專利名稱：通過抑制微粒的分泌治療aids或癌癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求享有于2009年6月12日提交的編號(hào)為61/213，471的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)和于2010年5月20日提交的編號(hào)為12/783，829的美國(guó)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。前述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引用的方式并入本文。本發(fā)明主要涉及醫(yī)學(xué)療法，且具體而言，涉及一種通過抑制微粒的分泌治療AIDS 或腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
膜囊泡是球形膜微粒，通常直徑小于200nm。該微粒由包含胞質(zhì)成分的脂雙層構(gòu)成。更具體地，個(gè)別的膜囊泡由細(xì)胞產(chǎn)生，從胞內(nèi)區(qū)室起通過與細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜融合，致使它們釋放到生物體的胞外生物流體或者到培養(yǎng)細(xì)胞的上層清液中。這些小囊泡/微?？梢砸远喾N方式釋放。經(jīng)典分泌途徑通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜對(duì)主要的傳統(tǒng)的攜帶膜信號(hào)的受體進(jìn)行加工(Lee 等人，(2004)Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20，87-123)。將分泌性蛋白質(zhì)裝配成運(yùn)輸小泡，遞送到高爾基體，并最終釋放到細(xì)胞外間隙?；蛘?，非經(jīng)典分泌途徑存在并介導(dǎo)胞質(zhì)、非信號(hào)攜帶分子向細(xì)胞外間隙的轉(zhuǎn)運(yùn) (Lippincott-Schwartz 等人，(1989)Cell 56,801-813 ；and Misumi 等人，(1986) J Biol. Chem. 261，11398-11403)。這些中的兩種涉及內(nèi)吞膜系統(tǒng)的胞內(nèi)囊泡，如分泌性溶酶體 (Muesch 等人，(1990) Trends Biochem. Sci. 15，86-88)和外來體(Johnstone 等人，(1987) J.Biol. Chem. 262，9412-9420)，后者為晚期胞內(nèi)體或多泡體(MVB)的內(nèi)囊泡。當(dāng)專門的內(nèi)吞結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的分泌性溶酶體)與質(zhì)膜融合時(shí)，溶酶體內(nèi)含物進(jìn)入細(xì)胞外部。當(dāng)MVB與質(zhì)膜融合時(shí)，晚期內(nèi)吞結(jié)構(gòu)的腔內(nèi)含物被釋放到細(xì)胞外間隙，導(dǎo)致內(nèi)部的多囊泡胞內(nèi)體連同它們的貨物分子一起釋放到細(xì)胞外間隙(稱作外來體)。其他的非經(jīng)典途徑包括利用蛋白質(zhì)傳導(dǎo)通道或者稱作膜起泡的過程直接運(yùn)輸胞質(zhì)因子穿過質(zhì)膜(Nickel， W. (2005)Traffic. 6，607-614)。膜起泡的特點(diǎn)是使質(zhì)膜衍生的微泡流出到細(xì)胞外間隙。已經(jīng)證實(shí)微粒在各種各樣的生理環(huán)境中從不同類型的細(xì)胞中釋放。已經(jīng)證實(shí)， 腫瘤細(xì)胞以攜帶腫瘤抗原并且能夠呈遞這些抗原或?qū)⑺鼈儌鬟f到抗原呈遞細(xì)胞的有規(guī)則方式來分泌微粒(第W099/03499號(hào)專利申請(qǐng))，如外來體(exosome)；腫瘤細(xì)胞源外來體 (texosome)，Tex 或腫瘤外來體(Yu 等人，(2007) J. Immunol. 178,6867-6875)。這些微粒由腫瘤細(xì)胞釋放并且通過殺死免疫細(xì)胞或使腫瘤生長(zhǎng)的反調(diào)節(jié)而引起免疫抑制。已發(fā)現(xiàn)， 這些含有hsL或TNF的外來體的釋放成為一種機(jī)制，通過這種機(jī)制腫瘤促進(jìn)免疫赦免/ 免疫抑制的狀態(tài)?；蛘撸扬@示感染HIV的細(xì)胞釋放含Nef的小囊泡(Guy等人，(1990) Virologyl76,413-425 ；and Campbell 等人，(2008)Ethn. Dis. 18，S2-S9)。我們假定這些小囊泡與HIV使用的類似，它們使免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常從而使HIV存活。最終，有人已提出胞內(nèi)體運(yùn)輸途徑還涉及從受感染細(xì)胞中釋放病毒體(Sanfridson等人，(1997)Proc. Natl. Acad. ki. U. S. A94，873-878 ；以及 Esser 等人，(2001) J Virol. 75，6173-6182)。因此，在 HIV感染過程中，涉及數(shù)個(gè)小囊泡釋放途徑的胞內(nèi)體途徑同時(shí)對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和受感染細(xì)胞的病毒體釋放起到雙重作用。獲得可用于減輕或抑制微粒/小囊泡釋放的有效方法將是特別有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種抑制從細(xì)胞中釋放微粒的新肽。所述肽的長(zhǎng)度為 10-100個(gè)氨基酸并且包含(1)位于N末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序，或者O) 位于C末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序，或者(3)至少兩個(gè)VGFPV (SEQ ID NO: 1)基序。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含位于N末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID N0:1)基序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含位于C末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO=D基序。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含至少兩個(gè)VGFPV(SEQ ID NO=D基序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含氨基酸序列VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO :2)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽具有 H2N-VGFPVAAVGFPVOTKDDDDK-0H(SEQ ID NO 3)的序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種編碼本發(fā)明的新肽的多核苷酸和攜帶編碼本發(fā)明的新肽的多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療AIDS或腫瘤的藥物組合物。所述藥物組合物包含(1) 一種肽或編碼這種肽的表達(dá)載體，所述肽的長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸并且包含 (a)位于N末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO :1)基序，或者(b)位于C末端的至少一個(gè) VGFPV (SEQ ID NO 1)基序，或者(c)至少兩個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序的肽；和(2)可藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療AIDS的方法。所述方法包括向需要這種治療的患者施用有效量的含有至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序且長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療腫瘤的方法。所述方法包括向需要這種治療的患者施用有效量的含有至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序且長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸的肽。


