專利名稱：重組產(chǎn)生的過敏原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及過敏癥的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及從哺乳動物中鑒定新型過敏原以及針對哺乳動物過敏癥的診斷和治療。
背景技術(shù)：
狗毛皮垢屑(dander)是室內(nèi)過敏癥的常見原因，室內(nèi)過敏癥的癥狀包括鼻炎、結(jié)膜炎、支氣管炎癥和哮喘。狗過敏原不但可在將狗作為寵物飼養(yǎng)的室內(nèi)檢測到，而且也可在諸如學校和日托中心等通常沒有狗的其它場所檢測到。對狗的過敏癥伴隨且依賴于與從狗毛發(fā)和毛皮垢屑釋放的蛋白質(zhì)的致敏。在對狗疑似過敏的情況中，臨床研究包括通過皮膚點刺的致敏分析或使用狗毛發(fā)和/或毛皮垢屑的提取物的特異性IgE抗體測量。對特異性IgE的實驗室免疫測定如Wiadia ImmunoCAP 可使用天然狗毛皮垢屑的提取物來檢測大多數(shù)對狗致敏的情況，這源于其有利的測定條件和可用于過敏原附著的大固體相。狗毛發(fā)和毛皮垢屑提取物包含過敏原性和非過敏原性蛋白的復合物[2，3]。至今已確定四種狗過敏原并詳細研究Can fUCan f2、Can f3和Can f5[4-6]0前兩種均為脂質(zhì)運載蛋白(lipocalin)家族的成員，且已被純化并作為重組蛋白表達W，7]。Can f3 (狗血清白蛋白)是相對保守的蛋白，顯示出與其它哺乳動物白蛋白的廣泛的交叉反應(yīng)性[8]。 Can f5(狗前列腺激肽釋放酶)最近已被描述為是主要的狗過敏原并顯示出與人前列腺特異性抗原(PSA)的交叉反應(yīng)[5]。在至今已知的狗毛皮垢屑過敏原中，Can fl和Can f5似乎是最重要的，分別結(jié)合約50%和70%來自狗過敏癥對象的IgE抗體[5，9]。雖然約20-40%的成年狗過敏癥個體顯示出結(jié)合Can f2或Can f3的IgE抗體，但很少的個體顯示出僅與或甚至主要與這些抗原中的任一種反應(yīng)[5，9]。在最近報導的研究中，發(fā)現(xiàn)盡管對天然狗毛皮垢屑提取物致敏，但少部分狗過敏癥患者顯示出不與Can fl、Can f2、Can f3和Can f5結(jié)合的IgE抗體[5]。除了上述過敏原外，已報導區(qū)別于Can fl和Can f2的IgE反應(yīng)性、18kDa脂質(zhì)運載蛋白樣蛋白，并將其命名為Can f4[9]。報導稱在25名狗過敏癥患者中有15名(60%) 患者顯示出在免疫印跡中對此ISkDa帶的血清IgE反應(yīng)性，這使其成為潛在地重要狗過敏原組分。然而，此過敏原在SDS PAGE凝膠中僅表征為13個氨基酸N端序列，此序列與來自狗的任何已知蛋白序列均不匹配。因此無法知曉全蛋白序列，且重組蛋白的克隆尚未進行。 此天然蛋白既未被純化，也未提示如何能實現(xiàn)Can f4的克隆?！? Saarelainen et al.出片反 Abstract Book of the 3rd International Symposium on Molecular Allergology in Salzburg April 18-20,2008 的摘要中，表明 Can f4特異性mAb識別奶牛毛皮垢屑提取物中的20kDa的蛋白。在科學雜志Allergy的專刊中發(fā)表了 2009年6月6_10日在華沙舉行的第28次歐洲過敏癥和臨床免疫學大會的摘要，摘要公開了已克隆編碼全長Can f4的cDNA[Allergy 64(Suppl.90) :179-538)。然而，并未說明如何實現(xiàn)此克隆，且未給出核酸或氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已確認本領(lǐng)域需要進一步表征和確立過敏原Can f4重要性。如上所述，用于特異性IgE的實驗室免疫測定可使用天然狗毛皮垢屑提取物來檢測大多數(shù)對狗致敏的情況，這源于其有利的測定條件和可用于過敏原附著的大固體相。然而，在小型化或非實驗室免疫測定如過敏原微陣列或醫(yī)生診所測試中，已發(fā)現(xiàn)次有利的測定條件、抗體結(jié)合過敏原試劑的較低載量和有限效價的天然過敏原提取物的組合引起不足夠的診斷靈敏度。類似的情況也存在于對其它動物上皮的特異性IgE的免疫測定。因此，在一些情況中需要使用純的過敏原性蛋白以實現(xiàn)在特異性IgE診斷測試中的足夠的靈敏度。 組分分解診斷(component-resolved diagnostics)的概念提出了對使用重組過敏原組分另一種需要[24]。根據(jù)此概念，分析對單獨的過敏原組分而非全部過敏原提取物的IgE應(yīng)答使得能夠更好地區(qū)分交叉反應(yīng)性過敏原致敏和天然過敏原致敏。因此，需要鑒定和作為重組蛋白產(chǎn)生來自特定過敏原來源的全部潛在過敏原組分。本發(fā)明人在嘗試使用本領(lǐng)域已知的標準方法測序和克隆Can f4時遇到了問題。如以下結(jié)果部分所述，此問題僅能通過使用非常規(guī)方法解決。本發(fā)明基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即 IgE抗體與狗和母牛毛皮垢屑提取物均結(jié)合，以及基于理解為了鑒定核酸序列且完成Can f4克隆，本發(fā)明人必需將Can f4與來自其它生物體的蛋白相關(guān)聯(lián)。一方面，本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的Can f4過敏原。另一方面，本發(fā)明涉及編碼所述重組產(chǎn)生的Can f4過敏原的核酸。再一方面，本發(fā)明涉及包括所述核酸的載體和包括所述載體的宿主細胞。又一方面，本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的Can f4，其用于體外診斷I型過敏癥。本發(fā)明另一方面涉及產(chǎn)生過敏原組合物的方法，包括將重組產(chǎn)生的Can f4過敏原加入至包括過敏原提取物和/或至少一種純化的過敏原組分的組合物中的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及“摻入(spiked) ”重組產(chǎn)生的Can f4過敏原的過敏原組合物。此類過敏原組合物可為不具有或具有少量Can f4過敏原的過敏原提取物或純化和/ 或重組過敏原組分的混合物，其中加入重組產(chǎn)生的Can f4過敏原以結(jié)合來自患者的IgE， 所述患者的IgE不結(jié)合或很差地結(jié)合所述組合物中的其它過敏原組分。本發(fā)明的此方面也涉及產(chǎn)生此組合物的方法，所述方法包括將重組產(chǎn)生的Can f4過敏原加入至過敏原組合物，如過敏原提取物(任選地摻入其它組分)或純化的天然或重組過敏原組分的混合物的步驟。再一方面，本發(fā)明涉及用于診斷患者中I型過敏癥的體外診斷方法，其中使來自所述患者的體液樣品如血液或血清樣品接觸根據(jù)在前方面的重組產(chǎn)生的Can f4過敏原或組合物，并檢測所述患者的樣品是否包含特異性結(jié)合重組產(chǎn)生的Can f4過敏原的IgE抗體，其中特異性結(jié)合所述Can f4過敏原的此IgE抗體的存在表明存在I型過敏癥。此診斷方法可以本領(lǐng)域熟知的任何方式進行。