三氯乙酸處理，在乙醇中洗滌，放置干燥，在7. 5ml閃爍液中進(jìn)行計(jì)數(shù)。測試樣品的抗病毒活性表示為50%抑制病毒致細(xì)胞病性所需的最低濃度_。而且，還為了評價(jià)測試樣品的細(xì)胞毒性，測定了對所用細(xì)胞導(dǎo)致形態(tài)損害(可用光學(xué)顯微鏡觀察到)所必需的最低濃度。相對于硫酸葡聚糖(DS)和藥物阿昔洛韋(兩種分子均具有已知的抗病毒功效，因此用作陽性對照)進(jìn)行了比較。所得結(jié)果顯示在圖10中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了 HASl和HAS3 二者的強(qiáng)有力的抗病毒作用HA_NS1與HASl之間的比較顯示并非所有的硫酸化透明質(zhì)酸都是等效的，因?yàn)镠A-NSl未被證明具有活性，并且， 這種功效上的差異不依賴于透明質(zhì)酸的分子量或硫酸化度，因此它取決于HA-NSl相對于 HASl的確切結(jié)構(gòu)。實(shí)際上，HAS顯示出與硫酸葡聚糖的功效相等并與用于治療單純皰疹的參比藥物阿昔洛韋的功效相當(dāng)?shù)墓πА６?，?yīng)當(dāng)指出，阿昔洛韋對VSV而言是無活性的， 而1度和3度HAS對VSV具有非常強(qiáng)有力的抗病毒活性。所有測試樣品對宿主細(xì)胞均無細(xì)胞毒性，所得的最低細(xì)胞毒性濃度實(shí)際上等于在臨床實(shí)踐中通常用于治療皰疹的參比藥物的最低細(xì)胞毒性濃度，并且被證明在病毒復(fù)制的抑制中比證明具有活性的那些平均高100倍。巨細(xì)胞病毒通過采用上述方案評價(jià)巨細(xì)胞病毒(CMV :AD-169和Davis品系)測定的致細(xì)胞病性的抑制測定了測試樣品的活性。相對于HEL細(xì)胞(肺胚細(xì)胞)測試了抗病毒活性，其表示為50%抑制上述病毒形成的噬斑數(shù)所需的濃度。所得結(jié)果顯示在圖11中:表格顯示了 HASl和HAS3獲得的清楚和顯著的陽性結(jié)果，這再次證實(shí)它們是有效的抗病毒劑。而且，在這種情況中，HA-NSl未被證明在抑制病毒增殖中具有活性，這證實(shí)了兩種類型的1度硫酸化產(chǎn)物之間在抗病毒能力方面的絕對多樣性。實(shí)施例14具有不同MW倌的酸度為3的HAS的纖維蛋白溶解特性的體外評價(jià)將接受測試的產(chǎn)品的纖維蛋白溶解性質(zhì)的評價(jià)與纖溶酶的已知纖維蛋白溶解活性進(jìn)行比較。具體而言，評價(jià)了纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的溶出速率和可溶性纖維蛋白降解產(chǎn)物 (FDP)的形成。
所用血漿樣品來自無任何進(jìn)行中的藥理學(xué)治療的健康受試者的全血。為了測試接受測試的產(chǎn)品的纖維蛋白溶解功效，將血樣分配入各測試管中，在各測試管中誘導(dǎo)了血塊形成。然后在添加如下物質(zhì)后評價(jià)了 FDP的形成 纖溶酶，作為對照治療 按照實(shí)施例1和2制備的HAS3 按照實(shí)施例4制備的HAS3實(shí)驗(yàn)研究將新鮮取出的血樣分配入各測試管中，各測試管以9 1的比例含有檸檬酸鈉。立即將測試管以3，OOOrpm離心5分鐘。將所得血漿轉(zhuǎn)入新的測試管中，立即用于進(jìn)行FDP評價(jià)。將預(yù)熱至37°C的凝血酶(300mU/ml)加入到血漿樣品中，作為誘導(dǎo)血塊形成的纖維蛋白原的活化劑。將下列成分加入到含有纖維蛋白凝塊的不同比色杯中-纖溶酶溶液0. 5mU、5mU、50mU、500mU 和 IU-濃度為 25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml 和 200mg/ml 的 HAS3 溶液。通過分光光度計(jì)評價(jià)每個(gè)比色杯在405nm的60秒的吸光度變化。使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)
行直至凝塊完全溶解。將凝固的血漿、纖溶酶溶液和HAS3 200KD和HAS3 20KD溶液以1 lv/v的比例混合，于37°C的操作溫度下維持。表1.纖溶酶的纖維蛋白溶解活性表格顯示了在已經(jīng)加入了不同濃度纖溶酶的含有凝固血漿的比色杯中記錄的 mAbs/min均值。所示的值顯示了纖維蛋白凝塊溶解的速率，因而顯示了產(chǎn)生FDI3s的速率。 纖溶酶的纖維蛋白溶解活性與其濃度成正比。隨后將針對每個(gè)纖溶酶濃度記錄的mAbs/min均值對各自的酶單位作圖，以建立將mAbs/min值與酶單位關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)函數(shù)。纖溶酶纖維蛋白溶解活性(mAbs/min)
IU500mU50mU5mU0. 5mU190178126681表2.不同麗值的HAS3的纖維蛋白溶解活性計(jì)算在已經(jīng)加入了不同濃度HAS3的含有凝固血漿的比色杯中記錄的mAbs/min 值。該值顯示了纖維蛋白凝塊溶解的速率，因而顯示了產(chǎn)生FDR的速率。HAS3的纖維蛋白溶解活性與其濃度成正比。在表格中，HAS3的纖維蛋白溶解活性表示為纖溶酶的單位當(dāng)量。HAS3 (200KD)纖維蛋白溶解活性(以mU纖溶酶當(dāng)量表示)
200mg/ml150mg/ml100mg/ml50mg/ml25mg/ml
