專利名稱：載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及一種將藥物或其它藥劑運(yùn)送到眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的載體。
背景技術(shù)：
向眼睛局部運(yùn)送藥物一直都是極具吸引力的實(shí)施路線，但在尋找能夠有效克服藥物到達(dá)眼睛前部和后部的物理和生理屏障的有效載體方面只取得了有限的成功。在早期的專利申請PCT/GB2008/004233中，發(fā)明者描述了使用常規(guī)方式向眼睛用藥時(shí)遇到的問題。進(jìn)一步地，發(fā)明者提出了一種常規(guī)藥物施藥中使用的載體，它能夠?qū)⑺幬镞\(yùn)輸?shù)窖劬蟛?，而無需直接侵入性的施藥方式。在失明情況下，如AMD (年齡相關(guān)的黃斑退化)和DR(糖尿病視網(wǎng)膜病)，隨著當(dāng)前使用眼內(nèi)(玻璃體)注射治療靶向VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的出現(xiàn)，還有一種對非侵入性輸送系統(tǒng)的需要。隨著老齡化疾病和糖尿病發(fā)生率的提高，亟待需要治療方法，特別是那種不具入侵性的療法，容易施藥且便宜。改進(jìn)用于藥物局部運(yùn)輸?shù)妮d體，以抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，治療AMD(年齡相關(guān)的黃斑退化)和DR(糖尿病視網(wǎng)膜病)及其他類似病癥，將是非常有用的。研發(fā)針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和眼睛的治療方法是藥物研發(fā)中最具挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域之一，特別是全身用藥。這主要是因?yàn)檠劬?nèi)存在的血視網(wǎng)膜屏障(BRB)，及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)存在血腦屏障(BBB)。盡管近期有取得進(jìn)展，血腦屏障(BBB)仍然是阻礙許多潛在的治療藥劑進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的現(xiàn)實(shí)問題。當(dāng)今的挑戰(zhàn)是研發(fā)藥物載體系統(tǒng)，保證藥物以安全且有效地方式穿過血腦屏障(BBB)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)治療中使用的藥物受到能夠以跨膜擴(kuò)散的方式穿過血腦屏障的小的脂溶性化合物的限制。此外，阿爾茨海默病的治療利用了被動(dòng)和主動(dòng)免疫——其主要的難點(diǎn)在于抗體很難穿過血腦屏障(BBB)，特別是IgG分子因其較大的體積而具有較差的滲透性。本發(fā)明涉及能夠使藥劑穿過血腦屏障(BBB)和血視網(wǎng)膜屏障(BRB)的載體。這些載體能夠以多種方式用于藥物施用，例如靜脈注射、經(jīng)鼻骨、經(jīng)皮膚和常規(guī)方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括一種維生素E衍生物、一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白、一種陰離子磷脂和一種固醇。該組合物可用于運(yùn)輸待輸送物質(zhì)，例如具有生物學(xué)或藥用活性的化合物，到受試者(subject)身體的區(qū)域。尤其是，該組合物可用于將“待輸送物質(zhì)(cargo)”穿過血視網(wǎng)膜屏障(BRB)或血腦屏障(BBB)運(yùn)輸。因此，該組合物還可以包括需要運(yùn)輸?shù)摹按斔臀镔|(zhì)”。維生素E衍生物、陰離子磷脂和固醇可構(gòu)成一個(gè)類脂膜(脂雙層)。陰離子磷脂結(jié)合蛋白能夠結(jié)合到脂雙層表面。所述的組合物還可包括能夠形成脂雙層的組分。
術(shù)語維生素E衍生物是指一種母育酚或生育三烯酸衍生物，具有與α -生育酚相似的生物活性。特別地，術(shù)語維生素E衍生物是指生育酚和生育三烯酚。維生素E有8種同分異構(gòu)體分子4種生育酚具有一個(gè)4’，8’，12’ -三甲基十三烷基葉綠醇側(cè)鏈，4種生育三烯酚因側(cè)鏈上3’，7’和11’位置上是否存在雙鍵而不同。術(shù)語維生素E衍生物還包括生育酚和生育三烯酚的衍生物，或者是這些分子的變體，具有輕微的結(jié)構(gòu)差異，但功能相似。維生素E包括兩種生育酚同系物，即“生育酚”和“生育三烯酚”。生育酚是一種單，雙或三甲基母育酚，可能具有維生素E的活性。生育酚還包括生育酚衍生物，特別是功能性衍生物，也就是那些保持母體分子載體功能的物質(zhì)。生育酚衍生物的一個(gè)例子是TPGS (D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)。生育三烯酸是一個(gè)在側(cè)鏈上具有三個(gè)雙鍵的母育酚，例如在植基中有三個(gè)額外雙鍵，因此6-(3’，7’，11’，15’ -四甲基-2’，6’，10’，14’ -hexadecatetraenyl) -1,4_ 對苯二酌·或 2_ 甲基 _2_ (4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯)苯并二氫吡喃-6-醇。天然產(chǎn)物在色原烷醇編號(hào)為5，7，和8的一個(gè)或多個(gè)位置上攜帶甲基，從而與生育酚是相同的，除了類似植基的側(cè)鏈內(nèi)具有不飽和鍵；而且類似的是環(huán)化形成一種色原烷醇衍生物，并氧化形成生育三烯酚醌(或色原烷醇)。生育三烯酸這一名詞表明了與母育酚和色原烷醇(維生素E類物質(zhì))的關(guān)系，色原烷醇這一名詞表明了與維生素K和輔酶Q類異戊二烯化合物的關(guān)系。如上所述，維生素E衍生物，陰離子磷脂與固醇能夠伴隨著其他脂雙層形成一種類脂膜(脂雙層)，該其它脂雙層可以是現(xiàn)有的，例如，附加的磷脂。維生素E衍生物的摩爾組成大概介于脂雙層組分的O. I到20%之間。更優(yōu)選地說，該摩爾組成是O. 1-15%的維生素E衍生物，甚至是O. 1-10 %的維生素E衍生物，還可以是O. 1-5 %的維生素E衍生物，O. 1-2%維生素衍生物，甚至是約為I %的維生素E衍生物。在濃度較低的范圍內(nèi)，維生素E衍生物限制了中和氧化膽固醇的能力，此外還會(huì)降低其抗氧化活性。然而，在較高濃度時(shí)，它會(huì)干擾膜相。陰離子磷脂結(jié)合蛋白(APLB)為該技術(shù)領(lǐng)域熟知。本發(fā)明中使用的APLB蛋白可以是天然的，或是重組的。APLB蛋白可以是完整的片段，或是具有功能的片段，也就是說該蛋白質(zhì)的一個(gè)片段或區(qū)域能夠如同整個(gè)蛋白質(zhì)那樣特異地結(jié)合到相同的分子上。還包括這種蛋白質(zhì)的具有功能的衍生物。特別是，該陰離子磷脂結(jié)合蛋白可認(rèn)為是包含具有功能相似的結(jié)合區(qū)域的分子。膜聯(lián)蛋白是APLB蛋白的一種實(shí)例。現(xiàn)在可以獲得多種膜聯(lián)蛋白，例如公開號(hào)為2006/0134001A的美國專利申請中描述的那些膜聯(lián)蛋白。首選的一種膜聯(lián)蛋白是膜聯(lián)蛋白V，這為該技術(shù)領(lǐng)域所熟知。另一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白包括突觸結(jié)合蛋白、V因子，VIII因子和乳凝集素(Iactadherin)。APLB蛋白的濃度最好介于100 μ g/ml到2mg/ml之間；或介于100 μ g/ml到lmg/ml之間，甚至是200 μ g/ml到400 μ g/ml之間，最好約為300 μ g/ml。脂雙層組分的濃度(例如，伴隨著其他附加的脂雙層組分的維生素E衍生物、陰離子磷脂和固醇)最好介于O. lmg/ml到30mg/ml之間，或介于O. lmg/ml到20mg/ml之間，或lmg/ml到10mg/ml之間，或介于3mg/ml到7mg/ml之間，甚至約5mg/ml。陰離子磷脂(APL)也是該技術(shù)領(lǐng)域所熟知的。其實(shí)例包括磷脂酰絲氨酸。