圖1為復(fù)合圖，其顯示合成HIV-I NefSMRwt肽(拮抗物)和HIV-1 NefSMRmt肽 (陰性對(duì)照)(圖A)；表達(dá)與GFP融合的HIV-I NefSMRwt肽或與GFP融合的HIV-I NefSMRmt 肽的載體構(gòu)建體(圖B)；以及在用HIV-I NefSMRwt肽(圖C)或SMRmt肽(圖D)轉(zhuǎn)染的 MDA-MB-231細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶(外來體的標(biāo)記)的數(shù)量。未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞用作陰性對(duì)照。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。將一毫升上清液在400，OOOxg下旋轉(zhuǎn)。 在PAGE上跑上清液顆?；蚪o定體積的細(xì)胞裂解物，印跡，以及用抗-AchE mAb (乙酰膽堿酯酶-1 1000稀釋；外來體的標(biāo)記)探測(cè)。用抗微管蛋白mAb(l 4000)再次探測(cè)細(xì)胞裂解物。通過光密度計(jì)測(cè)量譜帶，針對(duì)胞內(nèi)微管蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。在此顯示的數(shù)據(jù)為相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的對(duì)照的百分比。圖2為顯示在HEK293細(xì)胞中HIV_1 NefSMRwt肽對(duì)抗NefGFP釋放的圖。圖3A和3B為顯示在Jurkat細(xì)胞中HIV-1 NefSMRwt肽對(duì)抗NefGFP釋放的圖。圖4A為顯示在Jurkat細(xì)胞(圖A)、HEK293細(xì)胞(圖B) ,THP-I單核細(xì)胞(圖C)和U937單核細(xì)胞(圖D)中pM濃度的ELISA分析的復(fù)合圖。圖4B為顯示在Jurkat細(xì)胞中通過SMRwt肽(圖A)而不是通過SMRmt肽(圖B)阻斷pM釋放的共焦顯微鏡照片的復(fù)合圖。圖4C為顯示在Jurkat細(xì)胞中用R7和SMRwt肽(圖A-1)或用R7和SMRmt肽(圖 B-1)轉(zhuǎn)染后6天病毒顆粒分布的共焦電子顯微鏡照片的復(fù)合圖。圖4D為顯示在Jurkat細(xì)胞中用R7和SMRwt肽(圖A-2)或用R7和SMRmt肽(圖B-2)轉(zhuǎn)染后14天病毒顆粒分布的共焦電子顯微鏡照片的復(fù)合圖。圖4E為顯示在Jurkat細(xì)胞中用R7和SMRwt肽(圖A-1) 或用R7和SMRmt肽(圖B-1)轉(zhuǎn)染后6天以及在Jurkat細(xì)胞中用R7和SMRwt肽(圖A-2) 或用R7和SMRmt肽(圖B-2)轉(zhuǎn)染后14天Jurkat細(xì)胞中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中病毒顆粒分布的共焦電子顯微鏡照片的復(fù)合圖。圖5為顯示在用R7/SMRwt(圖Α)或R7/SMRmt (圖B)轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞中Nef 和PM的蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot analysis)的復(fù)合圖片。圖6為顯示在用R7/SMRwt(圖Α)或R7/SMRmt (圖B)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中Nef 和M4的蛋白質(zhì)印跡分析的復(fù)合圖片。圖7為顯示在用R7/SMRwt(圖Α)或R7/SMRmt (圖B)轉(zhuǎn)染的THP-I單核細(xì)胞中 Nef和pM的蛋白質(zhì)印跡分析的復(fù)合圖片。圖8為顯示在用R7/SMRwt (圖Α)或R7/SMRmt (圖B)轉(zhuǎn)染的U937單核細(xì)胞中Nef 和P24的蛋白質(zhì)印跡分析的復(fù)合圖片。圖9為在Jurkat細(xì)胞(圖A)、HEK293細(xì)胞(圖B)、THP-I單核細(xì)胞(圖C)和 U937單核細(xì)胞(圖D)中Nef和pM的蛋白質(zhì)印跡分析的復(fù)合圖。圖10為用R7病毒DNA/SMRwt肽(圖Α)或R7病毒DNA/SMRmt肽(圖B)轉(zhuǎn)染的 Magi/CXCR4細(xì)胞的復(fù)合圖片。圖11為顯示在Jurkat細(xì)胞(圖A)、HEK293細(xì)胞(圖B) ,THP-I單核細(xì)胞(圖C) 和U937單核細(xì)胞(圖D)中Magi測(cè)定病毒侵染性的復(fù)合圖。圖12為顯示用SMRwt或SMRmt 肽轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果的復(fù)合圖片。圖A-I和B-I 用碘化丙啶分別對(duì)SMRwt和 SMRmt肽轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色。圖A-2和B-2 用熒光素二乙酸酯分別對(duì)SMRwt和SMRmt肽轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色。圖A-3和B-3 用相差顯微鏡分別對(duì)SMRwt和SMRmt肽轉(zhuǎn)染的細(xì)胞成像。圖13為顯示用SMRwt或SMRmt肽(圖A)的免疫沉淀作用和通過蛋白質(zhì)印跡識(shí)別 75kD SMR-特異性蛋白質(zhì)的復(fù)合圖片。圖14為顯示Mortalin抗體抑制Nef分泌的圖。圖15為顯示用于監(jiān)測(cè)SMR肽或未知化合物對(duì)Nef分泌的影響的共轉(zhuǎn)染測(cè)定的圖。圖16為顯示用于監(jiān)測(cè)SMR肽或未知化合物對(duì)腫瘤囊泡分泌的影響的共轉(zhuǎn)染測(cè)定的圖。
具體實(shí)施例方式當(dāng)本發(fā)明可以以許多不同形式體現(xiàn)時(shí)，在此更加詳細(xì)地說明本發(fā)明的具體優(yōu)選的實(shí)施方式。這種說明是本發(fā)明的原理的范例，而不是將本發(fā)明限于所描述的具體的實(shí)施方式。已知細(xì)胞運(yùn)輸途徑涉及HIV的生命周期和腫瘤發(fā)展(Grossman等人，Q002)Nat. Med. 8,319-323)。例如，某些腫瘤細(xì)胞釋放的外來體使宿主的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常，從而使腫瘤生長(zhǎng)和增殖。目前，沒有可行的針對(duì)微粒運(yùn)輸途徑和操縱/抑制微粒從細(xì)胞中釋放的技術(shù)。本發(fā)明利用與細(xì)胞因子相互作用并操縱運(yùn)輸途徑的HIV-Nef序列，以阻斷細(xì)胞產(chǎn)生微粒的能力。肽本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種新的抑制從細(xì)胞中釋放微粒的肽。所述肽的長(zhǎng)度為 10-100個(gè)氨基酸并且包含(1)位于N末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序，或者O) 位于C末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序，或者(3)至少兩個(gè)VGFPV (SEQ ID NO: 1)基序。下文所用術(shù)語“微?！笔侵讣?xì)胞運(yùn)輸途徑涉及的微載體(microvehicle)。所述微粒通常由含有胞質(zhì)部分的脂雙層組成，并且直徑一般小于200nm。微粒的實(shí)例包括，但不限于，外來體、腫瘤細(xì)胞源外來體，以及Tex或腫瘤外來體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含至少兩個(gè)SEQ ID N0:1基序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含氨基酸序列VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO :2)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽具有 H2N-VGFPVAAVGFPVOTKDDDDK-0H(SEQ ID NO 3)的序列。本發(fā)明的肽可以化學(xué)合成或者使用重組DNA技術(shù)制造(例如，由宿主細(xì)胞表達(dá)和純化)。合成肽或使用重組DNA技術(shù)制造肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。表達(dá)載體本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種編碼本發(fā)明的新肽的多核苷酸和攜帶編碼本發(fā)明的新肽的多核苷酸的表達(dá)載體。術(shù)語“表達(dá)載體”是指以適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸的形式的包含編碼本發(fā)明的新肽的多核苷酸的非病毒或病毒載體。