專利名稱：用于治療心臟疾病的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過將藥物組合物遞送至有需要的個體而治療心臟疾病或疾患傾向。 具體地，公開了包含定向產生心臟組織的細胞和至少一種藥學上可接受賦形劑的藥物組合物，所述藥物組合物以允許細胞存活和運輸至世界各地、方便人員操作以遞送給接受者的方式包含在容器中，其中所述細胞根據國際認可的藥品生產標準制備。
背景技術：
再生細胞療法對于其中器官以需要組織重構以例如恢復形態(tài)以及患病器官功能的方式受損的疾病或者當生理修復機制受損時特別相關。心臟是末端分化器官，并且在例如心臟疾病發(fā)作中心肌細胞的大量損傷導致不可逆的損傷，因此需要修復。此外，心臟疾病是世界范圍死亡率的首要原因。心臟修復的細胞療法是極其重要的挑戰(zhàn)。細胞療法的臨床經驗基于以未改變狀態(tài)遞送的成體干細胞。第一代生物制劑是天然的人干細胞，人干細胞被鑒定為容易獲得的細胞型。已經顯示，一些個體在遞送了天然人干細胞時得到改善。人類心臟的天然細胞移植領域的技術水平特別描述于Abdel-LatifA. 等.iAdult bone marrow-derived cells for cardiac repair :a systematic review and meta-analysis.，Arch Intern Med. (2007) 167 :989-997 的綜述及其中參考文獻。在希望改善臨床結果的過程中，開發(fā)了第二代干細胞療法的概念，包括在遞送給患者之前提高天然干細胞的生心潛能。為了探索提高細胞生心潛能的方式，基礎研究首先使用小鼠胚胎干細胞(下文稱 SmESC)來闡釋心臟分化期間涉及的復雜的信號傳導通路。該研究導致生心物質的鑒定， 所述生心物質與細胞接觸時改善所述細胞分化成心臟修復細胞的能力。心臟修復細胞是中間細胞表型，其中細胞定向產生心臟組織但還沒有完全分化。心臟再生領域基礎研究的關鍵里程碑公開于Behfar 等.'Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny', Nature Clin. Pract. , Cardiovasc. Med. (2006)3 S78-S82,Behfar等·，iCardiopoietic programming of embryonic cells for tumor-free repairs', J. Exp. Med. (2007) 204 :405-420,以及WO 2006/015127, US 2008/0019944 和 WO 2009/151907,全部授予 Mayo Foundation for Medical Education and Research, Terzic A.禾口 Behfar A。上述作者、申請人和發(fā)明人顯示，mESC分化成定向產生心臟組織的細胞可以在 mESC與所謂生心物質的‘混合物’接觸培養(yǎng)時啟動，所述生心物質的‘混合物’即在溶液中含有生心因子的組合物。如W02006/015127中公開的，當mESC衍生的心臟修復細胞被遞送入慢性梗死鼠心臟時，可以實現心臟修復。因此，已知mESC衍生的心臟修復細胞可以顯示再生心臟組織的益處。然而，與ESC相關的腫瘤發(fā)生風險提出了將這些基礎發(fā)現用于治療用途的安全性問題。而且，在實驗室環(huán)境下在小鼠中進行實驗，使用從懸浮于實驗管培養(yǎng)基的培養(yǎng)物收集并隨后在相同設備中迅速使用的mESC衍生的心臟修復細胞。據信，成體干細胞療法沒有腫瘤發(fā)生風險。沒有記載腫瘤發(fā)生風險并合適衍生為心臟修復細胞的干細胞源的鑒定描述于Behfar等.‘Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yieldsprogeny', Nature Clinical Practice, Cardiovascular Medicine (2006) 3 :S78_S82。US2008/0019944 描述了從心臟修復細胞獲得的心臟修復細胞。作者、申請人和發(fā)明人還公開了可以使用生心因子的混合物實現人成體間充質干細胞分化成心臟修復細胞(W0 2009/151907)。人類心臟細胞移植領域的技術水平特別描述于Abdel-Latif A.等.‘Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair -.a systematic review and meta-analysis.，Arch Intern Med. (2007) 167 :989_997 的綜述及其中參考文獻。在Behfar 等· 'Guided stem cell cardiopoietic :Discovery and translation'J. Mol. and Cell. Cardiology (2008)45 523-529的另一綜述中，也公開了使用心臟修復細胞進行心臟再生的概念。從實驗室到醫(yī)院的轉移通常是制藥工業(yè)的挑戰(zhàn)。在這種情況下，該挑戰(zhàn)特別難克服，這是因為定向產生心臟組織的細胞的生物學特征以及當個體不在生產場所附近場所時絕對需要維持這些特征直到遞送給個體。