專利名稱：用于治療免疫失調(diào)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)，如自身免疫性疾病、炎性疾病以及膿毒癥。具體地，本發(fā)明涉及使用結(jié)合膜結(jié)合游離輕鏈的抗體來治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)將“自身”與“非自身”組分區(qū)別開的能力是關(guān)鍵性的，因?yàn)樽陨斫M分的異常識別導(dǎo)致多種組織損害以及自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、舍格倫綜合征以及多發(fā)性硬化(Browning, 2006)。雖然數(shù)十年來T細(xì)胞一直是自身免疫性疾病研究的焦點(diǎn)，作為淋巴瘤治療的B細(xì)胞排除抗體利妥昔單抗的開發(fā)已經(jīng)為研究B細(xì)胞在免疫失調(diào)中的作用提供了一種工具(Browning, 2006)。利妥昔單抗是一種有力的B細(xì)胞溶解性嵌合體IgGl⑶20特異性單克隆抗體，該抗體主要通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)殺死B細(xì)胞。利妥昔單抗的革巴標(biāo)是⑶20,它是從前B細(xì)胞期至前衆(zhòng)細(xì)胞期表達(dá)的(Edwards and Cambridge, 2006)。在注射抗CD20抗體之后，在外周血中的抗體覆蓋的B細(xì)胞被快速排除至非常低的水平并且保持在低水平持續(xù)約6至12個(gè)月(Browning，2006)。用利妥昔單抗反復(fù)循環(huán)排除B細(xì)胞可能與總免疫球蛋白的減少相關(guān)聯(lián)，對于IgG而言低至3. 5G I/1并且對于IgM而言低至不可檢出的水平，這可以限制能夠進(jìn)行的B細(xì)胞排除的次數(shù)(Edwards and Cambridge, 2006)。對于用于治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的新方法仍然存在著需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的諸位發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)鑒定膜結(jié)合游離輕鏈(mFLC)被表達(dá)在漿細(xì)胞前體 上。衆(zhòng)細(xì)胞前體上的mFLC為治療或預(yù)防B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)提供了一個(gè)祀標(biāo)。本發(fā)明的諸位發(fā)明人提出的治療方法是基于施用一種抗體，該抗體特異性地結(jié)合到mFLC上以排除患有B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的受試者體內(nèi)的楽:細(xì)胞前體。這種治療革巴標(biāo)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它不存在于正常B細(xì)胞上。因此，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防受試者體內(nèi)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的一種方法，該方法包括將治療有效量的一種抗體施用到受試者體內(nèi)，該抗體結(jié)合膜結(jié)合游離輕鏈(mFLC)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合漿細(xì)胞前體(例如漿母細(xì)胞)上的mFLC。在一個(gè)實(shí)施方案中，該漿母細(xì)胞對于標(biāo)志物⑶27、⑶38以及⑶45是陽性的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該漿母細(xì)胞對于標(biāo)志物IgD是陰性的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體特異性地結(jié)合到mFLC上。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用到受試者體內(nèi)的抗體被結(jié)合到一種細(xì)胞毒性部分或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑上。通過非限制性舉例的方式，該細(xì)胞毒性部分可以是一種細(xì)胞毒性藥物或一種細(xì)菌或植物源的酶活性毒素(如白樹毒素)，或這類毒素的一種酶活性片段(“A鏈”)。酶活性毒素及其片段是優(yōu)選的并且通過下面各項(xiàng)來舉例說明白樹毒素、白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-α -帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ、以及PAP-S)、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、絲裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、以及依諾霉素。細(xì)胞毒性部分還可以是一種放射性試劑。具體地，細(xì)胞毒性部分可以是一種放射性核素，像例如釔-90 (90Y)、銦-111 (111In)、碘-131 (131I)或銅-67 (67Cu)。優(yōu)選地，該細(xì)胞毒性部分是一種毒素、一種化學(xué)治療劑、或一種放射性試劑。可以被結(jié)合到抗體(該抗體結(jié)合mFLC)上并且用于本發(fā)明中的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括但不限于多種淋巴因子以及細(xì)胞因子，如IL-2以及干擾素類(α、β或Y)。這些生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑對細(xì)胞具有多種影響。在這些影響中的是，通過直接作用而增加細(xì)胞殺傷以及 通過提高宿主防御介導(dǎo)的過程而增加細(xì)胞殺傷?？贵w的結(jié)合(該抗體將mFLC結(jié)合到這些生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑上)將允許選擇性定位在漿細(xì)胞前體內(nèi)，由此抑制了導(dǎo)致非靶細(xì)胞的毒性的非特異性作用。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑優(yōu)選地是一種淋巴因子、一種細(xì)胞因子或一種干擾素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞毒性部分是編碼一種細(xì)胞毒性多肽的一種核酸分子。當(dāng)任何適合的抗體(該抗體結(jié)合mFLC)可以被用于本發(fā)明的方法中時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合KMA或LMA。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合KMA。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合mFLC的抗體是一種K121樣抗體。優(yōu)選地，該K121樣抗體包括SEQ ID NO :1中列出的VH區(qū)以及SEQ ID NO :2中列出的VL區(qū)，或與具有SEQ IDNO 1中列出的VH區(qū)以及在SEQ IDNO 2中列出的VL區(qū)一種抗體競爭結(jié)合到κ骨髓瘤抗體(KMA)上。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法治療的B細(xì)胞介導(dǎo)的失調(diào)是一種自身免疫性疾病。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這種自身免疫性疾病是選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、以及多發(fā)性硬化。本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制受試者體內(nèi)漿細(xì)胞前體的生長或?qū)⑵錃⑺赖囊环N方法，這種方法包括將有效量的結(jié)合mFLC的抗體施用于受試者。通過舉例，可以通過凋亡或通過受試者的免疫細(xì)胞(如通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC))、和/或通過抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用來影響抑制或殺死漿細(xì)胞前體。本發(fā)明還提供了通過施用一種結(jié)合mFLC的抗體在受試者體內(nèi)抑制或殺死漿細(xì)胞前體的一種方法，該抗體與細(xì)胞毒性部分或生物調(diào)節(jié)劑相結(jié)合。優(yōu)選地，該細(xì)胞毒性部分是一種毒素、一種化學(xué)治療劑、或一種放射性試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞毒性部分是編碼一種細(xì)胞毒性多肽的一種核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是一種淋巴因子、一種細(xì)胞因子或一種干擾素。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在受試者體內(nèi)定位漿細(xì)胞前體的一種方法，該方法包括將一種結(jié)合mFLC的抗體施用于該受試者，從而允許該抗體結(jié)合到受試者體內(nèi)的細(xì)胞上，然后確定該抗體在該受試者體內(nèi)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體被可檢出地標(biāo)記。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法中的抗體是一種嵌合抗體或一種人源化抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)合mFLC的抗體用來制造用于治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的藥物的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于將自體造血細(xì)胞移植到受試者體內(nèi)的一種方法，該方法包括(i)從受試者體內(nèi)取出造血祖細(xì)胞群，(ii)用結(jié)合mFLC的抗體來處理該細(xì)胞群，并且(iii)將步驟(ii)處理的細(xì)胞群移植到該受試者體內(nèi)。
