專利名稱：組合免疫療法組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及兩種不同免疫治療性組合物用于改進(jìn)誘導(dǎo)治療性免疫應(yīng)答和/ 或用于預(yù)防、改善和/或治療疾病(包括但不限于癌癥和傳染性疾病)的并行用途。
背景技術(shù)：
免疫治療性組合物(包括疫苗)是醫(yī)療工業(yè)可用于預(yù)防和治療疾病的最劃算措施之一。然而，仍然迫切需要開發(fā)安全且有效的針對多種疾病(包括那些由致病體感染、癌癥、遺傳缺陷和免疫系統(tǒng)的其它病癥引起的或與其有關(guān)的)的免疫治療策略和佐劑。對于治療癌癥和許多傳染性疾病(包括病毒性疾病和由胞內(nèi)病原體引起的疾病)，希望提供引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的(細(xì)胞)免疫應(yīng)答的免疫療法，盡管許多疫苗主要或完全致力于引發(fā)體液免疫。確實(shí)，許多亞單位疫苗以及許多殺滅或減毒病原體疫苗的缺點(diǎn)在于雖然它們表現(xiàn)出刺激強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，但是它們不能引發(fā)保護(hù)性的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。癌癥是全世界首要死因，而且針對癌癥的有效療法的開發(fā)繼續(xù)成為最活躍的研究領(lǐng)域之一。雖然已經(jīng)提出了用于治療和預(yù)防癌癥的多種創(chuàng)新辦法，但是許多癌癥繼續(xù)具有高死亡率且可能難以治療或相對不響應(yīng)常規(guī)療法。癌癥生物學(xué)的新發(fā)現(xiàn)提供了機(jī)會(huì)來設(shè)計(jì)靶特異性抗癌劑，而且促進(jìn)了藥物和免疫療法開發(fā)的進(jìn)步。這些發(fā)現(xiàn)使之有可能設(shè)計(jì)針對癌細(xì)胞中特定靶具有高選擇性的分子和治療性組合物。已經(jīng)報(bào)告了眾多免疫療法研究，在誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活性和抗腫瘤效果的能力方面比較靶向相同抗原的疫苗平臺(tái)(參見例如Wfeide et al.，Immunol Lett 2008 Jan 15; 115(1) :33-42 ；Riezebos-Brilman et al. , Gene Ther 2007 Dec ； 14 (24) :1695-704 ； Naslund et al.，J Immunol 2007 Jun 1 ；178(11) :6761-9 ；Mylin et al.，J Virol 2000 Aug;74(15) :6922-34 ；Millar et al.，Cell Immunol 2007Nov-Dec ；250 (1-2) :55-67 ； Hodge et al.，Cancer Res 2003 Nov 15 ；63 (22) :7942-9 ；Chan et al.，Gene Ther 2006 Oct ；13(19) :1391-402 ；Casimiro et al.，J Virol 2003 Jun ；77(11) :6305-13 ；及Bos et al.，J Immunol 2007 Nov 1 ； 179 (9) :6115-22) Millar 等人顯示了由靶向相同抗原的兩種不同載體(rV和重組腺病毒)誘導(dǎo)的T細(xì)胞群的功能性沒有差別(Millar et al.，Cell Immunol 2007Nov-Dec ；250 (1-2) :55-67)。先前在臨床前模型中報(bào)告了含有鼠B7-1、ICAM-1、和LFA-3基因以及人癌胚抗原(CEA)基因的重組痘苗(rV)和重組禽痘(rF)病毒的多樣化引發(fā)和加強(qiáng)疫苗方案(rV/ F-CEA/TRIC0M)的抗腫瘤功效(Hodge et al.，Cancer Res 2003Nov 15 ；63 (22) :7942-9 ； Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15 ；59 (22) :5800-7 ；Hodge et al.，Clin Cancer Res 2003 May ；9 (5) :1837-49 ；Grosenbach et al. , Cancer Res 2001 Jun 1 ；61(11) 4497-505 ；Greiner et al. , Cancer Res 2002 Decl ；62 (23) :6944-51 ；Arlen et al., Crit Rev Immunol 2007 ；27 (5) :451-62)。最近，還在臨床前模型中證明了重組啤酒糖酵母 (Saccharomyces cerevisiae)(酵母一CEA)疫苗的抗月中瘤效果(Bernstein et al. ,Vaccine 2008 Jan 24 ；26 (4) :509-21 ；Wansley et al.，Clin Cancer Res 2008 Jul 1 ；14(13) 4316-25)。證明了接種rV/FCEA/TRICOM或酵母-CEA任一后對免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，而且由任一疫苗引發(fā)的抗腫瘤效果主要?dú)w于對CEA特異性T細(xì)胞群的誘導(dǎo)。數(shù)項(xiàng)研究證明了對更多樣的T細(xì)胞群的誘導(dǎo)在多種疾病(包括癌癥)模型中發(fā)起免疫應(yīng)答中是有利的(Dudley et al. , Cancer J 2000 Mar-Apr ；6 (2) :69-77 ；Dutoit et al. , Cancer Res 2001 Aug 1 ；61 (15) :5850-6 ；Echchakir et al. , Int Immunol 2000 Apr ； 12 (4) :537-46 ；Ferradini et al. , Cancer Res 1992 Sep 1 ；52(17) :4649-54 ； Messaoudi et al.，Science 2002 Nov 29 ；298 (5599) :1797-800 ；Nikolich-Zugich et al.，Nat Rev Immunol 2004 Feb ；4 (2) :123-32 ；Sportes et al.，J Exp Med 2008 Jul 7 ； 205(7) :1701-14 ；Zhou et al.，Cancer Res 2005 Feb 1 ；65(3) :1079-88)。然而，沒有靴向相同抗原的疫苗的并行使用的報(bào)告。在靶向相同抗原的研究(諸如上文描述的那些)之后，調(diào)查人員在歷史上或是選擇最有效的疫苗進(jìn)行進(jìn)一步研究，或是采用多樣化引發(fā)和加強(qiáng)策略來擴(kuò)大T細(xì)胞應(yīng)答。例如，靶向CEA的重組痘苗和禽痘載體的多樣化引發(fā)-加強(qiáng)接種策略(Hodge et al. ,Vaccine 1997 Apr-May ； 15 (6-7) :759-68 ；Marshall et al.，J Clin Oncol 2000 Dec 1 ； 18 (23) :3964-7 得到采用，因?yàn)獒槍Φ谝灰呙绲拿庖邞?yīng)答顯示出降低后續(xù)相同載體接種的效果(Naslund et al.，2007，見上文；Grosenbach et al.，2001，見上文；Hodge et al.，1997，見上文；及 Wu et al.，J Virol 2005 Jul ；79 (13) :8024-31)。 在多種癌癥和其它疾病模型(包括HIV和瘧疾)中記載了相似結(jié)果，證明多樣化引發(fā)-加強(qiáng)策略的清楚優(yōu)點(diǎn)(Wu et al，2005，見上文；Pancholi et al.，J Infect Dis 2000 Jul ； 182(1) :18-27 ；Barnett et al. , AIDS Res Hum Retroviruses 1998 Oct ； 14 Suppl 3 S299-309 ；Dunachie et al. ,J Exp Biol 2003 Nov ；206 (Pt 21) :3771-9 ；McMichael,Annu Rev Immunol 2006 ；24 :227-55 ；Moore et al.，Immunol Rev 2004 Jun ；199 :126-43)。在這些研究中觀察到的增強(qiáng)的應(yīng)答歸于有關(guān)抗原特異性T細(xì)胞群的擴(kuò)大，但是再次使用多樣化引發(fā)-加強(qiáng)辦法來實(shí)現(xiàn)這些結(jié)果。因而，盡管癌癥療法和傳染性疾病免疫療法/疫苗技術(shù)有進(jìn)步，但是仍然迫切需要改進(jìn)安全且有效的免疫治療辦法來治療此類疾病。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療癌癥的至少一種癥狀，延長具有癌癥的個(gè)體的存活，和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種癌癥抗原的治療性免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對個(gè)體施用下述各項(xiàng)的步驟(a)包含重組痘苗病毒的第一免疫療法組合物，該重組痘苗病毒包含編碼至少一種共刺激性分子的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物， 該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域。該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。在一個(gè)方面，該重組痘苗病毒包含編碼共刺激性分子B7-1、ICAM-I和LFA-3 的核酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療癌癥的至少一種癥狀，延長具有癌癥的個(gè)體的存活，和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種癌癥抗原的治療性免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對個(gè)體施用下述各項(xiàng)的步驟(a)包含下述各項(xiàng)的第一免疫療法組合物⑴包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組痘苗病毒；和(ii)包含編碼GM-CSF 或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域。該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。在此實(shí)施方案的一個(gè)方面，在第一次施用后至少一周，該方法另外包括對個(gè)體施用下述各項(xiàng)的步驟(a)包含下述各項(xiàng)的第三免疫療法組合物(i)包含編碼 B7-UICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組禽痘病毒；和(ii)包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域。該第二和第三免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫療法組合物的組合在制備藥物中的用途，該藥物并行施用于個(gè)體，以在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療癌癥的至少一種癥狀，延長具有癌癥的個(gè)體的存活，和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答。該免疫療法組合物包含(a)包含下述各項(xiàng)的第一免疫療法組合物(i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組痘苗病毒；和(ii)包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒； 和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域。在一個(gè)方面，該免疫療法組合物進(jìn)一步包含包含下述各項(xiàng)的第三免疫療法組合物 (i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組禽痘病毒；和(ii)包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療疾病或狀況的至少一種癥狀的方法。該方法包括對個(gè)體施用下述各項(xiàng)的步驟(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對個(gè)體施用下述各項(xiàng)的步驟(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種延長具有疾病或狀況的個(gè)體的存活的方法。該方法包括對個(gè)體施用下述各項(xiàng)的步驟(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫療法組合物的組合在制備藥物中的用途，該藥物并行施用于個(gè)體，以在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療疾病或狀況的至少一種癥狀。該免疫療法組合物包括(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該組合物配制用于并行施用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫療法組合物的組合在制備藥物中的用途，該藥物并行施用于個(gè)體，以在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答。該免疫療法組合物包含(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該第一和第二免疫療法組合物之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。該組合物配制用于并行施用。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及免疫療法組合物的組合在制備藥物中的用途，該藥物并行施用于具有疾病或狀況的個(gè)體，以延長個(gè)體的存活。該免疫療法組合物包含(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該第一和第二免疫療法組合物之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。該組合物配制用于并行施用。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，其包含(a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物。該第一和第二免疫療法組合物之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。 該第一和第二免疫療法組合物混合提供。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種試劑盒，其包含下述免疫療法組合物(a)包含重組痘苗病毒的第一免疫療法組合物，該重組痘苗病毒包含編碼至少一種共刺激性分子的核酸序列和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種抗原或其免疫原性域。在一個(gè)方面，該重組痘苗病毒包含編碼共刺激性分子B7-1、ICAM-I和LFA-3的核酸序列。在一個(gè)方面，該抗原是癌癥抗原。在一個(gè)方面，該抗原是包含CAP-1-6D表位的經(jīng)修飾CEA。下文描述了本發(fā)明試劑盒的其它方面。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種試劑盒，其包含下述免疫療法組合物(a)包含下述各項(xiàng)的第一免疫療法組合物(i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組痘苗病毒；和 ( )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和(b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種抗原或其免疫原性域。在一個(gè)方面， 該試劑盒進(jìn)一步包含包含下述各項(xiàng)的第三免疫療法組合物(i)包含編碼B7-1、ICAM-I和 LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組禽痘病毒；和(ii)包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒。 在一個(gè)方面，該抗原是癌癥抗原。在一個(gè)方面，該抗原是包含CAP-1-6D表位的經(jīng)修飾CEA。 下文描述了本發(fā)明試劑盒的其它方面。在本文(上文或下文)描述的任何實(shí)施方案中，包括涉及本發(fā)明方法、用途組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該第一和第二免疫療法組合物(和/或特定實(shí)施方案中的第三免疫療法組合物)之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。在一個(gè)方面，該第一和第二免疫療法組合物(和/或特定實(shí)施方案中的第三免疫療法組合物)二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。在一個(gè)方面，該第一免疫療法組合物包含至少一種抗原或其免疫原性域，且該第二免疫療法組合物不然。在一個(gè)方面，該第二免疫療法組合物包含至少一種抗原或其免疫原性域，且該第一免疫療法組合物不然。在一個(gè)方面，該第一和第二免疫療法組合物均包含相同抗原或其免疫原性域。在一個(gè)方面，該第一和第二免疫療法組合物(和/ 或特定實(shí)施方案中的第三免疫療法組合物)包含不同抗原或其免疫原性域。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面，包括任何實(shí)施方案涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒，該第一和/或第三免疫療法組合物包含重組病毒，該重組病毒包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。在一個(gè)方面，該第一和/或第三免疫療法組合物包含包含病毒基因組或其部分和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組病毒和包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列的重組病毒。在一個(gè)方面，該第一和/或第三免疫療法組合物包含重組病毒，該重組病毒包含編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列和編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該第一和/或第三免疫療法組合物中的重組病毒或病毒是痘病毒。在一個(gè)方面，該重組病毒或該第一和/或第三免疫療法組合物中的病毒是重組痘苗病毒。在一個(gè)方面，該痘苗病毒是經(jīng)修飾的安卡拉(Ankara)痘苗病毒 (MVA)。在一個(gè)方面，該重組病毒或該第一和/或第三免疫療法組合物中的病毒是禽痘病