重組產(chǎn)生的Can f4過敏原可例如固定在如常規(guī)實驗室免疫測定、微陣列或側(cè)向?qū)游鰷y定的固體支持物上。又一方面，本發(fā)明涉及用于進行根據(jù)在前方面的方法的診斷試劑盒，所述試劑盒包括重組產(chǎn)生的Can f4過敏原。本發(fā)明進一步涉及治療哺乳動物I型過敏癥的方法，包括向需要此治療的個體施用重組產(chǎn)生的Can f4過敏原，或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式，如下所述。在一個實施方式中，所述哺乳動物為狗。在另一個實施方式中，所述哺乳動物可為具有顯示出與重組產(chǎn)生的Can f4過敏原有同源性的哺乳動物過敏原的任一種哺乳動物，條件是所述個體顯示出與所述哺乳動物過敏原如Bos d23k的IgE交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的此方面還涉及重組產(chǎn)生的Can f 4在包括如組分分解免疫治療等此類免疫治療中的應(yīng)用。修飾的實例包括但不限于分子的斷裂、截短或串聯(lián)化；內(nèi)部片段的缺失；氨基酸殘基的取代；結(jié)構(gòu)域重排；或通過破壞二硫鍵或其與另一個大分子結(jié)構(gòu)結(jié)合，或通過去除蛋白結(jié)合低分子量化合物的能力而破壞至少部分三級結(jié)構(gòu)。另一方面，本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的Can f4過敏原，或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式，如下所述，其用于治療I型過敏癥。又一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括重組產(chǎn)生的Can f4過敏原，或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式。在上述方面，重組產(chǎn)生的Can f4過敏原可被其與野生型Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段所替代，如下所定義。在上述每一方面的一個實施方式中，重組產(chǎn)生的Can f4過敏原具有根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列，且由根據(jù)SEQ ID NO 1的核酸序列編碼。而且，本發(fā)明涉及具有根據(jù)SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重組產(chǎn)生的Can f4過敏原，其用于診斷以及用于治療。本發(fā)明還涉及重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原，其用于I型過敏癥的體外診斷。本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生過敏原組合物的方法，包括將重組產(chǎn)生的Bos d 23k 過敏原加入至包括過敏原提取物和/或至少一種純化的過敏原組分的組合物的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及“摻入”重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原的過敏原組合物。此類過敏原組合物可為不具有或具有少量Bos d 23k過敏原的過敏原提取物或純化和/或重組過敏原組分的混合物，其中加入所述重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原以結(jié)合來自患者的 IgE，所述患者的IgE不結(jié)合或很差地結(jié)合所述組合物中的其它過敏原組分。本發(fā)明的此方面也涉及產(chǎn)生此組合物的方法，所述方法包括將重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原加入至過敏原組合物，如過敏原提取物(任選地摻入其它組分)或純化的天然或重組過敏原組分的混合物的步驟。再一方面，本發(fā)明涉及用于診斷患者中I型過敏癥的體外診斷方法，其中使來自所述患者的體液樣品如血液或血清樣品接觸根據(jù)在前方面的重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原或組合物，并檢測所述患者的樣品是否包含特異性結(jié)合重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原的 IgE抗體，其中存在特異性結(jié)合所述Bos d 23k過敏原的此IgE抗體表明存在I型過敏癥。 此診斷方法可以本領(lǐng)域熟知的任何方式進行。重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原可例如固定在如常規(guī)實驗室免疫測定、微陣列或側(cè)向?qū)游鰷y定的固體支持物上。又一方面，本發(fā)明涉及用于進行根據(jù)在前方面的方法的診斷試劑盒，所述試劑盒包括重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原。本發(fā)明進一步涉及治療哺乳動物I型過敏癥的方法，包括向需要此治療的個體施用重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原，或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式，如下所述。 在一個實施方式中，所述哺乳動物為牛。在另一個實施方式中，所述哺乳動物可為具有顯示出與重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原有同源性的哺乳動物過敏原的任一種哺乳動物，條件是所述個體顯示出與所述哺乳動物過敏原如Can f4的IgE交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的此方面還涉及重組產(chǎn)生的Bos d 23k在包括如組分分解免疫治療等此類免疫治療中的應(yīng)用。修飾的實例包括但不限于分子的斷裂、截短或串聯(lián)化；內(nèi)部片段的缺失；氨基酸殘基的取代；結(jié)構(gòu)域重排；或通過破壞二硫鍵或其與另一個大分子結(jié)構(gòu)結(jié)合，或通過去除蛋白結(jié)合低分子量化合物的能力而破壞至少部分三級結(jié)構(gòu)。另一方面，本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原，或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式，如下所述，其用于治療I型過敏癥。又一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原，或其 IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式的所述Bos d 23k過敏原。在上述方面，重組產(chǎn)生的Bos d 2 過敏原可被其與野生型Bos d 2 過敏原共享抗體表位的變體或片段所替代，如下所述。在涉及Bos d 2 的上述每一方面的一個實施方式中，重組產(chǎn)生的Bosd 2 過敏原具有根據(jù)SEQ ID NO 4的氨基酸序列，且由根據(jù)SEQ ID NO 3的核酸序列編碼。