在該組合物的制備期間，APLB蛋白質(zhì)的濃度大于陰離子磷脂(APL)。該組合物最好通過形成脂質(zhì)體制備。在APL含量高于APLB蛋白的位置將會(huì)有不完全的脂質(zhì)體表層。
APL的摩爾組合物與其在生物膜內(nèi)的正常生理水平相關(guān)。例如，磷脂酰絲氨酸，是一種APL，大約占哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中磷脂含量的10%。因此，當(dāng)APL是磷脂酰絲氨酸時(shí)，該組合物最好包括大約10%的磷脂酰絲氨酸。一般，該組合物大約包括10%的陰離子磷脂。其能夠由單一的陰離子磷脂組成，或者由一種以上的陰離子磷脂組成。APL的摩爾組成優(yōu)選地介于脂雙層組分的I至30%，或更優(yōu)選地介于5至20%，甚至介于5至15%，或8至12%，最優(yōu)選地甚至是大約10%。該組合物包含一種固醇，特別是一種膽固醇或類似物，例如6-酮膽留烷醇。摩爾組成優(yōu)選地，介于5至40%的固醇，或介于10至30%，或介于10至20%，或介于13至17%，甚至約占脂雙層組分的15%。該固醇最好是膽固醇。使用的膽固醇總量可選擇地影響待輸送物質(zhì)的釋放速率，膽固醇含量越高，待輸送物質(zhì)的釋放率越低。
本發(fā)明所述的百分比組分按摩爾組成計(jì)。本發(fā)明的組合物是在包含所承載的物質(zhì)以前，以脂質(zhì)體的形式制備。然后使用電穿孔的方法將所承載的物質(zhì)包封進(jìn)該脂質(zhì)體內(nèi)，然而也可以選用凍融的方法將所承載的物質(zhì)封入。本發(fā)明的組合物還包含附加的組分。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物還包括一種附加的脂質(zhì)。該組合物還可包含一種或多種磷脂，例如卵磷脂。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的脂雙層組分包括一種維生素E衍生物，例如生育酚，一種陰離子磷脂，例如磷脂酰絲氨酸，一種固醇，例如膽固醇和另一種磷脂，例如卵磷脂，其中，這些組分的比例如下維生素E衍生物0· 1-20%陰離子磷脂5-20 %固醇15-30%磷脂30-80%。本發(fā)明還提供了一種用于將待輸送物質(zhì)輸送到目標(biāo)位置的組合物的制備方法，該方法包括a)由一種維生素E衍生物，一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白，例如膜聯(lián)蛋白，一種陰離子磷脂，例如磷脂酰絲氨酸和一種固醇形成脂質(zhì)體；b)將待輸送物質(zhì)封進(jìn)該脂質(zhì)體組合物內(nèi)。優(yōu)選地，待輸送物質(zhì)在脂質(zhì)體形成時(shí)包封，或通過電穿孔、凍融、超聲波或渦流等方法包封。更優(yōu)選地是，在脂質(zhì)體形成時(shí)包封，或通過電穿孔、凍融或超聲波包封。優(yōu)選地，當(dāng)脂質(zhì)體的脂質(zhì)濃度相當(dāng)高時(shí)進(jìn)行包封。這有助于提高包封效率，從而使更多的待輸送物質(zhì)封入在脂質(zhì)體內(nèi)。脂質(zhì)濃度優(yōu)選為10mg/ml或更多，更優(yōu)選地，20mg/ml或更多，甚至是30mg/ml,最優(yōu)選的是40mg/ml或更多。本發(fā)明提供了一種維生素E衍生物，特別是其形成的本發(fā)明的組合物，作為一種載體，用于輸送藥劑穿過血腦屏障或穿過血視網(wǎng)膜屏障的用途。本發(fā)明還提供了一種用于將藥劑傳遞到眼睛較后面的區(qū)域的方法，包括將藥劑與本發(fā)明制藥組合物結(jié)合的眼睛用藥方法。本發(fā)明還提供了一種將藥劑輸送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法，包括將藥劑與維生素E衍生物，特別其形成的本發(fā)明相關(guān)的組合物結(jié)合，施用于需要的患者。眼睛較后面的部位是指眼睛后部結(jié)構(gòu)，包括水晶體、小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、眼色素層(包括睫狀體)、玻璃體和視網(wǎng)膜。特別是，本發(fā)明提供了向視網(wǎng)膜的改進(jìn)的輸送方式。本發(fā)明的組合物可用于輸送其他分子、藥劑或組分。因此，該組合物可另外包含一種或多種需要輸送的藥劑。這些藥劑可以包括具有治療或生物活性的藥劑。這些藥劑還可能包括神經(jīng)保護(hù)劑(例如，鹽酸美金剛)、生長因子和生長因子-拮抗劑(包括抗血管原性分子)、抗體(例如Lucentis (雷珠單抗)和(Avastin)阿瓦斯汀)、適配體(例如，Macugen (哌加他尼鈉))、類固醇(例如，Triamcinolone (去炎松))、分子藥劑。在一個(gè)實(shí)施例中，待輸送物質(zhì)是α-金環(huán)蛇毒(αΒΤ)。這可特異地標(biāo)記視網(wǎng)膜內(nèi)的動(dòng)脈。因此，它可以用于評估視網(wǎng)膜輸送。αΒΤ可以被標(biāo)記，從而更容易被檢測。αΒΤ可由任何適當(dāng)?shù)某上窕獦?biāo)記。在具體的實(shí)施例中，αΒΤ由突光素標(biāo)記。本發(fā)明的藥品組合物與其預(yù)期的實(shí)施路線兼容。施藥的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如，靜脈注射、腹膜內(nèi)、肌肉、玻璃體內(nèi)、內(nèi)腔、皮下、鼻內(nèi)、或局部施藥。用于皮膚內(nèi)或皮下施藥的溶液或懸浮液通常包括下列至少一種組分無菌的稀釋液，例如水、生理鹽水、固定油類、聚乙烯乙二醇、甘油、丙烯乙二醇，或其它合成溶液；抗菌劑，例如苯甲基乙醇或甲基對羥苯甲酸酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或重亞硫酸鈉；螯合齊U，例如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽；張度劑，例如氯化鈉或右旋糖。其PH值可用酸或堿來調(diào)節(jié)。這種制劑可密封于安瓿瓶、一次性注射器或多劑量藥瓶內(nèi)。用于靜脈注射或玻璃體內(nèi)施藥的溶液或懸浮液可以包括一種載體，例如生理鹽水、抑菌水、CremophorELT" " (BASF, Parsippany, NJ)、乙醇、或多元醇。在所有情況下，該組分必須是經(jīng)過滅菌且容易注射的液體。使用卵磷脂或表面活性劑通常能夠獲得合適的流體。在制造和儲(chǔ)存條件下，這些組分必須是穩(wěn)定的。