ο在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該免疫刺激性分子包含一種或多種共刺激性分子。在一個(gè)方面，該免疫刺激性分子包括但不限于B7. 1 (B7-1)、B7. 2 (B7-2) ,ICAM-U LFA-3、4-1BBL、⑶59、⑶40、⑶40L和/或⑶70。在一個(gè)方面，該免疫刺激性分子包含B7-1、 ICAM-1、和LFA-3中一種、兩種或所有三種。在一個(gè)方面，該免疫刺激性分子包含一種或多種細(xì)胞因子，包括但不限于腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL_6)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ (IFN-γ)，IFN-α、IFN-λ、白介素-12(IL-12)、 RANTES、和白介素-2(IL-2)。在一個(gè)方面，該細(xì)胞因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該第二免疫療法組合物包含表達(dá)至少一種抗原或其免疫原性域的酵母媒介。在一個(gè)方面，該第二免疫療法組合物中的酵母媒介是完整酵母。在一個(gè)方面，該第二免疫療法組合物中的酵母媒介是完整、熱殺死酵母。在一個(gè)方面，該第二免疫療法組合物中的酵母媒介來自糖酵母屬(Saccharomyces)。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何方法或用途實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面， 該第一和第二免疫療法組合物(和/或特定實(shí)施方案中的第三免疫療法組合物)施用于個(gè)體中的不同部位。在另一個(gè)方面，該第一和第二(和/或第三)免疫療法組合物施用于個(gè)體中的相同部位或鄰近部位。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何方法或用途實(shí)施方案或方面的另一個(gè)方面，該方法或用途進(jìn)一步包括對該個(gè)體加強(qiáng)該免疫療法組合物之一或二者(或某些實(shí)施方案中的所有三種)的步驟。在一個(gè)方面，對該個(gè)體加強(qiáng)該第二免疫療法組合物，比該第一免疫療法組合物更加頻繁。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何方法或用途實(shí)施方案或方面的另一個(gè)方面，其中有第一和第二免疫療法組合物，該方法或用途進(jìn)一步包括對該個(gè)體加強(qiáng)與該第一免疫療法組合物不同的包含重組病毒的第三免疫療法組合物的步驟，該重組病毒包含病毒基因組或其部分。例如，在一個(gè)方面，該第一免疫療法組合物包含重組痘苗病毒，且該第三免疫療法組合物包含禽痘病毒。在本文所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、 組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該第一或該第二免疫療法組合物任一比另一更加頻繁地施用。例如，在一個(gè)方面，當(dāng)該第一免疫療法組合物是基于病毒的免疫療法組合物，且該第二免疫療法組合物是基于酵母的免疫療法組合物時(shí)，該第二免疫療法組合物可以比該第一免疫療法組合物更加頻繁地施用。例如，在一個(gè)方面，在該第一和第二免疫療法組合物的并行施用中間，該第二免疫療法組合物可以多施用一次、兩次、三次或更多次。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何方法或用途實(shí)施方案或方面的另一個(gè)方面，該方法進(jìn)一步包括對該個(gè)體加強(qiáng)該抗原或其免疫原性域的另一種來源的步驟。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何方法或用途實(shí)施方案或方面的另一個(gè)方面，該方法進(jìn)一步包括對該個(gè)體施用至少一種生物應(yīng)答修飾劑的步驟。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該個(gè)體具有癌癥。在一個(gè)方面，該方法或用途在個(gè)體中降低腫瘤負(fù)荷或抑制腫瘤生長。在本發(fā)明的任何實(shí)施方案的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該抗原來自選自下組的癌癥黑素瘤，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，頭頸癌，甲狀腺癌，軟組織肉瘤，骨肉瘤，睪丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮膚癌，腦癌，血管肉瘤(angiosarcoma)，血管肉瘤(hemangiosarcoma)，肥大細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，原發(fā)性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃腸癌，腎細(xì)胞癌，造血瘤形成或其轉(zhuǎn)移癌。在一個(gè)方面，該抗原選自下組癌胚抗原(CEA)，點(diǎn)突變的Ras癌蛋白，Brachyury， MUC-I, EGFR, BCR-Abl, MART-I, MAGE-I, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2，正常的和點(diǎn)突變的 p53 癌蛋白，PSMA，酪氨酸酶，TRP-I (gp75), NY-ES0-1, TRP-2，TAG72, KSA, CA-125，PSA, HER-2/neu/c-erb/B2，hTERT，p73，B-RAF，腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)，Myc，馮希佩爾-林道蛋白(VHL)，Rb-1, Rb-2，雄激素受體(AR)，Smad4, MDRl, Flt-3, BRCA-I, BRCA-2, pax3-fkhr, ews-fli-1，HERV-H，HERV-K, TWIST，間皮素，NGEP，此類抗原的修飾，此類抗原的剪接變體， 和此類抗原的表位激動(dòng)劑，以及此類抗原的組合，和/或其免疫原性域，其修飾，其變體， 和/或其表位激動(dòng)劑。在一個(gè)方面，該抗原是癌胚抗原(CEA)，在一個(gè)實(shí)施方案，其包含 CAP1-6D表位。在一個(gè)方面，該抗原是包含CAP-1-6D表位的經(jīng)修飾CEA。在一個(gè)方面，該 CEA包含氨基酸序列SEQ ID NO :2(由本文中SEQ ID NO 1所示核酸序列編碼)。在另一個(gè)方面，該抗原是突變的Ras。在一個(gè)方面，該抗原是包含一個(gè)或多個(gè)Ras片段的多域融合蛋白，每個(gè)片段包含Ras位置12、13、59、61和/或76處的一處或多處突變。在一個(gè)方面，該Ras融合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO 4(由本文中SEQ ID NO 3所示核酸序列編碼)、 SEQ ID NO :6(由本文中SEQ ID NO :5所示核酸序列編碼)、SEQ ID NO :8(由本文中SEQ ID NO 7所示核酸序列編碼)、和/或SEQ ID NO 10(由本文中SEQ ID NO 9所示核酸序列編碼)。在一個(gè)方面，該抗原是Brachyury。在一個(gè)方面，該抗原是MUC-I。在一個(gè)方面，該抗原是EGFR。在一個(gè)方面，該抗原是BCR-Abl。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何方法或用途實(shí)施方案或方面的一個(gè)方面， 該方法或用途進(jìn)一步包括用化療治療該個(gè)體和/或用放療治療該個(gè)體的步驟。在本文(上文或下文)所述發(fā)明的任何實(shí)施方案或方面的另一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該個(gè)體具有由病原體引起或與病原體有關(guān)的疾病。在一個(gè)方面，該方法或用途減輕或預(yù)防病原體對個(gè)體的感染。在一個(gè)方面，該方法或用途降低個(gè)體中的病原體滴度。在本發(fā)明的任何實(shí)施方案的一個(gè)方面，包括涉及本發(fā)明方法、用途、組合物或試劑盒的任何實(shí)施方案，該抗原選自下組病毒抗原，真菌抗原，細(xì)菌抗原，蠕蟲抗原，寄生物抗原，外寄生物抗原，和原生動(dòng)物抗原。在一個(gè)方面，該抗原來自選自下組的病毒腺病毒，沙粒病毒，布尼亞病毒，冠狀病毒，柯薩奇病毒，巨細(xì)胞病毒，埃巴二氏病毒，黃病毒，肝DNA病毒，肝炎病毒，皰疹病毒，流感病毒，慢病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，粘病毒， 致癌病毒，正粘病毒，乳頭瘤病毒，乳多泡病毒，副流感病毒，副粘病毒，細(xì)小病毒，微小 RNA病毒，痘病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，呼腸病毒，桿狀病毒，風(fēng)疹病毒，披膜病毒，水痘病毒，和T-淋巴營養(yǎng)性病毒。在一個(gè)方面，該抗原來自選自下組的屬的感染因子曲霉(Aspergillus)，博德特氏菌(Bordatella，Bordetella)，布魯絲蟲(Brugia)， 假絲酵母(Candida)，衣原體(Chlamydia)，球蟲(Coccidia)，隱球菌(Cryptococcus)， 惡絲蟲(Dirofilaria)，埃希氏菌(Escherichia)，弗朗西絲氏菌(Francisella)，淋球菌(Gonococcus)，組織胞菜菌(Histoplasma)，利什曼原蟲(Leishmania)，分枝桿菌 (Mycobacterium)，支原體(Mycoplasma)，草履蟲(Paramecium)，百日咳(Pertussis)， 癥原蟲(Plasmodium),月市炎球菌(Pneumococcus),月市囊蟲(Pneumocystis),立克次氏體(Rickettsia)，沙門氏菌(Salmonella)，志賀氏菌(Shigella)，葡萄球菌(Staphylococcus),鏈球菌(Streptococcus)，弓形體(Toxoplasma),霍舌匕弧菌 (Vibriocholerae)，和耶爾森氏菌(Yersinia)。在一個(gè)方面，該抗原來自選自下組的屬的細(xì)菌假單胞菌(Pseudomonas)，博德特氏菌(Bordetella)，分枝桿菌(Mycobacterium)，弧菌 (Vibrio)，芽孢桿菌(Bacillus)，沙門氏菌(Salmonella)，弗朗西絲氏菌(Francisella)， 葡萄球菌(Staphylococcus),鏈球菌(Streptococcus), ±矣希氏菌(Escherichia),腸球菌 (Enterococcus),巴斯德氏菌(Pasteurella),禾口耳口爾森氏菌(Yersinia)。附圖簡述

圖1A-1I顯示了接種rV-CEA/TRICOM或酵母-CEA誘導(dǎo)差異血清細(xì)胞因子譜(圖 IA = MIPl α，圖 IB = RANTES,圖 IC = GM-CSF，圖 ID = IL-6，圖 IE = IL_12p70，圖 IF = IL-13,圖 IG = IL-I α，圖 IH = IL-I β 而圖 II = IL-5)。圖2A-2G顯示了接種rV/F_CEA/TRICOM或酵母-CEA誘導(dǎo)獨(dú)特TCR全集(顯示了無處理(圖2A)、rV/F-CEA/TRICOM(圖2B)、和酵母-CEA (圖2C)的V α譜，且顯示了無處理(圖 2D)、rV/F-CEA/TRICOM (圖 2E)、和酵母-CEA (圖 2F)的 V β 譜)。
圖3A顯示了 CEA域III A3環(huán)上離散、不交疊的CEA_5^和CEA-572表位。圖!3B-3C顯示了接種rV/F_CEA/TRIC0M或酵母-CEA響應(yīng)兩種離散CEA特異性表位即CEA-5^(圖3B)和CEA-572(圖3C)的體外刺激誘導(dǎo)獨(dú)特細(xì)胞因子譜。圖4A-4D顯示了來自接種rV/F_CEA/TRIC0M或酵母-CEA的小鼠對CEA-572表位特異性的T細(xì)胞系具有獨(dú)特TCR V α譜(rV/F-CEA/TRICOM T細(xì)胞系(黑色柱)的V α TCR 全集在CEA-5^肽(圖4A)和CEA-572肽(圖4B)存在下維持；酵母-CEA T細(xì)胞系(白色柱)的V α TCR全集在CEA-5^肽(圖4C)和CEA-572肽(圖4D)存在下維持)。圖5A-5F顯示了自接種rV/F_CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠生成的表位特異性T 細(xì)胞系具有相似水平的裂解活性但獨(dú)特的親合力(圖5A和5C顯示了自rV/F-CEA/TRICOM 接種生成的且對CEA-5^肽(圖5A)和CEA-572肽(圖5C)特異性的T細(xì)胞系；圖5B和5D 顯示了自酵母-CEA接種生成的且對CEA-5^肽(圖5B)和CEA-572肽(圖5D)特異性的 T細(xì)胞系；圖5E和5F顯示了自接種rV/F-CEA/TRIC0M(圖5E)或酵母-CEA(圖5F)的小鼠生成的對CEA-572表位特異性的T細(xì)胞系)。圖6顯示了在正位肺部轉(zhuǎn)移模型中并行施用rV/F-CEA/TRICOM和酵母-CEA疫苗提高抗腫瘤功效。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及兩種免疫治療性組合物(在本文中也稱為疫苗)用于誘導(dǎo)治療性免疫應(yīng)答和/或用于預(yù)防、改善和/或治療疾病(包括但不限于癌癥和傳染性疾病)的并行用途。更具體地，使用均靶向相同抗原或其免疫原性域的重組病毒免疫治療性疫苗和基于酵母的免疫治療性疫苗，在本文中證明疫苗載體和抗原二者在誘導(dǎo)具有共享的和獨(dú)特的細(xì)胞因子應(yīng)答、基因表達(dá)譜、和T細(xì)胞受體表型的T細(xì)胞群中具有作用。因而，抗原和載體二者在誘導(dǎo)獨(dú)特T細(xì)胞群中發(fā)揮作用。本文中呈現(xiàn)的研究指示由靶向相同抗原的兩種載體平臺(tái)誘導(dǎo)了表型上和功能上獨(dú)特的T細(xì)胞群。最后，本發(fā)明人證明了兩種疫苗可并行組合來改進(jìn)治療功效，在本文所述實(shí)驗(yàn)中顯示了疫苗的并行施用改進(jìn)抗腫瘤功效。這些結(jié)果指示來自靶向單一抗原的兩種獨(dú)特載體平臺(tái)的并行施用的治療好處，這是由于對更多樣的T細(xì)胞群的誘導(dǎo)和改善的治療功效。認(rèn)為此研究首次證明靶向相同抗原的兩種不同疫苗載體的有效并行施用。雖然先前顯示了本文所述研究中使用的疫苗均個(gè)別地誘導(dǎo)相似水平的CD4+T細(xì)胞群和CD8+T細(xì)胞溶胞活性(Wansley et al.，Clin Cancer Res, 2008Jul 1 ；14(13) :4316-25)，但是不知道或沒有預(yù)期這些疫苗誘導(dǎo)表型上和功能上獨(dú)特的T細(xì)胞群，及疫苗可并行組合來實(shí)質(zhì)性改進(jìn)抗腫瘤功效的發(fā)現(xiàn)。與顯示由靶向相同抗原(OVA)的兩種不同疫苗平臺(tái)(rV和重組腺病毒)誘導(dǎo)的 T細(xì)胞群的功能性沒有差別的在先研究(Millar et al. ,2007, Cell Immunol 250(1-2) 55-67)相反，本發(fā)明提供了載體和抗原二者影響由兩種不同免疫治療性疫苗(一種基于病毒的免疫療法組合物(在本文中稱為rV-CEA/TRIC0M)和一種基于酵母的免疫療法組合物(在本文中稱為酵母-CEA)誘導(dǎo)的T細(xì)胞群的功能性的證據(jù)。在細(xì)胞因子生成、基因表達(dá)、和TCR譜測定方面比較由兩種疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞群，本文中呈現(xiàn)的研究發(fā)現(xiàn)了 rV-CEA/ TRICOM誘導(dǎo)Thl應(yīng)答和具有Tcl表型的⑶8+T細(xì)胞，而酵母-CEA誘導(dǎo)混合Thl/Th2應(yīng)答和具有混合Tcl/Tc2表型的CD8+T細(xì)胞(圖1和幻。觀察到兩種疫苗對涉及免疫細(xì)胞遷移和TCR信號傳導(dǎo)和T細(xì)胞增殖的基因的上調(diào)(表1)。有趣地，雖然這些疫苗以表觀不利的方式調(diào)控涉及多種細(xì)胞途徑的基因的表達(dá)，但是沒有消除抗原特異性免疫應(yīng)答或抗腫瘤功效(ffansley et al.，Clin Cancer Res 2008 Jul 1 ；14(13) :4316-25)。本文中還證明了由任一疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞群具有共享的和獨(dú)特的Va和ViiTCR基因使用(圖2)，而且自接種CEA-Tg的小鼠創(chuàng)建的對兩種CEA表位之一特異性的T細(xì)胞系展現(xiàn)出不同的親合力和抗原特異性溶胞活性(圖幻?？傊@些研究證明了兩種免疫治療性疫苗誘導(dǎo)獨(dú)特T細(xì)胞群，而且這些T細(xì)胞群在表型和功能方面的差異可歸于載體和抗原二者。這些發(fā)現(xiàn)適用于在免疫療法組合物的背景中使用任何抗原。任一疫苗平臺(tái)投遞抗原的模式可影響這些獨(dú)特應(yīng)答的生成。酵母-CEA激活免疫應(yīng)答的主要機(jī)制是經(jīng)由攝取表達(dá)CEA的酵母及隨后由樹突細(xì)胞(DC)加工并呈遞CEA抗原 (Bernstein et al.，Vaccine 2008 Jan 24 ；26 (4) =5O9-2D，而 rV/F-CEA/TRICOM 載體感染細(xì)胞，誘導(dǎo)容許CEA抗原加工和呈遞的胞內(nèi)表達(dá)(Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15 ；59 (22) :5800-7)。觀察到的另一種差別是rV/F_CEA/TRIC0M接種誘導(dǎo)CEA特異性抗體的生成，而酵母-CEA不然(數(shù)據(jù)未顯示)。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和體液分支的激活中的此類機(jī)制差別也可影響對獨(dú)特T細(xì)胞群的載體和抗原特異性誘導(dǎo)。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在鼠正位肺部轉(zhuǎn)移模型中施用靶向相同抗原的兩種疫苗誘導(dǎo)獨(dú)特T細(xì)胞群且導(dǎo)致顯著更高的抗腫瘤免疫(圖6)。此研究還首次顯示了靶向相同抗原的兩種疫苗平臺(tái)能并行施用，這是由于它們對獨(dú)特T細(xì)胞群的誘導(dǎo)。另外，這些數(shù)據(jù)顯示了兩種疫苗的并行施用導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性升高的抗腫瘤效果，這是由于對更多樣的靶向相同抗原的T細(xì)胞群的誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)指示并行組合這些疫苗可用于提高抗原特異性免疫。本文所述免疫治療性疫苗的并行使用誘導(dǎo)更多樣的T細(xì)胞群，其由自兩種疫苗生成的T細(xì)胞組成，使得本發(fā)明之前使用的多樣化引發(fā)-加強(qiáng)進(jìn)度表不必要，盡管組合多樣化引發(fā)-加強(qiáng)進(jìn)度表與本文所述并行施用方案可進(jìn)一步增強(qiáng)有效免疫應(yīng)答。本發(fā)明使免疫應(yīng)答最大化， 始于初始接種，誘導(dǎo)更多樣的T細(xì)胞群，然后用每一次后續(xù)接種在程度上加強(qiáng)和擴(kuò)大。此類策略在癌癥患者以及罹患慢性傳染性疾病的患者中會(huì)是有效的，因?yàn)闀?huì)在他們的治療中早期誘導(dǎo)更多樣的T細(xì)胞群。因而，本發(fā)明涉及兩種或更多種不同免疫療法組合物的并行使用，以誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答，和/或至預(yù)防、改善和/或治療疾病或狀況，包括癌癥或傳染性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或更多種不同免疫療法組合物靶向相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或更多種不同免疫療法組合物之一靶向一種或多種抗原，且另一免疫療法組合物作為佐劑提供，不必靶向抗原，或不必與另一組合物靶向相同抗原(即在一個(gè)實(shí)施方案中，第二組合物靶向不同抗原)。在一個(gè)實(shí)施方案中，其可包括上文實(shí)施方案的任何組合，兩種或更多種免疫療法組合物并行施用，但是施用于患者中的不同身體部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可包括上文實(shí)施方案的任何組合，兩種或更多種不同免疫療法組合物并行施用，而且施用于患者中的相同部位或?qū)嵸|(zhì)性鄰近部位。