圖1顯示IgE抗體與非還原的狗毛皮垢屑提取物蛋白結(jié)合的免疫印跡分析。顯示出所分析的37份血清中的10份。對象編號在上方說明，血清的稀釋度在每個泳道下方說明。MW標記蛋白的位置在左側(cè)說明。圖2顯示通過4個連續(xù)步驟的免疫印跡鑒定的16kDa狗毛皮垢屑蛋白的純化。A 制備型尺寸排阻色譜。合并的級分由垂直條表示。B:陰離子交換色譜。虛線表示電導率 (右側(cè)y軸)。用于進一步純化的合并的級分由水平括號標記。C:反相色譜。虛線表示乙腈濃度(右側(cè)y軸)。用于進一步純化的合并的級分由水平括號標記。D:陰離子交換色譜。 虛線表示電導率(右側(cè)y軸)。包含純靶蛋白的峰用箭頭表示。圖3顯示從純化的16kDa狗毛皮垢屑蛋白的胰蛋白酶解片段獲得的肽序列。圖4顯示Can f4的cDNA序列(所附序列表中SEQ ID NO 1所示)和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。預測的信號切割位點用箭頭標記。圖5顯示純化nCan f4和rCan f4的比較生化和免疫學分析。A 分析凝膠過濾。 虛線:nCan f4(右側(cè)y軸)；實線rCan f4(左側(cè)y軸)。6. 5、13. 7、29、43和75kDa校準蛋白的洗脫體積由菱形符號標記。BmCan f4和rCan f4的非還原(ox)和還原(red)樣品的SDS-PAGE。相關(guān)MW標記蛋白的大小在左側(cè)示出。C 通過ImmunoCAP對IgE抗體結(jié)合活性(kUA/L)的分析。分析來自37名狗過敏癥對象的血清。虛線表示0. 10和0. 35kUA/L水平。圖6表示在37名狗過敏癥對象中，針對狗毛皮垢屑提取物(DDE)、rCan fl、rCan f2、nCan f3、rCan f5和rCan f4的IgE抗體的濃度。水平條表示中間值。點線表示0. 35kUA/ L水平。將低于0. lkUA/L的值設(shè)定為0. lkUA/L。圖7顯示rCan f4對IgE抗體結(jié)合Bos d 23k的抑制。在測量IgE結(jié)合固定化的 Bos d 2 前，用lOOyg/mL rCan f4(黑條)或緩沖液(陰性對照，灰條)預孵育三種Bos d 23k反應(yīng)性血清(A-C)。
圖8顯示從母牛毛皮垢屑中純化兩種IgE抗體結(jié)合蛋白，即Bos d 23k和Bos d2。 A 通過尺寸排阻色譜分餾。將來自標記為A和B的兩個峰的頂部級分合并并進行還原SDS PAGE分析(插圖)。相關(guān)MW標記蛋白的大小在右側(cè)示出。B 通過疏水性相互作用和陰離子交換色譜進一步純化后，純化的Bos d 23k和Bos d 2的還原(red)和非還原(ox)樣品的SDS-PAGE。相關(guān)MW標記蛋白的大小在每個凝膠的左側(cè)示出。圖9顯示IgE抗體結(jié)合Can f4、Bos d 23k(上圖)和Bos d 2(下圖)的比較。 說明了每個比較的相關(guān)系數(shù)(r)。分析了來自37名狗過敏癥對象的血清。虛線表示0.10 和 0. !35kUA/L 水平。圖 10 顯示 Can f4(如 SEQ ID NO 2 所示)和 Bos d 23k (如 SEQ ID NO 4 所示) 的氨基酸序列比對。定義Can f4應(yīng)被解釋為由免疫學會聯(lián)合會過敏原命名委員會(誦.allergen, org)列出的狗過敏原。脂質(zhì)運載蛋白應(yīng)被解釋存在于廣泛生物體中且涉及眾多功能的蛋白的大且多樣化的組[25-27]。它們表征為某些保守的結(jié)構(gòu)特征，但在氨基酸序列上不是高度保守。月旨質(zhì)運載蛋白能夠結(jié)合小的，主要是疏水性分子，包括類固醇、脂肪酸和信息素。存在于哺乳動物嗅覺器官中的脂質(zhì)運載蛋白的一個亞組被稱為氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins)，這源于它們可逆地結(jié)合和釋放參與嗅覺信號傳輸?shù)膿]發(fā)性化合物的能力[28]。 一些哺乳動物脂質(zhì)運載蛋白已被報導為引起致敏人中的呼吸性過敏癥狀的過敏原[29]。本發(fā)明人命名為Bos d 23k的蛋白作為從母牛毛皮垢屑中純化的23kDa蛋白描述于實施例中，其包括與從牛(Bos Taurus)基因組序列推斷出的假定?；虍a(chǎn)物(描述在登錄號XP_581277中)一致的氨基酸序列。術(shù)語“Can f4”未另外定義，應(yīng)被理解為全長的，未修飾的完整Can f4。相同的定義經(jīng)必要修正后也適用于Bos d 23k。與Can f 4過敏原共享抗體表位的Can f 4過敏原的變體和片段應(yīng)被理解為那些片段和變體，它們與來自代表性Can f4過敏原致敏患者的血清樣品的IgE抗體的結(jié)合可顯著地被Can f4過敏原所抑制。此類抑制測定可根據(jù)如WO 2008/079095的實施例8中所述的方案進行。變體和片段也具有與Can f4過敏原類似的IgE結(jié)合性質(zhì)。相同的定義經(jīng)必要修正后也適用于Bos d 23k。其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式的所述Can f4過敏原在本發(fā)明內(nèi)容中應(yīng)被理解為是指已經(jīng)過化學或遺傳學修飾以改變其免疫學性質(zhì)的Can f4過敏原，如以上涉及本發(fā)明免疫治療方面所例舉。相同的定義經(jīng)必要修正后也適用于Bos d 23k。同源過敏原應(yīng)被理解為是指其中核酸序列能夠與其它過敏原的核酸序列雜交的過敏原。雜交的結(jié)果可取決于序列的長度、同源性在序列內(nèi)的分布以及實驗條件，如鹽濃度、溫度、洗滌嚴格性等。根據(jù)本發(fā)明的同源過敏原可具有低于通常被認為是同源即 65-70%的整體序列相同性。通過本發(fā)明的定義，同源過敏原的核酸序列可顯示出較低的與其他過敏原的核酸整體序列相同性，但因序列片段顯示出較高序列相同性而仍與此其它過敏原雜交。
與過敏原的交叉反應(yīng)性應(yīng)被理解為是指個體針對第一過敏原的IgE抗體對于與此第一過敏原同源或不同源的第二過敏原也是反應(yīng)性的。發(fā)明詳述以下實施例通過來自狗的脂質(zhì)運載蛋白樣蛋白Can f4的分離和應(yīng)用來說明本發(fā)明。也有說明Can f4和母牛過敏原之間交叉反應(yīng)性的部分。實施例僅用于說明，且不應(yīng)被認為是限制本發(fā)明，本發(fā)明通過所述權(quán)利要求的范圍來限定。