使用抗菌劑或抗真菌劑可預(yù)防微生物的生長，例如對輕基苯酸酯、二氯叔丁醇、酹、抗壞血酸、局部抗菌劑(thimerosal)等等。在許多情況下，等滲劑(糖)、多元醇(甘露醇和山梨醇)、或氯化鈉可包含在該組分中。該組分的持久吸收可通過添加能夠延長吸收作用的試劑實(shí)現(xiàn)，例如單硬脂酸酯鋁和明膠。根據(jù)本發(fā)明的該藥品組分最好可以局部施藥，也就是說最好以滴眼液或其他局部形式施用于眼球的表面。相應(yīng)地，藥品組分還可包括其他載體、媒介或輔料，例如氯化鈉、氯化苯甲烴銨、一水合磷酸二氫鈉、無水磷酸二鈉和用于注射的水。本發(fā)明還提供了將維生素E衍生物用作把至少一種藥劑運(yùn)輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)的載體。維生素E衍生物可與陰離子磷脂結(jié)合蛋白結(jié)合使用，例如上述的藥物組合物可用作載體。這種載體可用于傳輸治療、診斷或其他藥劑到大腦中。同樣提供了輸送這種藥劑的方法。本發(fā)明還涉及一種用于標(biāo)記視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的α-金環(huán)蛇毒(αΒΤ)。這是在活體內(nèi)標(biāo)記的。已知αΒΤ可結(jié)合到尼古丁乙酰膽堿受體(nAChRs)，用于間接體內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)肌肉結(jié)點(diǎn)的末端板。當(dāng)用于全身時(shí)，因?yàn)樗哂袧撛诘纳窠?jīng)肌肉抑制作用而不能用于在體內(nèi)標(biāo)記。然而，在將它直接用于眼睛時(shí)沒有出現(xiàn)這種問題。視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)壁，特別是其動(dòng)脈，是一種包圍nAChRs的肌肉環(huán)境。因此，αΒΤ特異地標(biāo)記它們。這種在眼睛內(nèi)的圖案標(biāo)記有時(shí)是非常難以實(shí)現(xiàn)的。a BT最好是直接在眼睛的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)用藥，例如，通過玻璃體內(nèi)注射。αΒΤ可用成像基元標(biāo)記，例如熒光素。 本發(fā)明還涉及將α -金環(huán)蛇毒(α BT)用于標(biāo)記受試者的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的藥劑制造。此外，本發(fā)明提供了一種用于標(biāo)記受試者的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的方法，該方法包括將αΒΤ施用于受試者的眼睛。優(yōu)選地，αΒΤ直接施用于眼睛的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)，例如通過玻璃體內(nèi)注射。標(biāo)記可使視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)成像，尤其可生成視網(wǎng)膜動(dòng)脈。下面將參考附圖，通過示例的方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。


圖I顯示了 Lucentis (雷珠單抗)成像?；€成像(標(biāo)記，左側(cè))顯示了微弱的內(nèi)在488自體熒光，氬激光設(shè)置為95%的強(qiáng)度。上面(標(biāo)記，右側(cè))顯示了經(jīng)局部的488-標(biāo) 記Lucentis (雷珠單抗)40分鐘后，同一眼睛的成像，基線記錄的激光強(qiáng)度相同。注意看到的熒光越多，整幅圖片越亮。熒光強(qiáng)度的變化反映視網(wǎng)膜上488熒光團(tuán)的增加——這僅能夠歸因于488-標(biāo)記的Lucentis (雷珠單抗)經(jīng)過眼睛后面的通道。這說明488-標(biāo)記的Lucentis (雷珠單抗)可經(jīng)通用藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)載體運(yùn)輸，通過角膜、眼前房&眼后房、水晶體和玻璃體結(jié)構(gòu)到達(dá)眼睛的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層。圖2顯示了 Cy3_標(biāo)記的IgG成像?；€成像(標(biāo)記，左側(cè))顯示了微弱的內(nèi)在488自體熒光，氬激光設(shè)置為95%的強(qiáng)度。上面(標(biāo)記，右側(cè))顯示了經(jīng)局部的Cy3-標(biāo)記IgG—小時(shí)后同一眼睛的成像，基線記錄的激光強(qiáng)度相同。注意看到的熒光越多，整幅圖片越亮。此外，看到的高熒光的聚集區(qū)域(白點(diǎn))表示IgG結(jié)合到視網(wǎng)膜特定的結(jié)構(gòu)上。熒光強(qiáng)度的變化僅能夠歸因于Cy3-標(biāo)記的IgG到達(dá)眼睛后部的通道。圖3是一個(gè)與超速離心的不同樣本相關(guān)的熒光強(qiáng)度圖表。圖4是一個(gè)與體積排除的不同樣本相關(guān)的熒光強(qiáng)度圖表。圖5是一個(gè)與包封的不同樣本相關(guān)的突光強(qiáng)度圖表。圖6是使用休珀代克斯75柱對脂質(zhì)體和FITC- a BT的洗脫圖。圖7是圖6所示洗脫圖相關(guān)的熒光圖。圖8是顯示與吸收率相關(guān)的磷酸鹽濃度圖。圖9是顯示與吸收率相關(guān)的卵磷脂濃度圖。圖10是顯示從FPLC休珀代克斯75和休珀代克斯200柱子洗脫的I. 5ml部分相關(guān)的吸收率圖。圖11顯示了脂質(zhì)體熒光和a -BT流出G_50粗提柱的洗脫圖；洗脫圖分別在600nm測量混濁度，在488nm處測量熒光強(qiáng)度。圖12是顯示與超速離心的不同樣本相關(guān)總蛋白量的圖表。圖13是顯示不同脂質(zhì)濃度對包封影響的圖表。圖14是顯示因脂質(zhì)濃度增加產(chǎn)生的對光散射的影響。圖15是顯不具有不同去垢劑的不同突光素水平的突光圖表。圖16是眼睛的影像，顯示了 a BT特異地標(biāo)記視網(wǎng)膜動(dòng)脈。圖17顯示了 a BT和膜聯(lián)蛋白V-776的成功釋放。(A)顯示了在脂質(zhì)體的存在下，膜聯(lián)蛋白的釋放；(B)顯示了被壓縮的αΒΤ的釋放，(C)和⑶顯示了 lmg/ml的膜聯(lián)蛋白V-776和50 μ g/ml a BT經(jīng)無脂質(zhì)體注射的作用。圖18是一張表示膜聯(lián)蛋白V-GST高表達(dá)水平的凝膠圖。