用結(jié)合mFLC的抗體處理祖細(xì)胞群的步驟優(yōu)選地包括在足以使抗體結(jié)合到該群中存在的漿細(xì)胞前體上的條件下使該細(xì)胞群與結(jié)合mFLC的抗體進(jìn)行接觸從而抑制該漿細(xì)胞前體的生長，或從而將其殺死。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將結(jié)合mFLC的抗體靜脈輸注到該受試者體內(nèi)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該自體移植的方法是在細(xì)胞減少性治療期間或之后在該受試者身上進(jìn)行的。在又進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合mFLC的抗體被結(jié)合到固相支持體上。應(yīng)當(dāng)清楚的是本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選的特點(diǎn)以及特征可應(yīng)用于本發(fā)明的多個(gè)其他方面。貫穿本說明書，詞語“包括("comprise ")，，、或變體例如“包括”("comprises")或“包括”("comprising")應(yīng)當(dāng)理解為意指包括一個(gè)所述的要素、整體或步驟，或多個(gè)要素、整體或步驟的組，但不排除任何其他的要素、整體或步驟，或多個(gè)要素、整體或步驟的組。在下文中通過以下非限制性實(shí)例并且參考附圖
來說明本發(fā)明。附圖簡要說明圖I. IL-21、抗CD40以及抗IgM活化的B細(xì)胞(CD 19+)上的KMA表達(dá)。在IL-21、抗⑶40以及抗IgM的存在下外周B細(xì)胞被活化。在第6天，收集細(xì)胞然后針對KMA、IgD,CD27 以及 CD38 進(jìn)行染色。門 I = CD381ow，門 2 = CD38+ 并且門 3 = CD38++。圖2. SAC活化的漿母細(xì)胞上的KMA表達(dá)。在IL-21、抗⑶40以及抗IgM的存在下外周B細(xì)胞被活化。在第6天，收集細(xì)胞然后針對KMA、IgD,⑶27以及⑶38進(jìn)行染色。門I = CD381ow,門 2 = CD38+ 并且門 3 = CD38++。圖3. KMA被表達(dá)于⑶38++⑶45+的不成熟的漿細(xì)胞上。針對KMA、⑶19、⑶38、⑶45以及SYTOX Green來染色源于扁桃體的單核細(xì)胞。(a)根據(jù)CD19以及缺乏SYTOX green染色對活的B細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門(gated)。然后根據(jù)CD38表達(dá)對細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，其中門I =CD381ow，門 2 = CD38+ 并且門 3 = CD38++。(b)針對 KMA、CD38、CD45 以及 SYTOX green 將細(xì)胞染色。根據(jù)CD38++表達(dá)來對活的細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門并且針對KMA以及CD45陽性進(jìn)行分析。圖4.通過IHC用漿母細(xì)胞以及漿細(xì)胞形態(tài)學(xué)來鑒定KMA表達(dá)細(xì)胞。用FITC標(biāo)記的MDX1097、緊接著用小鼠抗-FITC第二抗體然后用抗小鼠過氧化物酶將來自正常組織的未固定切片染色。然后用顯色底物將這些切片顯色。小圖I =扁桃體切片，小圖2=唾液腺并且小圖3 =外周血。箭頭表示KMA+細(xì)胞。圖5. KMA被表達(dá)于IL-21、抗CD40以及抗IgM活化的漿母細(xì)胞上。在IL-21、抗⑶40以及抗IgM的存在下外周B細(xì)胞被活化。在第6天，收集細(xì)胞然后針對KMA、⑶27、CD38、CD45以及表面IgD(未顯示)進(jìn)行染色。小圖(a)是收集的細(xì)胞的散點(diǎn)圖。在活的門(門2)中進(jìn)行所有后續(xù)分析。小圖(b)顯示了設(shè)門的群的⑶27以及⑶38圖。小圖(c)顯示了小圖(b)中染色的群中針對KMA(與同種型對照進(jìn)行比較)的細(xì)胞陽性百分比，門3 =CD38+/-CD27-、門 4 = CD38+/-CD27+ 并且門 5 = CD38++CD27++。使用 APC 標(biāo)記的 MDX-1097來檢測KMA，并且同種型對照是一種APC標(biāo)記的人IgGl抗體。顯示的結(jié)果是5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖6. LMA被表達(dá)于IL-21、抗CD40以及抗IgM活化的漿母細(xì)胞上。在IL-21、抗⑶40以及抗IgM的存在下外周B細(xì)胞被活化。在第6天，收集細(xì)胞并且針對LMA、⑶27、⑶38、⑶45以及表面IgD(未顯示)進(jìn)行染色。小圖(a)是收集的細(xì)胞的散點(diǎn)圖。在活通道(通道I)中進(jìn)行所有后續(xù)分析。小圖(b)顯示了設(shè)門的群的CD27以及CD38圖。小圖(c)顯示了小圖(b)中染色的群中針對LMA(與同種型對照進(jìn)行比較)的細(xì)胞陽性百分比。門 2 = CD38+/-CD27-，門 3 = CD38+/-CD27+ 并且門 4 = CD38++CD27++。使用 APC 標(biāo)記的4G7來檢測LMA，并且同種型對照是一種APC標(biāo)記的小鼠IgGl抗體。顯示的結(jié)果是5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
發(fā)明詳細(xì)說明通用技術(shù)以及選擇的定義除非另外明確定義，在此使用的所有技術(shù)以及科學(xué)術(shù)語將采取與本領(lǐng)域(例如，在免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、以及生物化學(xué)領(lǐng)域中)的普通技術(shù)人員的所通常理解的具有相同含義。除非另外指明，本發(fā)明中所使用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)、以及免疫技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)程序，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是而言熟知的。這類技術(shù)在貫穿多個(gè)來源中的文獻(xiàn)進(jìn)行了說明和解釋，例如 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wileyand Sons(1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rdedn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), T.A. Brown(editor), EssentialMolecular Biology A Practical Approach, Volumes I and 2, IRL Press (1991),D. M. Glover and B.D. Hames(editors), DNA Cloning A Practical Approach, Volumes1-4, IRL Press (1995and 1996),以及 F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至今的所有更新)，Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),以及 J. E. Coligan et al. (editors)CurrentProtocols in Immunology, John Wiley&Sons (包括至今的所有更新)。關(guān)于“膜結(jié)合游離輕鏈”是指不與完整的免疫球蛋白相結(jié)合的膜結(jié)合輕鏈。該膜結(jié)合輕鏈可以包括膜結(jié)合K輕鏈和/或膜結(jié)合λ輕鏈。如在此使用的，術(shù)語“漿細(xì)胞前體”是指具有類似于分泌長壽命抗體(long livedantibody)的楽:細(xì)胞的活化的增殖前體的特征的細(xì)胞。這些衆(zhòng)細(xì)胞前體包括原B細(xì)胞、前B細(xì)胞、不成熟B細(xì)胞、初始B細(xì)胞、初始活化B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞、后生發(fā)中心B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、以及漿母細(xì)胞。當(dāng)我們稱一種細(xì)胞對于一種給定的標(biāo)志物是“陽性”的時(shí)，它可以是這種標(biāo)志物的一種低水平(+、lo或暗)或高水平(++，亮，bri)的表達(dá)者，這取決于該標(biāo)志物在細(xì)胞表面上存在的程度，其中這些術(shù)語涉及在細(xì)胞的顏色分選過程中所使用的熒光強(qiáng)度或其他顏色。低和高的區(qū)別應(yīng)當(dāng)在被分選的一種特定的細(xì)胞群上所使用的標(biāo)志物的背景下來理解。當(dāng)我們在此提及一種細(xì)胞對于給定的標(biāo)志物是“陰性的”時(shí)，并不意味著該標(biāo)志物根本不被該細(xì)胞表達(dá)。它是指該標(biāo)志物能夠以相對非常低的水平被該細(xì)胞表達(dá)，并且是指當(dāng)可檢測地標(biāo)記時(shí)，它產(chǎn)生非常低的信號。如在此使用的，術(shù)語“治療treating ")，“治療treat ")或“治療treatment")包括施用足以降低或延遲B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的發(fā)作或進(jìn)展，或足以降低或消除B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的至少一個(gè)癥狀的如在此所述的治療有效量的抗體。與膜結(jié)合游離輕鏈結(jié)合的抗體本發(fā)明的諸位發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)首次顯示膜結(jié)合游離輕鏈被表達(dá)在漿細(xì)胞前體的表面上。針對mFLC的抗體將能夠通過多種機(jī)制(如ADCC、補(bǔ)體依賴性溶解、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用、以及凋亡)來殺死漿細(xì)胞前體并且因此將成為針對B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的有效治療劑。此外，可以使用針對mFLC的抗體來將細(xì)胞毒素直接遞送至漿細(xì)胞前體。 雖然不是必要條件，該抗體可以特異性地結(jié)合到mFLC上。短語“特異性地結(jié)合”是指在特定條件下，該抗體結(jié)合mFLC并且不結(jié)合到顯著量的其他蛋白質(zhì)或碳水化合物上。優(yōu)選的是特異性地結(jié)合到mFLC上的抗體不結(jié)合與完整免疫球蛋白相結(jié)合的輕鏈。在這樣的條件下與mFLC的特異性結(jié)合可能需要針對其特異性而選擇的抗體?？