實施例材料和方法IgE免疫印跡分析對通過使用均勻的12. 5% ExcelGel(GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden)的SDS-PAGE分離的非還原的狗毛皮垢屑提取物進行免疫印跡分析，并印跡在 Hybond ECL 硝酸纖維素膜(GE Healthcare Life Sciences)上。使用 LMW 試劑盒(GE Healthcare Life Sciences)作為分子量(MW)標記。將蛋白印跡物用封閉緩沖液(50mM 磷酸鹽 PH 7. 4,0. 1% (ν/ν)吐溫-20、0·9% (w/v)NaCl,0. 3% (w/v)Dextran T10)在室溫下封閉1小時，并隨后用在封閉緩沖液中稀釋1. 5-30倍的每個患者的血清孵育過夜。在含 0.5% (ν/ν)吐溫-20的封閉緩沖液中清洗后，將膜用含125I-標記的抗人IgE抗體的封閉緩沖液在室溫下孵育4小時，清洗后，結(jié)合的IgE使用儲存磷光質(zhì)屏和Typhoon 9410多功能成像儀(GE Healthcare Life Sciences)通過放射攝影術(shù)檢測。從狗毛皮垢屑純化16kDa蛋白狗毛皮垢屑(Allergon，Valinge，Sweden)在2OmM MOPS pH 7. 6,0. 5M NaCl(MBS) 中提取，通過離心凈化，通過0. 45 μ m混合纖維素酯過濾器(Millipore，Billerica, ΜΑ)過濾并加入到尺寸排阻色譜(SEC)用的Superdex 75柱(GE Healthcare Life Sciences)。 將在免疫印跡分析中觀察到的含16kDa帶的級分使用YM-3過濾器在Amicon Stirred Cell(Millipore)中濃縮，在 kphadex G25 超細柱(GE Healthcare Life Sciences)上脫鹽至20mM Tris-HCl pH 8.0。隨后將脫鹽的制備物加入到陰離子交換色譜(AIEC)用的 Source Q 柱(GE Healthcare Life Sciences)并用 0-0. 5M 線性梯度 NaCl 洗脫。進一步的純化通過使用Source 15 RPC柱(GE Healthcare Life Sciences)和用在含0. 05%三氟乙酸(TFA)的水中的0巧4%線性梯度乙腈洗脫的反向色譜(RPC)進行。包含靶蛋白的級分通過SDS PAGE鑒定并合并。在還原、烷基化和胰蛋白酶裂解后，純化蛋白的肽通過RPC分離并通過氨基酸測序分析。為了通過ImmimoCAP評價IgE抗體結(jié)合，通過使用陽離子交換色譜(CIEC)對16kDa蛋白進行最終的處理步驟，所述陽離子交換色譜使用在20mM檸檬酸鹽 pH 4.0 中平衡的 SP Sepharose FF 柱(GE Healthcare Life Sciences)且用 0-1M 線性梯度NaCl洗脫。從母牛毛皮垢屑純化IgE結(jié)合蛋白提取母牛毛皮垢屑(Allerg0n)并通過上述的SEC分餾。將含顯著的23kDa帶的級分合并、用NH4SO4調(diào)節(jié)至IM的終濃度，并通過使用苯基kpharose HP柱(GE Healthcare Life Sciences)的疏水相互作用色譜(HIC)來進一步純化。將23kDa帶在通過級分的流中洗脫，并在kphadex G25超細柱(GE Healthcare Life Sciences)上脫鹽至20mM Bis-Tris丙烷pH 8. 5，并隨后加入到用相同緩沖液平衡的Source 15Q柱(GE Healthcare Life Sciences)。洗脫使用0_0. 4M線性梯度NaCl進行，并合并含23kDa帶的級分。最終制備物的蛋白濃度使用計算出的每mg/mL為1. 04的消光系數(shù)，在^Onm吸光度下確定。將含顯著的19kDa帶的級分合并并通過上述HIC進一步純化。將19kDa蛋白在 20mM Tris-HCl pH 8. 0中的O-IM線性梯度NH4SO4中洗脫，并收集峰級分。如上所述，進行脫鹽和在Source 15Q柱上的AIEC。最終產(chǎn)生物的蛋白濃度使用計算出的每mg/mL為1. 04 的消光系數(shù)，在^Onm吸光度下確定。蛋白分析除非另有說明，還原β-巰基乙醇)和非還原蛋白樣品的SDS-PAGE分析使用 10% NuPAGE 凝膠 anvitrogen，Carlsbad, CA)和作為 MW 標記的 Markl2 (Invitrogen) 進行。在電泳分離后，蛋白通過考馬斯亮藍染色來顯像。提取的蛋白帶的N端序列分析使用 Hewlett-Packard G1000A 儀器(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)進行。分析 SEC 在用 MBS 平衡的 Superdex 75HR 10/30 柱(GE Healthcare Life Sciences)上進行。柱的 MW 平衡使用LMW凝膠過濾平衡試劑盒(GE Healthcare Life Sciences)進行。對于通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-T0F)質(zhì)譜(MS)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，包括還原、烷基化和胰蛋白酶消化的溶液中RPC純化蛋白的樣品產(chǎn)生使用 Bruker Daltonics Autoflex 2 儀器(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)基本上按照 [10]所述進行。進行串聯(lián)MS(MS/MS)分析以鑒定選擇的肽。為了確定與所得PMF和MS/MS 結(jié)果匹配的蛋白，使用Mascot服務(wù)器(Matrixscience，London, UK)搜索MSDB數(shù)據(jù)庫。來自SDS-PAGE的單獨蛋白帶的凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化基本上根據(jù)Sievchenko et al. [11]進行。樣品制備和肽質(zhì)量指紋圖譜進行如上。
重組Can f4的克隆、表達和純化使用RNAqueous試劑盒(Ambion，Austin, Texas)，從狗舌頭的外側(cè)段來產(chǎn)生總 RNA。使用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare Life Sciences)從總RAN中分離聚腺苷酸化 RNA，且使用第一鏈cDNA合成試劑盒(GE Healthcare Life Sciences)制備第一鏈cDNA。 根據(jù)Fr0hman[12]，使用均帶有克隆用的末端NdeI限制性位點的嵌套正向寡核苷酸引物 5，-ATGAAGATCCTACTGTTGTGTC-3，和 5，-CAGCTACCCCTTCCTAATG-3，進行 3，RACE。將 7 個獨立的3’ RACE克隆分離并對它們?nèi)繙y序，由此可確定Can f4編碼序列。DNA測序使用 Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,Foster City,CA)進行。DNA和氨基酸序列的分析以及計算使用GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA, USA)的程序進行。信號肽預測使用 SignalP(www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)進行。出于蛋白表達的目的，Can f4編碼序列使用引物5’ -GTCAGCATATGCAGCTACCCCTTCCT AATG-3，和 5，-ACTGACTCGAGTTCATGGTTGGGACAGTTGTC-3，擴增，并克隆于載體 pET_23a(+) (Novagen, Madison, WI, USA)的 NdeI 和 XhoI 位點之間。使用 3-L 生物反應(yīng)器(Belach Bioteknik, Solna, Sweden)，在大腸桿菌(E. coli)BL21制備作為C末端6個組氨酸標記蛋白的重組Can f4。