本發(fā)明中使用的兩種或更多種不同免疫療法組合物均能夠個(gè)別地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答， 而且優(yōu)選至少細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且更優(yōu)選T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一個(gè)方面，至少一種組合物能夠誘導(dǎo)⑶8+和/或⑶4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且更優(yōu)選⑶8+和⑶4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所有依照本發(fā)明并行使用的組合物能夠誘導(dǎo)⑶8+和/或⑶4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且更優(yōu)選⑶8+和⑶4+免疫應(yīng)答。任選地，至少一種組合物能夠引發(fā)體液免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，由免疫療法組合物之一引發(fā)的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在表型上和/或在功能上在一個(gè)或多個(gè)方面不同于由另一免疫療法組合物引發(fā)的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)方面，免疫治療性組合物具有一項(xiàng)或多項(xiàng)下述特征(a)刺激一種或多種有效激活抗原呈遞細(xì)胞的樣式識別受體；(b)上調(diào)抗原呈遞細(xì)胞上的粘附分子、共刺激性分子、 和MHC I類和/或II類分子；(c)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞生成促炎性細(xì)胞因子；(d)誘導(dǎo)T細(xì)胞生成Thl型細(xì)胞因子；(e)誘導(dǎo)T細(xì)胞生成Thl7型細(xì)胞因子；(f)抑制或下調(diào)Treg ；和/或 (g)引發(fā)MHC I類和/或MHC II類抗原特異性免疫應(yīng)答。合適的免疫治療性組合物可包括基于酵母的免疫療法組合物、基于病毒的免疫療法組合物、基于抗體的免疫療法組合物、 DNA免疫療法組合物、亞單位疫苗、和對于刺激或調(diào)控免疫應(yīng)答有用的任何成分或佐劑(諸如TLR激動(dòng)劑、細(xì)胞因子、免疫強(qiáng)化劑、和其它藥劑)、及其任何組合，下文更為詳細(xì)地描述了其中許多。在一個(gè)方面，本發(fā)明中要使用的免疫療法組合物包括基于重組病毒的組合物和基于酵母的組合物(下文詳細(xì)描述)?；诓《镜拿庖忒煼ńM合物本發(fā)明的一個(gè)方面涉及基于重組病毒的免疫療法組合物(該短語可以與“基于病毒的免疫療法產(chǎn)品”、“基于病毒的組合物”、“基于病毒的免疫治療劑”、“基于病毒的疫苗”、 “包含或包括重組病毒或重組病毒載體的免疫療法組合物”、或這些短語的任何相似衍變互換使用)。如本文中使用的，短語“基于病毒的免疫療法組合物”指包括病毒載體成分(例如重組病毒或其有效構(gòu)成病毒載體的部分)且在受試者中引發(fā)足以實(shí)現(xiàn)至少一種治療性好處的免疫應(yīng)答的組合物。基于病毒的免疫療法組合物及其制備和一般使用的方法詳細(xì)記載于例如美國專利No. 6，045，802，美國專利No. 6，893，869，美國專利No. 6，548，068，及美國專利No. 6，969，609，通過述及將其每一篇完整收入本文。在一個(gè)方面，在本發(fā)明中有用的基于病毒的免疫療法組合物能夠誘導(dǎo)CD8+和/或CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且在一個(gè)方面，CD8+和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且在一個(gè)方面，體液免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中有用的基于病毒的免疫療法組合物能例如在個(gè)體中引發(fā)免疫應(yīng)答，使得該個(gè)體的疾病或狀況得到治療，或使得源自疾病或狀況的癥狀得到緩解或治療?；诓《镜拿庖忒煼ńM合物通常包含病毒載體，該病毒載體包含病毒基因組或其部分(例如重組病毒)和編碼至少一種來自疾病引起物或疾病狀態(tài)的抗原(例如癌癥抗原、傳染性疾病抗原、和/或至少一種其免疫原性域)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，基于病毒的免疫療法組合物進(jìn)一步包括至少一種病毒載體，該病毒載體包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。在一些實(shí)施方案中，編碼免疫刺激性分子和抗原的基因插入相同病毒載體(相同重組病毒)?？捎糜诖祟惐景l(fā)明免疫療法組合物的病毒為感染細(xì)胞，誘導(dǎo)病毒攜帶的抗原胞內(nèi)表達(dá)，容許抗原加工并呈遞的任何病毒。這些病毒中優(yōu)選那些誘導(dǎo)Thl應(yīng)答和具有Tcl表型的CD8+T細(xì)胞的?？捎糜诒景l(fā)明組合物的病毒包括部分基因組可刪除以引入新基因，不破壞病毒侵染性的病毒?？捎糜谏杀景l(fā)明病毒載體的親本病毒(即自其生成、衍生、建立、等病毒載體 /重組病毒的病毒)包括但不限于痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、α病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、微小 RNA病毒、桿狀病毒、和虹彩病毒。可用于本發(fā)明的痘病毒(痘病毒科的成員)包括復(fù)制型和非復(fù)制型載體。此類痘病毒包括但不限于正痘(正痘病毒屬)，諸如痘苗病毒(Perkus et al.，Science 229 :981-984,1985 ；Kaufman et al.，Int.J. Cancer 48 :900-907,1991 ； Moss, Science 252 :1662，1991)、浣熊痘、家兔痘等等，禽痘(禽痘病毒屬)，包括禽痘病毒，豬痘(豬痘病毒屬)，山羊痘(山羊痘病毒屬)等等。痘病毒可選自下組痘苗-哥本哈根，痘苗-Wyeth株，高度減毒的痘苗病毒(痘苗-MVA株)，經(jīng)修飾的安卡拉豆苗病毒(Sutter and Moss, Proc. Nat' 1 Acad. Sci. U. S. Α. 89 :10847-10851 ；Sutter et al., Virology 1994)，NYVAC，TR0VAC，金絲雀痘，ALVAC(Baxby and Paoletti, Vaccine 10:8-9， 1992 ；Rinns, Μ. Μ. et al. , (Eds)Recombinant Poxviruses CRC Press, Inc., Boca Raton 1992 ；Paoletti, Ε. , Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 93 :11349-11353，1996)，豬痘，等等。痘苗-Wyeth株的衍生物包括但不限于缺失功能性KlL基因的vTBC33。在又一個(gè)實(shí)施方案，病毒是作為天花疫苗自疾病控制中心(AtlanthGeorgia)可得的Dry-Vax。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組載體是痘苗病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組載體來自禽痘病毒。例如，禽痘病毒的一個(gè)株是 P0XVAC-TC (Schering-Plough Corporation)。可用于本發(fā)明的重組痘病毒具有多種屬性，包括(i)將基因有效投遞至多種細(xì)胞類型，包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)和腫瘤細(xì)胞；(ii)高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)；(iii)將抗原最佳呈遞給免疫系統(tǒng)；(iv)引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及抗體應(yīng)答的能力；(ν)瞬時(shí)而非永久的對細(xì)胞的遺傳修飾，和(vi)使用來自不同屬的痘病毒的組合的能力，因?yàn)樗鼈儧]有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。重組痘苗(rV，rMVA)和重組禽痘(rF)病毒是用于本發(fā)明基于病毒的免疫療法組合物的兩種例示性病毒。含有鼠B7-1、ICAM-1、和LFA-3基因以及人CEA基因的重組痘苗和禽痘病毒(rV/F-CEA/TRIC0M)已有記載(Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15 ； 59(22) :5800-7 ；Grosenbach et al. ,Cancer Res 200IJun 1 ；61(11) :4497-505 ^Hodge et al. ,Cancer Res 2003 Nov 15 ;63 :7942-7949)，通過述及將其每一篇完整收入本文。表達(dá)鼠 GM-CSF 的 rF 病毒(rF-GM-CSF)先前已有記載(Kass et al.，Cancer Res 2001 Jan 1 ；61⑴206-14)。為了本發(fā)明的目的，稱作“rV/F-CEA/TRIC0M”的疫苗指包括用rV-CEA/ TRICOM(含有編碼B7-1、ICAM-I、LFA-3和CEA的多核苷酸的重組痘苗)與rF_GM_CSF (含有編碼GM-CSF的基因的重組禽痘)混合引發(fā)，每7天用含有編碼B7-1、ICAM-I、LFA-3和 CEA的多核苷酸的rF-CEA/TRIC0M重組禽痘與rF_GM_CSF混合加強(qiáng)的完全疫苗方案。要理解，CEA僅僅是要與一種或多種本發(fā)明免疫療法組合物聯(lián)合使用的合適抗原(在此情況中是腫瘤相關(guān)或癌癥抗原)的一個(gè)例子。本發(fā)明的病毒載體包含至少一種與核酸序列可操作連接的表達(dá)控制元件。表達(dá)控制元件插入載體以控制和調(diào)節(jié)核酸序列的表達(dá)(Ausubel et al,1987, in" Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N. Y.)。表達(dá)控制兀件是本領(lǐng)域已知的，而且包括啟動(dòng)子。在本發(fā)明中有用的啟動(dòng)子是痘病毒啟動(dòng)子，如本領(lǐng)域已知的，其包括但不限于30K、13、sE/L、7. 5K、40K、和Cl。30Κ啟動(dòng)子的核酸序列已披露于 GenBank登錄號Μ35027，位于堿基編號28，012至28，423 (反義)。13的核酸序列披露于 GenBank登錄號J03399，位于堿基編號1100至1301 (反義)。7.漲啟動(dòng)子的核酸序列披露于GenBank登錄號Μ35027，位于堿基編號186550至186680。40Κ啟動(dòng)子的核酸序列披露于GenBank登錄號Μ13209，位于堿基編號9700至9858 (反義)。Cl啟動(dòng)子的核酸序列披露于GenBank登錄號M59027，位于堿基編號1至242及美國專利No. 5，093, 258。sE/L啟動(dòng)子的序列是本領(lǐng)域已知的?？墒褂闷渌徊《締?dòng)子，諸如Davison and Moss, J. Mol. Biol. 210 :749-769,1989)記載的那些。任何這些啟動(dòng)子可使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法來合成。適宜啟動(dòng)子的選擇基于其表達(dá)時(shí)機(jī)和水平。在一個(gè)方面使用早期或早期/晚期啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所利用的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子組合容許受感染宿主中每一種抗原和/或共刺激性分子的最佳表達(dá)以提供協(xié)同免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼抗原或共刺激性分子的核酸分子均受分開的和獨(dú)特的啟動(dòng)子控制。如本文中與為本發(fā)明中使用而描述的任何免疫療法組合物一起使用的，免疫刺激性分子包括但不限于細(xì)胞因子和共刺激性分子。例如，細(xì)胞因子可包括但不限于腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL_6)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN-y) ,IFN-α、IFN-λ、白介素-12 (IL-12)、RANTES、和白介素 _2 (IL-2)。共刺激性分子包括但不限于B7. 1 (在本文中也稱為B7-1)、B7. 2 (在本文中也稱為B7_2)、ICAM-I、 LFA-3、4_1BBL、⑶59、⑶40、⑶40L和⑶70。免疫刺激性分子可以在本發(fā)明的免疫療法組合物中單獨(dú)地和/或以各種組合提供，而且可以由一種或多種病毒載體或其它疫苗載體來表達(dá)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的重組載體含編碼至少三種共刺激性分子的基因，用于協(xié)同增強(qiáng)使用一種或兩種共刺激性分子得不到的免疫應(yīng)答。編碼共刺激性分子各種組合的基因是本發(fā)明用于重組載體的一個(gè)元件，而且可以包括諸如下述組合B7. 1，B7. 2，ICAM-UP LFA-3 ； B7. 1，ICAM-I，禾口 LFA-3 ；B7.1, B7. 2, ICAM—1，禾口 4—1BBL ；B7.1, B7.2, ICAM—1，LFA-3,禾口 4-1BBL ；CD59 和 VCAM-1 ；及 B7. 1 和 B7. 2 ；CD59, CD40，4_BBL，CD70 和 VCAM-1，B7. 1，B7. 2 ； 0X-40L，4-1BBL ；取決于所期望的免疫應(yīng)答和要治療的疾病或狀況。B7. 1 (⑶80)是T細(xì)胞抗原⑶觀的天然配體，介導(dǎo)T和B細(xì)胞粘附。B7. 1在活化的B細(xì)胞和γ -干擾素刺激的單核細(xì)胞上表達(dá)。⑶80對⑶觀和CTLA-4的結(jié)合對T細(xì)胞提供共刺激性信號并導(dǎo)致上調(diào)的淋巴因子生成。B7. 2(^86)是⑶的備選配體。ICAM-I (細(xì)胞間粘附分子1)，也稱為⑶M，是白細(xì)胞和內(nèi)皮相關(guān)細(xì)胞間粘附分子， 而且是白細(xì)胞受體LFA-I (整聯(lián)蛋白)的配體。ICAM-I在細(xì)胞因子刺激后上調(diào)，而且涉及細(xì)胞相互作用、白細(xì)胞內(nèi)皮移行、和涉及募集促炎性免疫細(xì)胞的信號傳導(dǎo)。LFA_3(淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3)，或⑶58，是由抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)的粘附分子，介導(dǎo)經(jīng)由在T細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞上找到的粘附分子CD2的共刺激性信號。此相互作用促進(jìn)細(xì)胞間粘附和T細(xì)胞活化。4-1BBL在活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)，而且是在活化的⑶4和⑶8 T細(xì)胞上表達(dá)的腫瘤壞死因子受體家族共刺激性成員4-1BB的配體。這些分子的相互作用能增強(qiáng) T細(xì)胞增殖和存活，及擴(kuò)大和活化CD8+T細(xì)胞記憶(Bukczynski et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 2004，101 (5) :1291-6)。⑶59是一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。病毒(包括痘苗病毒，痘苗)將宿主細(xì)胞⑶59摻入它們自己的病毒被膜以防止補(bǔ)體的裂解作用(Bohana-Kashtan et al. ,2004, Mol. Immunol. 41(6-7) :583-97)。VCAM-1 (血管細(xì)胞粘附分子-1)，或⑶106，是由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的粘附分子，而且介導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、和嗜堿性細(xì)胞對血管內(nèi)皮的粘附。它還在白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮功能。
⑶40是由抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)的共刺激性蛋白。⑶40對T細(xì)胞上其天然配體CD40L的結(jié)合活化APC并啟動(dòng)介導(dǎo)多種免疫和炎性應(yīng)答的信號傳導(dǎo)級聯(lián)。⑶70是生成和維持長期T細(xì)胞免疫所需要的受體⑶27的配體。0X40-L在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，并結(jié)合主要由活化的⑶4+T細(xì)胞表達(dá)的其天然受體0X40，因此，此相互作用涉及T細(xì)胞活化。GM-CSF (粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)是作為由T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和其它細(xì)胞生成的白血球生長因子發(fā)揮功能的細(xì)胞因子。GM-CSF刺激干細(xì)胞生成粒細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、和嗜堿性細(xì)胞)和單核細(xì)胞，因此是免疫系統(tǒng)活化和發(fā)育過程的一部分。免疫刺激性分子和抗原在病毒復(fù)制/感染部位(在任何情況中，抗原生成部位) 同時(shí)生成增強(qiáng)特定效應(yīng)器的生成。取決于具體的免疫刺激性分子，可能由不同機(jī)制負(fù)責(zé)增強(qiáng)的免疫原性提示輔助信號(IL-2)，募集專門APC (GM-CSF)，提高CTL頻率(IL-2)，和/或?qū)乖庸ね緩胶蚆HC表達(dá)的影響(IFN- γ和TNF α )。在一些情況中，為了具有多價(jià)疫苗而生成包含超過一種感興趣抗原的重組病毒可能是有益的。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物在藥學(xué)可接受載體中包含重組病毒(例如痘病毒)，該重組病毒含有編碼多種共刺激性分子的核酸分子。重組病毒可進(jìn)一步包含編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列，或者可提供編碼至少一種抗原或其免疫原性域的第二重組病毒(例如痘病毒)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的基于病毒的免疫療法組合物包括包含重組病毒(例如重組痘病毒)和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物，該重組病毒包含編碼Β7. 1或Β7. 2 的核酸序列、編碼ICAM-I的核酸序列、和編碼LFA-3的核酸序列。在Β7、ICAM-I、LFA-3構(gòu)建體之外，藥物組合物的重組病毒可另外包含編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列，或者可以通過第二重組病毒在組合物中提供編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物也可包含外源添加的免疫刺激性分子，如本領(lǐng)域已知的，包括但不限于共刺激性分子 Β7、ICAM-U LFA-3、4_1BBL、CD59、CD40、CD70、VCAM-U 0X-40L，和/或結(jié)合此類免疫刺激性分子的抗體，和/或此類免疫刺激性分子的激動(dòng)劑或拮抗劑，和/或細(xì)胞因子和趨化因子，包括但不限于IL-2、GM-CSF, TNF-α、IFN- y , IFN-α、 IFN-λ、IL-12、RANTES、MIP-1 α、Flt_3L (美國專利 No. 5，554,512 ；5，843，423)等等，以實(shí)現(xiàn)另外的免疫應(yīng)答協(xié)同或增強(qiáng)。