非病毒載體的一種類型為“質(zhì)粒”，其包括其中可以連接添加的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在本說明書中，由于質(zhì)粒是載體最常使用的形式，所以“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以交換使用。表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，其基于要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選擇，并可操作地與要表達(dá)的多核苷酸序列連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞從而制造蛋白質(zhì)或肽，例如本發(fā)明的新肽。本文所用術(shù)語“控制序列”或“調(diào)節(jié)序列”是指在特定的宿主生物體中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。術(shù)語“控制/調(diào)節(jié)序列”意欲包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))?？刂?調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中定向組成型表達(dá)的核苷酸序列和只在某些宿主細(xì)胞中定向表達(dá)的核苷酸序列(例如，組織特異性的調(diào)節(jié)序列)。當(dāng)核酸序列與另一核酸序列處于功能關(guān)系時(shí)，該核酸序列“可操作地連接”所述另一核酸序列。例如，如果多肽的DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則將前序列或分泌引導(dǎo)肽的DNA可操作地連接所述多肽的DNA ；如果編碼序列影響序列的轉(zhuǎn)錄，則將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接所述編碼序列；或者如果設(shè)置編碼序列是為了促進(jìn)翻譯，則將核糖體的結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接所述編碼序列。通常，“可操作地連接”指的是被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌引導(dǎo)的情況下是連續(xù)的且在閱讀相中。然而，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。連接是通過在便利的限制酶切位點(diǎn)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。如果這些位點(diǎn)不存在，則按照常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸接頭或連接體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠優(yōu)先地在特定細(xì)胞類型(例如，使用組織特異性調(diào)節(jié)元件表達(dá)多核苷酸)中定向表達(dá)多核苷酸。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域中已知的并且可以包括上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。適合的組織特異性啟動(dòng)子的其他的非限定性實(shí)例包括肝特異性啟動(dòng)子(例如，白蛋白啟動(dòng)子)、淋巴特異性啟動(dòng)子、T細(xì)胞受體和免疫球蛋白的啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子)、胰特異性啟動(dòng)子(例如，胰島素啟動(dòng)子)和乳腺特異性啟動(dòng)子(例如，乳清啟動(dòng)子)。發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(例如，α-胎兒球蛋白啟動(dòng)子)也包括在內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體為病毒載體。病毒載體的實(shí)例包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體和α病毒載體。病毒載體也可為星狀病毒、冠狀病毒、正粘液病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒病毒載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可以使用調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的肽。調(diào)節(jié)治療性基因表達(dá)的系統(tǒng)已被開發(fā)出并已將其并入當(dāng)前病毒和非病毒基因遞送載體。這些系統(tǒng)簡(jiǎn)要地描述如下Tet-開/關(guān)系統(tǒng)。Tet系統(tǒng)是基于源自大腸桿菌TnlO轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素抗性操縱子的兩個(gè)調(diào)節(jié)元件Tet阻遏蛋白(TetR)和與1TetR結(jié)合的Tet操縱基因DNA序列(tetO)。 該系統(tǒng)由兩個(gè)部件組成，“調(diào)節(jié)基因”和“報(bào)告基因”質(zhì)粒。“調(diào)節(jié)基因”質(zhì)粒編碼包含與單純皰疹病毒的VP16活化域融合的突變型Tet阻遏物(rtetR)的雜化蛋白。“報(bào)告基因”質(zhì)粒包含控制選擇的“報(bào)告”基因的tet應(yīng)答元件(TRE)。在四環(huán)素的存在下，rtetR-VP16融合蛋白只能與TRE結(jié)合，因此激活了 “報(bào)告”基因的轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)已被引入包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、 腺病毒和AAV的多種病毒載體中。蛻皮激素系統(tǒng)。蛻皮激素系統(tǒng)是基于在果蠅中發(fā)現(xiàn)的蛻皮誘導(dǎo)系統(tǒng)，但是為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可誘導(dǎo)地表達(dá)而進(jìn)行了改造。該系統(tǒng)使用果蠅留類激素蛻皮激素的類似物 (muristerone A)通過異二聚核受體激活目的基因的表達(dá)。已報(bào)道表達(dá)水平超過對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生理機(jī)能沒有影響的基礎(chǔ)水平200倍。黃體酮系統(tǒng)。黃體酮受體通常受激結(jié)合特異的DNA序列以及通過與其激素配體的相互作用來激活轉(zhuǎn)錄。與此相反，黃體酮拮抗物米非司酮(RU486)能夠阻斷激素誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)運(yùn)以及隨后的DNA結(jié)合。能夠通過與RU486的相互作用而受激結(jié)合的黃體酮受體的突變體形式已經(jīng)產(chǎn)生。為了產(chǎn)生特異的可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，黃體酮受體的RU486結(jié)合域已與酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域和HSV蛋白VP16的反式激活域融合。在沒有RU486的情況下，嵌合因子是無活性的。然而，激素的加入誘導(dǎo)了嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，并且這種變化使其結(jié)合到GAL4結(jié)合位點(diǎn)并激活了包含GAL4結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。雷帕霉素系統(tǒng)。免疫抑制劑(如Π(506和雷帕霉素)通過與特異的細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合并促進(jìn)它們的二聚而起作用。例如，雷帕霉素與Π(506結(jié)合蛋白(FKBP)的結(jié)合導(dǎo)致其與另一雷帕霉素結(jié)合蛋白FRAP的異二聚，這種現(xiàn)象可以通過除去藥物而逆轉(zhuǎn)。通過加入藥物使兩種蛋白質(zhì)集合的能力使其能夠調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，包括轉(zhuǎn)錄。嵌合DNA結(jié)合域已與 FKBP融合，從而使融合蛋白能夠與特異的DNA結(jié)合序列結(jié)合。轉(zhuǎn)錄激活域也已與FRAP融合。