對于rCan f4純化，將收集的細胞重懸在20mM Tris-HCl pH 8. O中，并使懸液在 15000-17000kPa 下通過 Emulsiflex C5 勻漿器(Avestin he.，Canada)來裂解。在通過離心和過濾凈化后，將上清液加入到用NiSO4裝載的Chelating Sepharose FF柱(GEHealthcare Life Sciences)。柱清洗通過在 20mM Tris-HCl pH 8· 0 中的 20mM 咪唑，0· 15M NaCl進行，且重組蛋白在相同緩沖液中的20-500mM線性梯度咪唑中洗脫。重組蛋白的進一步純化通過使用 Q Sepharose FF 柱(GE Healthcare Life Sciences)在 2OmM Tris-HCl pH 8. O中通過AIEC進行。蛋白使用0-0. 5M線性梯度NaCl洗脫，且根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果合并級分。最終制備物的蛋白濃度使用計算出的每mg/mL為0. 78的消光系數(shù)，在^Onm吸光度下確定。重組蛋白的完整性使用N末端測序確認。狗過敏癥對象和花粉過敏癥對照將來自西班牙(n = 23)、瑞典(n = 10)和北美(n = 4)的37名狗過敏癥對象的血清用于本研究中(表2)。全部患者具有醫(yī)生診斷的狗過敏癥，其癥狀例如哮喘、鼻結(jié)膜炎和風疹，且經(jīng)過陽性皮膚點刺測試和針對狗毛皮垢屑提取物的特異IgE的陽性ImmimoCAP 測試(Phadia，Uppsala, Sweden) 0將未診斷或未報導有狗過敏癥癥狀的44名花粉過敏癥對象的血清用于對照。在每個中心的當?shù)貍惱砦瘑T會許可下收集全部樣品和臨床數(shù)據(jù)。特異性IgE抗體測量使用常規(guī)和實驗的ImmimoCAP 測試(Phadia)檢驗純化的重組和天然過敏原的 IgE抗體結(jié)合活性。實驗的ImmimoCAP 測試如[13]所述進行。實驗測試的測定特異性使用陰性對照血清評價，此陰性對照血清摻入終濃度為0、1000或3000kU/L的骨髓瘤IgE。在測定IgE抗體與固定在ImmimoCAP固相上的23kDa母牛毛皮垢屑蛋白結(jié)合前，IgE抑制實驗通過使用終濃度100 μ g/mL的重組Can f4預孵育血清樣品來進行。以兩次確定的平均值來計算結(jié)果。結(jié)果來自狗過敏癥對象的血清的免疫印跡分析對來自10名狗過敏癥對象的血清樣品使用非還原狗毛皮垢屑提取物進行IgE免疫印跡分析(圖1)。對于相同的血清，特異性IgE對rCan fl、rCan f2、nCan f3和rCan f5的ImmimoCAP數(shù)據(jù)可用于比較。免疫印跡分析揭示IgE結(jié)合至少8種不同的蛋白帶。在這些帶中，23kDa區(qū)域中的帶與結(jié)合rCan fl和rCan f2的ImmunoCAP IgE有關(guān)(對象5、 24,31和33), 28kDa區(qū)域中的帶與rCan f5反應(yīng)性有關(guān)(對象1、3、5、15、31、33和36)，且約60kDa的帶與nCan f3反應(yīng)性有關(guān)(對象9、15和33)。結(jié)合16kDa帶的免疫印跡IgE通過4名對象(1、9、14和36)的血清檢測，其中一名對象(對象14)的血清引起特別強的信號。在ImmimoCAP分析中此血清未顯示出IgE與 rCan f UrCan f2、nCan f3或rCan f5中任一種結(jié)合的事實提示16kDa帶代表新過敏原。由免疫印跡鑒定的16kDa狗毛皮垢屑蛋白的純化包括SEC以及隨后AIEC和RPC的三步純化方法產(chǎn)生90_95%純度的16kDa蛋白的制備物(圖幻。此蛋白的N末端序列分析未讀出，提示其N末端已被封閉。為了克服此問題，將蛋白還原、烷基化和用胰蛋白酶消化以產(chǎn)生內(nèi)部肽。4種此類胰蛋白酶解肽可通過 RPC分離并通過N末端測序分析，產(chǎn)生的序列顯示在圖3中。使用這些肽序列進行的BLAST 搜索未確定出與任何已知的狗蛋白的正確匹配。然而，肽1至4與代表來自母牛和豬的氣味結(jié)合蛋白的數(shù)據(jù)庫條目的不完全匹配，這提示純化的狗蛋白可能與此蛋白家族有關(guān)。而且，使用降低的嚴格性設(shè)置，用肽4在狗基因組數(shù)據(jù)庫進行TBLASTN搜索，得到與在X染色體末端區(qū)域中三個相連區(qū)段的概念翻譯的匹配。純化蛋白的PMF分析未得到與已知蛋白序列的任何顯著匹配。16kDa狗毛皮垢屑蛋白的IgE結(jié)合活性通過ImmunoCAP免疫測定來評價，隨后進行最終的CIEC處理步驟以進一步增加制備物的純度。分析37名狗過敏癥個體的血清，且在 ImmunoCAP中IgE與純化蛋白的結(jié)合很好地與在狗毛皮垢屑提取物免疫印跡分析中檢測出的16kDa帶相關(guān)聯(lián)，說明純化蛋白代表在免疫印跡中觀察到的16kDa帶。來自狗和母牛的上皮過敏原之間的聯(lián)系我們實驗室中在來自其它動物種類的上皮過敏原上進行的分開的實驗意想不到地幫助了 16kDa狗過敏原的鑒定和克隆。在狗和母牛過敏原研究之間共享的一種血清顯示出IgE抗體與狗和母牛毛皮垢屑提取物均顯著結(jié)合，而在ImmunoCAP中對全部rCan Π、 rCan f2,nCan f3和rCan f5均無反應(yīng)性，這引出此血清可能定義新型狗過敏原的可能性。發(fā)現(xiàn)母牛毛皮垢屑提取物中的23kDa蛋白結(jié)合來自此血清的IgE且能夠通過SEC 高度富集(圖8A)。發(fā)現(xiàn)SEC分餾中的相鄰峰包含主要過敏原Bos d2，其是一種19kDa的脂質(zhì)運載蛋白，經(jīng)PMF分析確認(未顯示)。通過HIC和AIEC對這些蛋白的進一步純化(未顯示)導致適合作為免疫測定試劑的更高純度的制備物(圖8B)。23kDa蛋白通過PMF數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫條目XP_581277(如SEQ ID NO :4所示)的顯著匹配(ρ <0.05)來鑒定，代表被注解為“類似于氣味結(jié)合蛋白”的牛脂質(zhì)運載蛋白。而且，23kDa蛋白的N末端序列分析揭示出序列EAQGDASQFT，其匹配相同數(shù)據(jù)庫條目的殘基 19-28，因此證實了 PMF匹配。下文將此蛋白稱為Bos d 23k。通過Bos d 23k和Bos d 2進行的實驗ImmunoCAP測試被用于評估IgE結(jié)合16kDa 狗毛皮垢屑蛋白的相關(guān)性。分析來自37名狗過敏癥對象中的血清，且結(jié)果顯示在圖9中。 盡管16kDa狗毛皮垢屑蛋白和Bos d 2在IgE結(jié)合上未顯示出相關(guān)性(r = 0.01)，但觀察到與Bos d 23k的顯著相關(guān)性(r = 0. 89)，這提示在狗過敏原和Bos d 23k之間存在交叉反應(yīng)性和結(jié)構(gòu)相似性。16kDa狗毛皮垢屑蛋白的克隆和序列分析16kDa狗毛皮垢屑蛋白和Bos d 23k之間的潛在序列相似性有助于針對鑒定狗蛋白或其基因序列的數(shù)據(jù)庫搜索。用牛蛋白序列(XP_581277)在狗基因組數(shù)據(jù)庫進行 BLASTN搜索，得到登錄號AAEX02025758(狗基因組序列4314Mbp區(qū)段)的核苷酸位置 338441-338307的翻譯的匹配[14]。