可以在組合物中提供細(xì)胞因子和趨化因子自身，或者可以通過編碼細(xì)胞因子或趨化因子的重組病毒載體來提供細(xì)胞因子和趨化因子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供重組痘病毒，其包含在30K痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼LFA-3或其功能性部分的核酸序列、在13痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼ICAM-I或其部分的核酸序列、和在sE/L痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼B7. 1或其部分的核酸序列。重組痘病毒可進(jìn)一步提供編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供重組痘病毒，其包含在sE/L痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼B7. 1的核酸序列、在13痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼LFA-3或其部分的核酸序列、和在7. 5K痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼ICAM-I或其部分的核酸序列。任選地，構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼至少抗原或其免疫原性域的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組禽痘病毒包含在sE/L痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼B7. 1或其部分的核酸序列、在13痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼LFA-3或其部分的核酸序列、 和在7.漲痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼ICAM-I或其部分的核酸序列。重組禽痘病毒可進(jìn)一步包含在痘病毒啟動(dòng)子諸如40K痘病毒啟動(dòng)子控制下編碼靶抗原的核酸序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，基于重組病毒的免疫療法組合物不表達(dá)抗原，盡管在此類情況中，此類組合物的重組病毒載體優(yōu)選會(huì)表達(dá)一種或多種免疫刺激性分子，如本文中別處描述的。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，抗原由一種或多種不同免疫療法組合物提供，如本文中描述的，諸如本發(fā)明基于酵母的免疫療法組合物。因?yàn)楸景l(fā)明中使用的免疫療法組合物均可給免疫系統(tǒng)提供一些獨(dú)特的“危險(xiǎn)信號”或共刺激性信號，因此只有一種組合物包含抗原可能就足以提供載體的貢獻(xiàn)了。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生成包含編碼抗原和/或多種共刺激性分子的核酸序列的重組病毒的方法。一種生成重組痘病毒的方法是經(jīng)親本痘病毒基因組DNA和攜帶要插入的異源序列的質(zhì)粒載體之間的體內(nèi)同源重組實(shí)現(xiàn)的，如美國專利No. 5，093，258中披露的。用于將外來序列插入痘病毒的質(zhì)粒載體通過重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法來構(gòu)建。質(zhì)粒載體含有一種或多種嵌合外來基因，均包含與蛋白質(zhì)編碼序列連接的痘病毒啟動(dòng)子，側(cè)翼為來自痘病毒基因組非必需區(qū)域的病毒序列。使用本領(lǐng)域公認(rèn)的轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入受到親本痘病毒感染的細(xì)胞，而且質(zhì)粒上的痘病毒序列和親本病毒基因組中對應(yīng)DNA之間的重組導(dǎo)致來自質(zhì)粒的嵌合外來基因插入病毒基因組。重組病毒使用本領(lǐng)域已知的多種選擇或篩選系統(tǒng)任一來選擇和純化。外來基因插入痘苗基因組通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析來確認(rèn)。 外來基因的表達(dá)通過Western印跡分析來證明。一種生成重組痘病毒的備選方法是通過直接連接來實(shí)現(xiàn)的(Pleiderer et al.，J. Gen. Virol. 76 :2957-2962,1995 ；Merchlinsky et al.，Virol. 238 :444-451,1997)?；诮湍傅拿庖忒煼ńM合物在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括use of至少一種“基于酵母的免疫治療性組合物”(該短語可以與“基于酵母的免疫療法產(chǎn)品”、“基于酵母的組合物”、“基于酵母的免疫治療劑”、“基于酵母的疫苗”、“包含酵母媒介的免疫療法組合物”、或這些短語的任何相似衍變互換使用)。如本文中使用的，短語“基于酵母的免疫療法組合物”指包括酵母媒介成分且在受試者中引發(fā)足以實(shí)現(xiàn)至少一種治療性好處的免疫應(yīng)答的組合物。更特別地， 基于酵母的免疫治療性組合物是包括酵母媒介成分且能引發(fā)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，諸如細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括但不限于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物。在一個(gè)方面，在本發(fā)明中有用的基于酵母的免疫療法組合物能夠誘導(dǎo)CD8+和/或aCD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且在一個(gè)方面，CD8+和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。任選地，基于酵母的免疫療法組合物能夠引發(fā)體液免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中有用的基于酵母的免疫療法組合物能例如在個(gè)體中引發(fā)免疫應(yīng)答，使得該個(gè)體的疾病或狀況得到治療，或使得源自疾病或狀況的癥狀得到緩解或治療?；诮湍傅拿庖忒煼ńM合物通常包括酵母媒介和至少一種由酵母媒介表達(dá)、附著于酵母媒介、或與酵母媒介混合的抗原或其免疫原性域。在一些實(shí)施方案中，抗原或其免疫原性域作為融合蛋白來提供。在本發(fā)明的一個(gè)方面，融合蛋白可包括兩種或更多種抗原。在一個(gè)方面，融合蛋白可包括一種或多種抗原的兩種或更多種免疫原性域或者一種或多種抗原的兩種或更多種表位。TARM0GEN 是在本發(fā)明中有用的基于酵母的免疫療法組合物的一個(gè)非限制性例子。TARM0GEN (靶向分子免疫原，Globelmmune, Inc.，, Colorado) 一般指胞外(在其表面上)和/或胞內(nèi)(內(nèi)部或細(xì)胞溶質(zhì))表達(dá)一種或多種異源抗原的酵母媒介?；诮湍傅拿庖忒煼ńM合物及其制備和一般使用的方法詳細(xì)記載于例如美國專利No. 5，830，463，美國專利No. 7，083，787，美國專利No. 7，465，454，美國專利公開號 2007-0224208，美國專利公開號 US 2008-0003239，及 Stubbs et al. , Nat. Med. 7 625-629(2001), Lu et al., Cancer Research 64 :5084-5088(2004),及 Bernstein et al. , Vaccine 2008 Jan 24 ；26 (4) :509_21，通過述及將其每一篇完整收入本文。這些基于酵母的免疫治療性產(chǎn)品已經(jīng)顯示出引發(fā)免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答?；诮湍傅拿庖咧委熜援a(chǎn)品能夠在多種動(dòng)物物種中在體內(nèi)殺死表達(dá)多種抗原的靶細(xì)胞，而且是經(jīng)抗原特異性CD8+和/或CD4+介導(dǎo)的免疫應(yīng)答這樣做的。別的研究顯示了酵母被樹突細(xì)胞熱切吞噬并直接活化樹突細(xì)胞，然后樹突細(xì)胞以高度有效的方式將酵母相關(guān)蛋白呈遞給 CD4+ 和 CD8+T 細(xì)胞。參見例如 Mubbs et al. Nature Med. 5 :625-629(2001)和美國專利 No. 7，083，787。在本發(fā)明中使用的任何基于酵母的免疫療法組合物中，涉及酵母媒介的以下方面包括在本發(fā)明內(nèi)。依照本發(fā)明，酵母媒介指可以與一種或多種抗原、其免疫原性域或其表位聯(lián)合用于本發(fā)明的治療性組合物的任何酵母細(xì)胞(例如完整細(xì)胞)或其衍生物(見下文)， 或者在一個(gè)方面，酵母媒介可以單獨(dú)地或作為佐劑使用。酵母媒介因此可以包括但不限于活的完整酵母微生物(即具有其所有成分(包括細(xì)胞壁)的酵母細(xì)胞)、殺死的(死的)或滅活的完整酵母微生物、或其衍生物，包括酵母原生質(zhì)球(即缺乏細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞)、酵母胞質(zhì)體(即缺乏細(xì)胞壁和細(xì)胞核的酵母細(xì)胞)、酵母空細(xì)胞(即缺乏細(xì)胞壁、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的酵母細(xì)胞)、亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分(也稱為酵母膜顆粒，先前稱為亞細(xì)胞酵母顆粒)、任何其它酵母顆粒、或酵母細(xì)胞壁制備物。酵母原生質(zhì)球通常通過酶促消化酵母細(xì)胞壁來生成。這樣的方法加載于例如 Franzusoff et al.，1991，Meth. Enzymol. 194，662-674，通過述及完整收入本文。酵母胞質(zhì)體通常通過對酵母細(xì)胞去核來生成。這樣的方法加載于例如Coon，1978， Natl. Cancer Inst. Monogr. 48，45-55，通過述及完整收入本文。酵母空細(xì)胞通常通過將經(jīng)透化或溶解的細(xì)胞重新密封(reseal)來生成，可以而非必需包含該細(xì)胞的至少一些細(xì)胞器。這樣的方法加載于例如Franzusoff et al., 1983，J. Biol. Chem. 258，3608-3614 及 Bussey et al. , 1979, Biochim. Biophys. Acta 553， 185-196，通過述及將其每一篇完整收入本文。酵母膜顆粒(亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分)指缺乏天然細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的酵母膜。該顆?？梢允侨魏未笮〉?，包括范圍從天然酵母膜大小至通過超聲處理或本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它膜破碎方法繼以重新密封生成的微粒大小的大小。用于生成亞細(xì)胞酵母膜提取物的一種方法記載于例如 Franzusoff et al.，1991，Meth. Enzymol. 194，662-674。還可以使用包含酵母膜部分和(在制備酵母膜顆粒前由酵母重組表達(dá)抗原或其它蛋白質(zhì)時(shí)) 感興趣抗原或其它蛋白質(zhì)的酵母膜顆粒級分。感興趣抗原或其它蛋白質(zhì)可以在膜內(nèi)、在膜的表面上、或其組合方式(即蛋白質(zhì)可以既有膜內(nèi)的又有膜外的，和/或跨越酵母膜顆粒的膜)運(yùn)載。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母膜顆粒是重組酵母膜顆粒，其可以是完整的、遭到破壞的、或遭到破壞并重新密封的酵母膜，其在膜的表面上包含至少一種期望感興趣抗原或其它蛋白質(zhì)或所述抗原或其它蛋白質(zhì)至少部分包埋在膜內(nèi)。酵母細(xì)胞壁制備物的一個(gè)例子是在其表面上攜帶抗原或所述抗原至少部分包埋在細(xì)胞壁內(nèi)的分離的酵母細(xì)胞壁，使得該酵母細(xì)胞壁制備物在施用于動(dòng)物時(shí)刺激針對疾病靶的所期望的免疫應(yīng)答。任何酵母菌株都可用于生成本發(fā)明的酵母媒介。酵母是屬于以下三個(gè)綱之一的單細(xì)胞微生物子囊菌綱(Ascomycetes)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)和不完全菌綱(Fungi Imperfecti)。關(guān)于選擇用作免疫調(diào)控劑的酵母類型的一項(xiàng)考慮是酵母的病原性。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母是非病原性菌株，諸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。選擇非病原性酵母菌株使對接受酵母媒介施用的個(gè)體的任何不利效應(yīng)最小化。然而，如果酵母的病原性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何手段(例如突變株)來消除，那么可以使用病原性酵母。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，使用非病原性酵母菌株是優(yōu)選的。可用于本發(fā)明的酵母菌株的屬包括但不限于糖酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)(其可以是病原性的)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、和亞羅酵母屬(Yarrowia)。在一個(gè)方面，酵母屬選自糖酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和裂殖糖酵母屬，而且在一個(gè)方面，使用糖酵母屬?？捎糜诒景l(fā)明的酵母菌株的物種包括但不限于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、 白色假絲酵母(Candida albicans)、乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、羅侖氏隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala)、多形漢遜酵母 (Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)、馬克思克魯維酵母乳變禾中(Kluyveromyces marxianus var. lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、深紅酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、和脂肪溶解亞羅酵母(Yarrowia lipolytica)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，這些物種中的許多包括多種亞種、型、亞型等，它們意圖包括在上述物種內(nèi)。在一個(gè)方面，本發(fā)明中使用的酵母種包括啤酒糖酵母、白色假絲酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母和粟酒裂殖酵母。啤酒糖酵母是有用的，因?yàn)橄鄬σ子诓僮鞫矣米魇称诽砑觿┦恰肮J(rèn)是安全的”(Generally Recognized As Safe 或 GRAS) (GRAS, 1997 年 4 月 17 日 FDA 建議的規(guī)則62FR18938)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是能夠復(fù)制質(zhì)粒至特別高的拷貝數(shù)的酵母菌株，諸如啤酒糖酵母cir°株。該啤酒糖酵母菌株是這樣一種菌株，其能夠支持容許一種或多種靶抗原和/或抗原融合蛋白和/或其它蛋白質(zhì)以高水平表達(dá)的表達(dá)載體。另外，任何突變酵母株都可用于本發(fā)明，包括那些展現(xiàn)出所表達(dá)靶抗原或其它蛋白質(zhì)的翻譯后修飾降低，諸如延伸N-連接的糖基化的酶中有突變的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酵母媒介能夠與接受酵母媒介和抗原/藥劑投遞的細(xì)胞類型(諸如樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)融合，由此實(shí)現(xiàn)特別有效的將酵母媒介和(在許多實(shí)施方案中的)一種或多種抗原或其它藥劑投遞至該細(xì)胞類型。在用于本文時(shí)，酵母媒介與靶細(xì)胞類型的融合指酵母細(xì)胞膜或其顆粒與靶細(xì)胞類型(例如樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的膜融合而導(dǎo)致合胞體形成的能力。在用于本文時(shí)，合胞體指通過細(xì)胞合并而生成的多核原
23生質(zhì)塊。許多病毒表面蛋白(包括免疫缺陷病毒諸如HIV、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和腺病毒的那些)和其它促融劑(fusogen)(諸如那些牽涉卵子與精子間融合的)已經(jīng)顯示出能夠?qū)崿F(xiàn)兩種膜之間(即病毒與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜之間或哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜之間)的融合。例如，在其表面上生成HIV gpl20/gp41異源抗原的酵母媒介能夠與⑶4+T淋巴細(xì)胞融合。然而，應(yīng)當(dāng)注意，將尋靶模塊摻入酵母媒介不是必需的，盡管這可能是有些情況中所期望的。 在酵母媒介胞外表達(dá)抗原情況中，這可以是本發(fā)明酵母媒介的另一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诒景l(fā)明的酵母媒介一般易于由樹突細(xì)胞(以及其它細(xì)胞，諸如巨噬細(xì)胞)攝取。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，基于酵母的免疫療法組合物包括至少一種抗原、其免疫原性域、或其表位?？捎糜诒景l(fā)明的抗原包括期望針對它引發(fā)免疫應(yīng)答的任何抗原 (下文更為詳細(xì)地描述)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，基于酵母的免疫療法組合物不表達(dá)或以其它方式含有或展示抗原，盡管在這種情況中，酵母媒介可任選表達(dá)一種或多種免疫刺激性分子。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，抗原由一種或多種不同免疫療法組合物來提供，如本文中描述的， 諸如基于病毒的免疫療法組合物。因?yàn)楸景l(fā)明中使用的免疫療法組合物均可給免疫系統(tǒng)提供一些獨(dú)特的“危險(xiǎn)信號”或共刺激性信號，因此只有一種組合物包含抗原可能就足以提供載體的貢獻(xiàn)了。依照本發(fā)明，術(shù)語“酵母媒介-抗原復(fù)合物”或“酵母-抗原復(fù)合物” 一般用于描述酵母媒介與抗原的任何聯(lián)合體，而且可以與“基于酵母的免疫療法組合物”互換使用，當(dāng)此類組合物如上文所述用于引發(fā)免疫應(yīng)答時(shí)。此類聯(lián)合體包括由酵母(重組酵母)進(jìn)行的抗原的表達(dá)、將抗原導(dǎo)入酵母、抗原物理附著至酵母、及酵母與抗原混合在一起(諸如在緩沖液或其它溶液或配制劑中)。這些類型的復(fù)合物在下文中有詳細(xì)描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，將用于制備所述酵母媒介或作為所述酵母媒介的酵母細(xì)胞 (完整酵母)用編碼蛋白質(zhì)(例如抗原或藥劑)的異源核酸分子轉(zhuǎn)染，使得該酵母細(xì)胞表達(dá)該蛋白質(zhì)。此類酵母在本文中也稱為重組酵母或重組酵母媒介。然后可以施用酵母細(xì)胞， 或者可以將酵母細(xì)胞殺死，或者可以將它衍生化，諸如通過形成酵母原生質(zhì)球、胞質(zhì)體、空細(xì)胞、或亞細(xì)胞顆粒。還可以將酵母原生質(zhì)球直接用重組核酸分子轉(zhuǎn)染(例如從完整酵母生成原生質(zhì)球，然后轉(zhuǎn)染)，用以生成表達(dá)抗原或其它蛋白質(zhì)的重組原生質(zhì)球。一方面，將用于制備所述酵母媒介的酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球用編碼抗原或其它蛋白質(zhì)的重組核酸分子轉(zhuǎn)染，使得該酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球重組表達(dá)該抗原或其它蛋白質(zhì)。在這方面，使用重組表達(dá)抗原或其它蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球來生成一種酵母媒介，其包含酵母胞質(zhì)體、酵母空細(xì)胞、或酵母膜顆?；蚪湍讣?xì)胞壁顆粒，或其級分。由本發(fā)明的酵母媒介生成的抗原和/或其它蛋白質(zhì)的數(shù)目是酵母媒介合理生成的抗原和/或蛋白質(zhì)的任何數(shù)目，典型范圍為至少一種至至少大約6種或更多，包括大約2 種至大約6種異源抗原和/或其它蛋白質(zhì)。本發(fā)明酵母媒介中的抗原或其它蛋白質(zhì)表達(dá)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。簡言之，在一個(gè)方面，以這樣一種方式將編碼至少一種期望抗原或其它蛋白質(zhì)的核酸分子插入表達(dá)載體，使得該核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作連接，從而在轉(zhuǎn)化入宿主酵母細(xì)胞時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)核酸分子的組成性的或受調(diào)節(jié)的表達(dá)。編碼一種或多種抗原和/或其它蛋白質(zhì)的核酸分子可以在一種或多種表達(dá)載體上，可操作連接至一種或多種表達(dá)控制序