圖19顯示了熒光素不能夠穿越完整的血視網(wǎng)膜屏障，殘留在血管之外，如圖D，E和F所示。需要強(qiáng)調(diào)的是，用封入的材料(A-C)不能像不用該材料(D-F)那樣顯示視網(wǎng)膜血管，盡管封入處理的眼睛在34分鐘時(shí)(B)的動(dòng)脈壁有輕微熒光。然而，封入材料處理的眼睛視網(wǎng)膜上在7分鐘后出現(xiàn)熒光病灶斑或斑點(diǎn)，如圖A中圓圈突出顯示部分所示。如圖B所示，30分鐘后，熒光病灶斑的頻率達(dá)到最大值，如圖C所示，在74分鐘后開始消散。圖20為熒光素鈉(NaFl)滲漏作為室溫(RT)和高環(huán)境溫度(HAT)條件下，缺氧動(dòng)物的血腦屏障( BBB)分裂的標(biāo)志。注射了 NaFl的對照小鼠切片中額皮質(zhì)(上部)和頂葉皮層(下部)的腦組織內(nèi)沒有出現(xiàn)滲漏。相對地，I或2天的RT-缺氧小鼠腦組織切片的額皮質(zhì)和頂葉皮層中出現(xiàn)中等的單病灶滲漏。高環(huán)境溫度(HAT)及缺氧I或2天的腦組織切片中的腦組織里出現(xiàn)多個(gè)NaFl病灶區(qū)域；標(biāo)尺長度為100 μ m。圖21是為了評估待輸送物質(zhì)從包封的脂質(zhì)體的治療劑釋放，研發(fā)出一種每只眼睛施用500ng重組的人VEGF(rhVEGF165)的VEGF模型，這顯示出血管扭曲(A，反射圖像)的增加，血管的滲漏和增厚，這在注射過VEGF后24小時(shí)拍攝的熒光素血管造影中可見(B，熒光圖像)。使用2. 5 μ I治療級(jí)的Lucentis (雷珠單抗)進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射可將得以逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果(C-D)。經(jīng)Lucentis (雷珠單抗)治療的眼睛顯示出與未經(jīng)治療的VEGF模型相關(guān)的縮小血管的大小恢復(fù)正常(C，反射圖像)，沒有滲漏和正常的血管解剖(D，熒光圖像)。圖22是一些左側(cè)玻璃體內(nèi)注射VEGF-治療的眼睛在24小時(shí)(A，C)和48小時(shí)(B，D)獲得的熒光素血管造影照片。首先，經(jīng)VEGF誘導(dǎo)同步Lucentis (雷珠單抗)治療后24小時(shí)出現(xiàn)明顯的炎癥變化，包括嚴(yán)重的滲漏、隨血管加厚出現(xiàn)的扭曲(A，C)。然而，48小時(shí)后，用包封的Lucentis (雷珠單抗)治療動(dòng)物(B)出現(xiàn)較大的差異，與靜脈注射臨床級(jí)Lucentis (雷珠單抗)的動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)的大量滲漏、血-視網(wǎng)膜屏障破壞和大出血相比，沒有出現(xiàn)病灶滲漏，但出現(xiàn)脈管炎(靜脈炎)。圖23為經(jīng)包封的Lucentis (雷珠單抗)治療的眼睛顯示出扭曲度減小、縮小的血管尺寸恢復(fù)正常(A，反射圖像)，無滲漏和更為正常的血管解剖結(jié)構(gòu)(B，熒光圖像)。圖24是來自靜脈注射包封的熒光素鈉動(dòng)物大腦中類似區(qū)域的圖像(A-B)，與一個(gè)僅靜脈注射熒光素鈉的圖像(C-D)。顯示了熒光(A，C)和發(fā)射(B，D)圖像。顯然，注射包封材料的動(dòng)物大腦顯示有熒光，而僅有熒光素鈉靜脈注射的大腦則無信號(hào)(C)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例傳輸機(jī)制物理屏障，例如角膜上皮和血腦屏障和血視網(wǎng)膜屏障的內(nèi)皮細(xì)胞層由多層緊密粘合的細(xì)胞組成。細(xì)胞(角膜或血腦屏障BBB)之間的連接受蛋白復(fù)合體調(diào)節(jié)，構(gòu)成限制化合物運(yùn)動(dòng)的緊密連接。這些連接的選擇性取決于上皮組織的特異類型，通常親水性藥物或小分子量(100-200Da)的離子能夠利用旁細(xì)胞途徑。親脂性藥物能夠通過血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞層滲透，但其運(yùn)輸仍然僅限于分子量小于400Da。在角膜中，基質(zhì)成為親脂性藥物的一個(gè)額外的屏障，阻止親脂性藥物滲入眼睛較后面的部位。胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用允許分子選擇性地穿過上皮細(xì)胞。推測該機(jī)制是由大分子復(fù)合物和病毒能夠穿過上皮細(xì)胞，具有與脂質(zhì)體的共性(IOOnm磷脂包封的結(jié)構(gòu))。
通過上皮組織表面上的網(wǎng)格蛋白有被小窩或瓶狀內(nèi)陷的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用進(jìn)行，稱為細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷。網(wǎng)格蛋白有被小窩依靠受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，而細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷是由膽固醇和細(xì)胞膜蛋白、小窩蛋白介導(dǎo)。細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷中膽固醇的本質(zhì)特性與運(yùn)載系統(tǒng)內(nèi)膽固醇有關(guān)。在沒有特定的理論限制下，發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的組合物可刺激/利用細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用途徑，從而能夠穿過上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。氧化膽固醇的出現(xiàn)也可能與正常膽固醇的作用相反，抑制細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的功能，同時(shí)，維生素E衍生物的存在能中和氧化膽固醇的抑制作用。該假說由最近報(bào)道的進(jìn)一步支持，將膜聯(lián)蛋白V視作一個(gè)細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷相關(guān)蛋白。穿過血腦屏障由于大多數(shù)藥物在活的有機(jī)體內(nèi)不能穿過血腦屏障，能夠穿過血腦屏障的僅局限于高脂溶性和小于400-500道爾頓(Da)的低分子量小分子，所以全球腦藥物市場是不發(fā)達(dá)的領(lǐng)域。所有藥物的中具有這些化學(xué)特性的小分子數(shù)量小于2%。其他藥物不能穿過血腦屏障。沒有解決血腦屏障問題，98%以上具有潛在地治療大腦的藥物還未發(fā)展。嚴(yán)重紊亂疾病患者，例如老年癡呆癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓疾病、帕金森氏綜合征、中風(fēng)、大腦和脊柱損傷、腦癌和多重硬化會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)，具有少量新藥，包括神經(jīng)保護(hù)劑。傳輸大分子的能力也允許重組蛋白質(zhì)、抗體和RNA/DNA分子能夠運(yùn)輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)的目標(biāo)位點(diǎn)。人們認(rèn)為血腦屏障是一個(gè)問題，許多戰(zhàn)略已用于從血液傳輸化合物到大腦。這些包括基于神經(jīng)外科的策略——通過腦室注射灌輸或腦內(nèi)移植的完全侵入，以及通過注入高滲溶液或生物活性試劑，例如血管舒緩激肽來暫時(shí)破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞層的緊密連接，但問題是具有傳染和神經(jīng)病理學(xué)變化的風(fēng)險(xiǎn)。