有趣地是，此基因組區(qū)域的理論翻譯包含Can f4的所報導N末端序列的氨基酸殘基9-13的最佳的5殘基匹配。發(fā)現(xiàn)在更上游(339006-338926)， 編碼氨基酸的核苷酸序列匹配Can f4的殘基1-8以及推定的信號肽。出于克隆對應(yīng)于AAEX02025758鑒定區(qū)段的cDNA (假定編碼Can f4)的目的，進行 3’ RACE實驗。使用寡核苷酸引物以及從狗舌頭的多聚A RNA制備的第一鏈cDNA作為模板，此寡核苷酸引物基于編碼推定信號肽的第一部分的基因組序列和在預測斷裂位點后的延伸。獲得清楚的擴增產(chǎn)物，將此產(chǎn)物克隆、分析并隨后用于蛋白表達實驗。所克隆cDNA的完整DNA序列和氨基酸翻譯顯示在圖4中。確定出編碼174個氨基酸殘基的開放閱讀框，其中SignalP預測開始的16個殘基將形成信號肽。從所克隆cDNA 推導出的成熟蛋白由158個氨基酸殘基組成，包括兩個半胱氨酸，且具有17. 6kDa的預測分子量和6. 53的等電點。為了評估序列多樣性的存在，將7個獨立的3’ RACE克隆分離并測序。在這些克隆中發(fā)現(xiàn)很少的核苷酸取代(未顯示)，但沒有一個取代引起蛋白的氨基酸序列改變。在所分析的全部克隆中，在終止開放讀框的終止密碼子之后且在多聚A尾之前是 213個核苷酸的未翻譯區(qū)段。在殘基16和17之間的預測的信號肽斷裂位點將使得17位的谷氨酰胺殘基成為成熟蛋白中的第一個。N末端谷氨酰胺殘基可經(jīng)歷焦谷氨酸環(huán)化，其已知會通過Edman降解來阻斷N末端測序(15)，這與我們無法獲得從完整蛋白讀出的序列相符。而且，基于對天然蛋白PMF結(jié)果的復查，鑒定出1759. 98Da分子量的胰蛋白酶解片段，其準確地對應(yīng)于對所預測一級翻譯產(chǎn)物的殘基17-32的預測，此一級翻譯產(chǎn)物經(jīng)焦谷氨酸環(huán)化修飾。此外，鑒定出匹配氨基酸殘基33-51、56-63、66-73和95-104的胰蛋白酶解片段。由所克隆cDNA編碼的氨基酸序列進一步包含從純化的天然16kDa蛋白獲得的四個胰蛋白酶解肽序列(圖幻，其與肽2-4和肽1中的兩個保守的氨基酸取代很一致?？傊?， 通過PMF鑒定的蛋白片段和肽測序代表Can f4的推斷氨基酸序列的58%的覆蓋率(表1)。 結(jié)合在一起，這些結(jié)果提供了很強的證據(jù)，即純化的16kDa過敏原和由所克隆cDNA編碼的蛋白均代表狗過敏原Can f4。通過將所克隆的cDNA序列與登錄號AAEX02025758的基因組序列比對，發(fā)現(xiàn) Can f4基因的編碼部分跨越總共5916bp，且包含6個外顯子339006-338929 (外顯子 1) ,338447-338307 (外顯子 2) ,335150-335082 (外顯子 3) ,334581-334468 (外顯子 4)、 333609-333511 (外顯子5)和333114-333091 (外顯子6)。外顯子3和4之間的確切剪切位點無法明確地從序列中推斷出，且這些外顯子的邊界可分別更換為335150-335079和 334578-334468 ο氨基酸序列從Can f4 cDNA推斷出，且基因區(qū)段在5個位置彼此背離。在成熟Can f4序列位置20處，cDNA翻譯中異亮氨酸殘基對應(yīng)于基因衍生序列的纈氨酸殘基，在位置 30處天冬氨酸殘基對應(yīng)于谷氨酸殘基，在位置38處蛋氨酸殘基對應(yīng)于亮氨酸殘基，在位置 51處絲氨酸殘基對應(yīng)于亮氨酸殘基，且在位置81處酪氨酸殘基對應(yīng)于天冬氨酸或半胱氨酸殘基，這取決于外顯子3和4之間的確切剪切位點。除了上述Can f4基因序列外，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫條目AAEX02025758包含兩個其它的Can f4相關(guān)區(qū)段，這解釋了用胰蛋白酶解肽4序列在狗基因組中進行TBLASTN搜索獲得的三個匹配。三個Can f4相關(guān)區(qū)段彼此以5.4和6. 71Λ的距離串聯(lián)排列，其中上述的一個位于最遠的下游。位于中間的Can f4相關(guān)區(qū)段具有與上述Can f4基因類似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，且其推斷的氨基酸序列與Can f4基因相比在M個位置不同，與Can f4 cDNA相比在觀個位置不同。有趣地，其與胰蛋白酶解肽1的序列完全一致，此胰蛋白酶解肽1的序列在2 個位置與cDNA編碼的氨基酸序列背離。在位于最遠上游的Can f4相關(guān)區(qū)段中，未能鑒定出對應(yīng)于外顯子4的序列。Can f4屬于脂質(zhì)運載蛋白超家族，且顯示出與牛(XP_581277)和豬[16] (NP_998961)的氣味結(jié)合蛋白38-39%的序列相同性。Can f4和Bos d 23k的氨基酸序列比對如圖10所示。注意到，除了類似或相同殘基的分散模式，蛋白的C末端部分以及兩個半胱氨酸殘基(Can f4中的位置62和154)高度保守。作為脂質(zhì)運載蛋白特征的其它保守元件[17]包括臨近N末端的GxW基序(位置13-15)、甘氨酸殘基(位置118)。脂質(zhì)運載蛋白的另一典型基序[17]kxxYxG存在于Bos d 23k(位置74-80)中，但在Can f4中僅部分保守。有趣地，盡管屬于相同的蛋白家族，但Can f4僅顯示出與Can f 1和Can f2分別為和的氨基酸序列相同性。重組Canf4的產(chǎn)生不包括信號肽的重組Can f4在大腸桿菌中作為C末端6個組氨酸標記蛋白表達。 重組蛋白通過IMAC和AIEC從可溶性細胞級分中純化。為了評估重組蛋白的聚集狀態(tài)，對制備物的樣品以及同時對天然的純化天然Can f4進行分析SEC。如圖5A所示，在兩種情況中， 色譜圖以單一對稱峰為主，對應(yīng)于約16. 5kDa的MW，由所用校準器所定義。在SDS-PAGE (圖 5B)中，天然和重組的Can f4均顯示出基于還原的遷移率的移位，這提示存在于蛋白中的兩個半胱氨酸殘基均參與到二硫鍵中。應(yīng)注意到，由最初免疫印跡分析表明的Can f4的表觀分子量(圖1)受到以下事實的影響，即將用于分析的狗毛皮垢屑提取物以非還原形式加入到分離凝膠中，導致涉及對蛋白大小的低估，所述蛋白大小由純化蛋白還原樣品的隨后分析所表明。與天然蛋白相比由Can f4顯示的大小增加與在重組蛋白中加入C末端6個組氨酸標記和幾乎完全保留起始的甲硫氨酸殘基相一致。特異性IgE抗體與狗過敏癥對象中rCan f4結(jié)合的分析對比從狗毛皮垢屑純化的天然蛋白來評價重組Can f4的免疫活性。將每種蛋白固定在ImmimoCAP 固相上，且使用來自37名狗過敏癥對象的血清樣品檢驗它們的IgE抗體結(jié)合(圖5C)。兩個數(shù)據(jù)組顯示出非常強的相關(guān)性(r = 0. 99)，這表明對于IgE抗體結(jié)合決定簇，重組過敏原十分類似于其天然對應(yīng)體。圖6說明了與其它狗毛皮垢屑過敏原相比，IgE抗體對Can f4反應(yīng)性的頻率和數(shù)量級。狗過敏癥對象和它們的致敏模式上更全面的數(shù)據(jù)組顯示在表2中。在所分析的37 個血清中，13個(35% )顯示出IgE抗體結(jié)合Can f4。13個Can f4反應(yīng)性血清中的一個顯示IgE不結(jié)合所測試的其它狗過敏原?？