本發(fā)明通過以下公開解決了該問題根據國際認可的藥品生產標準工業(yè)生產包含定向產生心臟組織的細胞和至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物的方法，允許不同用途同時維持定向產生心臟組織的細胞的特征、其存活、運輸至世界各地、方便人員操作以遞送給接受者的細胞保持和包裝方法。定義在本發(fā)明范圍內并且除非指明相反，以下引號內指定的術語具有以下定義。‘BMMSC’指骨髓間充質干細胞?！甴BMMSC’指人來源的此類BMMSC?！呐K修復細胞’是中間細胞表型，即，定向產生心臟組織但未完全分化。心臟修復細胞特征在于Nkx2. 5和MEF2C的核轉移，以及肌節(jié)蛋白的缺乏(Behfar等.‘Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yields progeny', Nature Clin. Pract.，Cardiovasc. Med. (2006) 3 :S78_S82)。心臟修復細胞保留增殖能力。心臟修復細胞可以衍生自干細胞，包括例如人成體間充質干細胞、人胚胎干細胞(條件是其產生不引起人胚胎破壞)、胚胎樣干細胞、可誘導的多能干細胞或任何其他獲得性來源。‘生心混合物(cardiogenic cocktail)，或‘混合物(cocktail)，指含有至少兩種生心物質的組合物?！奈镔|(cardiogenic substance) ’是與細胞接觸時提高所述細胞分化成心臟修復細胞的能力的物質?！畢R合’指其中細胞在一定空間量內生長至最大容量的狀態(tài)。此時，與其他細胞的接觸導致它們抑制生長?！行Я俊硎咀阋蕴峁╊A期治療或生理效應或結果的量。這種效應或結果包括心臟組織的修復、維持、再生、增大、或心臟功能的改善。不期望的效應有時與期望的治療效應一起顯現；因此，專業(yè)人員在確定合適的‘有效量’時權衡潛在的益處和潛在的風險。該量可以在受試者之間變化，取決于例如受試者年齡、健康狀況、天生和后天差異等以及施用方式。因此，不可能指定確切的‘有效量’。然而，在任何個體情況下合適的‘有效量’可以由本領域普通技術人員在藥物組合物施用程序之前或期間確定，例如通過在藥物組合物的遞送期間遞送無不期望效應的最高可能量?！x形劑’是用作藥物活性成分載體的無活性物質。在許多情況下，“活性"物質可能不容易施用和被人體吸收；在這種情況下，關注的物質可以溶解入賦形劑或與賦形劑混合。除了其以單劑量使用外，賦形劑可用于生產過程以幫助操作關注的活性物質。根據施用途徑和藥物形式，可以使用不同的賦形劑。為了穩(wěn)定活性成分，添加賦形劑，保證活性成分保持"活性"，并且重要的是，穩(wěn)定足夠長的時間，使得產品貯存期限與其他產品相當?！鲋衬芰Α冈诒疚募秶鷥燃毎麛的康脑黾?。‘存活力’在本文件范圍內表示不吸收臺盼藍染料、從而說明細胞膜完整性的細胞特征。術語‘受試者’、‘接受者’和‘患者’在本文可互換使用并且除非明確說明，否則指需要用本文公開的藥物組合物治療心臟疾病或疾患的任何人或哺乳動物。受試者還包括有風險患者這種心臟疾病或疾患的那些。除非上下文另外明確指明，本說明書使用的單數形式‘一個’、‘一種’和‘該’包括復數方面。因此，例如，提及‘一個干細胞’包括單個細胞，也包括兩個或多個細胞；提及‘一種物質’或‘一種試劑’包括單一物質或試劑，也包括兩種或多種物質或試劑；提及‘該本發(fā)明’或‘一個發(fā)明’包括一個方面的單個方面或多個方面；依此類推。除非另外定義，本文使用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。盡管與本文描述的那些類似或等同的方法和材料可以用于實施或測試本發(fā)明，但下文描述了合適的方法和材料。發(fā)明_既述在以下詳細描述中，提供了許多細節(jié)以提供對要求保護的本主題的全面理解。然而，本領域技術人員會理解，要求保護的主題的實施可以無這些具體細節(jié)。在其他情況下， 公知的方法、程序、組分等未詳細描述以清晰要求保護的主題。本發(fā)明涉及包含定向產生心臟組織的細胞和至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。定向產生心臟組織的細胞優(yōu)選根據國際認可的藥品生產標準來產生。更優(yōu)選地，所述藥學上可接受的賦形劑是保存液。優(yōu)選地，所述保存液選自包括以下的組允許在-196°C至0°C的溫度下深低溫保藏的保存液和允許在0°C至+40°C的溫度下保存的保存液。優(yōu)選地，所述保存液是可以含有離子、PH緩沖劑、抗?jié)B透劑(impermeant)、膠體和代謝物、二甲基亞砜(DMSO)、甘油、蔗糖、血清白蛋白、海藻糖或其任意組合的保存液。優(yōu)選地，離子選自由以下組成的組Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cr和所述離子的組合。優(yōu)選地，pH緩沖劑選自由以下組成的組H2P04-、HC03-、(4-(2-羥乙基)-l-哌嗪乙磺酸)(HEPES)及其混合物。優(yōu)選地，抗?jié)B透劑選自由以下組成的組乳糖醛酸鹽、蔗糖、甘露醇、葡萄糖及其組合。優(yōu)選地，膠體是葡聚糖-40。優(yōu)選地，代謝物選自由以下組成的組腺苷、谷胱甘肽及其組合。優(yōu)選地， 所述至少一種藥學上可接受的賦形劑還包括選自由以下組成的組的至少一種成分生長因子、細胞因子、參與器官發(fā)生信號傳導的蛋白、藥物、血小板溶胞產物、血清、同位素、體內示蹤細胞的工具、稀釋劑、潤滑劑、基質或支架材料及其組合。