專利名稱：新的有力的抗apob反義化合物的制作方法
新的有力的抗APOB反義化合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡聚體化合物(寡聚體)，其靶向細(xì)胞中的APO-BlOOmRNA，導(dǎo)致AP0-B100的減少的表達(dá)。AP0-B100表達(dá)的減少有益于一系列醫(yī)療病癥，諸如與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病，諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。相關(guān)申請(qǐng)
將以下相關(guān)申請(qǐng)W02007/031081和W02008/113830通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
見W02007/031081和W02008/113830的背景部分，其通過引用并入本文。仍有對(duì)另外的安全和非-毒性且能有效拮抗載脂蛋白B功能及因而降低血漿Lp (a)水平的制劑的需求。本發(fā)明提供有效和安全的鎖核酸(LNA)寡聚體化合物和它們?cè)谟糜谡{(diào)節(jié)載脂蛋白B表達(dá)的方法中的用途，ApoB-100，包括抑制載脂蛋白B，ApoB-48的替代性的亞型。發(fā)明概述本發(fā)明提供長(zhǎng)度在10 50個(gè)之間，諸如10 30個(gè)核苷酸的寡聚體，其包含總共10 30個(gè)核苷酸之間的連續(xù)的核苷酸序列，其中所述連續(xù)的核苷酸序列至少80% (例如，85%，90%，95%，98%或99% )同源于對(duì)應(yīng)于哺乳動(dòng)物AP0-B100基因或mRNA，諸如人(genbank登錄No :NM_000384或genbank登錄No NG_011793)的反向互補(bǔ)體或其天然存在的變體的區(qū)。由此，例如，寡聚體與具有APOB-IOOmRNA或AP0B-100基因序列的部分序列的單鏈核酸分子雜交。本發(fā)明提供綴合物，其包含本發(fā)明的寡聚體，及共價(jià)附接于所述寡聚體的至少一個(gè)非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的寡聚體或綴合物，及藥學(xué)可接受的稀釋齊U，載體，鹽或佐劑。本發(fā)明提供本發(fā)明的寡聚體或綴合物，其用作藥物，諸如用于治療與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病，諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。本發(fā)明提供本發(fā)明的寡聚體或綴合物用于生產(chǎn)用于治療與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病的藥物的用途，所述疾病諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。本發(fā)明提供治療與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病的方法，所述疾病諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥,高膽固醇血癥,耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化，所述方法包括給患有或可能患有與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病的患者施用例如有效劑量的本發(fā)明的寡聚體，綴合物或藥物組合物，所述疾病諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。本發(fā)明提供抑制表達(dá)AP0-B100的細(xì)胞中的AP0-B100的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用本發(fā)明的寡聚體或綴合物，以便實(shí)現(xiàn)抑制所述細(xì)胞中的AP0-B100。

圖I :用LNA寡核苷酸SEQ ID NO 26 50處理后HuH_7細(xì)胞中的apoB mRNA表
達(dá)。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化到GAPDH及相對(duì)于模擬物對(duì)照表示，以平均值+STD，n = 2。A顯示SEQID NO 26 38，及 B 顯示 SEQ ID NO 39 50。圖2 :在施用10mg/kg SEQ ID NO =28,29,44或45經(jīng)4周和在最后施用LNA寡核苷酸之后48小時(shí)時(shí)處死的C57BL/6J小鼠中每周測(cè)量一次總血清膽留醇。數(shù)據(jù)相對(duì)于對(duì)照(施用的鹽水)以平均值土std, n = 5表示。TC =總膽甾醇。圖3 :祀向apoB，SEQ ID NO :45的3種不同寡核苷酸的以不同施劑水平的重復(fù)的施劑。圖顯示A)對(duì)施劑之后I周在血清中測(cè)量的總膽留醇的效應(yīng)及B)研究末期的ALT水平。圖4 :在不同時(shí)間點(diǎn)以不同劑量水平單施用SEQ ID NO :29之后的總血清膽甾醇水平(A)及對(duì)HDL/LDL比的效應(yīng)⑶。圖5 :施劑(箭標(biāo)指示(A)每周一次，(B)每?jī)芍芤淮问﹦?之后I周每周測(cè)量的總血清膽留醇。對(duì)小鼠施劑70天及在處死之前最后劑量之后I 3周回收。圖6 :在第77天(處理末，最后劑量后7天)和第91天(回收期末)肝中的ApoBmRNA表達(dá)圖7 :在第77天處死日(最后施劑之后I周)及第91天(最后施劑之后3周)血清中的ALT水平。發(fā)明詳述寡聚體本發(fā)明采用寡聚體化合物(稱之為寡聚體)，用于調(diào)節(jié)編碼哺乳動(dòng)物AP0-B100的核酸分子，諸如人APO B-IOOmRNA或基因的AP0-B100核酸，及該編碼哺乳動(dòng)物AP0-B100的核酸分子的天然存在的變體的功能。本發(fā)明的背景中的術(shù)語“寡聚體”，指通過2個(gè)或更多核苷酸的共價(jià)連接形成的分子(即寡核苷酸)。在本文中，單核苷酸(單元)也可指單體或單元。