為了能夠運(yùn)輸穿過血腦屏障，使用脂質(zhì)化穿過具有脂溶性結(jié)構(gòu)的水溶性藥物上的極性功能基團(tuán)的連接，或是通過脂溶性藥物載體，或藥物再生成為脂溶性藥物前體。本發(fā)明的組合物可用于將神經(jīng)保護(hù)劑和其他活性藥劑運(yùn)輸穿過血腦屏障。組合物的制造方法脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體通過脂質(zhì)薄膜再水化的方法制備。溶于氯仿甲醇(5 l,v/v)的親脂的脂質(zhì)(卵磷脂(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、膽固醇和α-生育酚)在用氮?dú)獯蹈扇軇┣耙赃m當(dāng)?shù)牧炕旌?。工作范圍?5-30%的膽固醇(最好是15%)、5-20%的磷脂酰絲氨酸(最好是10%)和O. 1-20%的維生素E衍生物(最好是1%)，剩下的部分由卵磷脂組成。獲得的脂質(zhì)薄膜再水化，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中(PBS土熒光團(tuán)/待輸送物質(zhì))。配制含儲(chǔ)藏液濃度為52mM的脂質(zhì)體，隨后在UDDS中稀釋為6. 5mM濃度的工作液。雷珠單抗(Lucentis)或任何蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記雷珠單抗(ranibizumab)是祀向血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)的人單克隆抗體片段?？贵w的蛋白質(zhì)屬性允許將熒光染料與特異的氨基酸結(jié)合。用O. 1M，pH8.3的重碳酸鈉緩沖液沖洗Lucentis (雷珠單抗)(10mg/ml),將濃度調(diào)節(jié)到約2mg/ml。使用100 μ g的alexafluor 488 (琥拍酰亞胺酯,溶于DMS0)在室溫進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng),標(biāo)記蛋白質(zhì)的任何主要氨基位點(diǎn)(賴氨酸殘基和N-末端)。由于藥物仍然受專利保護(hù)，所以無法得到蛋白質(zhì)公共結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，用于標(biāo)記的主要胺基數(shù)量是未知的。通過凝膠過濾移除未結(jié)合的染、料，標(biāo)記的Lucentis (雷珠單抗)洗脫入IXPBS pH7. 4。通過蛋白質(zhì)的光譜學(xué)分析獲得以下結(jié)果。在280nm (0. 215AU)和488nm(0. 128AU)處的峰代表充分水平的標(biāo)記。然而，由于缺乏序列信息，所以無法確定標(biāo)記的實(shí)際濃度和化學(xué)當(dāng)量比。電穿孔包封(首選方法)為了確定藥物是否能利用該組合物被運(yùn)輸?shù)窖劬蠖?，使用電穿孔的方法由該組合物包封過量的LuCentis-488(雷珠單抗)。常規(guī)的包封、冷凍/融化法會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。將15 μ I雷珠單抗(Lucentis)添加到50 μ I組分中，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)O. Icm大小缺口的基因電轉(zhuǎn)杯中，后者常用于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。該電轉(zhuǎn)杯在下述條件使用伯樂公司的電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電脈沖2. 5kV，25yF和200 Ω。在常規(guī)使用中，電脈沖使小分子(通常是質(zhì)粒DNA)穿過細(xì)胞的磷脂膜。因?yàn)橹|(zhì)體具有與細(xì)胞膜相似的結(jié)構(gòu)，所以該方法可能是一種能夠成功替代冷凍/融化法的包封方法。凍融法包封凍融法包封是在有待輸送物質(zhì)存在的情況下，通過在液氮中凍結(jié)載體進(jìn)行的，然后在固定流速的熱水中融化樣品。重復(fù)10次后，在合理的時(shí)間段內(nèi)可獲得最佳的包封。該方法對于單分子樣品來說是很好用的，但是會(huì)引起復(fù)雜分子，例如蛋白質(zhì)的變性。去除未包封的熒光團(tuán)通過60000Xg超速離心45分鐘去除未包封的熒光團(tuán)。棄掉上層清液，將沉淀重溶于新鮮的PBS緩沖液。添加陰離子磷脂結(jié)合蛋白在操作前，將加載的脂質(zhì)體與陰離子磷脂結(jié)合蛋白膜聯(lián)蛋白V混合，使脂質(zhì)體的終濃度為5mg/ml，膜聯(lián)蛋白V的終濃度為300 μ g/ml。脂質(zhì)體和膜聯(lián)蛋白的濃度變化可用于實(shí)現(xiàn)不同的運(yùn)輸水平。由于穩(wěn)定性問題，可使用的膜聯(lián)蛋白最大濃度為2mg/ml, 20mg/ml濃度的脂質(zhì)體劑量可提聞檢塞發(fā)生。體內(nèi)成像使用眼底激光掃描共聚焦(cSLO)對麻醉動(dòng)物(黑色刺鼠)成像。每個(gè)動(dòng)物拍攝一張熒光基線照片。簡單地說，在cSLO前對動(dòng)物進(jìn)行定位，然后對眼睛內(nèi)部成像。一個(gè)波長為488nm的氬激光被聚焦成為一個(gè)小點(diǎn)，通過一對鏡子激發(fā)該波長上的熒光團(tuán)沿視網(wǎng)膜進(jìn)行掃描。獲得的熒光聚集在共聚焦孔上，共聚焦孔具有排除感興趣的深度平面上方或下方的平面中不想要的熒光。在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層平面成像。因此，基線圖像僅記錄內(nèi)在的488自發(fā)熒光，其氬激光設(shè)置為95%的強(qiáng)度。記錄基線圖像后，10μ I包封的488標(biāo)記Lucentis (雷珠單抗)局部施用于小鼠眼睛。局部處理40分鐘后，在相同基線設(shè)置處對眼睛在此拍照一例如，488nm波長處氬激光強(qiáng)度為95%。拍照記錄內(nèi)在488自發(fā)熒光(作為基線)，以及任何到達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層平面上488-標(biāo)記的雷珠單抗。Cy3-標(biāo)記的I gG成像將10 μ I本發(fā)明包封的Cy3_標(biāo)記的IgG局部施用于小鼠眼睛后，記錄基線圖像。Cy3是一種眾所周知的熒光染料，經(jīng)氬激光激發(fā)后能夠檢測出來。局部施藥于眼睛I小時(shí)后，在相同設(shè)置下對眼睛再此拍照作為基線一一例如，488nm波長的氬激光95%強(qiáng)度。然后拍照記錄內(nèi)在的488自發(fā)熒光(作為基線)，以及任何到達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層平面上的Cy3-標(biāo)記的IgG0上述結(jié)果說明了用于傳輸功能性抗體到眼睛較后面部位的系統(tǒng)的潛力，因此證明了抗體衍生的治療藥劑運(yùn)輸?shù)臐摿?。A.廣譜藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)技術(shù)的發(fā)展I.用于運(yùn)輸待輸送物質(zhì)的廣譜藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)的改良用于成功地運(yùn)輸待輸送物質(zhì)的組分包括維生素E衍生物、卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、膽固醇和膜聯(lián)蛋白。在該過程的改良中，對允許不同的待輸送物質(zhì)/組成比例、純化與包封方法進(jìn)行了如下改良