24列。特別重要的表達(dá)控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄起始的，諸如啟動(dòng)子和上游激活序列。任何合適的酵母啟動(dòng)子可用于本發(fā)明，而且多種此類啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。用于在啤酒糖酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于編碼如下酵母蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子醇脫氫酶 I (ADHl)或II (ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、翻譯延長因子 EF-I α (TEF2)、甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH ；也稱為TDH3，即磷酸丙糖脫氫酶)、半乳糖激酶(GALl)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(GAL7)、UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶(GAL10)、細(xì)胞色素cl (CYCl)、kc7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PH05)，包括雜合啟動(dòng)子，諸如ADH2/GAPDH 和CYC1/GAL10啟動(dòng)子，而且包括ADH2/GAPDH啟動(dòng)子(其在細(xì)胞中的葡萄糖濃度低時(shí)(例如大約0. 至大約0. 2% )被誘導(dǎo))以及CUPl啟動(dòng)子和TEF2啟動(dòng)子。同樣的，知道許多上游激活序列(UAQ，也稱為增強(qiáng)子。用于在啤酒糖酵母中表達(dá)的上游激活序列包括但不限于編碼如下蛋白質(zhì)的基因的 UAS PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7 禾口 GAL10，以及由GAL4基因產(chǎn)物激活的其它UAS，在一個(gè)方面使用ADH2 UAS0因?yàn)锳DH2 UAS 受ADRl基因產(chǎn)物激活，所以可能優(yōu)選在異源基因可操作連接至ADH2 UAS時(shí)過表達(dá)ADRl基因。用于在啤酒糖酵母中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止序列包括α-因子、GAPDH、和CYCl基因的終止序列。用于在甲基營養(yǎng)酵母中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄控制序列包括編碼醇氧化酶和甲酸脫氫酶的基因的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。將核酸分子轉(zhuǎn)染入依照本發(fā)明的酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以通過將核酸分子施用入細(xì)胞的任何方法來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、超聲浴、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染、吸附、和原生質(zhì)體融合。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法，可以將所轉(zhuǎn)染的核酸分子整合入酵母染色體或保留在染色體外載體上。攜帶此類核酸分子的酵母載體的例子在本文中有詳細(xì)描述。如上所述，酵母胞質(zhì)體、酵母空細(xì)胞、和酵母膜顆粒或細(xì)胞壁制備物還可以如下重組生產(chǎn)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的技術(shù)，將完整的酵母微生物或酵母原生質(zhì)球用期望核酸分子轉(zhuǎn)染，在其中生成抗原，然后進(jìn)一步操作微生物或原生質(zhì)球，以生成含有期望抗原或其它蛋白質(zhì)的胞質(zhì)體、空細(xì)胞或亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分。在本發(fā)明的一個(gè)方面，對酵母媒介進(jìn)行操作，使得抗原通過所表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的投遞或易位而部分的或完全的在酵母媒介表面上表達(dá)或提供(胞外表達(dá))。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明這個(gè)方面的一種方法是使用間隔臂將一種或多種蛋白質(zhì)定位在酵母媒介的表面上。例如，可以使用間隔臂來創(chuàng)建感興趣抗原或其它蛋白質(zhì)與將該感興趣抗原或其它蛋白質(zhì)靶向酵母細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)的融合蛋白。例如，可用于其它蛋白質(zhì)靶向的一種此類蛋白質(zhì)是使得抗原或其它蛋白質(zhì)靶向酵母細(xì)胞壁，從而使得抗原或其它蛋白質(zhì)定位在酵母表面上的酵母蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞壁蛋白質(zhì)2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flol蛋白質(zhì))。可以使用酵母蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)作為間隔臂；然而，對于任何間隔臂蛋白質(zhì)，最希望免疫原性應(yīng)當(dāng)針對靶抗原而非間隔臂蛋白質(zhì)。因此，如果使用其它蛋白質(zhì)作為間隔臂，那么所使用的間隔臂蛋白質(zhì)不應(yīng)生成這樣大的針對間隔臂蛋白質(zhì)自身的免疫應(yīng)答，其使得針對靶抗原的免疫應(yīng)答被淹沒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)致力于相對于針對靶抗原的免疫應(yīng)答為小的針對間隔臂蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。如果需要，間隔臂可構(gòu)建成具有切割位點(diǎn)(例如蛋白酶切割位點(diǎn))，容許容易地切下抗原或自酵母加工掉抗原?？梢允褂脺y定免疫應(yīng)答量級的任何已知方法(例如抗體生成、溶解測定法等)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員早就知道的。
定位有待在酵母表面上暴露的靶抗原或其它蛋白質(zhì)的另一種方法是利用信號序列諸如糖基磷脂酰肌醇(GPI)將靶物錨定至酵母細(xì)胞壁?；蛘?，定位可以通過附加使感興趣抗原或其它蛋白質(zhì)經(jīng)易位入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)而靶向入分泌途徑的信號序列，使得抗原與結(jié)合至細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)(例如cwp)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。一方面，間隔臂蛋白質(zhì)是酵母蛋白質(zhì)。酵母蛋白質(zhì)可以由介于大約2個(gè)和大約800 個(gè)氨基酸之間的酵母蛋白質(zhì)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母蛋白質(zhì)是大約10-700個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酵母蛋白質(zhì)是大約40-600個(gè)氨基酸。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括至少250個(gè)氨基酸、至少300個(gè)氨基酸、至少350個(gè)氨基酸、至少400個(gè)氨基酸、至少450 個(gè)氨基酸、至少500個(gè)氨基酸、至少550個(gè)氨基酸、至少600個(gè)氨基酸、或至少650個(gè)氨基酸的酵母蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母蛋白質(zhì)的長度是至少450個(gè)氨基酸。使用酵母蛋白質(zhì)能穩(wěn)定融合蛋白在酵母媒介中的表達(dá)，防止所表達(dá)融合蛋白的翻譯后修飾，和/或?qū)⑷诤系鞍装邢蚪湍钢械奶囟ǜ羰?例如表達(dá)在酵母細(xì)胞表面上)。為了投遞入酵母分泌途徑，待使用的例示性酵母蛋白質(zhì)包括但不限于Aga(包括但不限于Agal 和/或Aga2) ；SUC2(酵母轉(zhuǎn)化酶)；α因子信號前導(dǎo)序列；CPY ;Cwp2p，用于其在細(xì)胞壁中的定位和保持；BUD基因，用于子細(xì)胞形成的初始階段中在酵母細(xì)胞芽處的定位；Flolp ； Pir2p ；和 Pir4p?？梢允褂闷渌蛄衼磉M(jìn)行蛋白質(zhì)對酵母媒介其它部分的靶向、保持、和/或穩(wěn)定， 例如在胞質(zhì)溶膠或線粒體中?？捎糜谌魏紊鲜鰧?shí)施方案的合適酵母蛋白質(zhì)的例子包括但不限于SEC7 ；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1、磷酸甘油激酶PGK和磷酸丙糖異構(gòu)酶TPI基因產(chǎn)物，因其在葡萄糖中的可抑制表達(dá)和胞質(zhì)溶膠定位；熱休克蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1， 其表達(dá)是誘導(dǎo)性的而且其蛋白質(zhì)在細(xì)胞暴露于熱處理時(shí)是更加熱穩(wěn)定的；線粒體蛋白質(zhì) CYCl，用于輸入線粒體；ACTl。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用控制酵母糖基化的量來控制酵母對抗原的表達(dá)，特別是在表面上的。酵母糖基化的量可影響在表面上表達(dá)的抗原的免疫原性和抗原性，因?yàn)樘悄K趨向于是大體積的。因此，在依照本發(fā)明調(diào)控酵母時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮酵母表面上糖模塊的存在及其對靶抗原周圍三維空間的影響?？墒褂萌魏畏椒▉斫档徒湍柑腔牧?或提高它， 如果需要的話)。例如，可以使用因具有低糖基化而選擇的酵母突變株(例如mrml、0Chl和 mnn9突變體)，或者可以通過突變靶抗原上的糖基化受體序列來消除?；蛘撸梢允褂镁哂泻喕腔瘶邮降慕湍?，例如畢赤酵母屬。也可以使用降低或改變糖基化的方法來處理酵母。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為在酵母媒介中重組表達(dá)抗原或其它蛋白質(zhì)的替代，給酵母媒介胞內(nèi)加載蛋白質(zhì)或肽，或者碳水化合物或其它充當(dāng)抗原和/或可用作依照本發(fā)明的免疫調(diào)控劑或生物應(yīng)答修飾劑的分子。隨后，現(xiàn)在胞內(nèi)包含抗原和/或其它蛋白質(zhì)的酵母媒介可以施用于患者或加載入載體諸如樹突細(xì)胞。肽和蛋白質(zhì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的技術(shù)直接插入本發(fā)明的酵母媒介，諸如通過擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)體融合、電穿孔、吞噬作用、凍融循環(huán)和超聲浴?？梢灾苯蛹虞d肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、或其它分子的酵母媒介包括完整酵母，以及原生質(zhì)球、空細(xì)胞或胞質(zhì)體，它們可以在生成后加載抗原和其它藥劑?；蛘撸梢越o完整酵母加載抗原和/或藥劑，然后由其制備原生質(zhì)球、空細(xì)胞、胞質(zhì)體、或亞細(xì)胞顆粒。在此實(shí)施方案中可以將任何數(shù)目的抗原和/或其它藥劑加載入酵母媒介，從至少1、2、3、4個(gè)/種或任何整數(shù)直至數(shù)百或數(shù)千抗原和/或其它藥劑，諸如例如通過加載微生物或其部分會(huì)提供的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原和/或其它藥劑物理附著至酵母媒介?？乖?或其它藥劑對酵母媒介的物理附著可以通過本領(lǐng)域的任何合適方法來實(shí)現(xiàn)，包括共價(jià)的和非共價(jià)的結(jié)合方法，包括但不限于化學(xué)交聯(lián)抗原和/或其它藥劑至酵母媒介的外表面或生物學(xué)連接抗原和/或其它藥劑至酵母媒介的外表面，諸如通過使用抗體或其它結(jié)合配偶?；瘜W(xué)交聯(lián)可以通過例如以下方法來實(shí)現(xiàn)，包括戊二醛連接、光親和標(biāo)記、碳二亞胺處理、 能夠連接二硫鍵的化學(xué)藥品的處理、和本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)交聯(lián)化學(xué)藥品的處理?；蛘?，可以使化學(xué)藥品接觸酵母媒介，改變酵母膜的脂雙層或細(xì)胞壁的組成的電荷，使得酵母的外表面更有可能融合或結(jié)合具有特定電荷特征的抗原和/或其它藥劑。靶向劑(諸如抗體、結(jié)合肽、 可溶性受體和其它配體)也可摻入抗原作為融合蛋白或以其它方式與抗原聯(lián)合用于將抗原結(jié)合至酵母媒介。在又一個(gè)實(shí)施方案中，酵母媒介和抗原或其它蛋白質(zhì)通過更被動(dòng)的、非特異性的或非共價(jià)的結(jié)合機(jī)制彼此聯(lián)合，諸如通過在緩沖液或其它合適配制劑(例如混合物)中一起溫和混合酵母媒介和抗原或其它蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將酵母媒介和抗原或其它蛋白質(zhì)二者都胞內(nèi)加載入載體，諸如樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，以形成本發(fā)明的治療性組合物或疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將完整酵母(有或無異源抗原或其它蛋白質(zhì)的表達(dá))磨碎或以一定方式加工以生成酵母細(xì)胞壁制備物、酵母膜顆粒或酵母片段(即不完整的)，而在有些實(shí)施方案中，酵母片段可以與包括抗原(例如DNA疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗、殺死的或滅活的病原體)的其它組合物一起提供或施用來增強(qiáng)。例如，酶學(xué)處理、化學(xué)處理或物理力(例如機(jī)械剪切或超聲處理)可以用來將酵母破碎成多個(gè)用作佐劑的部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中有用的酵母媒介包括已經(jīng)殺死或滅活的酵母媒介。殺死或滅活酵母可通過本領(lǐng)域已知的多種合適方法任一來實(shí)現(xiàn)。例如，酵母熱滅活是滅活酵母的標(biāo)準(zhǔn)方式，而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測靶抗原的結(jié)構(gòu)變化，如果需要的話?；蛘?，可以采用滅活酵母的其它方法，諸如化學(xué)的、電學(xué)的、放射性的或UV方法。參見例如標(biāo)準(zhǔn)酵母培養(yǎng)教科書中披露的方法學(xué)，諸如Methods of Enzymology，Vol. 194，Cold Spring Harbor Publishing(1990)。任何所用滅活策略應(yīng)當(dāng)考慮靶抗原的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)及保持此類結(jié)構(gòu)以優(yōu)化其免疫原性。生產(chǎn)重組酵母媒介和酵母媒介表達(dá)抗原和/或其它蛋白質(zhì)(例如本文所述藥劑) 的有效條件包括能培養(yǎng)酵母菌株的有效培養(yǎng)基。有效培養(yǎng)基通常是含有可同化的碳水化合物源、氮源和磷酸鹽源，以及適宜的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其它養(yǎng)分，諸如如維生素和生長因子的水性培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以包含復(fù)合營養(yǎng)素，或者可以是確定成分的極限培養(yǎng)基。本發(fā)明的酵母菌株可以在多種容器中培養(yǎng)，包括但不限于生物反應(yīng)器、錐形燒瓶、試管、微量滴定皿、 和皮氏培養(yǎng)皿。培養(yǎng)在適合酵母菌株的溫度、PH和氧含量進(jìn)行。此類培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的專業(yè)知識內(nèi)(參見例如Guthrie et al. (eds.), 1991,Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego)。在本發(fā)明的一些方面，在中性pH條件下培養(yǎng)酵母，而且特別是在pH水平維持在至少5. 5的培養(yǎng)基中，即培養(yǎng)液的pH不容許降至pH 5.5以下。在其它方面，酵母在維持在大約5. 5的pH水平培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，培養(yǎng)過程不僅包括酵母培養(yǎng)的開始，還包括培養(yǎng)物的維持。因?yàn)橐阎湍概囵B(yǎng)會(huì)隨時(shí)間變酸(即降低PH)，所以在培養(yǎng)過程中必須小心監(jiān)測PH水平。此工藝詳細(xì)記載于2008年8月14日公布的WO 2008/097863?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的許多技術(shù)將酵母媒介配制入本發(fā)明的基于酵母的免疫療法組合物或產(chǎn)品，包括直接施用于受試者的制備物，或者首先加載入載體。例如， 可以通過凍干將酵母媒介干燥。包含酵母媒介的配制劑還可以如下制備，即在蛋糕或藥片中包裝酵母，諸如對烘烤或釀造操作中所使用酵母的所進(jìn)行的那樣。另外，可以將酵母媒介與藥學(xué)可接受賦形劑混合，諸如宿主或宿主細(xì)胞耐受的等張緩沖液。