梢允褂枚喾N免疫測定形式來選擇與mFLC進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)地使用固相ELISA免疫測定法來選擇與一種蛋白質(zhì)或碳水化合物進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體。針對可以用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定方式以及條件的說明，參見Harlow and Lane (1988) Antibodies,a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications, New York。如在此使用的術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)、異質(zhì)偶聯(lián)抗體(heteroconjugate antibody)、嵌合抗體(括完整分子及其片段)、以及其他抗體樣分子。這些抗體包括多種形式的修飾，包括例如但不限于，包括VH或VL結(jié)構(gòu)域之一的結(jié)構(gòu)域抗體、重鏈可變區(qū)(如所述駱駝科動物的VHH)的二聚體、輕鏈可變區(qū)(VLL)的二聚體、僅包含可以直接地或通過連接物結(jié)合的輕鏈(VL)以及重鏈(VH)可變區(qū)的Fv片段、或包含重鏈可變區(qū)以及CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段。由重鏈和輕鏈的可變區(qū)構(gòu)成的scFv連接在一起從而形成一種單鏈抗體(Bird et al. , 1988 ；Hustonet al. ,1988)以及scFv的寡聚物，如二抗體以及三抗體也被術(shù)語“抗體”所包括。還包括的是抗體片段，如含有可變區(qū)以及恒定區(qū)的部分的Fab、(Fab' )2以及FabFc2片段。還包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)接枝的抗體片段以及抗體片段的寡聚物。Fv的重鏈和輕鏈組分可以來自相同的抗體或不同的抗體，由此生成嵌合的Fv區(qū)。該抗體可以是動物(例如，小鼠、兔或大鼠)或人源的或可以是嵌合的(Morrison et al.，1984)或人源化的(Jones et al.，1986)，并且在英國專利申請?zhí)?707252中公開。如在此使用的術(shù)語“抗體”包括這些不同形式。使用在此提供的指導(dǎo)以及本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的那些方法(這些方法在以上引證的文獻(xiàn)中并且在諸如以下的出版物中進(jìn)行了說明Harlow&Lane, Antibodies aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)),可以容易地制備用于本發(fā)明的方法中的這些抗體。這些mFLC結(jié)合抗體可以具有多個(gè)Fv區(qū)，這些Fv區(qū)包含輕鏈可變區(qū)(')以及重鏈可變區(qū)(Vh)，其中該輕鏈和重鏈可以直接地或通過一個(gè)連接物進(jìn)行結(jié)合。如在此所使用的，連接物是指一種分子，該分子被共價(jià)地連接到輕鏈以及重鏈上并且在這兩個(gè)鏈之間提供足夠的間距以及柔性這樣使得它們能夠?qū)崿F(xiàn)一種構(gòu)象，在該構(gòu)象中它們能夠特異性地結(jié)合針對它們的表位。特別地蛋白連接物是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛梢员槐磉_(dá)為融合多肽的Ig部分的內(nèi)在組分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用重組生產(chǎn)的單鏈scFv抗體，優(yōu)選地一種人源化的scFv。單克隆抗體本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地生產(chǎn)針對mFLC表位的單克隆抗體。通過雜交瘤制造單克隆抗體的通用方法是熟知的?？梢酝ㄟ^細(xì)胞融合，并且還通過其他技術(shù)(如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用愛潑斯坦-巴爾病毒病毒轉(zhuǎn)染)生成永生的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系。可以針對不同特性(即針對同種型以及表位親和性)對針對mFLC表位生成的單克隆抗體組進(jìn)行篩選。 源于動物的單克隆抗體可以被用于直接體內(nèi)以及體外免疫治療兩者。然而，已經(jīng)觀察到的是，例如，當(dāng)源于小鼠的單克隆抗體被作為治療劑用于人體內(nèi)時(shí)，患者產(chǎn)生人抗小鼠抗體。因此，源于動物的單克隆抗體對于治療(尤其是對于長期使用而言)不是優(yōu)選的。隨著基因工程技術(shù)的建立，有可能產(chǎn)生嵌合的或人源化的抗體，這些抗體具有源于動物以及源于人的部分。動物可以是例如小鼠或其他嚙齒動物(如大鼠)。如果嵌合抗體的可變區(qū)是(例如)源于小鼠同時(shí)恒定區(qū)是源于人的，相比于“純”的源于小鼠的單克隆抗體，該該嵌合抗體通常具有較低的免疫原性。這應(yīng)當(dāng)證明“純的”源于小鼠的抗體是不適合的，這些嵌合抗體將有可能更適合用于治療用途。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法是可得到的。例如，可以例如將免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈用于分開的質(zhì)粒中而分別地表達(dá)輕鏈和重鏈。然后可以將這些純化并且體外組裝成完全抗體；已經(jīng)說明了完成這樣的組裝的方法(參見，例如Sun et al.，1986)。這樣的DNA構(gòu)建體可以包括編碼針對抗mFLC抗體的輕鏈或重鏈可變區(qū)的功能性重排基因的DNA，該重排基因連接到編碼人恒定區(qū)的DNA上。用輕鏈和重鏈的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的淋巴樣細(xì)胞(例如骨髓瘤或雜交瘤)可以表達(dá)并且組裝這些抗體鏈。還描述了從簡化的分離的輕鏈和重鏈形成IgG抗體的體外反應(yīng)參數(shù)(參見例如Beychok, 1979)。在相同細(xì)胞中共表達(dá)輕鏈和重鏈以實(shí)現(xiàn)重鏈和輕鏈的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合或連接成完全的H2L2IgG抗體也是可能的。這樣的共表達(dá)可以使用在同一宿主細(xì)胞中的相同或不同的質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)。人源化方法/技術(shù)在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗mFLC抗體是人源化的，即一種通過分子模型技術(shù)生成的抗體，其中人抗體含量被最大化，同時(shí)引起可歸屬于例如親本大鼠、兔或鼠類抗體的可變區(qū)的結(jié)合親和力的較小損失或無損失?？梢愿鶕?jù)EP-A-0239400通過將所希望的⑶R接枝到人抗體框架上來將抗體人源化。因此可以用人DNA(其⑶R是希望重構(gòu)的)開始制造編碼所希望的重構(gòu)抗體的DNA序列。將包含所希望的CDR的源于動物的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與選擇的人抗體可變結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列進(jìn)行比較。對需要變成相應(yīng)的動物中的殘基的人可變結(jié)構(gòu)域中的殘基進(jìn)行標(biāo)記從而使人可變區(qū)結(jié)合來自動物的CDR。還可能存在需要從人序列中取代、添加或缺失的殘基。合成了可以用來誘變?nèi)丝勺兘Y(jié)構(gòu)域框架以包含希望的殘基的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以具有任何適宜的大小。寡核苷酸在長度方面通常只是被可用的具體的合成儀的能力所限制。寡核苷酸定向的體外誘變的方法是熟知的。
作為替代方案，可以使用WO 92/07075的重組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法來實(shí)現(xiàn)人源化。使用這種方法，可以將CDR剪接在人抗體的框架區(qū)之間。通常，可以使用一種模板來進(jìn)行WO 92/07075的技術(shù)，該模板包括兩個(gè)人框架區(qū)(AB和⑶)以及它們之間的⑶R，該⑶R將被供體CDR所替換。使用引物A和B來擴(kuò)增框架區(qū)AB，并且使用引物C和D來擴(kuò)增框架區(qū)CD。然而，引物B和C在它們的5’端上各自還包含一個(gè)額外的序列，該額外的序列相應(yīng)于供體⑶R序列的全部或至少一部分。引物B和C以一個(gè)足以允許它們的5'端退火(在允許進(jìn)行PCR的條件下)到彼此上的長度而重疊。因此，擴(kuò)增的區(qū)域AB和⑶可以通過重疊延伸而經(jīng)歷基因剪接從而在一個(gè)單一反應(yīng)中生成人源化的產(chǎn)物。誘變反應(yīng)以重構(gòu)抗體之后，可以將誘變的DNA連接到適當(dāng)?shù)木幋a輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA上，克隆到一種表達(dá)載體中，并且轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞)中。這些步驟能夠以常規(guī)方式來進(jìn)行。因此，可以通過下面的方法制備重構(gòu)抗體，該方法包括(a)制備一種第一可復(fù)制的表達(dá)載體,該表達(dá)載體包括一種適當(dāng)?shù)膯幼?該啟動子被可操作地連接到一個(gè)DNA序列上，該DNA序列編碼Ig重鏈或輕鏈的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，該可變結(jié)構(gòu)域包括來自人抗體的框架區(qū)以及本發(fā)明的人源化抗體所需要的CDR ；(b)制備一種第二可復(fù)制的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括一種適當(dāng)?shù)膯幼?，該啟動子被可操作地連接到一種DNA序列上，該序列至少編碼對應(yīng)的互補(bǔ)Ig輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域；(C)用第一或兩個(gè)制備的載體來轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；并且(d)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞系來生產(chǎn)所述改變的抗體。