稍贑an f4和Can Π或Can f2之間觀察到在 IgE結(jié)合中無相關(guān)性，這與它們高度分歧的一級結(jié)構(gòu)相一致。實驗Can f4 ImmimoCAP測試的分析特異性通過基于測試用至多3000kU/L骨髓瘤IgE突起化的陰性對照血清獲得的低結(jié)果來表明(表3)。為了檢查Can f4特異性IgE抗體在對狗不過敏的遺傳性過敏癥個體中的存在，測試未診斷或未報導有狗過敏癥癥狀的44名花粉過敏癥對象的血清，以及可獲得的全部狗過敏原組分和一系列花粉提取物(表4)。那些血清中的7個(16%)顯示出對狗毛皮垢屑提取物為陽性應(yīng)答，有一個在2kUA/L或更低的水平的例外，其中之一也顯示IgE抗體結(jié)合 rCan f4。對狗毛皮垢屑為陰性的血清未顯示出對rCan f4為陽性應(yīng)答。rCan f4和Bos d 23k之間的交叉反應(yīng)性為了研究在IgE抗體結(jié)合中由它們相關(guān)性所表明的Can f4和Bos d 23k之間交叉反應(yīng)性的程度，通過三種牛蛋白反應(yīng)性血清進行IgE抑制實驗。純化的牛蛋白附著于 ImmunoCAP固相，且測量來自用rCan f4或緩沖液預孵育的血清的IgE結(jié)合。從圖7中可見，在全部三個血清中rCan f4幾乎完全(彡96% )抑制IgE結(jié)合母牛毛皮垢屑蛋白，這表明由實驗中所用血清識別的結(jié)合牛蛋白的IgE的全部決定簇被rCan f4共享。討論如本申請所述，我們已經(jīng)分離、克隆并表征了來自狗毛皮垢屑的IgE結(jié)合蛋白，將其稱為Can f4。在本工作之前，僅知道此過敏原的13個殘基的N末端序列。發(fā)現(xiàn)Can f4 屬于不同的脂質(zhì)運載蛋白，且顯示出與包括母牛和豬的其它物種的氣味結(jié)合蛋白具有相似性。發(fā)現(xiàn)Can f4與從母牛毛皮垢屑純化的23kDa氣味結(jié)合蛋白交叉反應(yīng)。天然Can f4的純化導致很差的產(chǎn)率，這源于蛋白在毛皮垢屑提取物中的缺乏和低色譜分辨率。Can f4在RPC中若干峰中的存在和寬Can f4峰在CIEC步驟中的存在表明蛋白的一些異質(zhì)性程度。雖然對此特性存在一些解釋，包括蛋白修飾、部分降解和存在同種型，但N連接的糖基化是不可能的，因為Can f4序列不包含用于N-聚糖結(jié)合的潛在位點。 在所得的四種胰蛋白酶解肽序列中，與從cDNA克隆和所鑒定的基因組區(qū)段推斷出的氨基酸序列相比，一種肽序列顯示出在2個位置處的背離。因此，即使在7個獨立的cDNA克隆的 DNA測序中未獲得序列可變性的證據(jù)，但仍可能在天然蛋白純化期間同種型變化已導致所觀察到的異質(zhì)性。此外，胰蛋白酶解片段測序和MALDI-T0F分析共同確認從cDNA克隆推斷出的58%的氨基酸序列，這提示出有限的多態(tài)性。即使不能排除所鑒定的其它Can f4相關(guān)基因組區(qū)段中的至少一種被表達且可引起Can f4的變體形式，我們對此僅指出背離cDNA 編碼序列的胰蛋白酶解片段1的兩個氨基酸殘基的匹配。沒有優(yōu)先與其它Can f4相關(guān)區(qū)段和全部cDNA克隆匹配的其它肽序列明確地源于Can f4基因，對于此Can f4基因，本申請中詳述了核苷酸位置。無論可能的同種型變化，所產(chǎn)生的Can f4的重組形式在生物化學和免疫學上顯示出與純化的天然蛋白高度一致。在分析SEC中以確切的相同體積洗脫的兩種蛋白和它們的 IgE抗體結(jié)合顯示出很高的相關(guān)性。最重要地，未觀察到IgE結(jié)合天然過敏原以及重組過敏原的例子。事實上，對具有重組蛋白的實驗測試觀察到略高的IgE結(jié)合，但這很可能是因為由差的純化產(chǎn)率導致的低于天然蛋白的最佳偶聯(lián)濃度。作為狗毛皮垢屑過敏原的Can f4的重要性通過對來自37名狗過敏癥對象的血清進行ImmimoCAP測試來評價。在包括相同種群的最近研究中，我們報導了 49%顯示出IgE 抗體結(jié)合Can fl，22%顯示出IgE抗體結(jié)合Can f2，16%顯示出IgE抗體結(jié)合Can f3且 70%顯示出IgE抗體結(jié)合Can f5。在此工作中，我們發(fā)現(xiàn)37名對象中的13名(35% )對 Can f4致敏。因此，Can f4得到比rCan f2禾口 nCan f3更普遍的認識，rCan f2禾口 nCan f3 在本研究種群中表現(xiàn)為次要過敏原。在13個Can f4反應(yīng)性血清中，一個顯示IgE不結(jié)合所測試的其它狗過敏原，這提示Can f4可作為狗過敏癥中的獨立致敏物質(zhì)以及組分分解診斷的重要補充而相關(guān)聯(lián)。此觀念得到Can f4相比于Can f 1和Can f2在序列和IgE結(jié)合中均具有獨特性的支持。沒有狗過敏癥的44例花粉過敏癥對照中僅一例顯示出對Can f4 弱的IgE抗體應(yīng)答，此事實提示此過敏原的IgE識別并不由于其它氣源性過敏原致敏的原因經(jīng)常發(fā)生。相對于狗毛皮垢屑提取物，母牛毛皮垢屑提取物似乎包含更高含量的過敏原，因此給出了更令人滿意的純化結(jié)果。從母牛毛皮垢屑提取物的SDS-PAGE分析判斷，10-40kDa 范圍內(nèi)的主要抗原為Bos d 2和本文所報導的23kDa蛋白(Bos d 23k)，二者似乎以相似的量存在。Bos d 2已被很好地確立為母牛毛皮垢屑中的主要過敏原，作為重組過敏原產(chǎn)生并在結(jié)構(gòu)上表征[18-22]。相反，有關(guān)Bos d 23k所知甚少，雖然其與之前報導的通過母牛毛皮垢屑提取物免疫印跡分析所揭示的IgE結(jié)合的、22kDa蛋白帶相同[21-23]。Bos d 23k的巧4個殘基的氨基酸序列預測出17. 8kDa的分子量，這幾乎完全與 Can f4的分子量相同。盡管有此事實，其在SDS-PAGE中顯示出比Can f4顯著低的遷移率。 由于兩種蛋白在序列上相關(guān)且可被假定具有類似的折疊，糖基化的差異或許將是所觀察到的電泳不一致的可能解釋。確實，序列的檢查揭示Bos d 23k在成熟蛋白的天冬酰胺殘基 45位處包含潛在的N糖基化位點，而其不存在于Can f4的序列中。在已知的狗和母牛毛皮垢屑過敏原中，血清白蛋白(分別為Can f3和Bos d 6) 代表唯一被很好認可的對其它物種過敏原的交叉反應(yīng)性。因此，Can f4和Bos d 23k之間的交叉反應(yīng)性提供了狗和母牛毛皮垢屑過敏原之間的新型免疫學聯(lián)系?？紤]到它們相對低水平的整體序列相同性(37%)，二種蛋白之間廣泛的交叉反應(yīng)性似乎有些使人驚奇。然而，有可能所觀察的交叉反應(yīng)性是因為蛋白的部分具有比整體評分更高的序列相似性。特別地，兩種蛋白的C末端部分顯著保守，其中在位置136/133和155/152之間20個殘基的區(qū)段顯示出75%的相同性。盡管兩種蛋白之間有可論證的交叉反應(yīng)性，但對于所測試的全部血清，IgE對Can f4的應(yīng)答比對Bos d 23k的應(yīng)答更高，這暗示在我們研究的種群中Can f4是主要的致敏物質(zhì)，而非Bos d23k?？傊?，本申請報導了狗過敏原Can f4的克隆和表征。重組Can f4對狗過敏癥的組分分解診斷很重要，且其與大量牛毛皮垢屑蛋白的交叉反應(yīng)性在過敏癥與狗和母牛毛皮垢屑之間建立起可能的聯(lián)系。表1Can f4蛋白片段鑒定