此類賦形劑的例子包括水、鹽水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液、Hank氏溶液、和其它含水生理平衡鹽溶液。也可使用非水媒介，諸如不揮發(fā)性油、芝麻油、油酸乙酯、或甘油三酯。其它有用配制劑包括含有粘性增強(qiáng)劑諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、甘油或右旋糖苷的懸浮液。賦形劑也可含有微量的添加劑，諸如增強(qiáng)等張性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖液的例子包括磷酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液和Tris緩沖液，而防腐劑的例子包括硫柳汞、間或鄰甲酚、福爾馬林和苯甲醇。標(biāo)準(zhǔn)配制劑可以是注射液，或者是固體，可以在合適的液體中取用，成為懸浮液或溶液進(jìn)行注射。如此，在非液體配制劑中，賦形劑可包含例如右旋糖、人血清清蛋白、和/或防腐劑，可以在施用前對其添加無菌水或鹽水?？捎糜诒景l(fā)明免疫療法組合物的抗原依照本發(fā)明，術(shù)語“抗原”在本文中的一般使用指蛋白質(zhì)(肽、部分蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì))的任何部分，其中所述蛋白質(zhì)是天然存在的或合成衍生的；細(xì)胞組合物(完整細(xì)胞、細(xì)胞溶解物或破碎的細(xì)胞)；有機(jī)體(完整有機(jī)體、溶解物或破碎的細(xì)胞)；或碳水化合物、或其它分子、或其一部分。在一些實(shí)施方案中，抗原可引發(fā)針對免疫系統(tǒng)成分(例如T 細(xì)胞、抗體)遭遇的相同或相似抗原的抗原特異性免疫應(yīng)答(例如體液的和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。術(shù)語“癌癥抗原”在本文中可以與術(shù)語“腫瘤特異性抗原”、“腫瘤相關(guān)抗原”、 “癌癥相關(guān)靶”或“腫瘤相關(guān)靶”互換使用?？乖梢孕≈羻我槐砦?，或較大，而且可以包括多個(gè)表位。因此，抗原的大小可以小至大約5-12個(gè)氨基酸(例如肽)，大至部分蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì)，包括多聚體和融合蛋白、嵌合蛋白、或激動(dòng)性蛋白質(zhì)或肽。另外，抗原可以包括碳水化合物在提到免疫應(yīng)答的刺激時(shí)，術(shù)語“免疫原”是術(shù)語“抗原”的一個(gè)子集，因此在有些情況中可以與術(shù)語“抗原”互換使用。免疫原，在用于本文時(shí)，描述引發(fā)體液的和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(即免疫原性的)，使得免疫原對個(gè)體的施用引起針對個(gè)體的免疫系統(tǒng)遭遇的相同或相似抗原的抗原特異性免疫應(yīng)答的抗原。給定抗原的“免疫原性域”可以是抗原中包含至少一種在施用于動(dòng)物時(shí)充當(dāng)免疫原的表位的任何部分、片段或表位(例如肽片段或亞單位或抗體表位或其它構(gòu)象表位)。例如，單一蛋白質(zhì)可以包含多種不同免疫原性域。免疫原性域并不必然是蛋白質(zhì)內(nèi)的線性序列，諸如在體液免疫應(yīng)答的情況中?！氨砦弧痹诒疚闹卸x為給定抗原內(nèi)足以引發(fā)免疫應(yīng)答的單一免疫原性位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，T細(xì)胞表位在大小和組成上與B細(xì)胞表位不同，而且經(jīng)I型MHC途徑呈遞的表位與經(jīng)II型MHC途徑呈遞的表位不同。表位可以是線性序列或構(gòu)象表位(保守結(jié)合區(qū))。
在本文所述任何免疫療法組合物中有用的抗原可以包括希望針對它引發(fā)免疫應(yīng)答的任何抗原或其免疫原性域其，而且特別包括針對此類抗原的治療性免疫應(yīng)答會(huì)對個(gè)體有益的任何抗原或其免疫原性域。抗原可以包括但不限于癌癥抗原，病毒抗原，過表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面分子，細(xì)菌抗原，真菌抗原，原生動(dòng)物抗原，蠕蟲抗原，外寄生物抗原，攜帶一個(gè)或多個(gè)突變氨基酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞分子，正常情況下由哺乳動(dòng)物細(xì)胞在出生前或新生時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)，其表達(dá)由流行病學(xué)因子(例如病毒)的插入誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，其表達(dá)由基因易位誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，和其表達(dá)由調(diào)節(jié)序列的突變誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在本發(fā)明的一種或多種免疫療法組合物中有用的抗原包括任何癌癥或腫瘤相關(guān)抗原。在一個(gè)方面，抗原包括與瘤形成前或增生狀態(tài)有關(guān)的抗原?？乖部梢耘c癌癥有關(guān)或引起癌癥。此類抗原可以是腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原(TAA) 或組織特異性抗原、其表位，或其表位激動(dòng)劑。癌癥抗原包括但不限于來自任何腫瘤或癌癥的抗原，包括但不限于黑素瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、頭頸癌、甲狀腺癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、腦癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤 (hemangiosarcomas)、肥大細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃腸癌(包括結(jié)腸直腸癌)、腎細(xì)胞癌、造血瘤形成及其轉(zhuǎn)移癌。合適的癌癥抗原包括但不限于至癌胚抗原(CEA)及其表位諸如CAP-1、 CAP-1-6D(GenBank 登錄號 M29540 或 Zaremba et al. ,1997, Cancer Research 57: 4570-4577)、MART-I (Kawakami et al, J. Exp. Med. 180 :347-352,1994) ,MAGE-I (美國專利 No. 5，750，395)、MAGE_3、GAGE (美國專利 No. 5，648，226)、GP-100 (Kawakami et al. , Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 91 :6458-6462,1992)、MUC-I (例如 Jerome et al.，J. Immunol.， 151 :1654-1662(1993)), MUC-2,突變的 Ras 癌蛋白(參見例如美國專利 No. 7, 465, 454 和 7，563，447)、正常的和突變的 p53 癌蛋白(Hollstein et al, Nucleic Acids Res. 22 3551-3555，1994)、PSMA(前列腺特異性膜抗原；Israeli et al. ,Cancer Res. 53 :227-230, 1993)、酪氨酸酶(Kwon et al, PNAS 84 :7473-7477,1987), TRP-I (gp75) (Cohen et al, Nucleic Acid Res. 18 :2807-2808,1990 ；美國專利No. 5，840，839)、NY_ES0_1 (Chen et al, PNAS 94 :1914-1918,1997)、TRP-2 (Jackson et al.，EMB0J，11 :527-535,1992)、TAG72、 KSA、CA-125、PSA(前列腺特異性抗原；Xue et al.，The Prostate，30 :73-78 (1997))、 HER-2/neu/c-erb/B2 (美國專利 No. 5，550, 214)、EGFR (表皮生長因子受體；Harr is et al.，Breast Cancer Res. Treat, 29 :1-2 (1994))、hTERT、p73、B-RAF (B-Raf 原癌基因絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶；Sithanandam et al.，(1990)，Oncogene 5(12) :1775-80)、腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)、Myc、馮·希佩爾-林道蛋白蛋白(VHL)、Rb-U Rb_2、雄激素受體(AR)、 Smad4、MDR1(也稱作 P-糖蛋白)、Flt_3、BRCA-1 (乳腺癌 1 ；美國專利 No. 5，747，282)、 BRCA-2(乳腺癌 2;美國專利 No. 5，747，282))、Bcr-Abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、 Brachyury(GenBank 登錄號 ΝΡ_003172· 1 或 ΝΜ_003181· 2 ;Edwards et al.，1996， Genome Res. 6 :226-233)、HERV-H(人內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒H)、HERV-K(人內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒K)、 TWIST (GenBank 登錄號 NM_000474 和 NP_000465)、間皮素(Kojima et al.，1995，J.Biol· Chem. 270(37) :21984-90 ；Chang and Pastan, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 93 (1) 136-40)、NGEP (在前列腺中表達(dá)的新基因；Bera et al.，2004，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.Α.101 (9) :3059-3064 ；Cereda et al.,2010, Cancer Immunol. Immunother. 59(1)
2963-71 ；GenBank登錄號AAI~40139或AAI~40140)、組織特異性抗原和此類抗原的修飾、此類抗原的間接變體、和/或此類抗原的表位激動(dòng)劑。本領(lǐng)域知道其它癌癥抗原。也可以通過本領(lǐng)域已知方法，諸如美國專利No. 4，514，506中記載的那些來鑒定、分離和克隆其它癌癥抗原。癌癥抗原也可包括一種或多種生長因子及其剪接變體。在本發(fā)明的一個(gè)方面，癌癥抗原是癌胚抗原(CEA)，包含其表位或由其表位組成的多肽(諸如 CAP-I，CAP-1-6D (GenBank 登錄號 M29540 或 Zaremba et al.，1997，Cancer Research 57 :4570-4577))、經(jīng)修飾CEA、CEA的剪接變體、此類CEA蛋白的表位激動(dòng)劑，和/ 或包含至少一種CEA免疫原性域或其激動(dòng)性表位的融合蛋白。在一個(gè)方面，CEA是經(jīng)修飾 CEA，與具有2007年3月1日公布的美國專利公開號US 2007_0048860中由核酸序列SEQ ID N0:45編碼的SEQ ID NO :46所示氨基酸序列的經(jīng)修飾CEA對應(yīng)的。在一個(gè)方面，抗原是具有本文中由SEQ ID NO :1所示核酸序列編碼的SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的經(jīng)修飾 CEA。在本發(fā)明的一個(gè)方面，抗原是突變的Ras癌蛋白。例示性Ras癌蛋白已經(jīng)記載于例如美國專利No. 7，465，454和7，563，447。Ras是已知特定位置處存在幾處與一種或多種類型的癌癥的發(fā)生有關(guān)的突變的癌蛋白的一個(gè)例子。因此，可構(gòu)建由含有已知在某些癌癥中突變的特定殘基的肽組成的融合蛋白，其中每個(gè)域含有該位點(diǎn)處的不同突變以覆蓋該位點(diǎn)處的數(shù)種或所有已知突變。在本發(fā)明中有用的融合蛋白可具有一個(gè)、兩個(gè)、或多個(gè)域，其中每個(gè)域由來自特定蛋白質(zhì)(相同或不同的蛋白質(zhì))的肽組成，每個(gè)肽由包括表位或突變氨基酸(諸如在蛋白質(zhì)中找到的突變氨基酸，其中突變與特定疾病例如癌癥有關(guān))及任一側(cè)側(cè)翼的至少4個(gè)氨基酸殘基組成。例如，關(guān)于Ras，可提供一種、兩種、三種、或更多種免疫原性域，其包含包括位置12及任一側(cè)的至少4個(gè)氨基酸，其中每種域具有對非突變Ras蛋白中正常存在的甘氨酸的不同替代(例如用纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、 或丙氨酸替代甘氨酸)。再例如，可以提供一種、兩種、三種、或更多種免疫原性域，其包含包括位置13及任一側(cè)的至少4個(gè)氨基酸，其中每種域具有對非突變Ras蛋白中正常存在的甘氨酸的不同替代(例如用天冬氨酸替代甘氨酸)。又例如，可提供一種、兩種、三種、或更多種免疫原性域，其包含包括位置61及任一側(cè)的至少4個(gè)氨基酸，其中每種域具有對非突變Ras蛋白中正常存在的谷氨酰胺的不同替代(例如用亮氨酸、精氨酸、或組氨酸替代谷氨酰胺)。例如，癌癥抗原包含野生型Ras蛋白的至少5-9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段，其含有相對于野生型Ras蛋白的氨基酸位置12、13、59、61或76，其中位置12、13、59、61或76處的氨基酸殘基相對于野生型Ras蛋白是突變的。在一個(gè)方面，融合蛋白構(gòu)建體由以符合讀碼框的方式與另一種突變的腫瘤抗原(例如相對于野生型Ras蛋白序列包含至少一處突變的Ras蛋白)融合的至少一種肽組成，其中該肽選自下組(a)至少包含野生型Ras(人或鼠K-Ras、N-Ras或H-Ras)位置8_16的肽，其中相對于野生型Ras位置12處的氨基酸殘基與野生型Ras相比是突變的；(b)至少包含野生型Ras位置9_17的肽，其中相對于野生型Ras位置13處的氨基酸殘基相對于野生型Ras是突變的；(c)至少包含野生型Ras位置 55-63的肽，其中相對于SEQ ID NO :3位置59處的氨基酸殘基與野生型Ras相比是突變的； (d)至少包含野生型Ras位置57-65的肽，其中相對于野生型Ras位置61處的氨基酸殘基與野生型Ras相比是突變的；或(e)至少包含野生型Ras位置72-80的肽，其中相對于野生型Ras位置76處的氨基酸殘基與野生型Ras相比是突變的。注意到這些位置在人和小鼠K-Ras, N-Ras和H-Ras間是相同的，因?yàn)槿撕托∈笮蛄性诘鞍踪|(zhì)的這個(gè)區(qū)域是相同的且因?yàn)镵-Ras、H-Ras和N-Ras在這個(gè)區(qū)域是相同的。在一個(gè)方面，適于用作本發(fā)明抗原的Ras融合蛋白選自SEQ ID NO :4(由本文中SEQ ID NO :3所示核酸序列編碼)，SEQ ID N0:6(由本文中SEQ ID NO 5所示核酸序列編碼)，SEQ ID NO :8(由本文中SEQ ID NO 7所示核酸序列編碼)，和/或SEQ ID NO 10(由本文中SEQ ID NO 9所示核酸序列編碼)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，抗原是人Brachyury。人Brachyury的氨基酸序列在本文中呈現(xiàn)于SEQ ID NO :15，其由SEQ ID NO 14所示核酸序列編碼。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在本發(fā)明的一種或多種免疫療法組合物中有用的抗原包括與病原體或由病原體引起的與病原體有關(guān)的疾病或狀況有關(guān)的任何抗原。此類抗原包括但不限于病毒抗原、真菌抗原、細(xì)菌抗原、蠕蟲抗原、寄生物抗原、外寄生物抗原、原生動(dòng)物抗原、或來自任何其它感染因子的抗原。在一個(gè)方面，抗原來自病毒，包括但不限于腺病毒，沙粒病毒，布尼亞病毒，冠狀病毒，柯薩奇病毒，巨細(xì)胞病毒，埃巴二氏病毒，黃病毒，肝DNA病毒，肝炎病毒，皰疹病毒，流感病毒，慢病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，粘病毒，正粘病毒，乳頭瘤病毒，乳多泡病毒，副流感病毒，副粘病毒，細(xì)小病毒，微小RNA病毒，痘病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，呼腸病毒，桿狀病毒，風(fēng)疹病毒，披膜病毒，和水痘病毒。其它病毒包括T-淋巴營養(yǎng)性病毒，諸如人 T-細(xì)胞淋巴營養(yǎng)性病毒(HTLV，諸如HTLV-I和HTLV-II)，牛白血病病毒(BLVS)和貓白血病病毒(FLV)。慢病毒包括但不限于人(HIV，包括HIV-I或HIV-2)，猿(SIV),M (FIV)和犬 (CIV)免疫缺陷病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒抗原包括那些來自非致癌病毒的。在另一個(gè)方面)，(抗原來自選自下述的屬的感染因子曲霉(Aspergillus)， 博德特氏菌(Bordatella，Bordetella)，布魯絲蟲(Brugia)，假絲酵母(Candida)，衣原體(Chlamydia)，球蟲(Coccidia)，隱球菌(Cryptococcus)，惡絲蟲(Dirof i laria)， 埃希氏菌(Escherichia)，弗朗西絲氏菌(Francisella)，淋球菌(Gonococcus)，組織胞漿菌(Histoplasma),利什曼原蟲(Leishmania)，分枝桿菌(Mycobacterium)，支原體(Mycoplasma)，草履蟲(Paramecium)，百日咳(Pertussis),皰原蟲(Plasmodium), 月市 & 求 Iif (Pneumococcus)，月市■ & (Pneumocystis)， 3 i^C 1 # (Rickettsia)， ^ 門氏菌(Salmonella)，志賀氏菌(Shigella),葡萄球菌(Staphylococcus),鏈球菌 (Streptococcus),弓形體(Toxoplasma),霍舌L 弧菌(Vibriocholerae),禾口耳口爾森氏菌 (Yersinia)。在一個(gè)方面，感染因子選自鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)或間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)。在一個(gè)方面，抗原來自來自選自下述的科的細(xì)菌腸桿菌科 (Enterobacteriaceae),微球菌禾斗(Micrococcaceae),弧菌禾斗(Vibrionaceae),巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae),支原體科(Mycoplasmataceae)，禾口立克次氏體科 (Rickettsiaceae)。在一個(gè)方面，細(xì)菌是選自下述的屬的假單胞菌(I^seudomonas)， 博德特氏菌(Bordetella)，分枝桿菌(Mycobacterium)，霍亂弧菌(Vibriocholerae)， 芽孢桿菌(Bacillus),沙門氏菌(Salmonella),弗朗西絲氏菌(Francisella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，鏈球菌(Streptococcus)，埃希氏菌(Escherichia)，腸球菌 (Enterococcus),巴斯德氏菌(Pasteurella)，和耶爾森氏菌(Yersinia)。