優(yōu)選地，定向產生心臟組織的細胞可以是干細胞，或者定向產生心臟組織的細胞衍生自干細胞。優(yōu)選地，干細胞選自由以下組成的組成體干細胞、胚胎干細胞、誘導的多能干細胞(IPS)、骨髓分離的成體多譜系可誘導細胞(MIAMI)、心臟自身干細胞、植物干細胞 (vegetal stem cell)或其任意組合。優(yōu)選地，干細胞是從選自由以下組成的組的合適組織源收獲的間充質干細胞骨髓、脂肪組織、臍帶血、羊水、月經液、血液。優(yōu)選地，定向產生心臟組織的細胞是哺乳動物細胞。優(yōu)選地，哺乳動物細胞選自由以下組成的組人、貓、狗、 豬、馬、小鼠、大鼠、倉鼠和其他哺乳動物。優(yōu)選地，所述細胞是自體細胞、同種異體細胞、異種細胞或其任意組合。優(yōu)選地，定向產生心臟組織的細胞是心臟修復細胞。優(yōu)選地，心臟修復細胞可以衍生自人成體間充質干細胞、人胚胎干細胞(條件是其產生不引起人胚胎破壞)、胚胎樣干細胞、可誘導的多能干細胞、心臟自身干細胞或任何其他獲得性來源或其組合。優(yōu)選地，所述組合物不含可檢測的非心臟修復細胞，所述非心臟修復細胞包括但不限于心肌細胞、造血細胞、內皮祖細胞、成脂肪細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、成骨細胞骨細胞、成神經細胞和神經細胞。優(yōu)選地，總的非心臟修復細胞含量是總細胞數的 0%至50%，優(yōu)選是總細胞數的0%至15%。優(yōu)選地，每個類別的非心臟修復細胞的含量是總細胞數的0%至50%，優(yōu)選是總細胞數的0%至15%。本發(fā)明還涉及用于治療缺血性心肌病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、非局部缺血起源的心衰竭、局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其組合的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于生產藥物組合物的方法，所述方法包括以下步驟獲得可以衍生定向產生心臟組織的細胞的細胞；在允許獲得定向產生心臟組織的細胞的條件下培養(yǎng)所述細胞；收獲所述定向細胞；向所述定向細胞添加至少一種藥學上可接受的賦形劑。優(yōu)選地，本發(fā)明方法根據國際認可的藥品生產標準來進行，所述方法包括在所述方法的任何步驟取樣，以進行質量控制操作。最優(yōu)選地，本發(fā)明方法根據國際認可的藥品生產標準來進行，所述方法包括在細胞培養(yǎng)的最后一步取樣，以進行活性物質的質量控制。優(yōu)選地，活性物質的質量控制標準包括選自由以下組成的組的至少一種檢驗鑒定檢驗、均一性檢驗、純度檢驗及其組合。優(yōu)選地，當定向產生心臟組織的細胞是心臟修復細胞時，所述心臟修復細胞的鑒定對應于由以下組成的組中至少一種基因表達水平的觀察到的增力口 :Nkx2. 5, Tbx5, MEF2C, GATA4, GATA6, MespU FOGU F0G2, Flkl 及其同系物。優(yōu)選地，基因表達的增加通過qPCR方法測定與參照相比是至少2倍。優(yōu)選地，當定向產生心臟組織的細胞是心臟修復細胞時，所述心臟修復細胞的鑒定被認為滿足與參照相比由以下組成的組中至少一種多肽物類的觀察到的存在Nkx2. 5、Tbx5、MEF2C、GATA4、GATA6、MespU FOGU F0G2、Flkl及其同系物，并且Nkx2. 5或MEF2C或兩者進一步轉移至心臟修復細胞的細胞核。優(yōu)選地，所述觀察到的存在通過用由以下組成的組的至少一種抗體免疫標記來顯示抗 Nkx2. 5、抗 Tbx5、抗 MEF2C、抗 GATA4、抗 GATA6、抗 Mespl、抗 F0G1、抗 F0G2、抗 Flkl 及其同系物。優(yōu)選地，當給定樣品中至少50%是心臟修復細胞時，滿足均一性。優(yōu)選地，當給定樣品中至少50%、優(yōu)選至少80%是心臟修復細胞時，滿足均一性。優(yōu)選地，收獲細胞中間
10充質干細胞的存在通過以下顯示用針對選自由⑶105、⑶90、⑶133、⑶105、⑶166丄擬9和 ⑶44組成的組的表面標記的抗體陽性免疫標記，和用針對選自由⑶14、⑶34和⑶45組成的組的表面標記的抗體無可檢測的免疫標記。優(yōu)選地，與參照相比CD34、FABP4、骨鈣蛋白、 巢蛋白、Sox9和MYH7基因及其同系物表達水平增加兩倍或更多時純度不符合要求。優(yōu)選地，與參照相比基因表達的所述增加通過qPCR方法測定。優(yōu)選地，通過免疫標記顯示增加的非心臟修復細胞數目時純度不符合要求，所述非心臟修復細胞包括但不限于心肌細胞、 造血細胞、內皮祖細胞、成脂肪細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、成骨細胞骨細胞、成神經細胞和神經細胞。優(yōu)選地，所述參照由非心臟修復細胞組成。優(yōu)選地，所述參照由在缺乏任何生心物質時培養(yǎng)的細胞組成。優(yōu)選地，培養(yǎng)條件包括使用生物反應器，包括固定或包封所述細胞至顆?；蚧|上并使細胞培養(yǎng)基穿過顆粒或基質床。本發(fā)明還涉及用于治療心臟疾病或疾患傾向的方法，其中藥物以有效量遞送給個體。優(yōu)選地，所述個體顯示心血管系統的不足。優(yōu)選地，所述個體罹患缺血性心肌病、心肌梗死、局部缺血起源的心衰竭或非局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其組合。