當(dāng)這兩種融合蛋白在相同的細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，可以通過由加入雷帕霉素介導(dǎo)的異二聚而形成全功能轉(zhuǎn)錄因子。然后二聚嵌合轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合合成的包含合成的DNA結(jié)合序列拷貝的啟動(dòng)子序列。該系統(tǒng)已被成功地整合到腺病毒和AAV載體中。在小鼠和狒狒體內(nèi)已實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期的可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)。通過感染(對(duì)于病毒載體)、轉(zhuǎn)染(對(duì)于非病毒載體)和其他的本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可以實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞中。其他遞送方法和媒介的實(shí)例包括與死病毒結(jié)合或分開的聚陽離子縮合DNA，配體結(jié)合的DNA，脂質(zhì)體，真核細(xì)胞遞送載體細(xì)胞(delivery vehicles cell)，光致聚合的水凝膠材料的沉積，手提式基因轉(zhuǎn)移基因槍， 電離輻射，核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。也可以利用粒子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。簡(jiǎn)言之，可以將 DNA序列插入到包含用于高水平表達(dá)的常規(guī)控制序列的常規(guī)載體中，然而與合成的基因轉(zhuǎn)移分子孵育，合成的基因轉(zhuǎn)移分子例如為與細(xì)胞靶向配體(如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或運(yùn)鐵蛋白)結(jié)合的聚合的結(jié)合DNA的陽離子(如聚賴氨酸、魚精蛋白和白蛋白)。也可以利用裸露DNA。使用生物可降解的膠乳珠可以提高裸露DNA的吸收效率。通過對(duì)所述珠進(jìn)行處理提高疏水性由此促進(jìn)內(nèi)體破裂，并使DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中從而可以進(jìn)一步改進(jìn)該方法。在某些實(shí)施方式中，將本發(fā)明的新肽與一種或多種抑制分泌的其他藥物引入到靶細(xì)胞中。這些藥物的實(shí)例包括，但不限于，二甲基氨氯吡咪、H+/Na+和Na+/Ca2+通道的抑制劑以及奧美拉唑、K+/H+ ATP酶抑制劑。藥物組合物本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療AIDS或腫瘤的藥物組合物。所述藥物組合物包含(1) 一種包含位于N末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序且長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸的肽或編碼這種肽的表達(dá)載體；和( 可藥用載體。在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含一種或多種抑制分泌的其他藥物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的一種或多種其他藥物包括二甲基氨氯吡咪或奧美拉唑，或同時(shí)包含二者。本文所用文字“可藥用載體”意欲包括與藥物施用可配伍的任何及全部溶劑、增溶齊 、填料、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、堿、緩沖劑、潤(rùn)滑劑、控制釋放賦形物、稀釋劑、乳化劑、濕潤(rùn)劑、潤(rùn)滑劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌或抗真菌劑、等滲吸收延遲劑等。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域眾所周知的。會(huì)考慮任何常規(guī)介質(zhì)或試劑在組合物中的使用，除非其與活性化合物不相容。還可以向組合物中加入補(bǔ)充的試劑。本發(fā)明的藥物組合物配制成與其施用的預(yù)定途徑相適合。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外，例如，靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下，經(jīng)口(例如，吸入)，經(jīng)皮(局部的)，經(jīng)粘膜和直腸施用。 用于腸胃外、真皮內(nèi)或皮下施用的溶液或混懸液可包括下列成分無菌稀釋劑，例如，注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他的合成溶劑；抗菌劑，例如，苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑，例如，抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，例如，乙二胺四乙酸；緩沖齊 ，例如，醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如，氯化鈉或葡萄糖?？梢允褂盟峄驂A(例如，鹽酸或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)ρΗ。腸胃外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。適合可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液或分散劑以及用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末。就靜脈內(nèi)施用而言，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、 Cremophor EL (BASF,Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，可注射的組合物應(yīng)當(dāng)是無菌的并且應(yīng)當(dāng)為能達(dá)到到易于溶液注射程度的流體。其在制造和貯藏條件下必須是穩(wěn)定的并且必須針對(duì)如細(xì)菌和真菌的微生物污染行為進(jìn)行防腐。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，例如，包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及它們的合適的混合物。例如，通過使用如卵磷脂的包衣、通過在分散的情況下保持所需的粒度或者通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過多種抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如，對(duì)羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)可以實(shí)現(xiàn)微生物行為的防止。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。通過使組合物中包含延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和凝膠)可以使可注射的組合物的延長(zhǎng)吸收。在具有上述列舉的成分的一種或組合的適當(dāng)?shù)娜軇┲屑尤胨枇康幕钚曰衔?(例如，SRPP片段或抗SRPP抗體)來制備無菌的可注射溶液，根據(jù)需要，之后再過濾滅菌。 通常，可以通過將活性化合物加入到包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的其他來自上述列舉的那些成分中的成分的無菌載體中來制備分散劑。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，這樣可以得到活性成分加任何附加的來自其預(yù)先過濾滅菌溶液中的所需成分的粉末。經(jīng)口的組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用的載體?？梢詫⑺鼈兎庋b在凝膠膠囊中或者壓制成片劑。為了經(jīng)口治療施用，可以將活性化合物與賦形劑結(jié)合并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。也可以使用用作嗽口水的流體載體來制備經(jīng)口的組合物，其中，流體載體中化合物經(jīng)口施用、發(fā)出嗖嗖聲、咳出或吞咽?？