在一個(gè)方面，細(xì)菌來自選自下述的種銅綠假單胞菌(I^seudomonas aeruginosa)，鼻疽假單胞菌(Pseudomonas mallei),類鼻疽假單胞菌(Pseudomonas pseudomallei),百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis),結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis),麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae), 土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis),霍舌匕弧菌(Vibrio cholerae),炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis),腸沙門氏菌(Salmonella enteric),鼠疫耳口爾森氏菌(Yersinia pestis),大腸埃希氏菌/大腸桿菌(Escherichia coli)和支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella bronchis印tica)。在一個(gè)方面，抗原來自真菌，此類真菌包括但不限于來自下述的真菌糖酵母 (Saccharomyces spp.)，曲霉(Aspergillus spp.)，隱球菌(Cryptococcus spp·)，球抱子菌(Coccidioides spp.)，脈孢菌(Neurospora spp.)，組織胞菜菌(Histoplasma spp.)，或芽生菌(Blastomyces spp.)。在一個(gè)方面，真菌來自選自下述的種煙曲霉(Aspergillus fumigatus)， H 曲 β (A. flavus)， ■曲 β (A. niger)， ± 曲 β (A. terreus)，豐勾 H 曲 β (A. nidulans),粗球抱子菌(Coccidioides immitis), Coccidioides posadasii 或新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)。引起侵入性疾病的最常見曲霉屬物種包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉和構(gòu)巢曲霉，而且可以在例如具有免疫抑制或T細(xì)胞或吞噬細(xì)胞損傷的患者中找到。已經(jīng)將煙曲霉與哮喘、曲霉腫和侵入性曲霉病聯(lián)系起來。球孢子菌病(也稱作圣華金谷熱)是由粗球孢子菌引起的真菌病，而且可導(dǎo)致急性呼吸道感染和慢性肺部狀況或擴(kuò)散至腦膜、骨、和關(guān)節(jié)。本發(fā)明的方法還靶向隱球菌病相關(guān)狀況，例如在非免疫抑制受試者或免疫抑制受試者，諸如感染有HIV的受試者中。在一些實(shí)施方案中，抗原是融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)方面，融合蛋白可包括兩種或更多種抗原。在一個(gè)方面，融合蛋白可包括一種或多種抗原的兩種或更多種免疫原性域和/或兩種或更多種表位。涵蓋抗原、其免疫原性域、和/或其表位的任何組合以用于本發(fā)明的組合物。含有此類抗原、其免疫原性域、和/或其表位的免疫治療性組合物可以在廣泛的患者中提供抗原特異性免疫接種。例如，在本發(fā)明中有用的融合蛋白可具有多個(gè)域(兩個(gè)或更多個(gè)域)，其中每個(gè)域由來自特定蛋白質(zhì)的肽或多肽組成，該肽或多肽由包括在蛋白質(zhì)中找到的突變氨基酸及任一側(cè)側(cè)翼的至少4個(gè)氨基酸殘基組成，其中突變與特定疾病或狀況有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用作在本發(fā)明中有用的基于酵母的免疫治療性組合物的成分的融合蛋白是使用對于在酵母中表達(dá)異源抗原特別有用的構(gòu)建體生成的。典型地，將期望的抗原性蛋白質(zhì)或肽在其氨基末端融合至(a)穩(wěn)定融合蛋白在酵母媒介中的表達(dá)或阻止對所表達(dá)的融合蛋白的翻譯后修飾的特定合成肽(此類肽有詳細(xì)記載，例如2004年8 月12日公布的美國專利公開號2004-0156858A1，通過述及完整收入本文)；(b)內(nèi)源酵母蛋白質(zhì)的至少一部分，其中任一融合配偶提供顯著增強(qiáng)的在酵母中表達(dá)蛋白質(zhì)的能力和/ 或阻止酵母細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(此類蛋白質(zhì)也有詳細(xì)記載，例如美國專利公開號 2004-0156858A1，見上文)；和/或(c)引起融合蛋白在酵母表面上表達(dá)的酵母蛋白質(zhì)的至少一部分(例如Aga蛋白，詳細(xì)記載于W02008/019366)。另外，本發(fā)明包括融合至編碼抗原的構(gòu)建體C端的肽的使用，特別是用于選擇和鑒定蛋白質(zhì)。此類肽包括但不限于任何合成或天然肽，諸如肽標(biāo)簽(例如6X His)或任何其它短表位標(biāo)簽。附著至依照本發(fā)明的抗原 C端的肽可以在有或沒有添加上文所討論的N端肽的情況中使用。依照本發(fā)明，在一個(gè)實(shí)施方案中，該兩種或更多種不同免疫療法組合物優(yōu)選靶向
32相同抗原。在這個(gè)實(shí)施方案中，相同抗原或其免疫原性域通常由每一種免疫療法組合物載體表達(dá)，盡管可以將抗原和/或其免疫原性域與組合物之一或二者混合，和/或在基于酵母的免疫療法組合物的情況中，可以將抗原附著至酵母媒介和/或在酵母媒介內(nèi)部攜帶抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種組合物都可靶向相同抗原，盡管每一種組合物可靶向相同抗原內(nèi)的不同表位或免疫原性域。在一個(gè)實(shí)施方案中，每一種免疫療法組合物靶向不同抗原和 /或其免疫原性域和/或表位。例如，可能有利的是，使用一種組合物靶向一種抗原，諸如 Ras，并使用另一種免疫療法組合物靶向另一種也在相同癌癥或相同癌癥的子集中表達(dá)的癌癥抗原，諸如CEA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種類型的免疫療法組合物的組合，其中有相同類型內(nèi)的至少兩種不同抗原組合物(例如表達(dá)突變的Ras或包含突變的Ras的多個(gè)免疫原性域的融合蛋白的基于酵母的免疫療法組合物和表達(dá)CEA或本文所述經(jīng)修飾CEA的基于酵母的免疫療法組合物的組合)。這種組合與另一種類型的表達(dá)相同或不同抗原的免疫療法組合物(例如基于病毒的組合物)并行施用。在此類實(shí)施方案一個(gè)方面，可以混合各種組合，或者在另一個(gè)方面，不需要物理混合各種組合，而是可以并行施用，諸如施用于相同部位或不同部位，或在相同施用期內(nèi)施用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或更多種不同免疫療法組合物之一靶向一種或多種抗原，而另一種免疫療法組合物作為佐劑提供，不需要靶向任何抗原(即該組合物利用其非抗原特異性免疫療法好處)，或不需要與另一組合物靶向相同癌癥抗原。更特別地，因?yàn)槊恳环N本文所述免疫療法載體已顯示出促成組合物功效的載體特異性效果，所以在一些實(shí)施方案中，可以只有一種載體與抗體相關(guān)或表達(dá)抗原，而另一種載體并行使用以提供非抗原特異性免疫療法效果。本發(fā)明組合物的使用方法在本發(fā)明的方法中，首先將兩種或更多種本文所述免疫療法組合物并行施用于個(gè)體。如本文中關(guān)于組合物施用使用的，術(shù)語“并行”表示施用每一種組合物，特別是此類組合物的第一劑，尤其是在基本上相同時(shí)間或在相同劑量給藥期內(nèi)，或在發(fā)生免疫療法組合物引發(fā)免疫系統(tǒng)的初始效果期間的時(shí)期內(nèi)(例如在1-2天和優(yōu)選不到1-2天內(nèi))。為了清除起見，并行施用不要求在完全相同時(shí)刻施用所有組合物，而是所有組合物的施用應(yīng)當(dāng)發(fā)生在患者的一次安排好的劑量給藥內(nèi)，以用每一種組合物并行引發(fā)免疫系統(tǒng)(例如可以首先施用一種組合物，接著立即或接近施用第二組合物，等等)。在一些情況中，諸如當(dāng)將組合物施用于相同部位時(shí)，組合物可以混合提供，盡管甚至在施用于相同部位時(shí)，可能優(yōu)選在相同劑量給藥期期間序貫施用每一種組合物。在一個(gè)方面，在相同1-2天內(nèi)，和在一個(gè)方面，在同一天，和在一個(gè)方面，在相同12小時(shí)時(shí)期內(nèi)，和在一個(gè)方面，在相同8小時(shí)時(shí)期內(nèi)，和在一個(gè)方面，在相同4小時(shí)時(shí)期內(nèi)，和在一個(gè)方面，在相同1、2或3小時(shí)時(shí)期內(nèi)，和在一個(gè)方面， 在相同1、2、3、4、6、7、8、9、或10分鐘內(nèi)施用組合物。在一些情況中，第一或第二免疫療法組合物任一的施用比另一種更加頻繁。例如， 在一個(gè)方面，當(dāng)?shù)谝幻庖忒煼ńM合物是基于病毒的免疫療法組合物且第二免疫療法組合物是基于酵母的免疫療法組合物時(shí)，第二免疫療法組合物的施用可以比第一免疫療法組合物更加頻繁。例如，在一個(gè)方面，在第一和第二免疫療法組合物的并行施用之間，第二免疫療法組合物可以多施用一次、兩次、三次或更多次。例如，因?yàn)槊庖呓臃N基于病毒的免疫療法組合物導(dǎo)致延長的抗原呈遞，所以以較短的頻率施用這種組合物可能不是必需的或有益的，而基于酵母的免疫療法組合物呈遞抗原的離散塊，所以它們可以更加頻繁地施用，沒有抑制免疫應(yīng)答的擔(dān)心。例如，在一個(gè)方面，每、2、3或4或更多周施用基于病毒的免疫療法組合物，而以1周間隔施用基于酵母的免疫療法組合物，其可以隨著總治療期延長而延長至更長的間隔0、3或4周或更久)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，并行施用兩種或更多種免疫療法組合物，但是施用于患者中的不同身體部位。例如，一種組合物可施用于個(gè)體身體一側(cè)的部位，而另一種組合物可施用于個(gè)體身體另一側(cè)的部位。再例如，一種組合物可施用于特定引流淋巴結(jié)附近的部位，而另一種組合物可施用于不同引流淋巴結(jié)附近的部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或更多種不同免疫療法組合物并行施用于患者中相同或?qū)嵸|(zhì)性鄰近的部位。實(shí)質(zhì)性鄰近的部位指與施用第一組合物的注射部位不是完全相同，但是與第一注射部位極其接近(挨著或接近)的部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，混合施用兩種或更多種不同免疫療法組合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，皮下、肌肉內(nèi)、或腫瘤內(nèi)施用本發(fā)明基于病毒的免疫療法組合物，且皮下施用基于酵母的組合物。一些實(shí)施方案可包括施用辦法的組合。例如，使用基于酵母的免疫療法組合物 (第一組合物)和基于病毒的免疫療法組合物(第二組合物)的并行施用的例示性情況，基于酵母的組合物的劑量的一部分(例如基于酵母的組合物的總劑量的一部分)可以與基于病毒的免疫療法組合物的部分或整個(gè)劑量混合施用或施用于與基于病毒的免疫療法組合物的部分或整個(gè)劑量相同或鄰近的部位，然后將基于酵母的免疫療法組合物的劑量的剩余部分施用于個(gè)體中其它部位。類似地，基于病毒的組合物的劑量的一部分可以與基于酵母的組合物的部分或整個(gè)劑量混合施用或施用于與基于酵母的組合物的部分或整個(gè)劑量相同或鄰近的部分，然后基于病毒的免疫療法組合物的剩余部分施用于個(gè)體中其它部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，在要分部分施用于個(gè)體上不同部位的基于病毒的和/或基于酵母的免疫療法組合物的單一劑量內(nèi)，一些部分可含有或表達(dá)靶抗原，而其余部分可以不這樣(即其余部分可以是孔載體或表面共刺激性分子、細(xì)胞因子、或其它非抗原劑)。疫苗或組合物的施用可以是系統(tǒng)的、粘膜的和/或鄰近靶部位的位置(例如腫瘤附近)。優(yōu)選施用路徑對本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯然的，這取決于要預(yù)防或治療的狀況的類型、使用的抗原、和/或靶細(xì)胞群或組織。各種可接受施用方法包括但不限于靜脈內(nèi)施用、 腹膜內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、結(jié)節(jié)內(nèi)施用、冠狀動(dòng)脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用(例如入頸動(dòng)脈)、皮下施用、經(jīng)皮投遞、氣管內(nèi)施用、皮下施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、心室內(nèi)施用、吸入(例如氣霧劑)、 顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、眼內(nèi)、耳、鼻內(nèi)、口服、肺部施用、導(dǎo)管注入、和直接注射入組織。在一個(gè)方面， 施用路徑包括靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、吸入、鼻內(nèi)、□服、眼內(nèi)、 關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)、和脊柱內(nèi)。胃腸外投遞可包括皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、 皮下、心房導(dǎo)管和靜脈導(dǎo)管(venal catheter)路徑。耳的投遞可以包括滴耳液，鼻內(nèi)投遞可以包括滴鼻液或鼻內(nèi)注射，而眼內(nèi)投遞可以包括滴眼液。氣溶膠(吸入)投遞還可以使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行(參見例如Mribling et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189 11277-11281，1992，通過述及將其完整收入本文)。調(diào)控粘膜免疫的其它施用路徑在病毒感染的治療中是有用。此類路徑包括支氣管、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、其它吸入、直腸、皮下、表面、 經(jīng)皮、陰道和尿道路徑。在一個(gè)方面，本發(fā)明的免疫治療性組合物皮下施用。優(yōu)選施用方法包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮或腫瘤內(nèi)。劑量施用至少一次。可以根據(jù)指示施用后續(xù)劑量，而且通常利用后續(xù)劑量。
更特別地，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的兩種或更多種不同免疫療法組合物的初始并行施用可以繼以一種和(在一個(gè)實(shí)施方案中)所有(兩種或更多種)免疫療法組合物的后續(xù)加強(qiáng)劑量。加強(qiáng)劑量(加強(qiáng))可以相隔任何合適時(shí)期施用，而且通常相隔1、2、3、4、 5、6、7、或8周施用。兩種或更多種免疫療法組合物的加強(qiáng)劑量可以根據(jù)需要并行或分開施用，但是最通常的是并行施用，正如引發(fā)劑量。正如引發(fā)劑量，施用方法可使用上文關(guān)于引發(fā)劑量描述的部位和施用策略的任何組合，但不限于與引發(fā)劑量相同的施用方案。例如， 如果引發(fā)劑量施用于兩個(gè)不同部位(每個(gè)部位一種免疫療法組合物)的話，加強(qiáng)劑量可以施用于相同兩個(gè)部位、一個(gè)部位或鄰近部位、或兩個(gè)不同部位，或者使用上文所述分部分策略。另外，不需要以與引發(fā)劑量完全相同的方式來配制加強(qiáng)劑量。例如，如果每一種免疫療法組合物在引發(fā)劑量中提供抗原和/或其免疫原性域的話，在加強(qiáng)劑量中，兩種免疫療法組合物均可再次提供抗原和/或其免疫原性域，或者只有一種免疫療法組合物可提供抗原和/或其免疫原性域，而另一種免疫療法組合物可以是空載體或提供非抗原劑(例如免疫刺激性分子或其它藥劑)。還涵蓋加強(qiáng)階段期間對本文所述組合物的其它可能修飾，包括修飾或改變所使用的病毒載體(例如在引發(fā)組合物中使用痘苗病毒而在加強(qiáng)組合物中使用禽痘病毒，或反之亦然)，修飾或改變對酵母媒介(例如酵母株的改變、酵母生成方法的改變、酵母如何提供抗原的改變，諸如表達(dá)與混合)，劑量，由一種或多種組合物提供的抗原或域，及免疫刺激性分子或其它藥劑的包括或消除或替代。俗語“單位劑量(unit dose) ”在關(guān)于本發(fā)明組合物的接種物時(shí)指適于作為哺乳動(dòng)物的單一劑量，物理上離散的單元，每個(gè)單位含有與所需稀釋劑聯(lián)合的，根據(jù)計(jì)算，產(chǎn)生期望免疫原性效果的預(yù)定數(shù)量的免疫療法組合物。本發(fā)明接種物的新穎單位劑量的規(guī)格由特定免疫療法組合物的獨(dú)特特征和要實(shí)現(xiàn)的特定免疫學(xué)效果規(guī)定且取決于特定免疫療法組合物的獨(dú)特特征和要實(shí)現(xiàn)的特定免疫學(xué)效果。在給個(gè)體(優(yōu)選人)提供本發(fā)明的免疫療法組合物時(shí)，施用的重組載體的劑量會(huì)隨諸如個(gè)體的年齡、重量、高度、性別、一般醫(yī)學(xué)狀況、 先前的醫(yī)學(xué)史、疾病進(jìn)展、腫瘤負(fù)荷、病原體負(fù)荷等等因素而變化。通常將接種物在可耐受(可接受)稀釋劑諸如鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水或其它生理可耐受稀釋劑等等中制備成溶液以形成含水藥物組合物。關(guān)于本發(fā)明基于重組病毒的免疫療法組合物，一般而言，希望給接受者提供約IO5 至約101°噬斑形成單位范圍中的重組病毒劑量，盡管可以施用更低或更高的劑量，包括但不限于IO2UO3UO4UO5UO6UO7UO8UO9UOiciUO11或更多噬斑形成單位。用于將重組病毒載體施用入個(gè)體的方法的例子包括但不限于離體將腫瘤細(xì)胞暴露于重組病毒，或通過靜脈內(nèi)、皮下(s.C.)、皮內(nèi)(I.D.)或肌肉內(nèi)(ι.μ.)施用病毒將重組載體注射入受影響宿主?；蛘?，可以通過直接注射入癌性病損或腫瘤或在藥學(xué)可接受載體中表面應(yīng)用來局部施用重組病毒載體或重組病毒載體組合。要施用的攜帶與編碼多種共刺激性分子的核酸序列組合的一種或多種抗原的核酸序列的重組載體的數(shù)量基于病毒顆粒的滴度。要施用的抗原的一個(gè)優(yōu)選范圍是IO5至101°個(gè)病毒顆粒每只哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，盡管可以施用更低或更高的劑量，包括但不限于IO2UO3,104、105、106、107、IO8、109、1010、IO11或更多噬斑形成單位。關(guān)于本發(fā)明基于酵母的免疫療法組合物，一般而言，一種合適的單個(gè)劑量是當(dāng)在合適時(shí)期里施用一次或多次時(shí)，能夠以有效引發(fā)抗原特異性免疫應(yīng)答的量給給定細(xì)胞類型、組織、或患者身體區(qū)域有效提供酵母媒介和抗原(如果包括的話)的劑量。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酵母媒介的單個(gè)劑量為約IxlO5至約切107個(gè)酵母細(xì)胞當(dāng)量每千克施用組合物生物體體重。更優(yōu)選地，本發(fā)明的酵母媒介的單個(gè)劑量為約0.1 Y. U. (IxlO6 個(gè)細(xì)胞)至約100Y.U. (IxlO9個(gè)細(xì)胞)每劑(即每個(gè)生物體)，包括任何中間劑量，增量為 0. IxlO6 個(gè)細(xì)胞(即 1. IxlO6，1. 2xl06，1. 3χ106· · ·)。優(yōu)選劑量包括 1Y. U 和 40Y. U.之間和更優(yōu)選地10Y. U.和40Y. U之間的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在個(gè)體上不同部位但在相同劑量給藥期期間施用劑量。例如，40Y. U.劑量可以通過在一個(gè)劑量給藥期期間注射10Y. U.齊IJ 量至個(gè)體上四個(gè)不同部位來施用。如果要免疫接種的哺乳動(dòng)物早就罹患疾病(例如癌癥或轉(zhuǎn)移癌或慢性病原體感染)的話，在并行施用本文所述不同免疫療法組合物植物，可以與用于治療疾病的其它治療性處理(例如化學(xué)療法、放射療法、小分子療法、細(xì)胞因子療法、抗病毒療法、生物應(yīng)答修飾劑療法、手術(shù)、等)聯(lián)合施用疫苗。本發(fā)明的免疫療法組合物的使用方法引發(fā)在個(gè)體中免疫應(yīng)答，使得個(gè)體受到保護(hù)而免于疾病或狀況，或免于源自疾病或狀況的癥狀。