_4] (I)移除未包封在內(nèi)的物質(zhì)評估成功包封的主要挑戰(zhàn)是獲得可靠的能有效移除未包封在內(nèi)的物質(zhì)的方法。已經(jīng)篩選了下文列出的幾種方法。a)軺諫離心以60000g的速度對脂質(zhì)體進(jìn)行超速離心會(huì)使脂質(zhì)體變成小球，與任何包封在內(nèi)的物質(zhì)一起落下。而單個(gè)分子不能在該離心速度中沉淀下來，保留在上清中。棄上清，用新鮮緩沖液重懸沉淀。重復(fù)幾次清洗樣品的過程，直到上清不含有大量的未包封物質(zhì)。每次清洗耗時(shí)45分鐘，5次清洗后即可去除大量的未包封物質(zhì)(見圖3)。圖3中的00表示突光團(tuán)讀物是滲透的。b)體積排除法柱子將樣品加載到能夠根據(jù)分子大小分離分子的柱子上。大分子結(jié)構(gòu)，如脂質(zhì)體，能夠快速穿過，而小分子則有延遲。例如，對于熒光素來說，一次性Pd-IO柱的截留分子量為5000da。這些方法的最優(yōu)化顯示了盡管過柱一次后能夠移除絕大多數(shù)的未包封物質(zhì)，但仍需要進(jìn)行二次過柱以提高精確度(見圖4)。透析將樣品加載入具適當(dāng)分子量的大小的細(xì)孔的透析袋中。體積大于孔的顆粒被截留在透析袋中，例如脂質(zhì)體，而體積小于孔的顆粒則能夠自由擴(kuò)散進(jìn)入更大體積的溶液中。透析過夜，甚至在兩次透析步驟后仍會(huì)有相當(dāng)大的背景熒光。b)包封研究確定了最適合的純化方法，同時(shí)還研究了包封低分子量化合物的不同方法。這些方法包括(i)將脂質(zhì)體置于化合物內(nèi)；(ii)渦旋;(iii)超聲波降解；(iv)凍融；及 (V)電穿孔。由于熒光素具有較高的離子特性，所以在低鹽環(huán)境中與電穿孔具有不相容性。渦旋樣品產(chǎn)生非常小的包封體，而超聲波降解、凍融和預(yù)制成型的脂質(zhì)體都產(chǎn)生顯著包封(見圖5)。2.不同待輸送物質(zhì)的優(yōu)化組分根據(jù)分子質(zhì)量分級(jí)的待輸送物質(zhì)具有三條帶低分子量的熒光組分，例如熒光素鈉(Mwt 376. 28da);中等分子量的組分，例如αΒΤ (8000da)和雷珠單抗(48000da);以及高分子量組分，例如阿瓦斯汀(149000da)。使用體積排阻分離柱系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以使用具有特定截留分子量的不同樹脂。為了分離未包封的α ΒΤ，發(fā)明者選擇嘗試使用休珀代克斯75柱，它能夠分離3000至70000da的蛋白質(zhì)。最初，使用熒光素包封的脂質(zhì)體來添加柱子，確定流出柱體的脂質(zhì)體部分。圖6(上)的方框所示的是脂質(zhì)體的峰。用FITC-αΒΤ裝載分離柱。圖6(下)的方框表示流出柱體的αΒΤ的部分。
圖7所示的結(jié)果顯示Superdex 75柱具有足以分離包封和未包封的a BT的分辨率。特別有意義的是，從大分子量的蛋白質(zhì)中分離脂質(zhì)體的能力，例如抗體，特別是治療藥劑，如雷珠單抗(48000da)和阿瓦斯汀(149000da)。使用一個(gè)休珀代克斯200柱子能夠?qū)崿F(xiàn)分離10000到600000da范圍內(nèi)的分子。從PdlO重力柱到FPLC的休珀代克斯柱改造體積排阻柱，發(fā)明者遇到了樣品損失等問題。這可能歸因于一系列原因，例如脂質(zhì)體破裂。為了能夠觀察這一現(xiàn)象，發(fā)明者采用檢測磷酸鹽水平的方法確定磷脂的水平。磷脂的定量用5M的HCl處理樣本，用羅丹明B和仲鑰酸銨的混合物孵育，以提供一個(gè)相對于磷酸鹽濃度的吸收值。溶液中磷酸鹽的量直接反應(yīng)了磷脂水平。發(fā)明人優(yōu)化了磷脂分析法。圖8顯示了在555nm處的吸收值和相應(yīng)的磷酸鹽濃度。該方法可用于檢測下圖所示的磷脂分子“頭部”內(nèi)的磷酸基團(tuán)。這使得我們能夠確定體積排阻柱中的哪部分含有包封的脂質(zhì)體。因此，該方法可用于檢測包封效率(見圖9)。FPLC休珀代克斯-75和休珀代克斯_200柱脂質(zhì)體樣品流經(jīng)FPLC休珀代克斯-75和休珀代克斯_200柱，每I. 5ml收集一份流出部分。如圖10所示，當(dāng)超速離心和磷脂分析顯示與緩沖液對照相比有極微量的磷酸鹽時(shí)，這些部分都沒有產(chǎn)生預(yù)期的脂質(zhì)體顆粒。圖10中所示的吸收值低于FPLC檢測柱靈敏度的下限，證實(shí)FPLC不適用于脂質(zhì)體純化。G50粗制樹脂重力ro-ΙΟ柱的局限是截留分子量(MWCO)為5000Da，這意味著不能分離差異大于5000Da的不同化合物。其他樹脂，例如G-50粗制樹脂的截留分子量(MWCO)大于30000Da，從而能夠從脂質(zhì)體中分離小蛋白，且不會(huì)引起脂質(zhì)體破裂。一種更精確且不復(fù)雜的確定脂質(zhì)濃度的方法是基于溶液的混濁度，憑借脂質(zhì)體在600nm處的散射光來確定它們的濃度。脂質(zhì)體、熒光素和a -BT的樣品穿過G-50粗制樹脂柱，洗脫物分別在600nm處檢測混濁度，在488nm處檢測熒光強(qiáng)度。
圖11顯示了分離柱分離熒光素的能力，表示柱子正確包裝沒有泄露，然而脂質(zhì)體與αΒΤ之間的分辨率是不夠的。由于大的色譜柱成本較高，所需昂貴的樹脂數(shù)量較多，所以需要再次使用超速離心法分離。超速離心使用熒光素超速離心會(huì)遇到的問題主要是濃度依賴的。足量的染料會(huì)限制該過程的效率，a-BT和Lucentis (雷珠單抗)等蛋白質(zhì)的使用濃度較低,需要較少次數(shù)的清洗。最初的包裝方法使用的是超聲波降解法，適合最終體積的小球熒光性提供一定量的總包封蛋白。超速離心法能夠移除自由的蛋白質(zhì)，約Iyg的小球內(nèi)最初附加10 μ g會(huì)獲得大約10%的包裝(見圖12)。在我們的體內(nèi)a -BT滴定結(jié)果的基礎(chǔ)上，取5 μ I的濃度為50 μ g/ml的量是最優(yōu)劑量，代表添加O. 25 μ go從這些包裝的結(jié)果可見，200 μ I里含有I μ g，因此需要50 μ I眼藥的100 %傳輸。包封效率為了制備更可行傳輸目標(biāo)，發(fā)明者嘗試進(jìn)一步提高包封效率。其中有三種可能的方法>提高初始的a-BT濃度>提高脂質(zhì)濃度>采用可選的包封方法，例如凍融和電穿孔。提高a -BT的濃度僅能輕微提高包封效率。圖13中，從Α&Β到C&D到E&F的移動(dòng)差異較A&B，C&D或E&F兩個(gè)柱形圖之間的差異明顯，說明脂質(zhì)濃度的提高會(huì)明顯增加包封的程度。光散射很難計(jì)算包封程度的精確值，隨著高濃度的脂質(zhì)溶液的混濁度干擾熒光讀數(shù)，光散射增加，從而減少熒光信號(hào)(見圖14)。圖14顯示了在較低的脂質(zhì)值時(shí)，光散射對熒光影響較大，說明包封效率可能大于首次提示的10%。脂質(zhì)體破裂為了精確確定包封值，熒光素與緩沖液和脂質(zhì)體，以及不同去垢劑包括十二烷基磺酸鈉(SDS)、NP40、吐溫-20 (Tween-20)和曲拉通 X-100 (Triton X-100) 一起孵育。