優(yōu)選地，步驟(a)中的DNA序列編碼人抗體鏈的可變結(jié)構(gòu)域以及每個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域兩者。可以使用任何適當(dāng)?shù)闹亟M表達(dá)系統(tǒng)來制備人源化抗體。被轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)改變的抗體的細(xì)胞系可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系或永生化哺乳動物細(xì)胞系，該永生化哺乳動物細(xì)胞系有利地是淋巴來源的,如骨髓瘤、雜交瘤、三源雜交瘤或四源雜交瘤細(xì)胞系。該細(xì)胞系還可以包括一種正常的淋巴樣細(xì)胞，例如一種B細(xì)胞，該B細(xì)胞已經(jīng)通過用病毒，例如愛潑斯坦-巴爾病毒病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化而永生化。更優(yōu)選地，該永生化細(xì)胞系是一種骨髓瘤細(xì)胞系或它的一種衍生物。用于表達(dá)抗體的CHO細(xì)胞可以是二氫葉酸還原酶(dhfr)缺陷的并且因此依賴于胸苷和次黃嘌呤來生長(Urlaub and Chasin，1980)。用編碼抗體的DNA和dhfr基因(該基因能夠選擇dhfr陽性表型的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)化體)來轉(zhuǎn)染親本的dhfr-CHO細(xì)胞系。通過將這些集落在缺乏胸苷以及次黃嘌呤的培養(yǎng)基上(它們的缺乏阻止了未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再補(bǔ)救葉酸鹽途徑，并且因此繞過該選擇系統(tǒng))培養(yǎng)來進(jìn)行選擇。這些轉(zhuǎn)化體通常由于共整合感興趣的轉(zhuǎn)染DNA以及編碼dhfr的DNA而表達(dá)低水平的感興趣的DNA?？梢允褂眉装钡?MTX)通過擴(kuò)增來增加編碼抗體的DNA的表達(dá)水平。這種藥物是酶dhfr的直接抑制劑，并且允許分離抗性集落，這些集落擴(kuò)大了它們的dhfr基因拷貝數(shù)(足以在這些條件下存活)。因?yàn)榫幋adhfr以及抗體的DNA序列被緊密連接于這些初始轉(zhuǎn)化體中，通常存在伴隨性擴(kuò)增，并且因此增加了所希望的抗體的表達(dá)。與CHO或骨髓瘤細(xì)胞一起使用的另一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是W087/04462中所述的谷氨酰胺合成酶(GS)擴(kuò)增系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)包括用編碼酶GS的DNA以及用編碼所希望的抗體的DNA來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后選擇在無谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，并且因此可以假設(shè)這些細(xì)胞已經(jīng)整合編碼GS的DNA。然后使用甲硫氨酸砜亞胺(Msx)使這些選擇的克隆經(jīng)受酶GS的抑制。為了存活，這些細(xì)胞將擴(kuò)增編碼GS的DNA，伴隨性地?cái)U(kuò)增編碼抗體的DNA。雖然用于生產(chǎn)人源化抗體的細(xì)胞系優(yōu)選地是一種哺乳動物細(xì)胞系，作為替代方案可以使用任何其他適合的細(xì)胞系，如細(xì)菌細(xì)胞系或酵母細(xì)胞系。具體地說，可以設(shè)想的是，可以使用大腸桿菌衍生的菌株。針對功能性對獲得的抗體進(jìn)行檢查。如果功能性喪失，有必要返回步驟(2)并且改變抗體的框架。一旦表達(dá)，可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)步驟回收并且純化全抗體、它們的二聚體、單獨(dú)的輕鏈和重鏈、或其他免疫球蛋白形式，這些標(biāo)準(zhǔn)程序包括硫酸銨沉淀、親和柱層析、柱層析、凝膠電泳等(概括地參見 Scopes, R. , Protein Purification, Springer-Verlag,N.Y. (1982))。對于藥物用途而言，至少約90%至95%均勻性的基本上純的免疫球蛋白是優(yōu)選的，并且98 %至99 %或更高均勻性是最優(yōu)選的。一旦部分純化或達(dá)到所希望的均勻性，然后可以將人源化抗體用于治療或用于開發(fā)和進(jìn)行測定步驟，免疫熒光染色，等(概括地參見 Immunological Methods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, eds. , AcademicPress, New York, N.Y. (1979and 1981))。Greenwood等人(1993)進(jìn)行的研究已經(jīng)證明，可以通過工程化免疫球蛋白分子的恒定區(qū)而優(yōu)化人效應(yīng)細(xì)胞對抗體的Fe區(qū)的識別。這可以通過將具有所希望特異性的抗體的可變區(qū)基因與編碼免疫球蛋白同種型的人恒定區(qū)基因進(jìn)行融合來實(shí)現(xiàn)，這些同種型在人類受試者體內(nèi)證明了有效的ADCC,例如IgGl和IgG3同種型(Greenwood and Clark (1993)Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man. Edited by Mike Clark, published by Academic Titles. Section
II85-113)。得到的針對mFLC的嵌合的或人源化的抗體在誘導(dǎo)ADCC方面應(yīng)當(dāng)是特別有效的。還可以通過將抗原施用于轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)來制備具有抗mFLC的完全人可變區(qū)的抗體，該轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)被改進(jìn)以響應(yīng)于抗原激發(fā)而產(chǎn)生這種抗體，但是它們的內(nèi)源性基因座已經(jīng)被失活(disabled)?？梢赃M(jìn)行多種隨后操作來得到抗體本身或其類似物(參見，例如，美國專利號6，075，181)。編碼抗體或其片段的基因的制備可以從雜交瘤細(xì)胞系中克隆編碼抗體、輕鏈和重鏈基因兩者或它們的部分(例如，單鏈Fv區(qū))的基因。它們都可以使用相同的通用策略來進(jìn)行克隆。典型地，例如，使用隨機(jī)六聚體作為引物對從雜交瘤細(xì)胞中提取的聚(A)+HiRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對于Fv區(qū)而 言，通過兩個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別地?cái)U(kuò)增Vh和'結(jié)構(gòu)域。對應(yīng)地可以使用5'端引物(這些引物是根據(jù)抗mFLC重鏈的氨基末端蛋白質(zhì)序列來設(shè)計(jì)的)以及3'端引物(根據(jù)共有的免疫球蛋白恒定區(qū)序列)來擴(kuò)增重鏈序列(Kabat et al. , Sequences ofProteins of Immunological Interest. 5th edition. U. S. Department of Health andHuman Services, Public Health Service, National Institutes of Health， Bethesda，Md. (1991))。使用根據(jù)抗mFLC輕鏈的氨基末端蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)的5'端引物并且與引物C-κ相結(jié)合來擴(kuò)增輕鏈Fv區(qū)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到可以使用許多適當(dāng)?shù)囊飦慝@得Fv區(qū)。將這些PCR產(chǎn)物亞克隆到適合的克隆載體中。通過DNA限制性酶切(DNArestriction)鑒定包含正確尺寸插入片段的克隆。然后可以使用與克隆位點(diǎn)鄰近的測序引物從雙鏈質(zhì)粒DNA來確定重鏈或輕鏈編碼區(qū)的核苷酸序列。可以使用商購的試劑盒(例如，美國俄亥俄州克立夫蘭市United States Biochemical公司的Sequenase 試劑盒)?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒?，包?例如)擴(kuò)增技術(shù)(如PCR以及LCR)，來制備編碼Fv區(qū)的DNA。化學(xué)合成產(chǎn)生了一種單鏈寡核苷酸。這可以通過與互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交，或者通過使用該單鏈作為模板使用DNA聚合酶進(jìn)行聚合而轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA。同時(shí)化學(xué)合成整個(gè)單鏈Fv區(qū)是可能的，優(yōu)選的是合成大量的較短的序列(約100至150個(gè)堿基)，這些序列隨后被 連接在一起。作為替代方案，可以克隆子序列以及使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄?。然后可以將這些片段連接以生產(chǎn)所希望的DNA序列。一旦獲得Fv可變輕鏈和重鏈DNA，可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)直接地或者通過編碼肽連接物的DNA序列將這些序列連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過一個(gè)柔性肽連接物(例如，(Gly4Ser)3)來連接重鏈和輕鏈區(qū)，該連接物始于在重鏈Fv結(jié)構(gòu)域的羰基末端并且止于輕鏈Fv結(jié)構(gòu)域的氨基端。整個(gè)序列以單鏈抗原結(jié)合蛋白的形式編碼Fv結(jié)構(gòu)域。抗-KMA抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合mFLC的抗體是一種抗KMA抗體。例如，該抗體可以是Kl21或一種K121樣抗體。K121是一種鼠單克隆抗體(mAb)，該抗體特異性識別人游離K輕鏈以及表達(dá)在K型骨髓瘤細(xì)胞的表面上的抗原。這種抗原被命名為K骨髓瘤抗原或KMA(Boux，HA. et al.，1983)。已經(jīng)確立的是，KMA由與細(xì)胞膜上的肌動蛋白非共價(jià)結(jié)合的形式表達(dá)的游離 K 輕鏈構(gòu)成(Goodnow et al.，1985)。當(dāng)在此使用時(shí)，短語“K121樣抗體”是指這樣一種抗體，該抗體包括SEQ ID NO 1中列出的VH區(qū)以及SEQ ID NO :2中列出的VL區(qū)，或與具有SEQ ID NO :1中列出的VH區(qū)以及在SEQ ID NO : 2中列出的VL區(qū)的一種抗體競爭結(jié)合到κ骨髓瘤抗原(KMA)上?？