梢园帉W(xué)可配伍的結(jié)合劑和/或輔劑材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以包含任何下列成分或相似性質(zhì)的化合物粘合劑，例如，微晶纖維素、黃蓍樹膠或凝膠；賦形劑，例如，淀粉或乳糖；崩解劑，例如，藻酸、淀粉羥乙酸鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如，硬脂酸鎂或Mertes ；助流齊U，例如，膠體二氧化硅；甜味劑，例如，蔗糖或糖精；或者調(diào)味劑，例如，薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。為了通過吸入施用，將化合物以來自加壓容器或者包含適合的推進(jìn)劑(例如，如二氧化碳的氣體)的分配器或噴霧器中的噴霧劑的形式遞送。也可以通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮手段進(jìn)行全身施用。就經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用而言，在制劑中使用適合透入屏障的滲透劑。這種滲透劑是本領(lǐng)域中通常已知的，并且包括，例如，就經(jīng)粘膜施用而言，清潔劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。通過使用鼻腔噴霧或栓劑可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)粘膜施用。就經(jīng)皮施用而言，將生物活性化合物制成本領(lǐng)域中所熟知的軟膏劑、油膏劑、凝膠或乳膏劑。為了直腸遞送，還可以將化合物制備成栓劑(例如，含有如可可油和其他甘油酯的常規(guī)栓劑主要成分)或保留灌腸劑的形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用防止化合物由身體快速排出的載體(例如，控制釋放制齊U，包括埋植劑和微囊包埋遞送系統(tǒng))來制備可以包含生物活性化合物的治療部分。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這些制劑的制備方法將是明顯的。還可以商購(gòu)材料，例如，從Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂質(zhì)體混懸液(包括靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體，其攜帶有針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體)也可用作可藥學(xué)可接受載體。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以制備這些。為了易于施用和劑量統(tǒng)一，制成以劑量單位形式的經(jīng)口或腸胃外的組合物是特別有利的。此處所用的劑量單位形式包括適合作為要被治療的患者的單位劑量的物理上的離散單位；每個(gè)單位包含預(yù)定量的計(jì)算與必須的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生所需治療效果的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由活性化合物的獨(dú)特特性和所要實(shí)現(xiàn)的特定治療效果以及在合成這種用于個(gè)體治療的活性化合物的領(lǐng)域中的固有限制因素規(guī)定，或者直接取決于活性化合物的獨(dú)特特性和所要實(shí)現(xiàn)的特定治療效果以及在合成這種用于個(gè)體治療的活性化合物的領(lǐng)域中的固有限制因素。在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法可以確定這種化合物的毒性和治療效能，例如，確定LD50 (50%群體致死的劑量)和ED50(50%群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數(shù)并且它可以表示為L(zhǎng)D50/ED50比。優(yōu)選具有大的治療指數(shù)的化合物。盡管可以使用具有毒副作用的化合物，但是為了最小化對(duì)未受感染細(xì)胞的潛在損害并由此減少副作用，應(yīng)當(dāng)注意設(shè)計(jì)使這種化合物靶向受侵襲組織的部位的遞送系統(tǒng)。中從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)可以用于配制在人體中使用的劑量的范圍。這種化合物的劑量?jī)?yōu)選處于包括具有很少毒性或無毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。依據(jù)所利用的劑量形式和所采用的施用途徑，所述劑量在該范圍內(nèi)可以變化。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，可以從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中最初估計(jì)治療的有效劑量。在動(dòng)物模型中配制劑量以得到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(即達(dá)到癥狀的半最大抑制的試驗(yàn)化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可用于更加精確地確定人體內(nèi)的有用劑量。 例如，可以通過高效液相色譜法測(cè)量血漿水平。藥物組合物可以連同施用說明一起包含在容器、包裝或分配器中。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括制備調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的表達(dá)或活性的藥物組合物的方法。該方法包括配制藥學(xué)可接受載體和調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的表達(dá)或活性的藥劑。該組合物可進(jìn)一步包括額外的活性劑。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括通過配制藥學(xué)可接受載體和調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的表達(dá)或活性的藥劑和一種或多種額外的生物活性劑制備藥物組合物的方法。治療AIDS和腫瘤的方法本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療AIDS的方法。所述方法包括向需要這種治療的患者施用有效量的含有至少一個(gè)VGFPV基序且長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含至少兩個(gè)VGFPV (SEQ ID NO 1)基序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含氨基酸序列VGFPVAAVGFPV(SEQ ID NO :2)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽具有 H2N-VGFPVAAVGFPVOTKDDDDK-0H(SEQ ID NO 3)的序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種治療腫瘤的方法。所述方法包括向需要這種治療的患者施用有效量的含有位于N末端的至少一個(gè)SEQ ID N0:1基序且長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含至少兩個(gè)SEQ ID N0:1基序。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽包含 H2N-VGFPVAAVGFPVDYKDDDDK-0H (SEQ ID NO 3)的序列。通過下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。貫穿本申請(qǐng)引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)以及附圖和表格的內(nèi)容在此通過引用的方式并入。實(shí)施例1 腫瘤細(xì)胞中小囊泡分泌的抑制1-1.細(xì)胞和培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞分別源自人胸腺癌和人乳腺癌細(xì)胞，并且得自美國(guó)典型菌種收藏所(ManassasJA.)。將細(xì)胞維持在補(bǔ)充有鏈霉素(100U/ml)、青霉素(100U/ml)、L_谷氨酰胺 QmM)和 HEPES 緩沖鹽水溶液(30 μ M)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基(Invitrogen, Palo Alto, Calif.)中。1-2.抗體使用下列抗體⑴小鼠單克隆(MEM-28)抗CD45抗體(Abcam，Inc, Cambridge, ΜΑ) ； (ii)鼠科單克隆抗 HIV-I Nef 抗體(ImmunoDiagnostic, INC. ,Ma.) ； (iii)單克隆抗乙酰膽堿酯酶(AchE)抗體，克隆AE-l(CHEMIC0N，Ca.) ； (iv)單克隆抗微管蛋白抗體，克隆 B-5-1-2 (SIGMA, Mo.)