優(yōu)選地，所述藥物組合物使用選自由以下組成的組的施用途徑遞送心肌內、心臟內、冠狀血管內、肌肉內、皮下、腹腔內、子宮內、胃腸外或全身。優(yōu)選地，所述藥物組合物使用導管、注射器或其組合心肌內遞送。可以衍生定向產生心臟組織的細胞的細胞可以至少一種生心物質接觸，所述生心物質可以選自由以下組成的組TGF-3 1、TGF-β 2, TNF-α、BMP-U ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-6、 FGF-2、FGF-4、FGF-5、FGF-12, FGF-13, FGF-15, FGF-20、白血病抑制因子(LIF)、VEGF-A, VEGF-C、胰島素樣生長因子1 (IGF-I)、白介素6 (IL-6)、活化素Α、α凝血酶、視黃酸、心肌營養(yǎng)蛋白l、cardiogenol C及其組合?？梢允褂迷S多生心混合物。以下列表不是限制性的?？梢允褂美缟奈镔|的混合物，所述生心物質的混合物包括TGFii -1、ΒΜΡ-4、α -凝血酶、選自由心肌營養(yǎng)蛋白和 IL-6組成的組的化合物、和選自由Cardiogenol C和視黃酸組成的組的化合物。另一種混合物可以包括TGF0-1、ΒΜΡ-4、α-凝血酶、心肌營養(yǎng)蛋白和Cardiogenol C。另一種混合物可以包括選自由以下組成的組的至少一種化合物FGF-2、IGF-1、活化素-A、TNF-α、 FGF-4、LIF、VEGF-A及其組合。它們還可以包括FGF-2、IGF-I和活化素-A。其他優(yōu)選的混合物包括活化素-A、FGF-2、IL-6、IGF-I和視黃酸。其他混合物可以缺乏選自由TNF-α、 FGF-4、LIF和VEGF-A組成的組的至少一種化合物。當以下化合物存在于混合物中時，其可以1至5ng所述TGF β -1/ml、1至IOng所述 BMP4/ml、0. 5至5ng所述心肌營養(yǎng)蛋白/ml、0. 5至5單位所述α -凝血酶/ml、50至500nM 所述 Cardiogenol C/ml、l 至 IOng 所述 FGF-2/ml、10 至 IOOng 所述 IGF-1/ml、1 至 50ng 所述活化素-A/ml、1 至 50ng 所述 TNF- α /ml、1 至 20ng 所述 FGF-4/ml、10 至 IOOng 所述 IL-6/ ml、1至10單位所述LIF/ml、1至50ng所述VEGF_A/ml、0. 1至1. O μ M所述視黃酸/ml的量存在。特定的混合物類型包括以組合方式使用的重組TGFii-I (2. 5ng/ml)、BMP4(5ng/ ml)、心肌營養(yǎng)蛋白(lng/ml) Xardiogenol C(IOOnM)。特別優(yōu)選的混合物包括此類化合物， 并且還包括 α -凝血酶、(lU/ml)、FGF-2(10ng/ml)、IGF-I (50ng/ml)和活化素-A (5ng/ml)。其他優(yōu)選的混合物包括以組合方式使用的重組TGFii-I (2. 5ng/ml)、BMP4(5ng/ml)、活化素-A (5ng/ml)、FGF-2 (10ng/ml)、IL-6 (100ng/ml)、因子-IIa (h α -凝血酶、IU/ ml)、IGF-I (50ng/ml)和視黃酸(1 μ Μ)。混合物可以在介質中稀釋，所述介質包含選自由胎牛血清、人血清、血小板溶胞產物、血小板衍生的生長因子及其混合物組成的組的化合物和選擇的化合物。本發(fā)明還涉及用于施用藥物組合物的試劑盒，所述試劑盒包括含有所述藥物組合物的容器。優(yōu)選地，所述容器是允許細胞存活和世界范圍內運輸、方便護理人員操作以遞送給接受者的生物相容性容器。優(yōu)選地，所述容器是密閉的。優(yōu)選地，所述容器與賦形劑和保存條件相容。優(yōu)選地，所述容器是密閉的玻璃容器。優(yōu)選地，所述容器具有可刺穿的隔膜帽。 優(yōu)選地，所述可刺穿的隔膜帽允許包括Iuer激活閥的管形瓶接頭從所述容器抽取液體。優(yōu)選地，所述可刺穿的隔膜帽可以用針頭進入。優(yōu)選地，所述藥物組合物貯存在合適深低溫保藏的密閉容器中。優(yōu)選地，所述容器中藥物組合物的貯存期限是至少48小時。優(yōu)選72小時。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括至少一個導管。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括至少一個注射器。附圖簡述

圖1顯示左心室(LV)舒張末期容量(LVEDV，圖Α)、左心室收縮末期容量(LVESV， 圖B)和左心室射血分數(LVEF，圖C)，其在基線和之后6個月在受試者中測量，受試者被隨機分成對照組(n = 8)和治療組(n = 9)。結果根據基線標準化。發(fā)明詳述