權(quán)利要求
1.重組產(chǎn)生的Canf4過敏原，或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段。
2.核酸，其編碼權(quán)利要求1的Canf4過敏原或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段。
3.權(quán)利要求2的核酸，其具有SEQID NO 1的序列。
4.載體，其包括權(quán)利要求2或3的核酸分子。
5.宿主細胞，其包括權(quán)利要求4的載體。
6.重組產(chǎn)生的Canf4過敏原或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段，其用于體外診斷I型過敏癥。
7.產(chǎn)生過敏原組合物的方法，包括將重組產(chǎn)生的Canf4過敏原或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段加入至包括過敏原提取物和/或至少一種純化的過敏原組分的組合物中的步驟。
8.通過權(quán)利要求7的方法獲得的過敏原組合物。
9.用于體外診斷I型過敏癥的方法，包括以下步驟-使來自疑似患有I型過敏癥的患者的體液樣品接觸重組產(chǎn)生的Can f4過敏原、或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段、或權(quán)利要求8的過敏原組合物；和-檢測樣品中特異性結(jié)合所述Can f4過敏原或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段的IgE抗體的存在，其中特異性結(jié)合所述Can f4過敏原或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段的此IgE抗體的存在表明存在I型過敏癥。
10.用于進行權(quán)利要求9的方法的診斷試劑盒，包括重組產(chǎn)生的Canf4過敏原、或其與 Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段、或權(quán)利要求8的組合物。
11.治療哺乳動物I型過敏癥的方法，包括給對此治療敏感的個體施用重組產(chǎn)生的Can f4過敏原、或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段、或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式的所述Can f4過敏原、或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段。
12.權(quán)利要求11的方法，特征在于所述哺乳動物為犬。
13.藥物組合物，包括重組產(chǎn)生的Canf4過敏原、或其與Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段、或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式的所述Can f4過敏原、或其與 Can f4過敏原共享抗體表位的變體或片段。
14.用于診斷的重組產(chǎn)生的Canf4過敏原，其具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
15.用于治療的重組產(chǎn)生的Canf4過敏原，其具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
16.重組產(chǎn)生的Bosd 23k過敏原，或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段，其用于體外診斷I型過敏癥。
17.產(chǎn)生過敏原組合物的方法，包括將重組產(chǎn)生的Bosd 23k過敏原或其與Bos d 23k 過敏原共享抗體表位的變體或片段加入至包括過敏原提取物和/或至少一種純化的過敏原組分的組合物中的步驟。
18.通過權(quán)利要求17的方法獲得的過敏原組合物。
19.用于體外診斷I型過敏癥的方法，包括以下步驟-使來自疑似患有I型過敏癥的患者的體液樣品接觸重組產(chǎn)生的Bos d23k過敏原、或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段、或權(quán)利要求18的過敏原組合物；和-檢測樣品中特異性結(jié)合所述Bos d 23k過敏原或與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的其變體或片段的IgE抗體的存在，其中特異性結(jié)合所述Bos d 23k過敏原或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段的此IgE抗體的存在表明存在I型過敏癥。
20.用于進行權(quán)利要求19的方法的診斷試劑盒，其包括重組產(chǎn)生的Bosd 23k過敏原、 或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段、或權(quán)利要求18的組合物。
21.治療哺乳動物I型過敏癥的方法，包括給對此治療敏感的個體施用重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原、或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段、或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式的所述Bos d 23k過敏原、或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段。
22.權(quán)利要求21的方法，特征在于所述哺乳動物為牛。
23.藥物組合物，包括重組產(chǎn)生的Bosd 23k過敏原、或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段、或其IgE結(jié)合應(yīng)答被消除或減弱的修飾形式的所述Bos d 23k過敏原、或其與Bos d 23k過敏原共享抗體表位的變體或片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及過敏癥的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及從哺乳動物中鑒定新型過敏原以及針對哺乳動物過敏癥的診斷和治療。具體地，本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生的Can f4過敏原以及其在用于體外診斷和治療過敏癥的診斷組合物和方法中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步涉及重組產(chǎn)生的Bos d 23k過敏原以及其在用于體外診斷和治療過敏癥的診斷組合物和方法中的應(yīng)用。
文檔編號A61P11/06GK102459323SQ201080025013
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者J·利德霍爾姆, L·馬特松, T·隆格倫 申請人:法蒂亞公司