寡聚體由長(zhǎng)度在10 50之間，諸如10 30個(gè)核苷酸的連續(xù)的核苷酸序列組成或包含長(zhǎng)度在10 50之間，諸如10 30個(gè)核苷酸的連續(xù)的核苷酸序列。在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物不包含RNA (單元)。優(yōu)選是，本發(fā)明的化合物是線性分子或合成為線性分子。寡聚體是單鏈分子，及優(yōu)選不包括如下短區(qū)，例如，至少3，4或5個(gè)連續(xù)的核苷酸，與相同的寡聚體之內(nèi)的相當(dāng)?shù)膮^(qū)互補(bǔ)(即雙聯(lián)體)，在這點(diǎn)上，寡聚體不是(基本上)雙鏈。在一些實(shí)施方式中，寡聚體基本上不是雙鏈，諸如不是siRNA。在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡聚體可完全由連續(xù)的核苷酸區(qū)組成。由此，寡聚體基本上不自身-互補(bǔ)。靶標(biāo)適宜地，本發(fā)明的寡聚體能下調(diào)AP0-B100基因的表達(dá)。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的寡聚體可影響AP0-B100的抑制，一般在哺乳動(dòng)物諸如人細(xì)胞，諸如肝細(xì)胞中。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的寡聚體結(jié)合于靶標(biāo)核酸及實(shí)現(xiàn)相比正常表達(dá)水平至少10%或20%的表達(dá)抑制，更優(yōu)選相比正常表達(dá)水平至少30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %或95 %抑制。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)使用0. 04和25nM之間，諸如0. 8和20nM之間的本發(fā)明的化合物的濃度時(shí)觀察到該調(diào)節(jié)。在相同的或不同實(shí)施方式中，表達(dá)抑制少于100%，諸如少于98%抑制，少于95%抑制，少于90%抑制，少于80%抑制，諸如少于70%抑制。表達(dá)水平的調(diào)節(jié)可通過測(cè)量蛋白水平測(cè)定，例如通過方法，諸如SDS-PAGE然后是使用針對(duì)產(chǎn)生的靶蛋白的適合的抗體的蛋白印跡?；蛘?，表達(dá)水平的調(diào)節(jié)可通過測(cè)量mRNA水平來測(cè)定，例如通過RNA印跡或定量RT-PCR。當(dāng)經(jīng)mRNA水平測(cè)量時(shí)，當(dāng)使用適當(dāng)?shù)膭┝?，諸如0. 04和25nM之間，諸如
0. 8和20nM濃度之間時(shí)的下調(diào)的水平，在一些實(shí)施方式中，在缺乏本發(fā)明的化合物下，一般是10 20%之間的正常水平的水平。本發(fā)明因此提供下調(diào)或抑制表達(dá)AP0-B100蛋白和/或mRNA的細(xì)胞中AP0-B100蛋白和/或mRNA表達(dá)的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞施用本發(fā)明的寡聚體或綴合物，以下調(diào)或抑制所述細(xì)胞中AP0-B100蛋白和/或mRNA的表達(dá)。適宜地，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如人細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，施用可體外發(fā)生。在一些實(shí)施方式中，施用可體內(nèi)發(fā)生。本文使用的術(shù)語“靶核酸”指編碼哺乳動(dòng)物AP0-B100多肽，諸如人AP0-B100，諸如人APO-BlOOmRNA的DNA或RNA。編碼核酸或其天然存在的變體，及由其來源的RNA核酸，優(yōu)選mRNA，諸如前-mRNA，盡管優(yōu)選成熟mRNA的AP0-B100。在一些實(shí)施方式中，例如當(dāng)在研究或診斷學(xué)使用時(shí)候，“靶核酸”可為源于以上DNA或RNA核酸靶的cDNA或合成寡核苷酸。本發(fā)明的寡聚體優(yōu)選能與靶標(biāo)核酸雜交。會(huì)認(rèn)可，人APO-BlOOmRNA是cDNA序列，且由此，對(duì)應(yīng)于成熟mRNA靶序列，盡管在cDNA序列中用胸苷取代尿嘧啶。術(shù)語“其天然存在的變體”指在定義的分類群之內(nèi)，諸如哺乳動(dòng)物，諸如小鼠，猴和優(yōu)選人中天然地存在的核酸序列的AP0-B100多肽的變體。一般而言，當(dāng)說道多核苷酸的“天然存在的變體”時(shí)，術(shù)語也可包括通過染色體轉(zhuǎn)位或復(fù)制編碼基因組DNA，及RNA，諸如由其來源的mRNA的AP0-B100的任何等位基因變體?！疤烊淮嬖诘淖凅w”也可包括源于APO-BlOOmRNA的可變剪接的變體。當(dāng)參考特定多肽序列時(shí)，例如，術(shù)語也包括蛋白的天然存在的形式，其可因此加工，例如通過共翻譯或翻譯后修飾，諸如信號(hào)肽切割，蛋白水解切割，糖基化，等。序列寡聚體包含連續(xù)的核苷酸序列或由連續(xù)的核苷酸序列組成，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于存在于人APO-BlOOmRNA的核苷酸序列的反向互補(bǔ)體。由此，寡聚體可包含SEQ ID NO:I 25或由SEQ ID NO :1 25組成，或選自SEQ ID NO :1 25的序列(表I)，其中所述寡聚體(或其連續(xù)的核苷酸部分)可任選地與所述選擇的序列具有1，2或3個(gè)錯(cuò)配。表I
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)度在10 30個(gè)核苷酸之間的寡聚體，其包含總共10 30個(gè)核苷酸之間的連續(xù)的核苷酸序列， 其中所述連續(xù)的核苷酸序列至少80%同源于對(duì)應(yīng)于哺乳動(dòng)物APO-BlOO基因或mRNA，諸如人APO-BlOOmRNA的反向互補(bǔ)體或其天然存在的變體的區(qū)，且 其中連續(xù)的核苷酸序列至少80%同源于對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :4，3，19，20之任何一個(gè)或SEQ ID NO :1 25之任何一個(gè)的區(qū)。