和(ν)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG重鏈加輕鏈(H+L) (Pierce, Rockford, 111)。1-3.從MDA-MB-231細(xì)胞中分離和純化外來體通過Chariot 方法(Active Motif co. , Carlsbad, CA)用 SMRwt (H2N-VGFPVAAVG FPVDYKDDDDK-OH)(SEQ ID NO :3)、SMRmt(H2N-AGFPVAAAGFPVDYKDDDDK-0H) (SEQ ID NO :4)、 pQBI-SMRwt-GFP (圖 1 中的圖 B)或 pQBI-SMRmt-GFP (圖 1 中的圖 B)轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231 細(xì)胞 (3xl05)。兩種肽為商業(yè)制造(圖1中的圖A)。SMR序列在肽的N末端重復(fù)兩次，并且伴有短的二丙氨酸分開重復(fù)。接著SMR序列是使我們回收肽的C末端FLAG序列。然而，可以將任何序列插入C末端處。通過在pQBI載體(Qbiogen Inc.)的T7啟動(dòng)子和GFP編碼序列之間插入單拷貝的SMR wt序列或SMR mt序列分別產(chǎn)生pQBI-SMRwt-GFP(SEQ ID NO 5)禾口 pQB I-SMRmt-GFP (SEQ ID NO 6)構(gòu)建體。簡(jiǎn)言之，將Iyg肽加入到200 μ 1含有10 μ 1 Chariot溶液的無血清培養(yǎng)基中，充分混合，并在室溫下孵育30min。洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板。將400 μ 1的Chari0tTM/DNA/肽復(fù)合物加入到該培養(yǎng)板，接著加入1600μ 1的無血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37°C、5% CO2條件下孵育1 小時(shí)。將Iml完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)板中并將該板在37°C、5% CO2條件下孵育48小時(shí)。通過在2000xg下離心5min從培養(yǎng)物上清液中移除細(xì)胞。然后，將上清液在10，OOOg下旋轉(zhuǎn)30min以除去細(xì)胞碎片。將Iml的10，OOOg上清液置于離心管中并于4°C在50，OOOxg, 100，OOOxg和400，OOOxg下旋轉(zhuǎn)2小時(shí)以沉淀外來體。采用從未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞中同樣制備的上清液用作陰性對(duì)照。1-4.免疫印跡分析將沉淀物重懸浮于Ix SDS-PAGE加樣緩沖液中，通過SDS-PAGE分離。二十微升的各樣品在 4-20% Tris-HCl 標(biāo)準(zhǔn)預(yù)制凝膠(Bio-Red Laboratories, Hercules, CA)上通過SDS-PAGE分離，并電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將該膜在TBS中洗滌5min，而后用含有5%脫脂乳的TTBS (含有0. 吐溫20的TBQ在室溫下通過搖動(dòng)封閉lh，并使用一抗 (1 1000稀釋的抗乙酰膽堿酯酶(AchE)mAb)進(jìn)行免疫印跡，4°C下?lián)u動(dòng)過夜，接著再加入 HRP結(jié)合的IgG Ab(H+L)。通過蛋白質(zhì)印跡魯米諾試劑(Luminol Reagent) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.，Santa Cruz, CA)檢測(cè)蛋白質(zhì)帶。AchE檢測(cè)后，剝?nèi)ビ≯E并用CD45再次雜交。通過蛋白質(zhì)印跡魯米諾試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)帶，隨后曝光成照相膠片(BioMax film； Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.)。將圖像掃描到 Adobe Photoshop 6. 0，并用 Adobe Illustrator軟件(版本8. O ；Adobe系統(tǒng))排列以及使用Scion Image J軟件Release Beta 3b (Scion公司，F(xiàn)rederick，MD.)進(jìn)行光密度計(jì)測(cè)定。如圖1所示，拮抗物肽(HIV-1 NefSMRwt ；圖1中圖C)降低了 MDA-MB-231細(xì)胞的胞內(nèi)和細(xì)胞上清液中的AChE(測(cè)量腫瘤小囊泡的分泌)。數(shù)據(jù)還顯示了在兩個(gè)區(qū)室中的劑量依賴性。陰性對(duì)照(HIV-1 NEfSMRmut，圖1中圖D)對(duì)胞內(nèi)區(qū)室或上清液區(qū)室中的AChE 均無影響。以上結(jié)果顯示，HIV-1 NefSMRwt肽對(duì)抗從腫瘤細(xì)胞中釋放外來體小囊泡。已顯示這些小囊泡使癌癥患者的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常，使腫瘤細(xì)胞存活并生長(zhǎng)旺盛。外來體釋放的拮抗作用將使免疫系統(tǒng)自我修復(fù)并攻擊/殺死腫瘤。實(shí)施例2 :HIV-1 NEF轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的小囊泡分泌抑制盡管遺傳學(xué)研究清楚地顯示SMR基序突變消除Nef分泌，但是不清楚這種作用是由于SMR結(jié)合位點(diǎn)的破壞，還是只是結(jié)構(gòu)的改變而導(dǎo)致Nef蛋白錯(cuò)折疊。因此，進(jìn)行一組共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。使用Chariot將HEK293細(xì)胞用0. 5yg的pQBI-HIV Nef_GFP(表達(dá)野生型Nef蛋白)和0. 5 μ g的HIV-1 Nef SMRwt或SMRmut肽或sMl肽(完全隨機(jī)對(duì)照肽，ALAETCQNAWA(SEQ ID NO :7))共轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，用Chariot試劑在室溫下復(fù)合野生型 Nef-GFP克隆和SMR肽30分鐘。將DNA/肽/Chariot復(fù)合物加入到無血清培養(yǎng)基中的 HEK293細(xì)胞中，并將細(xì)胞鋪板。接著在37°C下孵育2小時(shí)，向平皿中加入含血清培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在37°C下孵育48小時(shí)。然后，收集培養(yǎng)基并使用熒光分光光度計(jì)對(duì)分泌進(jìn)行測(cè)定。 使用酶標(biāo)儀(plate reader)對(duì)來自這些培養(yǎng)物中的條件上清液的GFP熒光進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示為相對(duì)于NefGFP+sMl肽(陰性對(duì)照；100% )的熒光的百分比。如圖2中所示，HIV-1 NefSMRwt肽(從左起第一柱)對(duì)抗NefGFP釋放到胞外上清液。已經(jīng)顯示，NefGFP在胞外上清液中的外來體樣小囊泡中。陰性對(duì)照HIV-1 NefSMRmut 和sMl對(duì)小囊泡釋放沒有影響。這些結(jié)果證明，拮抗物阻斷了 HIV-1 Nef轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的釋放。數(shù)據(jù)說明這些小囊泡，類似于腫瘤細(xì)胞釋放的那些，破壞免疫系統(tǒng)或使免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常，使HIV生長(zhǎng)旺盛并最終導(dǎo)致AIDS發(fā)病。外來體釋放的拮抗作用將使免疫系統(tǒng)自我修復(fù)阻斷AIDS進(jìn)程。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用Chariot 將 Jurkat 細(xì)胞用 500ng HIV-IwtNef-GFP 禾口 7. 8-500ng的SMRwt肽共轉(zhuǎn)染。如圖3A所示，SMRwt肽抑制Jurkat細(xì)胞中的小囊泡分泌。 圖:3B為顯示SMRwt肽以劑量依賴方式抑制Jurkat細(xì)胞中的小囊泡分泌的劑量響應(yīng)曲線。實(shí)施例3 小囊泡分泌以及從感染HIV的細(xì)胞中釋放病毒體顆粒的抑制3.1 實(shí)驗(yàn) II.如下所示將Jurkat細(xì)胞共轉(zhuǎn)染(使用Chariot試劑盒轉(zhuǎn)染效率30-40% )#1. pNL4-3+Nef SMR wt (拮抗物)4 板#2. pNL4-3+Nef SMR mt (無功能拮抗物) 4 板#3. pNL4-3+sMl (陰性對(duì)照肽)4 板pNL4-3是含有病毒基因組的克隆。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中使病毒基因組表達(dá)并且最終病毒形成體并釋放。通過PM蛋白(病毒蛋白質(zhì))測(cè)量胞外上清液中產(chǎn)生的病毒體的數(shù)量。在感染后48小時(shí)和96小時(shí)收集樣本。在感染后48小時(shí)取出各組中的兩個(gè)板并通過以下分析a. p24 測(cè)定b. Nef 測(cè)定c.侵染性測(cè)定在感染后96小時(shí)取出各組中的另外兩個(gè)板并通過以下分析a.pM 測(cè)定b. Nef 測(cè)定c.侵染性測(cè)定如表I所示，96小時(shí)時(shí)在肽拮抗物(NefSMRwt)存在下病毒產(chǎn)生數(shù)量急劇減少，對(duì)陰性對(duì)照肽(NefSMRmut)沒有看出影響。數(shù)據(jù)說明，拮抗物阻斷了受感染細(xì)胞中病毒顆粒的產(chǎn)生和/或釋放。表1:實(shí)驗(yàn)I的結(jié)果