實施例生產起始已經從患者髂嵴收獲并滿足最低質量標準的人骨髓樣品在37°C /5% CO2培養(yǎng)箱中175-cm2燒瓶中培養(yǎng)以純化BMMSC。最低質量標準包括供體的陰性血清學檢測 (至少HIV 1/2、梅毒、HBV、HCV)、收集地點和生產地點之間的骨髓運輸溫度控制、總體積、 記錄血塊的存在和體積、和細菌污染的缺乏。M小時之后，從燒瓶小心去除骨髓和細胞碎片。附著的BMMSC用磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ洗滌，添加培養(yǎng)基，重新開始培養(yǎng)，直至初始傳代P0，每4至6天更換培養(yǎng)基。PO-從集落初始擴增為細胞層進行初始傳代(PO)以離解集落并使它們擴增并形成單層。細胞以1 1的比例接種于175-cm2燒瓶并允許擴增并形成單層，持續(xù)6天。匯合決定下一次傳代的時間。如果BMMSC自發(fā)形成單層而無可檢測的集落，則該步驟可以被跳過。該過程以類似傳代繼續(xù)，編號‘P0’，隨后連續(xù)字母，直至獲得最少50xl06個細胞。確定諸如接種細胞密度和匯合觸發(fā)的傳代等參數。決定應該用于接種以優(yōu)化產量并避免接觸抑制的容器大小的是傳代獲得的細胞數目。PO期的過程中控制測試包括細胞數目和百分比存活。Pl-生心混合物處理的開始細胞在培養(yǎng)基和生心混合物中培養(yǎng)5天。例如， 可以使用諸如描述于以下的生心混合物W02006/015127、W02009/151907和Behfar 等.'Derivation of a cardiopoietic population from human mesenchymal stem yieldsprogeny', Nature Clinical Practice, Cardiovascular Medicine, March 2006 vol. 3 supplement 1,第 S78-S82 頁)。P2-生心混合物處理的結束除去含有生心混合物的培養(yǎng)基?，F在，培養(yǎng)物中含有心臟修復細胞。培養(yǎng)物被傳代并接種于含有培養(yǎng)基的新容器以允許需要的額外擴增期。
P3-擴增和收獲接下來的傳代編號為‘P3’，隨后是連續(xù)字母。細胞在達到最佳匯合時傳代，并重復直至獲得細胞數目為600xl06至1200xl06個細胞。當符合該標準時，收獲細胞。該步驟涉及最終的胰蛋白酶消化，隨后洗滌和離心濃縮步驟。最后洗滌在細胞保存液中進行。合適地，采用的保存液可以類似于標準器官和生物組織保存的冷貯存水溶液，例如 BioLife Solutions(Bothell, Wash)的 HypoThermosol-FRS 。然后將細胞濃縮物轉移至生物相容性容器(本實施例中是I型玻璃瓶，Ph. Eur.)， 添加保存液，達到IOml的總體積和60xl06至120xl06細胞/ml范圍的細胞濃度。這時結束藥物組合物的生產。藥物組合物釋放標準通常包括細胞密度、均一度和純度，它們與確認不存在外來污染的生產參數(無菌、低水平內毒素、和過程中未增加支原體)相結合。值得注意的是，不對本發(fā)明有任何偏見，可以考慮生產心臟修復細胞的其他方法來替代生心物質的使用。本實施例中，保存介質是來自BioLifeSolutions (Bothel 1，Wash)的 HypoThermosol-FRS ο HypoThermosol-FRS 含有離子(IOOmM Na\42. 5mM K\0. 05mM Ca2+、 5mM Mg2\l7. ImM CF) ；pH 緩沖劑(10mMH2P0—、5mM HC03\25mM HEPES)；抵抗細胞溶脹的抗?jié)B透劑(IOOmM乳糖醛酸鹽、20mM蔗糖、20mM甘露醇)；膠體(6%葡聚糖-40)；和代謝物 (5mM葡萄糖、2mM腺苷、3mM谷胱甘肽)。藥物組合物的保存可以根據本發(fā)明通過在二甲基亞砜(DMSO)中深低溫保藏來實現。這提供了允許甚至更長貯存期限(一周或更長)的優(yōu)點，條件是在干冰上運輸、適當控制運輸溫度。根據其中賦形劑是HypoThermosol-FRS的本發(fā)明藥物組合物的實施方案，容器中藥品的貯存期限是至少72小時。特別值得注意的是發(fā)現，總數1200xl06的細胞具有約8毫升的體積，而心肌內注射的期望最大體積是約10毫升。這意味著HypoThermosol-FRS的量相對于細胞體積而言是小的，并且將在僅幾毫升的范圍內。已經令人驚訝地發(fā)現，即使小量的HypoThermosol-FRS也足以維持藥物組合物這種重要的72小時貯存期限。這提供了足以確認所有要滿足的釋放標準、將藥物組合物運輸至世界任何地方和將它遞送給接受者的時間。藥物組合物釋放標準-鑒定心臟修復細胞特征在于幾種早期心臟分化標志物的陽性表達和適用的核轉移，所述標志物包括Nkx2. 5、MEF2C和GATA-4。通過實時定量 RT-PCR(qPCR)測量的MEF2C和/或Tbx5表達水平與參照標準相比至少2倍增加及其在貯存期限期間的維持代表藥物組合物中含有的心臟修復細胞的陽性鑒定。在該優(yōu)選實施方案中，以下表1、表2和表3顯示早期心臟分化標志物的表達被維持直至藥物組合物貯存于其最終容器后14天，并且這種細胞的存活和增殖維持至少5天。 這說明了本文描述的生產方法的獨特能力，以獲得并維持暴露于生心物質的處于適合其預期用途狀態(tài)的細胞的鑒定。表1 100百萬總存活細胞/ml的鑒定(qPCR)。
權利要求
1.一種藥物組合物，包含定向產生心臟組織的細胞和至少一種藥學上可接受的賦形劑。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述定向產生心臟組織的細胞根據國際認可的藥品生產標準來制備。
3.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述至少一種藥學上可接受的賦形劑是保存液。