梢酝ㄟ^它們與Κ121 (或Κ121的嵌合的或人源化的形式)競爭結(jié)合到的HMy2細(xì)胞上的KMA的能力來鑒定K121樣抗體。在這個(gè)步驟中，可以使用已建立的步驟使用生物素來結(jié)合K121 (Hofmann et al.，1982)。然后通過它們與生物素?；腒121競爭結(jié)合到HMy2上的KMA上的能力評估這些K121樣抗體。生物素?；腒121到HMy2細(xì)胞上的結(jié)合可以通過加入熒光素標(biāo)記的鏈親和素來評估，該熒光素標(biāo)記的鏈親和素將結(jié)合到K121分子上的生物素上。然后通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的熒光染色進(jìn)行定量，并且K121樣抗體的競爭效應(yīng)被表達(dá)為在缺乏競爭物下得到的熒光水平的百分比。抗LMA抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合mFLC的抗體是一種抗LMA抗體。如在此使用的術(shù)語“ LMA”包括與源于λ型免疫球蛋白的輕鏈等效的任何游離λ輕鏈。因此該術(shù)語包括一定范圍的λ輕鏈多肽，這些多肽在它們的可變區(qū)序列方面可能是不同的。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言這些抗LMA抗體應(yīng)該是已知的。例如，在用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的試驗(yàn)中，已經(jīng)使用了針對LMA的抗體來檢測血清或尿液中游離λ輕鏈(Bradwell et al.，2001)。然而，LMA至今并沒有被用作用于治療患者體內(nèi)的B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的靶標(biāo)。適合的抗LMA 抗體的實(shí)例包括 3D12 (產(chǎn)品 #abl944 ；AbCam Ltd, Cambridge, UK)、 CBL317(Cymbus Biotechnology Ltd, UK)、4G7(產(chǎn)品 #ab54380 ；AbCam Ltd)、ME_154(產(chǎn)品 #ab9245 ；AbCam Ltd) >26D(產(chǎn)品 #CBL317 ；Chemicon Australia Pty Ltd, Victoria,Australia)或 2G9 (產(chǎn)品 #CBL109 ;Chemicon Australia Pty Ltd)。細(xì)胞毒性部分用于本發(fā)明的適合的細(xì)胞毒性部分包括但不限于試劑類，如細(xì)菌性或植物毒素類，藥物類，如環(huán)磷酰胺(CTX ;環(huán)磷酰胺)、苯丁酸氮芥(CHL ;瘤可寧)、順鉬(CisP ；CDDP ；順氯氨鉬)、白消安(馬利蘭)、美法蘭、卡莫司汀(BCNU)、鏈脲菌素、曲他胺(TEM)、絲裂霉素C、以及其他烷化劑；甲氨蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP-16 ;凡畢士)、6_巰基嘌呤(6MP)、6-硫鳥嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、2-氯脫氧腺苷(2-CdA)、以及其他抗代謝物；抗生素類包括放線菌素D、阿霉素(DXR ;亞德利亞霉素)、柔紅霉素(道諾霉素)、博來霉素、光輝霉素以及其他抗生素類；生物堿類例如新長春堿(VCR)、長春堿等；以及其他抗癌劑類(包括細(xì)胞生長抑制劑類)；糖皮質(zhì)激素類如地塞米松(DEX ;地卡特隆)以及皮質(zhì)激素類如潑尼松、核苷酸酶抑制劑例如羥基脲，以及類似物。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到的是，存在著可以通過熟知的技術(shù)結(jié)合到抗體上并且遞送以特異性破壞患病組織的多種其他放射性同位素以及化學(xué)細(xì)胞毒性劑。參見例如授予Blattler等人的美國專利號4，542，225。光活化的毒素的實(shí)例包括二氫吡啶以及ω芋螺毒素(Schmidt et al.，1991)。可以使用的成像以及細(xì)胞毒試劑的實(shí)例包括1251、1311、mIn、123I、99mTc、32P、3H、以及14C;突光標(biāo)記，如熒光素以及羅丹明，以及化學(xué)發(fā)光劑類，例如螢光素?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)用這類試劑來標(biāo)記抗體。例如，抗體的放射性標(biāo)記的相關(guān)技術(shù)，參見 Wenzel and Meares, Radioimmunoimaging and Radio immunotherapy,Elsevier, N. Y. (1983)(還參見 Colcher et al.，1986 ； " Order, Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy" , in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,Baldwin etal. (eds)，pp.303-16 (Academic Press 1985))。在一個(gè)實(shí)例中,通過穩(wěn)定的硫脲共價(jià)鍵將連接物-螯合劑替伊莫單抗連接到結(jié)合mFLC的抗體上從而為銦-111或釔-90提供高親和性螯合位點(diǎn)。當(dāng)編碼細(xì)胞毒性劑的DNA分子存在于本發(fā)明的治療組合物中時(shí)，優(yōu)選地該DNA編碼一種多肽，該多肽是一種細(xì)菌毒素或植物毒素。這些多肽包括但不限于多肽類，如天然的或修飾的假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻毒素、相思豆毒素、白樹毒素、木鱉子甙II ;細(xì)菌RIP，如志賀以及志賀樣毒素a-鏈、絲瓜素(Islam et al.，1990)、α天花粉蛋白(atrichosanthin) (Chow et al. , 1990)、木鳘子式 I (Ho et al.，1991)、紫茉莉?qū)倏共《镜鞍?Habuka et al.，1989)、美洲商陸抗病毒蛋白(Kung et al.，1990)、byodin 2(美國專利號5，597，569)、gaporin(Benatti et al.，1989)、以及它們的基因工程變體。天然PE以及DT是高度毒性的化合物，這些化合物典型地通過肝臟毒性而引起死亡。優(yōu)選地，將PE以及DT改良成一種形式，該形式去除了該毒素的天然靶向組分，例如PE的結(jié)構(gòu)域Ia以及DT的B鏈。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明不限于特定的細(xì)胞毒性劑。如在此使用的術(shù)語“假單胞菌外毒素”(PE)是指全長天然(天然發(fā)生的)PE或已經(jīng)被修飾的一種PE。這類修飾可以包括但不限于消除結(jié)構(gòu)域la、結(jié)構(gòu)域II和III中多個(gè)氨基酸的缺失、單個(gè)氨基酸取代(例如在位置590以及606處用Gln替換Lys)，并且在羧基端添加一個(gè)或多個(gè)序列(參見Siegall et al.，1989)。因此，例如，PE38是指一個(gè)截短的假單胞菌外毒素，它包括氨基酸253-364以及381-613。PE的天然C末端，REDLK (殘基609-613)，可以用序列KDEL、REDL來替換，并且Lys_590以及Lys_606可以各自被突變成Gln0如在此使用的術(shù)語“白喉毒素”(DT)是指全長天然DT或是指一種已經(jīng)被修飾的DT。這些修飾典型地包括去除B鏈中的靶向結(jié)構(gòu)域，并且更具體地，涉及平截B鏈的羧基區(qū)。
治療方法本發(fā)明的這些方法對于治療或預(yù)防B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)(例如，自身免疫失調(diào)、炎性失調(diào)以及膿毒癥)是有用的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)不包括B細(xì)胞惡性腫瘤。可以用本發(fā)明的這些方法治療的自身免疫性失調(diào)包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、多發(fā)性硬化、克羅恩病、免疫性血小板減少性紫癜、尋常天皰瘡、自身免疫性蕁麻疹、乳糜瀉、皰疹樣皮炎、急性風(fēng)濕熱、格雷夫病、重癥肌無力、舍格倫綜合征、古德帕斯丘綜合征、鏈球菌感染后腎小球腎炎、接觸性皮炎、自身免疫性甲狀腺炎、橋本甲狀腺炎、艾迪生病、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、由抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)引起的血管炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、自身免疫性肝炎、以及原發(fā)性膽汁性肝硬化。一方面，本發(fā)明的這些方法使用未修飾的抗體或結(jié)合片段，這依賴于這些抗體或片段原位結(jié)合到漿細(xì)胞前體的表面mFLC上從而在其上激發(fā)了一種免疫攻擊。例如，可以使用一種嵌合抗體(其中抗原結(jié)合位點(diǎn)被連接到人Fe區(qū)上)，例如IgGl，來促進(jìn)抗體依賴性介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。本發(fā)明的另一個(gè)方面，可以使用mFLC結(jié)合部分(如一種結(jié)合mFLC的抗體，在其上結(jié)合有一種細(xì)胞毒性劑或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑)來進(jìn)行該治療方法。生成的結(jié)合物結(jié)合到漿細(xì)胞前體上，抑制了這些細(xì)胞的生長或?qū)⑺鼈儦⑺馈Ｈ绫绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，一些B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)患者在他們的循環(huán)系統(tǒng)中可能具有顯著水平的游離λ輕鏈。當(dāng)抗mFLC抗體與這些游離輕鏈進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，它們在受試者的體液中的存在可能降低治療的效果。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法進(jìn)一步包括在施用抗mFLC抗體之前，對受試者進(jìn)行治療以降低在受試者的體液(例如血液)中循環(huán)的游離λ輕鏈的水平的步驟。這種額外的治療步驟可以包括(例如)血漿取出法。