細(xì)胞時(shí)間樣本p24 pg/ml 效果fa/b)
Jurkat 48 小時(shí) pNL4-3+NefSMRwt (a)01
pNL4-3+NefSMRmut (a)01
pNL4-3+sMl (b)01
Jurkat 96 小時(shí) pNL4-3+NefSMRwt (a)O<0.033
pNL4-3+NefSMRmut (a)150.5
pNL4-3+sMl (b)301
29348 小時(shí) pNL4-3+NefSMRwt (a)902
pNL4-3+NefSMRmut (a)300.67
pNL4-3+sMl (b)451.0
293 96 小時(shí) pNL4-3+NefSMRwt (a)3450.359
pNL4-3+NefSMRmut (a)11251.17
pNL4-3+sMl (b)96013. 2 實(shí)驗(yàn) II使用ChariotTM試劑盒將Jurkat細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、THP-1單核細(xì)胞和U937單核細(xì)胞用R7或Nef SMR wt (拮抗物)或者用R7+Nef SMR mt (無功能拮抗物)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率為30-40%。R7是含有病毒基因組的克隆。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中使病毒基因組表達(dá)并且最終病毒形成體并釋放。通過p24蛋白(病毒蛋白質(zhì))測(cè)量胞外上清液中產(chǎn)生的病毒體的數(shù)量。在轉(zhuǎn)染后2小時(shí)、3天、6天、9天、13天、15天、17天、20天、23天、27天和36天，從各板中收集0.5ml上清液，與0.5ml新鮮培養(yǎng)基混合并通過p24 ELISA測(cè)定分析。從各板中收集1. 5ml上清液并在TLA100轉(zhuǎn)子中于400，OOOxg下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)以產(chǎn)生沉淀。該沉淀物用于蛋白質(zhì)印跡分析(用P24 mAb和Nef mAb)。如圖4A所示，在轉(zhuǎn)染后3天，在陰性對(duì)照(R7/SMRmt)中Jurkat細(xì)胞中的pM濃度增加，但是直到轉(zhuǎn)染后13天在SMRwt (拮抗物)培養(yǎng)物中才增加。在HEK293細(xì)胞和在 THP-I單核細(xì)胞中觀察到了相似的結(jié)果。在SMRwt轉(zhuǎn)染的U937單核細(xì)胞中有很少的p24， 說明該細(xì)胞不能清除SMRwt拮抗物。這些數(shù)據(jù)說明，SMRwt對(duì)抗病毒生長(zhǎng)或病毒從受感染細(xì)胞中釋放的一些方面。然而，SMRwt的作用似乎是暫時(shí)的?？磥黼S著時(shí)間的推移，Jurkat 和HEK細(xì)胞能夠降解該肽，而U937單核細(xì)胞不能降解該肽。通過使用不可降解的肽(例如，具有硫鍵的肽或d-對(duì)映異構(gòu)體(d-enatiomer)肽)可以克服肽的暫時(shí)性作用的問題。 圖4B是顯示在Jurkat細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染后3、6、10、14、17天通過R7/SMRwt (圖A)而不是通過 R7/SMRmt (圖B)阻斷pM釋放的共焦顯微鏡照片的復(fù)合圖。結(jié)果符合從ELISA/Western/ 和MAGI分析中獲得的數(shù)據(jù)。藍(lán)染色為核染色，紅染色為細(xì)胞質(zhì)染色，以及綠色FITC染色是針對(duì)P24蛋白的。與相同圖像中的陰性對(duì)照處理過的細(xì)胞相比，在第3、6、10天的圖像中可以看到拮抗物處理過的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中PM大量聚積。在第14和17天，p24開始像圖像中陰性對(duì)照處理過的細(xì)胞中的那樣。這符合在MAGI/Western/ELISA數(shù)據(jù)中出現(xiàn)pM被釋放的事實(shí)，正如我們所料，胞內(nèi)水平的肽被耗盡使病毒開始被釋放。圖4C-4E是顯示用R7/SMRwt或R7/SMRmt轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染后6天(圖 4C)和14天(圖4D)電子顯微鏡照片。在第6天，可以觀察到病毒顆?；蚝藲ぞ鄯e在用R7/ SMRwt處理過的細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞質(zhì)中以及MVB內(nèi)。在這些細(xì)胞的胞外表面上不能觀察到病毒顆粒(圖4C中圖A-I和)。相反，在用R7/SMRmt處理過的細(xì)胞內(nèi)部可以觀察到非常少的 MVB，觀察到的大多數(shù)病毒顆粒聚積在細(xì)胞的胞外表面上并極化到細(xì)胞的南極(圖4C中圖 B-1)。在第14天，可以觀察到病毒顆粒聚積在用R7/SMRwt (圖4D中圖A-2)處理過的細(xì)胞的胞外表面上，非極化地貫穿整個(gè)膜表面，如在用R7/SMRmt處理過的細(xì)胞(陰性對(duì)照)中觀察到的一樣多(圖4D中圖B-2)。為了顯示如上所述聚積的高電子密度‘病毒顆?！谙旅嬖诘?天和第14天的拮抗物和陰性對(duì)照肽圖像中顯示了更高放大倍數(shù)圖像(圖4E)。 如EM所測(cè)量，證據(jù)顯示SMRwt拮抗物延遲了病毒從受感染細(xì)胞中的釋放。圖5-8中顯示了蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。結(jié)果總結(jié)于圖9中。如圖3-9所示， 在肽拮抗物(NefSMRwt)的存在下病毒產(chǎn)生的數(shù)量急劇減少到0或接近0。陰性對(duì)照肽 (NefSMRmut)沒有觀察到影響。細(xì)胞裂解物測(cè)定顯示在全部測(cè)定條件下p24的產(chǎn)生是相同的，說明測(cè)定條件對(duì)病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)沒有影響。數(shù)據(jù)說明拮抗物阻斷了病毒顆粒從受感染細(xì)胞中的釋放。這可能是由于向細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸病毒成分的拮抗作用。最終，這將(i)切斷HIV感染并且(ii)阻斷AIDS進(jìn)程。3. 3 實(shí)驗(yàn) III將Magi/CXCR4細(xì)胞暴露于來自用R7病毒DNA/SMRwt肽或R7病毒DNA/SMRmt肽轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、THP-I單核細(xì)胞或U937單核細(xì)胞的條件上清液中48小時(shí)。然后將這些細(xì)胞固定并用X-Gal染色。圖IOA顯示了暴露于來自用R7/SMRwt轉(zhuǎn)染的 Jurkat細(xì)胞的lng/ml稀釋的pM上清液中的Magi/CXCR4細(xì)胞。圖IOB顯示了暴露于來自用R7/SMRmt轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞的lng/ml稀釋的pM上清液中的Magi/CXCR4細(xì)胞。通過藍(lán)色核染色在光學(xué)顯微鏡檢下容易看到有效地感染了 R7的細(xì)胞。放大倍數(shù)χ20。注意到， 用R7和肽拮抗物(SMRwt)處理過的細(xì)胞顯示出藍(lán)色染色細(xì)胞的數(shù)目急劇減少，而用R7和陰性對(duì)照肽(SMRmt)處理過的細(xì)胞顯示出許多藍(lán)色染色細(xì)胞。這說明，來自R7/陰性對(duì)照肽處理過的細(xì)胞的條件上清液中有病毒，而來自R7/拮抗物處理過的細(xì)胞的條件上清液中