圖15可見，去垢劑的存在降低了含有緩沖液和熒光素樣本中的整個(gè)熒光信號(hào)，這是最為明顯的高熒光強(qiáng)度的影響。去垢劑的存在，特別是SDS的存在，由于脂質(zhì)光散射的影響會(huì)減少熒光信號(hào)的損失。使用1%的SDS并限制熒光產(chǎn)量，在200000AU以下測量，發(fā)明者能夠精確測量待輸送物質(zhì)的包封效率。B.通用藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)的體內(nèi)檢測I.成熟向視網(wǎng)膜輸送的新方法為了評估不同通用藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)組分的功效，發(fā)明者確定了一種新型的αΒΤ標(biāo)簽來評估視網(wǎng)膜運(yùn)輸。αΒΤ(購自Sigma(Τ9641))能夠特異地標(biāo)記視網(wǎng)膜內(nèi)的動(dòng)脈，如圖16所示，從而是一種極好的標(biāo)記。
2.待輸送物質(zhì)的釋放為了評估包封材料的釋放，通過玻璃體內(nèi)注射含有包封的a BT和膜聯(lián)蛋白V-776的脂質(zhì)體，3小時(shí)后對眼睛進(jìn)行成像。圖17顯示了 a BT和膜聯(lián)蛋白V-776的成功釋放。(A)顯示了在脂質(zhì)體存在時(shí)膜聯(lián)蛋白的釋放，(B)顯示了包封的αΒΤ的釋放，而(C)和(D)顯示了在沒有脂質(zhì)體存在的情況下注射分別lmg/ml的膜聯(lián)蛋白V-776和50 μ g/ml a BT的影響。包封的a BT的信號(hào)強(qiáng)度較自由的a BT有所減少，但釋放效率可引出特異的動(dòng)脈標(biāo)記。 3.膜聯(lián)蛋白的產(chǎn)生 發(fā)明者獲得了膜聯(lián)蛋白的密碼子優(yōu)化序列。如圖18所示，新系統(tǒng)表達(dá)高水平的膜聯(lián)蛋白V-GST，允許產(chǎn)生大量的膜聯(lián)蛋白用于靜脈輸送。4.靜脈輸送一用于血腦屏障(ΒΒΒ)&血視網(wǎng)膜屏障(BRB)Α.血視網(wǎng)膜屏障(BRB)a)熒光素鈉向視網(wǎng)膜的靜脈輸送主要目的是為了顯示包封的物質(zhì)穿過血腦屏障和血視網(wǎng)膜屏障的成功輸送。已經(jīng)建立了優(yōu)化的通用藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)的包封和釋放法，已對通用藥物運(yùn)輸系統(tǒng)(UDDS)向視網(wǎng)膜和大腦輸送熒光素鈉的能力進(jìn)行了評估。對小鼠經(jīng)尾靜脈注射300 μ I 5%的突光素鈉或Iml O. 2%包封的突光素鈉,并檢測其視網(wǎng)膜。使用上述超速離心法和ro-io柱子分離移除自由的熒光素。熒光素不能穿過完整的血視網(wǎng)膜屏障，仍隔離在血管外，如圖19(D，E和F)所示。需要強(qiáng)調(diào)的是具有包封物質(zhì)(A-C)的視網(wǎng)膜血管和沒有包封物質(zhì)(D-F) —樣不可見，盡管在34分鐘時(shí)包封治療的眼睛內(nèi)有細(xì)微的動(dòng)脈壁熒光。然而，如圖A中圓圈強(qiáng)調(diào)的那樣，包封物質(zhì)治療的眼睛在7分鐘后，視網(wǎng)膜上出現(xiàn)熒光聚焦斑或熒光點(diǎn)。圖B中顯示了 30分鐘后，這些熒光斑的頻率達(dá)到最大值，如圖C所示，74分鐘后，熒光斑開始消散。在用沒有包封的物質(zhì)治療的眼睛中沒有出現(xiàn)熒光斑。熒光聚焦斑是含有熒光素的完好無損的脂質(zhì)體。這些熒光斑的本地化說明完好無損的脂質(zhì)體被運(yùn)輸?shù)揭暰W(wǎng)膜處。還證實(shí)了僅被包封的熒光素穿過了血視網(wǎng)膜屏障(BRB)。熒光素鈉熒光斑或“單聚焦泄漏”的出現(xiàn)與大腦中血腦屏障的破裂時(shí)的情況類似(見圖 20，參考 Natah，S. S. et al. J Appl Physiol 107:1348-13562009)。b)評估治療劑釋放的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)模型的發(fā)展為了評估從眼睛中包封的脂質(zhì)體里的治療劑的釋放，研制出一種每只眼睛使用500ng的重組人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) (rhVEGF165)的VEGF模型。圖21顯示了經(jīng)VEGF注射24小時(shí)后進(jìn)行熒光素血管造影(B，熒光成像)的一只血管扭曲度增加(A，反射成像)、滲漏和血管加厚的眼睛。經(jīng)玻璃體內(nèi)注射2. 5μ I的治療級(jí)Lucentis (雷珠單抗)可逆轉(zhuǎn)這些影響(C-D)。與未治療的VEGF模型有關(guān)，經(jīng)Lucentis (雷珠單抗)治療的眼睛顯示了血管大小歸于正常(C，反射圖像)、無滲漏和正常的血管解剖結(jié)構(gòu)(D，熒光圖像)。c)雷珠單抗(Lucentis)經(jīng)靜脈注射輸送到視網(wǎng)膜由于Lucentis分子量較大，不能穿過血視網(wǎng)膜屏障，所以不適合靜脈注射。該研究是為了觀察包封的Lucentis (Lucentis UDDS)能夠經(jīng)靜脈注射成功地穿過血視網(wǎng)膜屏障輸送到視網(wǎng)膜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一只眼睛經(jīng)VEGF治療，另一只眼睛不予治療。當(dāng)用VEGF治療時(shí)，小鼠靜脈注射Iml包封的Lucentis (A, B)或300 μ I臨床級(jí)Lucentis (C, D)。由于包裝效率，更大體積的包封材料可減少Lucentis的濃度。
圖22顯示了從左側(cè)玻璃體內(nèi)VEGF治療眼睛后24小時(shí)(A，C)和48小時(shí)(B，D)后拍攝的熒光素血管造影。首先，明顯可見Lucentis與VEGF的同步治療在24小時(shí)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥變化，包括嚴(yán)重的滲漏、血管增厚產(chǎn)生的扭曲(A，C)。然而，在48小時(shí)，用包封的Lucentis治療動(dòng)物(B)體內(nèi)則產(chǎn)生較大的差異，沒有焦點(diǎn)泄漏區(qū)域，但與大量滲漏相t匕，靜脈注射臨床級(jí)Lucentis的動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)脈管炎(靜脈炎)、血-視網(wǎng)膜屏障破壞和大出血癥狀。這有力地表明48小時(shí)后包封的Lucentis已經(jīng)釋放，具有逆轉(zhuǎn)性變化的治療效果。這說明在此期間，Lucentis能夠持久地/延時(shí)釋放，成功穿過血視網(wǎng)膜屏障。同時(shí)還評估了玻璃體內(nèi)注射VEGF后經(jīng)靜脈注射包封的Lucentis的效果(見圖23)。經(jīng)VEGF注射28小時(shí)后進(jìn)行熒光素血管造影術(shù)(B，熒光成像)。實(shí)現(xiàn)VEGF作用的逆轉(zhuǎn)。