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的，血漿取出法是一種過程，其中通過稱為細(xì)胞分離器的一種裝置將血漿去除血細(xì)胞。該分離器或者通過在高速下旋轉(zhuǎn)血液來從體液中分離細(xì)胞或者通過使血液通過具有小到僅血漿可以通過的多個(gè)孔的膜來進(jìn)行操作。使這些細(xì)胞返回到受試者體內(nèi)，而將血漿(血漿包含游離輕鏈)棄去并且用其他流體替換。在該步驟期間可以通過靜脈給予用于保持血液防止凝固的藥物(例如抗凝血藥)。應(yīng)當(dāng)理解的是，涉及抗mFLC抗體的使用的治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)(像例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、以及多發(fā)性硬化)的方法能夠單獨(dú)地或作為其他已知治療方案的輔助手段來進(jìn)行。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)踐中，可以使用抗mFLC抗體以從患者樣品中去除漿細(xì)胞前體，如在重新引入患者體內(nèi)之前的骨髓。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，這些抗體被附連到一種基質(zhì)(如珠粒)上。這可以通過數(shù)種熟知的用于制備親和基質(zhì)的方法中的任何一種來完成，該親和基質(zhì)包括抗體或它們的結(jié)合片段。然后將患者樣品暴露于該基質(zhì)，例如通過在促進(jìn)樣品中的漿細(xì)胞前體通過抗原/抗體相互作用與附連到該基質(zhì)上的抗體或結(jié)合片段相結(jié)合的條件下使這些細(xì)胞通過包含該基質(zhì)的柱子。樣品中的這些漿細(xì)胞前體附連到基質(zhì)上，而柱子流出物(即，未粘附的細(xì)胞群)被排除漿細(xì)胞前體?？梢酝ㄟ^針對殘留漿細(xì)胞前體對這些細(xì)胞進(jìn)行檢查來監(jiān)測該步驟的效果，例如通過使用如下所述的可檢出地標(biāo)記的抗體。該步驟可以被重復(fù)或修改以增加功效。
診斷測定與試劑盒結(jié)合mFLC的抗體對于診斷應(yīng)用(在體外以及體內(nèi)兩者中)、對于檢測表達(dá)游離輕鏈的漿細(xì)胞前體也是有用的。體外診斷法包括細(xì)胞的免疫組織學(xué)檢測。免疫組織化學(xué)技術(shù)包括用結(jié)合mFLC的一種抗體將一種生物樣品(例如組織樣品)染色，并且然后檢測抗體與其抗原復(fù)合成為抗原抗體復(fù)合物的存在。這類抗體-抗原與樣品復(fù)合的形成表明該組織中存在表達(dá)游離輕鏈的漿細(xì)胞前體。使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)可以完成對樣品上的抗體的檢測，例如免疫酶技術(shù)，例如，免疫過氧化物酶染色技術(shù)，或抗生物素蛋白-生物素技術(shù),或免疫突光技術(shù)(參見例如,Ciocca et al. , " Immunohistochemical TechniquesUsing Monoclonal Antibodies" ,Methods Enzymol,121 :562-79,1986and Kimball,(ed),Introduction to Immunology(2. sub. nd Ed), pp.113-117 (Macmillan Pub. Co. ,1986)。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。如在此使用的術(shù)語“標(biāo)記物”是指通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、或化學(xué)手段可檢出的一種組合物。例如，有用的標(biāo)記物包括多種放射性分子，如32P、14C、125I、3H、以及35S;熒光染料類，如熒光素或羅丹明、電子致密試劑、異硫氰酸酯；生色團(tuán)類；酶類(如ELISA中通常使用的)；發(fā)光酶類，如螢蟲素酶等。這類標(biāo)記的抗體可以用于抗原的組織學(xué)定位、用于ELISA、用于細(xì)胞分選、以及用于例如對抗原以及帶有這些抗原的細(xì)胞進(jìn)行檢測和/或定量的其他免疫技術(shù)。如上所述，這類標(biāo)記的抗體或它們的片段的具體用途是在移植特別是自身骨髓移植之前確定漿細(xì)胞前體從骨髓組織中排除的效果。本發(fā)明還針對使用如上所述的抗mFLC抗體用于B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的成像方法。該方法包括施用或輸注如在此所述的與或不與可檢出部分(例如放射性核素)相結(jié)合的抗體。在施用或輸注之后，該抗體或抗體片段結(jié)合到這些漿細(xì)胞前體上，此后檢測出抗體的位置。對于可檢出地標(biāo)記的抗體(例如用放射性核素標(biāo)記的那些)而言，可以使用成像儀器來鑒定該試劑在體內(nèi)的位置。對于使用未標(biāo)記的抗體而言，可以施用一個(gè)第二可檢出的試劑，該試劑將這些抗體定位，并且因此可以被適當(dāng)?shù)貦z測。這些方法已經(jīng)用于其他抗體，并且熟練的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)詳盡地了解針對體內(nèi)的抗體或片段的位置的成像的這些不同的方法。本發(fā)明還包括用于研究或診斷目的的試劑盒。試劑盒典型地包括一個(gè)或多個(gè)容器，這些容器包含一種抗mFLC抗體。該抗mFLC抗體可以用一種標(biāo)記物衍生，或者作為替代方案，它可以與一種第二標(biāo)記物結(jié)合從而提供隨后的檢測。如上所述，這類標(biāo)記物可以包括放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記(即辣根過氧化物酶(HRP))或類似物。該試劑盒還包括適當(dāng)?shù)牡诙?biāo)記物(例如，綿羊抗小鼠HRP，或類似物)。該試劑盒還可以包含不同的試劑以有助于融合多肽的結(jié)合、非特異性結(jié)合抗體的去除、以及結(jié)合的標(biāo)記物的檢測。這類試劑是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。在本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了多種組合物，這些組合物包括結(jié)合到固相支持體上的抗mFLC抗體。用于本發(fā)明的固相支持體對于用于結(jié)合的反應(yīng)條件而言應(yīng)當(dāng)是惰性的。用于本發(fā)明的固相支持體必須具有反應(yīng)基團(tuán)或活化基團(tuán)以附連到單克隆抗體上或它 的結(jié)合配偶體上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該固相支持體可以是一種有用的色譜支持體，例如碳水化合物聚合物類SEPHAROSE. RTM.、SEPHADEX. RTM.、或瓊脂糖。如在此使用的，固相支持體不限于特定類型的支持體。然而，大量的支持體是可用的并且對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的。固相支持體包括例如硅膠類、樹脂類、衍生的塑料薄膜類、玻璃珠粒類、棉制品、塑料珠粒類、氧化鋁凝膠、磁珠類、膜類(包括但不限于硝酸纖維素、纖維素、尼龍、以及玻璃棉)、塑料以及玻璃皿或孔，等。使用上述這些研究以及診斷試劑盒的方法是通常熟知的，并且通常提供于使用該試劑盒的指導(dǎo)手冊中。實(shí)例實(shí)例I. lH常人外周血B細(xì)胞的體外活化在體外使用兩種不同實(shí)驗(yàn)方案將⑶19+外周血衍生的B細(xì)胞活化，I. IL-21、抗CD40以及抗IgM的組合，或2.福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌細(xì)菌(SAC)。用IL-21、抗⑶40以及抗IgM純化的B細(xì)胞的活化而產(chǎn)生漿細(xì)胞，包括在它們的表面上表達(dá)KMA的那些(通過mKap [K121]反應(yīng)性來定義KMA)。通過流式細(xì)胞儀的表達(dá)KMA細(xì)胞的表型分析顯示，它們是由表面IgD-、⑶27++以及⑶38++定義的漿細(xì)胞的一個(gè)亞群(圖I)。這些KMA+/IgD-/⑶27++/⑶38++代表了所有⑶38++B細(xì)胞的大致12%。相反，用SAC進(jìn)行刺激沒有產(chǎn)生任何漿細(xì)胞。然而，在兩個(gè)不同的群中發(fā)現(xiàn)了 KMA表達(dá)；CD27++和⑶381ow漿母細(xì)胞(大致10%的⑶381ow群)以及⑶27+/++和⑶38+漿母細(xì)胞(大致14% 的 CD38+群；圖 2)。實(shí)例2.在ιΗ常人淋巴B細(xì)胞中的KMA的體內(nèi)表汰倘若用體外活化系統(tǒng)獲得結(jié)果，諸位發(fā)明人確定是否類似類型的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)KMA。通過FACS針對KMA表達(dá)連同B細(xì)胞標(biāo)志物⑶19、⑶38以及⑶45—起，對來自人扁桃體的單核細(xì)胞進(jìn)行分析。諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在CD38++漿細(xì)胞部分中的一小群表達(dá)KMA的細(xì)胞(超過同種型對照大致7. 8% ;圖3a，門3)。有趣的是，這些細(xì)胞還表達(dá)⑶45，⑶45是未成熟的漿細(xì)胞表型的代表(圖3b)。除了對表達(dá)KMA的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞評估之外，在正常組織上進(jìn)行了免疫組織化學(xué)研究(IHC)。用FITC標(biāo)記的MDX1097 (包括mKap可變結(jié)構(gòu)域的一種人-小鼠嵌合抗體)將來自正常供體的深冷保存的、未固定的組織切片染色，緊接著使用小鼠抗-FITC第二抗體以及山羊抗小鼠過氧化物酶。用顯色底物對載波片進(jìn)行處理并且對表達(dá)進(jìn)行分析。用MDX1097進(jìn)行正常人類組織的IHC染色顯示在扁桃體以及唾液腺中的少量KMA陽性細(xì)胞具有漿細(xì)胞以及漿母細(xì)胞形態(tài)(即細(xì)胞具有大量細(xì)胞質(zhì)以及圓形細(xì)胞核)。在細(xì)胞膜上(作為KMA)以及細(xì)胞內(nèi)兩者上觀察到染色表明這些細(xì)胞包含大量的游離kLC。在正常外周血中未觀察到表達(dá)KMA的細(xì)胞證實(shí)了前面的結(jié)果(圖4 ；ffalker et al.，1985)。實(shí)例3.在活化的外周血B細(xì)朐h. KMA以及LMA的表汰從由澳大利亞紅十字會得到的供體樣品中分離CD19+外周血B細(xì)胞。然后進(jìn)行密度梯度離心用于分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，使用磁性MicroBead以及MACS分離系統(tǒng)或autoMACS Pro儀器(Miltenyi Biotec，德國)對CD19+細(xì)胞進(jìn)行純化。通過在37°C，5%CO2 下在含有 IL-21 (I μ g/mL ;Invitrogen,美國)、抗 0)40 抗體(10 μ g/mL ；R&D Systems,美國)以及抗IgM抗體(50 μ g/mL ;Sigma_Aldrich,美國)抗體類的培養(yǎng)基中孵育6_7天來活化這些⑶19+細(xì)胞。