2.權(quán)利要求I的寡聚體，其中所述連續(xù)的核苷酸序列與人APO-BlOOmRNA的對(duì)應(yīng)區(qū)的反向互補(bǔ)體不包含錯(cuò)配或包含不多于I個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配。
3.權(quán)利要求I 2中任一項(xiàng)的寡聚體，其中所述寡聚體的核苷酸序列由連續(xù)的核苷酸序列組成。
4.權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)的寡聚體，其中所述連續(xù)的核苷酸序列長(zhǎng)度在10 18個(gè)核苷酸之間。
5.權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)的寡聚體,其中所述連續(xù)的核苷酸序列包含核苷酸類似物。
6.權(quán)利要求5的寡聚體，其中所述核苷酸類似物是糖修飾的核苷酸，諸如選自下列的糖修飾的核苷酸鎖核酸(LNA)單元'2' -O-烷基-RNA單元，2' -OMe-RNA單元，2'-氨基-DNA單元，及W -氟-DNA單元。
7.權(quán)利要求5的寡聚體，其中所述核苷酸類似物是LNA。
8.權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)的寡聚體，其為間隔聚體。
9.權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)的寡聚體，其中寡聚體由SEQID NO 26 50之任何一個(gè)組成，或包含SEQ ID NO 26 50之任何一個(gè)。
10.權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)的寡聚體，其中寡聚體由SEQID NO :29，28，44或45之任何一個(gè)組成，或包含SEQ ID NO :29，28，44或45之任何一個(gè)。
11.權(quán)利要求I 10中任一項(xiàng)的寡聚體，其抑制表達(dá)AP0-B100基因或mRNA的細(xì)胞中AP0-B100基因或mRNA的表達(dá)。
12.綴合物，其包含 權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)的寡聚體，及 共價(jià)附接于所述寡聚體的至少一個(gè)非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
13.藥物組合物，其包含 權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)的寡聚體，或權(quán)利要求12的綴合物，及 藥學(xué)可接受的稀釋劑，載體，鹽或佐劑。
14.權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)的寡聚體，或權(quán)利要求12的綴合物，其用作藥物，諸如用于治療與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病，諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。
15.權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)的寡聚體，或權(quán)利要求12中定義的綴合物，用于生產(chǎn)用于治療與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病的藥物的用途，所述疾病諸如在非限制性例中，不同類型的HDULDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥,高膽固醇血癥,耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。
16.治療與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病的方法， 所述疾病諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化， 所述方法包括給患有或可能患有與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病的患者施用有效量的權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)的寡聚體，或權(quán)利要求12的綴合物，或權(quán)利要求13的藥物組合物， 所述疾病諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽留醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。
17.抑制表達(dá)APO-BlOO的細(xì)胞中的AP0-B100的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)的寡聚體，或權(quán)利要求12的綴合物，以便抑制所述細(xì)胞中的AP0-B100。
全文摘要
本發(fā)明涉及寡聚體化合物(寡聚體)，其靶向細(xì)胞中的APO-B100mRNA，導(dǎo)致APO-B100的減少的表達(dá)。APO-B100表達(dá)的減少有益于治療某些醫(yī)療病癥，諸如與載脂蛋白B活性關(guān)聯(lián)的疾病，諸如在非限制性例中，不同類型的HDL/LDL膽甾醇不平衡；血脂異常，例如，家族性混合性高脂血癥(FCHL)，獲得性高脂血癥，高膽固醇血癥，耐抑制素的高膽固醇血癥；冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀心臟病(CHD)，動(dòng)脈粥樣硬化。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102802637SQ201080025791
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者N·F·尼爾森, E·M·斯特拉普, M·林德霍爾姆 申請(qǐng)人:桑塔里斯制藥公司