4.根據權利要求3所述的藥物組合物，其中所述保存液選自包括以下的組允許在-196°C至0°C的溫度下深低溫保藏的保存液和允許在0°C至+40°C的溫度下保存的保存液。
5.根據權利要求3和4中任一項所述的藥物組合物，其中所述保存液是可以含有離子、 PH緩沖劑、抗?jié)B透劑、膠體和代謝物、二甲基亞砜(DMSO)、甘油、蔗糖、血清白蛋白、海藻糖或其任意組合的保存液。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述離子選自由以下組成的組Na+、K+、 Ca2+、Mg2+、Cl—和所述離子的組合。
7.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述pH緩沖劑選自由以下組成的組 H2P04-、HC03-、(4-(2"羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)及其混合物。
8.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述抗?jié)B透劑選自由以下組成的組乳糖醛酸鹽、蔗糖、甘露醇、葡萄糖及其組合。
9.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述膠體是葡聚糖-40。
10.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中所述代謝物選自由以下組成的組腺苷、 谷胱甘肽及其組合。
11.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述至少一種藥學上可接受的賦形劑包括選自由以下組成的組的至少一種成分生長因子、細胞因子、參與器官發(fā)生信號傳導的蛋白、藥物、血小板溶胞產物、血清、同位素、體內示蹤細胞的工具、稀釋劑、潤滑劑、基質或支架材料及其組合。
12.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述定向產生心臟組織的細胞是干細胞。
13.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述定向產生心臟組織的細胞衍生自干細胞。
14.根據權利要求12或13所述的藥物組合物，其中所述干細胞選自由以下組成的組 成體干細胞、胚胎干細胞、誘導的多能干細胞(IPS)、骨髓分離的成體多譜系可誘導細胞 (MIAMI)、心臟自身干細胞、植物干細胞或其任意組合。
15.根據權利要求14所述的藥物組合物，其中所述干細胞是從選自由以下組成的組的合適組織源收獲的間充質干細胞骨髓、脂肪組織、臍帶血、羊水、月經液、血液。
16.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述定向產生心臟組織的細胞是哺乳動物細胞。
17.根據權利要求16所述的藥物組合物，其中所述哺乳動物細胞選自由以下組成的組人、貓、狗、豬、馬、小鼠、大鼠、倉鼠和其他哺乳動物。
18.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述細胞是自體細胞、同種異體細胞、異種細胞或其任意組合。
19.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其中所述定向產生心臟組織的細胞是心臟修復細胞，所述心臟修復細胞能夠衍生自人成體間充質干細胞、人胚胎干細胞 (條件是其產生不引起人胚胎破壞)、胚胎樣干細胞、可誘導的多能干細胞、心臟自身干細胞或任何其他獲得性來源或其組合。
20.根據權利要求19所述的藥物組合物，其中所述組合物不含可檢測的非心臟修復細胞，所述非心臟修復細胞包括但不限于心肌細胞、造血細胞、內皮祖細胞、成脂肪細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、成骨細胞骨細胞、成神經細胞和神經細胞。
21.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中總的非心臟修復細胞含量是總細胞數的 0%至50%，優(yōu)選是總細胞數的0%至15%。
22.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中每個類別的非心臟修復細胞的含量是總細胞數的0%至50%，優(yōu)選是總細胞數的0%至15%。
23.根據權利要求1至22中任一項所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療缺血性心肌病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、非局部缺血起源的心衰竭、局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其組合。
24.一種用于制備根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物的方法，該方法包括以下步驟獲得能夠衍生定向產生心臟組織的細胞的細胞；在允許獲得定向產生心臟組織的細胞的條件下培養(yǎng)所述細胞；收獲所述定向細胞；向所述定向細胞添加至少一種藥學上可接受的賦形劑。