用IL-21、抗⑶40以及抗IgM活化⑶19+外周血B細(xì)胞導(dǎo)致了 KMA+以及LMA+細(xì)胞的產(chǎn)生。表達(dá)KMA以及LMA的細(xì)胞的表型是⑶27++、⑶38++、⑶45+以及IgD-，因此證實(shí)了上述結(jié)果，顯示在一個(gè)亞群的晚期漿母細(xì)胞上表達(dá)KMA (之前沒有研究過⑶45的表達(dá))。
在這項(xiàng)研究中，在6 % -60 %的⑶38++/⑶27++/⑶45+群中觀察到KMA，這被前面的證據(jù)所支持，即顯示在大致14%的活化⑶19+B細(xì)胞亞群上表達(dá)KMA。之前沒有研究過LMA的表達(dá)，并且我們希望對體外活化的CD19+細(xì)胞上LMA的存在/缺乏進(jìn)行檢查。這項(xiàng)研究證明10% -20%的⑶27++、⑶38++、⑶45++以及IgD-細(xì)胞表達(dá)LMA。所獲得的結(jié)果的匯總提供于表I中。表I.在活化的漿母細(xì)胞上KMA以及LMA表達(dá)的匯總。
供體活化后的天數(shù) KMA表達(dá)LMA表達(dá)
1660.00%20.80%
26 0.00%* 10.00%
3712.54%12.52%
466.12%13.73%
5**69.09%0.00%在IL-21、抗⑶40以及抗IgM抗體存在下外周血B細(xì)胞活化之后，研究了 KMA和LMA的表達(dá)。如上所示按百分?jǐn)?shù)計(jì)在⑶27++、⑶38++、⑶45+以及IgD-細(xì)胞上檢測了 KMA以及LMA。對于供體1-3使用MACS分離系統(tǒng)，而對于供體4-5使用autoMACS Pro儀器。*流式細(xì)胞儀運(yùn)行中收集的低的事件數(shù)量〃低生存力討論
表型以及形態(tài)分析證明，KMA以及LMA作為mFLC被表達(dá)在一個(gè)亞群的正常漿母細(xì)胞以及未成熟的漿細(xì)胞上。這些細(xì)胞類型代表分泌抗體細(xì)胞的功能獨(dú)特亞群(Shapiro-Shelef et al. ,2005) 在正常免疫應(yīng)答過程中，許多早期抗體產(chǎn)生主要是由漿母細(xì)胞以及未成熟的漿細(xì)胞支配的。最后這些細(xì)胞最終分化成為成熟的衆(zhòng)細(xì)胞，這些衆(zhòng)細(xì)胞或者經(jīng)歷快速細(xì)胞死亡或者遷移到骨髓中并且由于來自骨髓微環(huán)境的生存信號而維持長壽命(Manz et al.，1997)。許多研究已經(jīng)分析了漿母細(xì)胞以及漿細(xì)胞在不同自身免疫病理學(xué)中的作用。因?yàn)闈{母細(xì)胞和未成熟的漿細(xì)胞兩者是自身抗體以及成熟漿細(xì)胞的前體的來源，它們被認(rèn)為是很多自身免疫性疾病中一些的主要效應(yīng)細(xì)胞類型。例如，在多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、舍格倫綜合征、糖尿病以及反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥中已經(jīng)顯示漿母細(xì)胞以及未成熟的衆(zhòng)細(xì)胞的累及(Cepok et al. , 2005 ；ffilliam et al. , 2005 ;以及 Jego et al.，1999)。倘若KMA以及LMA作為mFLC特異性地表達(dá)在這些細(xì)胞類型上，則KMA以及LMA代表用于治療不同自體免疫狀態(tài)的有吸引力的治療靶標(biāo)。 實(shí)例4.由結(jié)合mFLC的抗體介導(dǎo)的肓接介導(dǎo)細(xì)胞毒性4. I增殖測定在適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基以及條件下，用不同濃度的結(jié)合mFLC的抗體來孵育細(xì)胞。通過舉例，可以在37°C在添加有5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中將細(xì)胞與抗體一起孵育，持續(xù)I小時(shí)至4天之間的不同時(shí)間長度。與單獨(dú)的細(xì)胞相比較，抗體處理的細(xì)胞的增殖狀態(tài)可以通過使用多種試劑來測量，這些試劑測量細(xì)胞群的代謝健康。一種這樣的試劑是MTS溶液(Promega,美國)，該試劑通過代謝活性細(xì)胞而被轉(zhuǎn)化成甲膜。這種轉(zhuǎn)化伴隨著在490nm處的吸光度的產(chǎn)生，這可以使用吸光度讀取儀器進(jìn)行測量。4. 2凋亡測定在適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基以及條件下，用不同濃度的抗體來孵育細(xì)胞。例如，在37°C下在添加有5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中將細(xì)胞與不同濃度的抗體一起孵育4小時(shí)。與單獨(dú)的細(xì)胞相比較，抗體處理細(xì)胞的凋亡狀態(tài)可以使用錨定蛋白_V-FITC(異硫氰酸熒光素)或碘化丙錠(PD試劑以及流式細(xì)胞儀進(jìn)行研究。錨定蛋白-V結(jié)合到帶負(fù)電荷的磷脂磷脂酰絲氨酸(PS)上，在凋亡早期該帶負(fù)電荷的磷脂磷脂酰絲氨酸被從細(xì)胞膜的內(nèi)層而重新分布到細(xì)胞膜的外層上?？梢酝ㄟ^PI檢測壞死的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀能夠測量PI和FITC的熒光，因此能夠區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。4. 3抗體交聯(lián)在如上所述適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基以及條件下，將細(xì)胞與不同濃度的抗體以及交聯(lián)劑一起孵育。該交聯(lián)劑可以是一種抗體制劑，該抗體制劑結(jié)合到用于靶向細(xì)胞的抗體上。例如，如果抗KMA或抗LMA抗體是人IgGl，該交聯(lián)抗體可以是對于人IgGl具有特異性的一種多克隆制劑。已知抗體交聯(lián)增強(qiáng)了抗體的直接細(xì)胞毒性效應(yīng)?？梢允褂蒙鲜鲈鲋骋约暗蛲鰷y定法來測量抗體交聯(lián)對靶細(xì)胞增殖的作用。實(shí)例5.經(jīng)由結(jié)合mFLC的抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒件5. I抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)用于ADCC測定中的效應(yīng)細(xì)胞可以是外周血單核細(xì)胞(PBMC)制劑或特異性細(xì)胞群，如包含在PMBC制劑中的自然殺傷細(xì)胞(NK)或單核細(xì)胞。將使用聚蔗糖密度梯度從血液中分離PBMC?？梢詫⒀焊采w在聚蔗糖上，離心將產(chǎn)生梯度，并且將從該梯度的界面中收集PBMC。將使用磁性標(biāo)記的抗體制品(Miltenyi Biotec,德國)從如上產(chǎn)生的PBMC制品中分離出特異性細(xì)胞群以剔除不想要的細(xì)胞。例如，可以使用磁性標(biāo)記的抗體混合物來分離NK細(xì)胞，該混合物從PMBC制品中剔除非NK細(xì)胞。將保留磁性標(biāo)記的細(xì)胞(AutoMacs Pro儀器，Miltenyi Biotec，德國)，并且將收集NK細(xì)胞。在ADCC測定中，包被有不同濃度抗體的效應(yīng)和靶細(xì)胞將以不同的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率進(jìn)行混合，并且可以在適合的培養(yǎng)基中以及在適合細(xì)胞生長的條件下將該混合物孵育。例如，可以在37°C下在添加有10%胎牛血清的RPMI中將該混合物孵育16小時(shí)。在測定終點(diǎn)時(shí)，將對細(xì)胞溶解的程度進(jìn)行測量。例如，可以使用CytoTox-ONE均勻細(xì)胞膜完整性測定試齊Li盒(CytoTox-ONE Homogenous Membrane Integrity Assay Kit, Promega,美國)測量釋放的細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)的水平作為細(xì)胞溶解的指示物。
5. 2抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP)在AD⑶測定中，將在體外產(chǎn)生吞噬效應(yīng)細(xì)胞。通過經(jīng)由使用磁性標(biāo)記的抗體混合物(antibody cocktail)以及 AutoMacs Pro 儀器(Miltenyi Biotec,德國)排除非單核細(xì)胞，PMBC制劑將被用來分離單核細(xì)胞。將在適合于單核細(xì)胞的培養(yǎng)和分化成巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)純化的單核細(xì)胞?？梢詫⒕奘杉?xì)胞從板中取出置于支持它們粘附并且適合使用共聚焦顯微鏡來研究細(xì)胞相互作用的培養(yǎng)室中。用熒光染料如pHRododnvitiOgen，美國)將靶細(xì)胞染色，該染料是PH敏感的，包被有不同濃度的抗體并且置于包含巨噬細(xì)胞的室中。一旦該pHRodo染料暴露于酸性PH，它的熒光光譜發(fā)生改變?？梢栽谶m合的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞混合物。例如，可以在37°C下在添加有10%胎牛血清的RPMI 1640中將該細(xì)胞混合物孵育2小時(shí)。在測定終點(diǎn)時(shí)，可以洗滌未結(jié)合的細(xì)胞并且可以用對于唯一在巨噬細(xì)胞表面上表達(dá)標(biāo)志物具有特異性的的熒光結(jié)合抗體將巨噬細(xì)胞染色。最后，可以使用共聚焦顯微鏡對這些細(xì)胞進(jìn)行分析。將通過從它們的細(xì)胞膜的特異性標(biāo)記產(chǎn)生的熒光來鑒定巨噬細(xì)胞。除了它們的膜染色之外，已經(jīng)攝入靶細(xì)胞的巨噬細(xì)胞將具有由細(xì)胞的酸性內(nèi)涵體中的PHRodo染料所賦予的熒光?？梢酝ㄟ^對一定數(shù)量的顯微鏡視野中的細(xì)胞總數(shù)以及吞噬細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)來測量吞噬作用。5. 3補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)可以在補(bǔ)體(純化的補(bǔ)體或包含補(bǔ)體的人血清)以及抗體存在下在支持細(xì)胞生長的條件下孵育靶細(xì)胞。