經(jīng)包封的Lucentis治療的眼睛中扭曲減少、血管大小也減小到正常水平(A，反射成像)，無滲漏，具有更為正常的血管解剖結(jié)構(gòu)(B，熒光成像)。這些都說明了包封的Lucentis能夠穿過血視網(wǎng)膜屏障，并具有療效。B.血腦屏障靜脈注射輸送熒光素到大腦300 μ I 5%的突光素鈉或Iml O. 2%包封的突光素鈉通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，然后檢測其視網(wǎng)膜。利用上述超速離心和PD-柱子的方法移去自由的熒光素。2小時(shí)后，經(jīng)常規(guī)麻醉術(shù)，用4%的仲甲醛固定動(dòng)物。大腦儲(chǔ)存于4%的仲甲醛中固定過夜，然后做800 μ m厚的切片，在熒光共聚焦顯微鏡下鏡檢。熒光素鈉不能穿過完整的血腦屏障；這是一些實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，包括先前Natah.S.S.等提到過的研究(JAppl Physiol 107 =1348-1356,2009) 圖24中所示的圖片來自靜脈注射包封的熒光素鈉(A-B)動(dòng)物大腦相同區(qū)域，與僅靜脈注射熒光素鈉(C-D)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較。同時(shí)顯示了熒光(A，C)與反射(B，D)成像。顯而易見的是，僅包封的材料顯示出熒光(A)，而僅靜脈注射熒光素鈉的大腦則無任何信號(hào)(C)。這證實(shí)了包封能夠使熒光素鈉穿過血腦屏障。此外，如典型的熒光圖像(E，G)和相應(yīng)的反射圖像(F，H)所示，只有包封的材料具有熒光斑。熒光斑的出現(xiàn)或熒光素鈉的“單焦點(diǎn)滲漏”與大腦發(fā)生血腦屏障破裂時(shí)的情況類似，先前已有討論(Natah, S. S. et al. J Appl Physiol 107 :1348-1356 2009)。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含一種維生素E衍生物、一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白、一種陰離子磷脂和一種固醇。
2.如權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物還包含需要運(yùn)輸?shù)摹按斔臀镔|(zhì)”。
3.如權(quán)利要求I或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述的維生素E衍生物為生育酚。
4.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，所述的陰離子磷脂結(jié)合蛋白是一種膜聯(lián)蛋白。
5.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，所述的陰離子磷脂是磷脂酰絲氨酸。
6.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，所述的固醇是膽固醇或6_酮膽留烷醇。
7.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，所述的維生素E衍生物的量與能夠形成脂雙層的組分的量相比為O. 1-20%。
8.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，所述的陰離子磷脂的量與能夠形成脂雙層的組分的量相比為5-20%。
9.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，所述的固醇的量與能形成脂雙層的組分的量相比為15-30%。
10.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物還包含一種附加的磷脂，其中，該附加的磷脂的量與能形成脂雙層的組分的量相比為30-80%。
11.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物還包含一種附加的磷脂，其中，每個(gè)組分的量與能形成脂雙層的組分的量相比為 維生素E衍生物0. 1-20% ； 陰離子磷脂5-20%; 固醇15-30% ； 附加的磷脂30-80%。
12.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述的“待輸送物質(zhì)”是α-金環(huán)蛇毒。
13.一種用于將“待輸送物質(zhì)”運(yùn)輸?shù)绞茉囌叩慕M合物的制備方法，其特征在于，該方法包含 a)由一種維生素E衍生物，一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白，例如膜聯(lián)蛋白，一種陰離子磷月旨，例如磷脂酰絲氨酸和一種固醇形成脂質(zhì)體； b)將“待輸送物質(zhì)”包封于上述的脂質(zhì)體中。
14.如權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)“待輸送物質(zhì)”被包封時(shí)，磷脂濃度為20mg/ml以上。
15.如權(quán)利要求13或14所述的制備方法，其特征在于，所述的待輸送物質(zhì)通過在脂質(zhì)體形成時(shí)包封，或通過電穿孔、凍融、聲波降解法或渦流包封。
16.如權(quán)利要求I 12中任意一項(xiàng)所述的組合物可用于治療。
17.如權(quán)利要求I 12任意一項(xiàng)所述的維生素E衍生物或組合物作為載體使用，將一種藥劑通過血腦屏障或血視網(wǎng)膜屏障輸送。
18.一種用于將藥劑傳遞到眼睛較后面的區(qū)域的方法，其特征在于，該方法包含將藥劑與權(quán)利要求I 12所述的藥物組合物一起施用于眼睛。
19.一種將藥劑輸送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法,其特征在于,該方法包含將藥劑與權(quán)利要求I 12任意一項(xiàng)所述的維生素E衍生物或藥物組合物一起對需要的患者用藥。
20.用于標(biāo)記受試者的視網(wǎng)膜內(nèi)脈管系統(tǒng)的α-金環(huán)蛇毒UBT)。
21.一種標(biāo)記受試者的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的方法，其特征在于，該方法包含將αΒΤ施用于受試者的眼睛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其包括一種維生素E衍生物、一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白、一種陰離子磷脂和一種固醇。此外，本發(fā)明還提出了一種制備用于將“待輸送物質(zhì)”運(yùn)輸?shù)绞茉囌叩慕M合物的方法，包括a)由一種維生素E衍生物，一種陰離子磷脂結(jié)合蛋白，例如膜聯(lián)蛋白，一種陰離子磷脂，例如磷脂酰絲氨酸和一種固醇形成脂質(zhì)體；b)將“待輸送物質(zhì)”包封在脂質(zhì)體組合物中。
文檔編號(hào)A61K9/127GK102648005SQ201080024101
公開日2012年8月22日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者凱蒂·考克森, 弗蘭斯卡·科迪羅, 斯蒂芬·莫斯, 詹姆斯·杜根 申請人:Ucl商業(yè)股份有限公司