權(quán)利要求
1.用于局部應(yīng)用來預(yù)防和/或治療炎性/刺激性皮膚疾病如皮炎、特應(yīng)性皮炎、日光性皮炎、蕁麻疹、白斑、濕疹、銀屑病、所有與促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL_7、IL-8、 IL-12和TNF活化相關(guān)的皮膚刺激的硫酸化透明質(zhì)酸。
2.用于局部應(yīng)用來作為水化劑用于以干燥、苔癬化、刺激、瘙癢和發(fā)紅、炎癥和脫皮為特征的皮膚病理學(xué)情況的治療療法的硫酸化透明質(zhì)酸。
3.用于局部應(yīng)用來預(yù)防和/或治療與血管內(nèi)皮和/或血管壁損害相關(guān)的皮膚病理學(xué)情況和用于治療在皮膚水平上形成的纖維蛋白凝塊和血栓的硫酸化透明質(zhì)酸。
4.用于局部應(yīng)用來作為藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性劑的皮膚吸收促進(jìn)劑的硫酸化透明質(zhì)酸。
5.用于局部應(yīng)用來預(yù)防和/或治療唇單純性皰疹和生殖器皰疹、水泡性口炎病毒和巨細(xì)胞病毒的硫酸化透明質(zhì)酸。
6.用于局部應(yīng)用來預(yù)防和/或治療與IL-10的免疫防御缺乏相關(guān)的皮膚病理學(xué)情況如白斑、濕疹、銀屑病和皮炎、刺激抗炎細(xì)胞因子合成的硫酸化透明質(zhì)酸。
7.用于局部應(yīng)用來通過吸入預(yù)防和/或治療與IL-1、IL-6和TNF活化相關(guān)的哮喘的硫酸化透明質(zhì)酸。
8.用于局部應(yīng)用來預(yù)防和/或治療具有自身免疫性質(zhì)的疾病如銀屑病、哮喘以及系統(tǒng)性和盤狀紅斑狼瘡的皮膚表現(xiàn)的硫酸化透明質(zhì)酸。
9.用于局部應(yīng)用來預(yù)防和/或治療皮膚瘤形成的硫酸化透明質(zhì)酸。
10.用于局部應(yīng)用的藥物組合物，其含有可能與藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性劑聯(lián)合的上述權(quán)利要求的硫酸化透明質(zhì)酸。
11.上述權(quán)利要求10的藥物組合物，含有類固醇、激素、蛋白質(zhì)、營養(yǎng)因子、維生素、非類固醇抗炎藥、局部用化療藥、抗生素、抗病毒藥、局部麻醉藥、抗凝血藥和/或纖維蛋白溶解劑、酶和/或其它蛋白酶。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，含有透明質(zhì)酸酶。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，含有聚合物如透明質(zhì)酸及其衍生物、羧甲基纖維素和/ 或天然或合成來源的其它聚合物。
14.權(quán)利要求10-13的藥物組合物，其為軟膏劑、脂質(zhì)體凝膠劑、水凝膠、唇膏、霜?jiǎng)①N劑、陰道珠和探條、泡沫劑、粘膜凝膠劑、眼用制劑、陰道灌洗液、漱口劑、用于局部應(yīng)用或吸入的溶液劑的形式。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，含有作為藥物的皮膚吸收促進(jìn)劑的硫酸化透明質(zhì)酸， 為軟膏劑、脂質(zhì)體凝膠劑、水凝膠、唇膏、霜?jiǎng)?、貼劑、陰道珠和探條、泡沫劑、粘膜凝膠劑、眼用制劑、陰道灌洗液、漱口劑、溶液劑的形式。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，為含有硫酸化透明質(zhì)酸與非類固醇抗炎藥的貼劑形式。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，含有雙氯芬酸。
全文摘要
本發(fā)明的目的涉及硫酸化透明質(zhì)酸(HAS)作為細(xì)胞因子活性(促炎和抗炎)調(diào)節(jié)劑的新的和出人意料的用途以及因此涉及HAS在制備用于局部應(yīng)用來預(yù)防和治療與具有促炎和抗炎性質(zhì)的細(xì)胞因子的活化和/或缺乏相關(guān)的病理學(xué)情況的新藥劑的用途。申請人實(shí)際上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了HAS調(diào)節(jié)這些特定蛋白質(zhì)的活性的獨(dú)特能力，它已經(jīng)研究了其作用機(jī)制并證明了現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中已知的不同硫酸化類型之間的主要差異，但最重要的是，它已經(jīng)證明了HAS對不同類型和品系的皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水泡性口炎病毒的出乎意料高的活性。最后，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及HAS作為具有抗炎性質(zhì)的藥物的皮膚吸收促進(jìn)劑的用途。
文檔編號A61K45/06GK102427808SQ201080020708
公開日2012年4月25日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者G·蓋恩納里, M·戴斯特 申請人:菲迪雅制藥股份公司