例如，可以在37°C下在補(bǔ)體以及抗體存在下在添加有10%胎牛血清的RPMI中將靶細(xì)胞孵育30分鐘至12小時(shí)。在測定終點(diǎn)時(shí)，將對細(xì)胞溶解的程度或細(xì)胞的代謝狀態(tài)(反映細(xì)胞生長)進(jìn)行測量?？梢允褂靡陨?. I節(jié)中所述的方法來測量細(xì)胞溶解?？梢允褂枚喾N試劑如Alamar Blue (Invitrogen,美國)來測量細(xì)胞的代謝狀態(tài)。在加入Alamar Blue之后，在補(bǔ)體以及抗體處理的細(xì)胞混合物中檢測的熒光與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。在此所討論的和/或引用的所有出版物都以其全部內(nèi)容結(jié)合在此。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，正如在特定的實(shí)施方案中所示可以對本發(fā)明進(jìn)行許多改變和/或修飾，而不偏離如廣泛說明的本發(fā)明的范圍。因此，這些實(shí)施方案將在所有的方面被認(rèn)為是用作說明性的而不是限制性的。已經(jīng)包括在本說明書中的文件、法案、材料、裝置、物品等的任何討論僅僅是用于提供本發(fā)明的背景的目的。當(dāng)它在本申請的各權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前存在時(shí)，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為承認(rèn)這些事項(xiàng)中的任何一項(xiàng)或全部構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的公知常識。參考文獻(xiàn)Benatti et al. (1989) Eur J Biochem，183 :465-470.Beychok(1979)Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, p69.Bird et al. (1988) Science，242 :423-426.Boux, HA. et al. (1983) J Exp Med. 158 :1769.Bradwell et al. (2001)Clin. Chem. 47 :673-680.Browning (2006)Nat Rev Drug Discovery, 5 :564-576.Cepok et al. (2005) Brain, 128 :1667.Chow et al. (1990) J Biol Chem, 265 :8670-8674.Edwards and Cambridge(2006)Nat Rev Immunol，6 :394-403.Goodnow et al. (1985) J. Immunol. 135 :1276Greenwood et al. (1993)Eur J Immunol, 23 :1098-1104.Habuka et al. (1989) J Biol Chem，264 :6629-6637.Ho et al. (1991)BBA，1088 :311-314.Hofmann K，et al. (1982)Biochemistry 21 :978-84.Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci. USA，85 :5879-5883.Islam et al. (1990)Agricultural Biological Chem，54 :1343-1345.Jego et al. (1999)Blood，94 :701.Jones et al. (1986) Nature，321，522-525.Kung et al. (1990) Agric Biol Chem，54 :3301-3318.Manz et al. (1997) Nature，388 :133-134.Morrison et al. (1984)Proc Natl Acad Sci USA,81 :6851-6855.Schmidt et al. (1991) J Biol Chem. 266 :18025-33.Shapiro-Shelef et al. (2005)Nature Reviews Immunology, 5 :230-242.Siegall et al. (1989) J Biol Chem 264:14256-14261.Sun et al. (1986) Hybridoma 5Suppl I :517-20.Urlaub and Chasin (1980)Proc Natl Acad Sci USA. 77 :4216-4220.Walker et al. (1985)Adv Exp Med Biol, 186 :833-841.William et al. (2005). J Immunol，174 :6879-6887.
權(quán)利要求
1.一種用于治療或預(yù)防受試者體內(nèi)B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的方法，該方法包括將治療有效量的一種抗體施用到受試者體內(nèi)，該抗體結(jié)合膜結(jié)合游離輕鏈(mFLC)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該抗體結(jié)合在漿細(xì)胞前體上的mFLC。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該抗體結(jié)合到細(xì)胞毒性部分或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中該細(xì)胞毒性部分是一種毒素、一種化學(xué)治療劑、或一種放射性試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中該細(xì)胞毒性部分是編碼一種細(xì)胞毒性多肽的一種核酸分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中該生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是一種淋巴因子、一種細(xì)胞因子、或一種干擾素。
7.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其中該抗體結(jié)合KMA或LMA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中該抗體結(jié)合KMA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該抗體是一種K121樣抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該抗體包括SEQID NO :1中列出的VH區(qū)以及SEQID NO :2中列出的VL區(qū)，或與具有SEQ ID NO :1中列出的VH區(qū)以及在SEQ ID NO :2中列出的VL區(qū)的一種抗體競爭結(jié)合到K骨髓瘤抗體(KMA)上。
11.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其中該抗體結(jié)合LMA。
12.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其中該B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)是一種自身免疫性疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該自身免疫性疾病是選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、以及多發(fā)性硬化。
14.一種抑制受試者體內(nèi)漿細(xì)胞前體的生長或?qū)⑵錃⑺赖姆椒?，該方法包括將有效量的結(jié)合mFLC的一種抗體施用于受試者。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該抗體結(jié)合到細(xì)胞毒性部分或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑上。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該細(xì)胞毒性部分是一種毒素、一種化學(xué)治療劑、或一種放射性試劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該細(xì)胞毒性部分是編碼一種細(xì)胞毒性多肽的一種核酸分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是一種淋巴因子、一種細(xì)胞因子、或一種干擾素。
19.一種用于在受試者體內(nèi)定位漿細(xì)胞前體的方法，該方法包括將一種結(jié)合mFLC的抗體施用于該受試者，從而允許該抗體結(jié)合到受試者體內(nèi)的細(xì)胞上，并且確定該抗體在該受試者體內(nèi)的位置。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該抗體是被可檢出地標(biāo)記的。
21.根據(jù)權(quán)利要求I至20的任一項(xiàng)所述的方法，其中該結(jié)合mFLC的抗體是一種嵌合抗體或一種人源化抗體。
22.—種結(jié)合mFLC的抗體用于制造用于治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)的藥物的用途。
23.一種用于在受試者體內(nèi)進(jìn)行自體造血細(xì)胞移植的方法，該方法包括(i)從受試者體內(nèi)取出造血祖細(xì)胞群， (ii)用結(jié)合mFLC的抗體處理該細(xì)胞群,并且 (iii)將步驟(ii)處理的細(xì)胞群移植到該受試者體內(nèi)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括將結(jié)合mFLC的一種抗體靜脈內(nèi)輸注到該受試者體內(nèi)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中該自體移植方法是在細(xì)胞減少治療期間或之后在受試者身上進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、以及多發(fā)性硬化的治療。具體而言，本發(fā)明涉及使用結(jié)合到表達(dá)于漿細(xì)胞前體的表面上的膜結(jié)合游離輕鏈的抗體來治療B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失調(diào)。
文檔編號A61P37/00GK102802667SQ201080025215
公開日2012年11月28日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月7日
發(fā)明者安德魯·塔斯曼·哈欽森, 達(dá)倫·羅斯·瓊斯, 羅伯特·林賽·雷森, 帕里薩·阿斯瓦迪, 羅薩內(nèi)·鄧恩 申請人:免疫系統(tǒng)治療有限公司