25.根據權利要求M所述的方法，其中所述能夠衍生定向產生心臟組織的細胞的細胞與由選自以下物質的生心物質構成的生心混合物接觸；至少一種物質選自由以下組成的組活化素Α、α-凝血酶、血管生成素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)例如BMP-I、ΒΜΡ-2、 ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、心肌營養(yǎng)蛋白1、Cardiogenol C、表皮生長因子(EGF)、促紅細胞生成素(EPO)、成纖維細胞生長因子(FGF)例如 FGF-I、FGF-2、FGF-4、FGF-5、FGF-12, FGF-13, FGF-15、FGF-20、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、 生長分化因子-9(⑶F-9)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGF)例如IGF-1、 IGF-2、肌抑素(⑶F-8)、神經營養(yǎng)蛋白例如NT-3、NT_4、NT-I和神經生長因子(NGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)例如？06 -0、？06 ^4、？06 -88、血小板生成素(TP0)、TGF_(轉化生長因子α )、轉化生長因子β (TGF-β )例如TGF-β 1、TGF-β 2, TGF-β 3, VEGF(血管內皮生長因子)例如VEGF-A、VEGF-C, TNF-α、白血病抑制因子(LIF)、白介素6 (IL-6)、 視黃酸、C SDF-I (間質細胞衍生因子-1)、BDNF(腦源性神經營養(yǎng)因子)、Periostin、血管緊張肽II、Flt3配體、膠質細胞衍生的神經營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子結合蛋白_3、 胰島素樣生長因子結合蛋白-5、白介素-3、白介素_8、肝素結合細胞因子、孕酮、腐胺、干細胞因子、TGF-α、Wntl、Wnt3a、Wnt5a、胱天蛋白酶-4、趨化因子配體1、趨化因子配體 2、趨化因子配體5、趨化因子配體7、趨化因子配體11、趨化因子配體20、觸珠蛋白、凝集素、膽固醇25-羥化酶、突觸融合蛋白-8、突觸融合蛋白-11、血漿銅藍蛋白、補體成分1、 補體成分3、整聯蛋白α 6、溶酶體酸性脂酶1、β-2小球蛋白、遍在蛋白、巨噬細胞游走抑制因子、肌動蛋白絲切蛋白、親環(huán)蛋白A、FKBP12、NDH(、抑制蛋白1、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 C、鈣周期蛋白、司腺鈣蛋白-1、PGE-2、mpCCL2、IDO、iNOS、HLA-G5、M-CSF, PIGF、 MCP-I、細胞外基質分子、CCL2 (MCP-I)、CCL3 (MIP-1 β )、CCL4 (ΜΙΡ-1 β )、CCL5 (RANTES)、 CCL7(MCP-3)、CCL20 (MIP-3 β )、CCL26 (嗜酸細胞活化趨化因子-3)、CX3CL1(分形趨化因子)、CXCL5 (ENA-78)、CXCLl 1 (i-TAC)、CXCLl (GR0 β )、CXCL2 (GR0 β )、CXCL8 (IL-8)、 CCLlO (IP-10)及其組合。
26.根據權利要求M至25中任一項所述的方法，其中所述生心混合物在介質中稀釋， 所述介質包含選自由胎牛血清、人血清、血小板溶胞產物、血小板衍生的生長因子及其混合物組成的組的化合物和選自由以下組成的組的化合物(混合物l)TGFi3-l、BMP_4、α-凝血酶、選自由心肌營養(yǎng)蛋白1和IL-6組成的組的化合物、和選自由Cardiogenol C和視黃酸組成的組的化合物；(混合物》TGFi3 -1、ΒΜΡ-4、α -凝血酶、心肌營養(yǎng)蛋白1、IL_6、 視黃酸和Cardiogenol C ；(混合物3)活化素-A、FGF-2、IL-6、IGF-I和視黃酸；(混合物 4) TGF- β 1、TGF- β 2、TNF- α、BMP-U BMP-2、BMP-4、BMP-6、FGF-2, FGF-4、FGF-5、FGF-12, FGF-13, FGF-15, FGF-20、白血病抑制因子、VEGF-A, VEGF-C、胰島素樣生長因子1、白介素 6(11^-6)、活化素々、α-凝血酶、視黃酸、心肌營養(yǎng)蛋白1、Cardiogenol C及其組合。
27.根據權利要求對至沈中任一項所述的方法，所述方法根據國際認可的藥品生產標準來進行，所述方法包括在所述方法的任何步驟取樣，以進行質量控制操作。
28.根據權利要求對至27中任一項所述的方法，所述方法根據國際認可的藥品生產標準來進行，所述方法包括在細胞培養(yǎng)的最后一步取樣，以進行活性物質的質量控制。
29.根據權利要求對至觀中任一項所述的方法，其中活性物質的質量控制標準包括選自由以下組成的組的至少一種檢驗鑒定檢驗、均一性檢驗、純度檢驗及其組合。
30.根據權利要求M至四中任一項所述的方法，其中當定向產生心臟組織的細胞是心臟修復細胞時，所述心臟修復細胞的鑒定對應于由以下組成的組中至少一種基因表達水平的觀察到的增加Nkx2. 5, Tbx5, MEF2C, GATA4, GATA6, MespU FOGU F0G2,Flkl 及其同系物。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述基因表達的增加通過qPCR方法測定與參照相比是至少2倍。