沒有病毒。對(duì)這些Magi培養(yǎng)物的藍(lán)色染色細(xì)胞定量。數(shù)據(jù)繪制為轉(zhuǎn)染后時(shí)間的函數(shù)。如圖 11中所示，在來自NefSMRwt轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞或NefSMRwt轉(zhuǎn)染的THP-I單核細(xì)胞的上清液存在下，受感染細(xì)胞的數(shù)目顯著減少。數(shù)據(jù)表明拮抗物阻斷了病毒顆粒從受感染細(xì)胞中的釋放。這可能是由于向細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸病毒成分的拮抗作用。最終，這將切斷HIV感染并且阻斷AIDS進(jìn)程?？傊@些實(shí)驗(yàn)證明，這種技術(shù)可以用于迫使細(xì)胞制造和胞外分泌任何蛋白質(zhì)或表位，從而可以容易地從細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)或表位。如果小囊泡載有靶向表位(例如，針對(duì)腫瘤標(biāo)志物的抗體表位)和抗腫瘤蛋白或表位，其也可用于化學(xué)療法。此外，利用這種技術(shù)，可以將載體轉(zhuǎn)染到患者特定細(xì)胞從而使用自體小囊泡(self-vesicle)。由于蛋白質(zhì)也位于小囊泡外膜上，它們還可用于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。因此，例如，可以將流感表位載入載體中并在小囊泡外表上表達(dá)以誘導(dǎo)針對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)。實(shí)施例4 分泌拮抗物(HIV NEF SMRWT肽)對(duì)HIV-I GAGWT-GFP-誘導(dǎo)的分泌的影響 使用Chariot將細(xì)胞用0. 5 μ g的pQBI-HIV Gag-GFP (表達(dá)野生型Gag蛋白)禾口 0. 5 μ g的HIV-I Nef SMRwt, SMRmut肽、sMl肽或未轉(zhuǎn)染的對(duì)照共轉(zhuǎn)染48小時(shí)。使用酶標(biāo)儀對(duì)來自這些培養(yǎng)物的條件上清液進(jìn)行GFP熒光測(cè)定。結(jié)果示于表II中。顆粒分泌水平相對(duì)于任意地設(shè)定為Ix的未轉(zhuǎn)染的對(duì)照(陰性對(duì)照；100% )而顯示。
表II 熒光酶標(biāo)儀測(cè)定分泌(相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)的提高
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞中微粒釋放的肽，所述肽的長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸并且包含(1)位于N末端的至少一個(gè)VGFPV (SEQ ID NO :1)基序，或者(2)位于C末端的至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序，或者(3)至少兩個(gè)SEQ ID N0:1基序。
2.權(quán)利要求1所述的肽，其包含至少兩個(gè)SEQID NO 1基序。
3.權(quán)利要求1所述的肽，其包含位于N末端的至少一個(gè)SEQID N0:1基序。
4.權(quán)利要求1所述的肽，其包含位于C末端的至少一個(gè)SEQID N0:1基序。
5.權(quán)利要求1所述的肽，其包含VGFPVAAVGFPV(SEQID NO 2)的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1所述的肽，其由VGFPVAAVGFPVOTKDDDDK(SEQID NO 3)的序列組成。
7.一種編碼權(quán)利要求1所述的肽的多核苷酸。
8.權(quán)利要求7所述的多核苷酸，其中，所述肽包含至少兩個(gè)SEQID N0:1基序。
9.權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其中，所述肽進(jìn)一步包含氨基酸序列SEQID NO :2。
10.權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其中，所述肽進(jìn)一步包含SEQID NO :3的氨基酸序列。
11.一種表達(dá)載體，其包含可操作地連接調(diào)節(jié)序列的權(quán)利要求7所述的多核苷酸。
12.—種藥物組合物，其包含(1)含有SEQID NO 1的肽或編碼這種肽的表達(dá)載體；和(2)藥學(xué)可接受載體，其中，所述含有SEQ ID NO 1的肽包含(a)位于N末端的至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序，或者(b)位于C末端的至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序，或者(c)至少兩個(gè)SEQ ID N0:1基序。
13.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述含有VEFPV(SEQ ID NO=D的肽包含至少兩個(gè)SEQ ID NO 1基序。
14.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述含有SEQID NO 1的肽包含位于N末端的至少一個(gè)SEQ ID NO 1基序。
15.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述含有SEQID NO :1的肽包含位于C末端的至少一個(gè)SEQ ID NO 1基序。
16.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述含有SEQID NO :1的肽包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中，所述含有SEQID NO :1的肽進(jìn)一步包含SEQ ID NO 3的序列。
18.一種治療AIDS的方法，其包括向需要這種治療的患者施用有效量的含有至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序且長(zhǎng)度為 10-100個(gè)氨基酸的肽。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述肽包含至少兩個(gè)VGFPVSEQ ID N0:1基序。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述肽包含位于N末端的至少一個(gè)SEQID N0:1基序。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述肽包含位于C末端的至少一個(gè)SEQID N0:1基序。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述肽包含SEQID NO 2的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述肽進(jìn)一步包含SEQID NO :3的序列。
24.一種治療腫瘤的方法，其包括向需要這種治療的患者施用有效量的含有至少一個(gè)SEQ ID NO :1基序且長(zhǎng)度為 10-100個(gè)氨基酸的肽。
25.權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述肽包含至少兩個(gè)SEQID N0:1基序。
26.權(quán)利要求對(duì)所述的方法，其中，所述肽包含位于N末端的至少一個(gè)SEQID N0:1基序。
27.權(quán)利要求對(duì)所述的方法，其中，所述肽包含位于C末端的至少一個(gè)SEQID N0:1基序。
28.權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述肽包含氨基酸序列SEQID NO :2。
29.權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述肽進(jìn)一步包含SEQID NO :3的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制細(xì)胞中微粒釋放的新肽。所述肽包含位于N末端的至少一個(gè)VGFPV基序并且長(zhǎng)度為10-100個(gè)氨基酸。本發(fā)明還公開了編碼所述肽的多核苷酸、攜帶所述多核苷酸的表達(dá)載體以及使用所述新肽治療AIDS和腫瘤的方法。
文檔編號(hào)A61P31/18GK102482325SQ201080025184
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者安德烈亞·D·雷蒙德, 弗朗索瓦·瓊·菲林格爾, 文森特·克雷格·邦德, 賽義德·阿里, 邁克爾·鮑威爾, 銘博·黃, 馬丁·內(nèi)維爾·謝爾頓 申請(qǐng)人:莫爾豪斯醫(yī)學(xué)院