32.根據權利要求對至31中任一項所述的方法，其中當定向產生心臟組織的細胞是心臟修復細胞時，所述心臟修復細胞的鑒定被認為滿足與參照相比由以下組成的組中至少一種多肽物類的觀察到的存在Nkx2. 5、Tbx5, MEF2C、GATA4、GATA6、Mespl、FOGl、F0G2、Flkl 及其同系物，并且Nkx2. 5或MEF2C或兩者進一步轉移至心臟修復細胞的細胞核。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述觀察到的存在通過用由以下組成的組的至少一種抗體免疫標記來顯示抗Nkx2. 5、抗Tbx5、抗MEF2C、抗GATA4、抗GATA6、抗Mespl、抗 F0G1、抗F0G2、抗Flkl及其同系物。
34.根據權利要求M至33中任一項所述的方法，其中當給定樣品中至少50%是心臟修復細胞時，滿足均一性。
35.根據權利要求34所述的方法，其中當給定樣品中至少50%、優(yōu)選至少80%是心臟修復細胞時，滿足均一性。
36.根據權利要求M至35中任一項所述的方法，其中收獲細胞中間充質干細胞的存在通過以下顯示用針對選自由CD105、CD90、CD133、CD105、CD166、⑶四和CD44組成的組的表面標記的抗體陽性免疫標記，和用針對選自由CD14、CD34和CD45組成的組的表面標記的抗體無可檢測的免疫標記。
37.根據權利要求M至36中任一項所述的方法，其中與參照相比⑶34、FABP4、骨鈣蛋白、巢蛋白、Sox9和MYH7基因及其同系物表達水平增加兩倍或更多時，純度不符合要求。
38.根據權利要求37所述的方法，其中與參照相比基因表達的所述增加通過qPCR方法測定。
39.根據權利要求31、37或38中任一項所述的方法，其中所述參照由非心臟修復細胞組成。
40.根據權利要求39所述的方法，其中所述參照由在缺乏任何生心物質時培養(yǎng)的細胞組成。
41.根據權利要求M至40中任一項所述的方法，其中培養(yǎng)條件包括使用生物反應器， 包括固定或包封所述細胞至顆粒或基質上并使細胞培養(yǎng)基穿過顆?；蚧|床。
42.一種用于治療心臟疾病或疾患傾向的方法，其中將有效量的根據權利要求1至22 中任一項所述的藥物組合物遞送入個體。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述個體顯示心血管系統的不足。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述個體罹患缺血性心肌病、心肌梗死、局部缺血起源的心衰竭或非局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病或其組合。
45.根據權利要求42至44中任一項所述的方法，其中所述藥物組合物使用選自由以下組成的組的施用途徑遞送心肌內、心臟內、冠狀血管內、肌肉內、皮下、腹腔內、子宮內、胃腸外或全身。
46.根據權利要求42至45中任一項所述的方法，其中所述藥物組合物使用導管、注射器或其組合心肌內遞送。
47.一種用于施用根據權利要求1至22中任一項所述的藥物組合物的試劑盒，所述試劑盒包括含有所述藥物組合物的容器。
48.根據權利要求47所述的試劑盒，其中所述容器是允許細胞存活和世界范圍內運輸、方便護理人員操作以遞送給接受者的生物相容性容器。
49.根據權利要求46或48所述的試劑盒，其中所述容器是密閉的。
50.根據權利要求46至49所述的試劑盒，其中所述容器與賦形劑和保存條件相容。
51.根據權利要求46至50所述的試劑盒，其中所述容器是密閉的玻璃容器。
52.根據權利要求46至51所述的試劑盒，其中所述容器具有可刺穿的隔膜帽。
53.根據權利要求52所述的試劑盒，其中所述可刺穿的隔膜帽允許包括Iuer激活閥的管形瓶接頭從所述容器抽取液體。
54.根據權利要求53所述的試劑盒，其中所述可刺穿的隔膜帽可以用針頭進入。
55.根據權利要求46至M所述的試劑盒，其中所述藥物組合物貯存在適合深低溫保藏的密閉容器中。
56.根據權利要求46至55所述的試劑盒，其中所述容器中藥物組合物的貯存期限是至少48小時。
57.根據權利要求46至56所述的試劑盒，其中所述容器中藥物組合物的貯存期限是至少72小時。
58.根據權利要求46至57所述的試劑盒，所述試劑盒還包括至少一個導管。
59.根據權利要求46至58所述的試劑盒，所述試劑盒還包括至少一個注射器。
60.一種定向產生心臟組織的細胞在生產用于治療缺血性心肌病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、非局部缺血起源的心衰竭、局部缺血起源的心衰竭、先天性心肌病、或其組合的根據權利要求1至22中任一項所述的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及根據國際認可的藥品生產標準制備的、包含定向產生心臟組織的細胞和至少一種藥學上可接受賦形劑的藥物組合物，用于制備這種藥物組合物的方法，以及用于施用所述藥物組合物的、包括含有所述藥物組合物的容器的試劑盒。
文檔編號A61K35/34GK102438636SQ201080021110
公開日2012年5月2日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權日2009年5月20日
發(fā)明者C·霍姆西, R·戈登-貝瑞斯福特, V·高森 申請人:卡迪歐參生物科技有限公司