如本文中使用的，短語“受到保護(hù)而免于疾病”指預(yù)防疾病、預(yù)防疾病的至少一種癥狀、延遲疾病的發(fā)作、減輕疾病的一種或多種癥狀、減少疾病的發(fā)生、和/或降低疾病的嚴(yán)重性。關(guān)于癌癥，本發(fā)明的免疫療法組合物的并行施用優(yōu)選導(dǎo)致下述一項(xiàng)或多項(xiàng)預(yù)防腫瘤生長，延遲疾病發(fā)作，降低腫瘤負(fù)荷，降低腫瘤生長，延長存活，改善器官功能，和/或改善個(gè)體一般健康。關(guān)于傳染性疾病和其它疾病， 免疫療法組合物的并行施用優(yōu)選導(dǎo)致下述一項(xiàng)或多項(xiàng)預(yù)防疾病或狀況，預(yù)防感染，延遲疾病發(fā)作，延長存活，降低病原體負(fù)荷(例如降低病毒滴度)，減輕個(gè)體中源自感染的至少一種癥狀，減輕源自感染或疾病的器官或系統(tǒng)損傷，和改善器官或系統(tǒng)功能。在本發(fā)明的治療方法中，本發(fā)明免疫療法組合物的施用可以是“預(yù)防性”的或“治療性”的。當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，在疾病或狀況的任何癥狀之前提供本發(fā)明的免疫療法組合物。 免疫療法組合物的預(yù)防性施用用來預(yù)防或改善或延遲任何后續(xù)疾病的發(fā)作時(shí)間。當(dāng)治療性提供時(shí)，在疾病的癥狀發(fā)作時(shí)或之后提供免疫療法組合物。術(shù)語“疾病”指相對于動(dòng)物的正常健康狀況的任何偏離，包括存在疾病癥狀時(shí)的狀態(tài)，以及已經(jīng)發(fā)生偏離(例如腫瘤生長、 感染、等)但是癥狀尚未表現(xiàn)出來的狀況。在本發(fā)明的任何實(shí)施方案中，在對個(gè)體施用本發(fā)明的免疫療法組合物之外，可以單獨(dú)或組合施用別的外源免疫調(diào)控劑或免疫刺激性分子、化療藥物、抗生素、抗真菌藥物、 抗病毒藥物、癌癥療法、細(xì)胞因子、和其它治療劑、治療性組合物、或治療方案，這取決于要治療的狀況。可以與本發(fā)明的免疫療法組合物聯(lián)合使用的合適生物應(yīng)答修飾劑包括但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、激素、脂衍生物、肽、蛋白質(zhì)、多糖、小分子藥物、抗體及其抗原結(jié)合片段(包括但不限于抗細(xì)胞因子抗體、抗細(xì)胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體)、維生素、多核苷酸、核酸結(jié)合模塊、適體(aptamer)、和生長調(diào)控劑。外源添加的藥劑和生物應(yīng)答修飾劑的例子包括但不限于Flt-3L、環(huán)磷酰胺、順鉬、更昔洛韋(gancyclovir)、兩性霉素B、5-氟尿嘧啶、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、IL-6、白介素IO(IL-IO)、白介素 12 (IL-U)、I型干擾素(包括IFN-α)或I型干擾素的激動(dòng)劑或拮抗劑或其受體；II型干擾素(包括IFN-γ)或II型干擾素的激動(dòng)劑或拮抗劑或其受體；III型干擾素(包括 IFN-λ)或III型干擾素的激動(dòng)劑或拮抗劑或其受體；腫瘤壞死因子- α (TNF-α)；轉(zhuǎn)化生
36長因子-β (TGF- β )；抗-⑶40 ；⑶40L ；抗-CTLA-4抗體(例如用于釋放無變應(yīng)性T細(xì)胞)； T細(xì)胞共刺激物(例如抗-⑶137，抗-⑶觀，抗-⑶40)；阿倫珠單抗(alemtuzumab)(例如 CamPath )，denileukin diftitox (例如 ONTAK )；抗-CD4 ；抗-CD25 ；抗-PD-1， 抗-PD-Ll，抗-PD-L2 ；阻斷F0XP3的藥劑(例如用于消除活性/殺死⑶4+/⑶25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞)；Flt3配體，咪喹莫特(Aldara )，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，沙莫司亭(Leukine );激素，包括但不限于促乳素和生長激素；Toll 樣受體(TLR)激動(dòng)劑，包括但不限于TLR-2激動(dòng)劑、TLR-4激動(dòng)劑、TLR-7激動(dòng)劑、和TLR-9 激動(dòng)劑；TLR拮抗劑，包括但不限于TLR-2拮抗劑、TLR-4拮抗劑、TLR-7拮抗劑、和TLR-9拮抗劑；抗炎劑和免疫調(diào)控劑，包括但不限于C0X-2抑制劑(例如塞來考昔，NSAIDS)、皮質(zhì)類固醇、抑制素/他汀、和沙利度胺及其類似物，包括IMiD (其是沙利度胺的結(jié)構(gòu)和功能類似物(例如REVLIMID (lenalid0mide)、ACTIMID (pomalidomide))；促炎劑，諸如真菌或細(xì)菌成分或任何促炎性細(xì)胞因子或趨化因子；免疫治療性疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于細(xì)菌的疫苗、或基于抗體的疫苗；和任何其它免疫調(diào)控劑、免疫強(qiáng)化劑、抗炎齊U、和/或促炎劑。這些外源藥劑和療法可以與本發(fā)明的免疫療法組合物并行地或在不同的時(shí)間點(diǎn)施用。例如，當(dāng)與化療聯(lián)合給予個(gè)體時(shí)，可能希望在化療劑量之間的“假期”期間施用免疫療法組合物，以使免疫療法組合物的功效最大化。本發(fā)明的組合物和治療性疫苗可進(jìn)一步包括可用于保護(hù)受試者免于特定疾病或狀況(包括病原體感染)的任何其它化合物，治療或改善此類感染的任何癥狀的任何化合物，和用于癌癥的任何化合物或治療。在本發(fā)明的方法中，組合物和治療性組合物可以施用給動(dòng)物，包括任何脊椎動(dòng)物， 特別是脊椎動(dòng)物綱、哺乳類的任何成員，包括但不限于靈長類、嚙齒類、家畜和寵物。家畜包括用于消費(fèi)的或生產(chǎn)有用產(chǎn)物(例如用于羊毛生產(chǎn)的綿羊)的哺乳動(dòng)物。要保護(hù)的哺乳動(dòng)物包括人、犬、貓、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬和豬。在本發(fā)明中有用的通用技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)闡述，諸如Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990) ；Biology and activities of yeasts, Skinner, et al. , eds. , Academic Press (1980) ；Methods in yeast genetics :a laboratory course manual,Rose et al. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)； The Yeast Saccharomyces :Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al. , eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997) ；The Yeast Saccharomyces :Gene Expression, Jones et al. , eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993) ；The Yeast Saccharomyces :Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broach et al., eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992) ；Molecular Cloning :A Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al. ,1989)及 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel,2001) ( ^t^JC^ Mt^ "Sambrook")； Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. , eds. , 1987,包括直至Ij 2001 年的 ±曾干Ij ) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al.，eds.， 1994) ；Harlow and Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York ；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(在本文中統(tǒng)禾爾為“Harlow and Lane，，)，Beaucage et al. eds. , Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons,Inc. ,New York,2000) ；Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed. ,6th edition (2001),及 Vaccines, S.Plotkin and W. Orenstein, eds.,3rd edition(1999)。通用定義“免疫治療性組合物”為在受試者中引發(fā)足以實(shí)現(xiàn)至少一種治療性好處的免疫應(yīng)答的組合物。術(shù)語“生物學(xué)活性”一般指示化合物具有至少一種對細(xì)胞或生物體的代謝或其它過程有影響的可檢測活性，如在體內(nèi)(即在天然生理環(huán)境中)或在體外(即在實(shí)驗(yàn)室條件下)測量或觀察的。因而，例如，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分或片段或域指大小足以具有全長蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的部分、片段或域。此類活性為該蛋白質(zhì)特別的活性，而非作為一類的所有蛋白質(zhì)的活性?！皞€(gè)體”或“受試者”或“患者”(這些術(shù)語可互換使用)指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物， 更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括但不限于家畜、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物、寵物、靈長類動(dòng)物、小鼠和大鼠。術(shù)語 “個(gè)體”可以與術(shù)語“動(dòng)物”、“受試者”或“患者”互換使用。依照本發(fā)明，該術(shù)語“調(diào)控”可以與“調(diào)節(jié)”互換使用，而且一般指上調(diào)或下調(diào)特定活性。如本文中使用的，術(shù)語“上調(diào)”可以一般性用于描述下述任一項(xiàng)關(guān)于特定活性的引發(fā)，啟動(dòng)，提高，提升，加強(qiáng)，改進(jìn)，增強(qiáng)，擴(kuò)大，促進(jìn)，或提供。類似地，術(shù)語“下調(diào)”可以一般性用于描述下述任一項(xiàng)關(guān)于特定活性的降低，減輕，抑制，改善，消除，減少，阻斷，或阻止。在本發(fā)明中提到分離的蛋白質(zhì)或多肽包括全長蛋白質(zhì)、融合蛋白、或此類蛋白質(zhì)的任何片段、結(jié)構(gòu)域、構(gòu)象表位、或同源物。更具體的說，分離的蛋白質(zhì)，依照本發(fā)明，指已經(jīng)離開其天然環(huán)境(即已經(jīng)進(jìn)行過人為操作)的蛋白質(zhì)(包括多肽或肽)，可以包括例如純化的蛋白質(zhì)、部分純化的蛋白質(zhì)、重組生成的蛋白質(zhì)、和合成生成的蛋白質(zhì)。因此，“分離的” 并不反映蛋白質(zhì)已經(jīng)純化的程度。優(yōu)選的是，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)是重組生產(chǎn)的。依照本發(fā)明，術(shù)語“修飾”或“突變”可以互換使用，特別是關(guān)于本文所述蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)的修飾/突變。在用于本文時(shí)，術(shù)語“同源物”用于指因?qū)μ烊淮嬖诘鞍踪|(zhì)或肽的微小修飾而與天然存在蛋白質(zhì)或肽(即“原型”或“野生型”蛋白質(zhì))不同但保留天然存在形式的基本蛋白質(zhì)和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或肽。此類變化包括但不限于一個(gè)或一些氨基酸側(cè)鏈的變化；一個(gè)或一些氨基酸的變化，包括刪除(例如截短型式的蛋白質(zhì)或肽)、插入和/或替代；一個(gè)或一些原子的立體化學(xué)變化；和/或微小衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、 乙?；?、肉豆蔻酰化、異戊二烯化(prenylation)、棕櫚化(palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。同源物可以具有與天然存在蛋白質(zhì)或肽相比增強(qiáng)的、減弱的、或基本上相似的特性。同源物可以包括蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或蛋白質(zhì)的拮抗劑。同源物可以使用本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)來生產(chǎn)，包括但不限于直接修飾分離的天然存在蛋白質(zhì)、直接蛋白質(zhì)合成、或修飾編碼蛋白質(zhì)的核酸序列(例如使用經(jīng)典或重組DNA技術(shù)來實(shí)現(xiàn)隨機(jī)或靶向誘變)。給定蛋白的同源物可以包含與參照蛋白質(zhì)的氨基酸序列至少大約45%、或至少大約50%、或至少大約55%、或至少大約60%、或至少大約65%、或至少大約70%、或至少大約75 %、或至少大約80 %、或至少大約85 %、或至少大約90 %、或至少大約95 %相同、或至少大約95 %相同、或至少大約96 %相同、或至少大約97 %相同、或至少大約98 %相同、或至少大約99%相同(或介于45%和99%之間的、整數(shù)增量的任何百分比同一性)的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列組成，或由所述氨基酸序列組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，同源物包含與參照蛋白質(zhì)的天然存在氨基酸序列少于100%相同、少于大約99%相同、少于大約98%相同、少于大約97%相同、少于大約96%相同、少于大約95%相同、諸如此類、增量為1%、至少于大約70%相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列組成，或由所述氨基酸序列組成。在用于本文時(shí)，除非另有說明，提到百分比(％ )同一性指使用如下方法進(jìn)行的同源性評估=(I)BLAST 2.0 Basic BLAST同源性搜索，使用blastp進(jìn)行氨基酸搜索而使用 blastn進(jìn)行核酸搜索，其中使用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)，其中以缺省方法(by default)對檢索序列過濾低復(fù)雜性區(qū)域(見 Altschul，S. F.，Madden, Τ. L.，SchaSffer，Α. A.，Zhang, J.，Zhang, Ζ. ，Miller, W. & Lipman，D. J. (1997)“ Gapped BLAST and PSI-BLAST :a new generation of protein database search programs. " Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,通過述及完整收入本文)；O)BLAST 2比對(使用下文所述參數(shù))；C3)和/或PSI-BLAST(位置特異性的疊加BLAST (Position-Specific Iterated BLAST))，其中使用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)。注意至IJ，由于BLAST 2.0 Basic BLAST與BLAST 2之間標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的一些差異，在使用BLAST 2程序時(shí)可能將兩種特定序列認(rèn)定為具有顯著同源性，而使用序列之一作為檢索序列以BLAST 2.0 Basic BLAST進(jìn)行的搜索可能沒有在上等匹配中鑒定到第二序列。另外，PSI-BLAST提供了自動(dòng)化的、易于使用的“序型”(profile)搜索型式，這是一種尋找序列同源物的靈敏方法。該程序首先進(jìn)行帶缺口的BLAST數(shù)據(jù)庫搜索。PSI-BLAST程序利用來自任何返回的顯著比對的信息來構(gòu)建位置特異性得分矩陣，它取代了檢索序列用于下一輪數(shù)據(jù)庫搜索。因此，應(yīng)當(dāng)理解，百分比同一性可以使用這些程序中的任一種來測定。兩種特定序列可以使用BLAST 2序列彼此比對，見Tatusova and Madden, (1999), “ Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247_250，通過述及完整收入本文。BLAST 2 序列比對以blastp或blastn進(jìn)行，使用BLAST 2. 0算法在兩種序列之間進(jìn)行帶缺口的BLAST 搜索(BLAST 2.0)，容許在所得比對中引入缺口(刪除和插入)。為了表述清楚，使用標(biāo)準(zhǔn)缺省參數(shù)如下進(jìn)行BLAST 2序列比對。對于blastn，使用 0BL0SUM62 矩陣匹配獎(jiǎng)分=1錯(cuò)配罰分=-2開放缺口(5)和延伸缺口(2)罰分缺口x_ 落選(dropoff) (50)期望(expect) (10)詞長(11)濾器(開)對于blastp，使用 0BL0SUM62 矩陣
39
打開缺口(11)和延伸缺口(1)罰分缺口x_ 落選(dropoff) (50)期望(expect) (10)詞長(3)濾器(開)如本文中使用的，“激動(dòng)劑”為結(jié)合受體或配體或與另一分子或化學(xué)或生物學(xué)系統(tǒng)內(nèi)的分子相互作用并產(chǎn)生或觸發(fā)應(yīng)答的任何化合物或藥劑，包括但不限于小分子、蛋白質(zhì)、 肽、抗體、核酸結(jié)合劑、等，，其可包括模擬天然存在物質(zhì)的作用的藥劑(例如蛋白質(zhì)或肽的激動(dòng)劑)?！稗卓箘睘樽钄嗷蛞种苹蚪档图?dòng)劑或天然存在物質(zhì)的作用的任何化合物或藥齊U，包括但不限于小分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、核酸結(jié)合劑、等。分離的核酸分子指已經(jīng)離開其天然環(huán)境的(即已經(jīng)進(jìn)行人為操作的)核酸分子， 其天然環(huán)境指在自然界中找到該核酸分子的基因組或染色體。因此，“分離的”不必然反映該核酸分子已經(jīng)純化的程度，但是指明該分子不包括在自然界中找到該核酸分子的整個(gè)基因組或整個(gè)染色體。分離的核酸分子可以包括基因。包括基因的分離的核酸分子不是包含所述基因的染色體片段，而是包括與該基因有關(guān)的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)，但是沒有在相同染色體上天然發(fā)現(xiàn)的別的基因。分離的核酸分子還可以包括側(cè)翼(即在序列的5'和/或3' 末端)有別的核酸的指定核酸序列，所述別的核酸在自然界中通常不在所述指定核酸序列的側(cè)翼(即異源序列)。分離的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA任一的衍生物(例如cDNA)。盡管短語“核酸分子”主要指物理上的核酸分子，而短語“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是這兩個(gè)短語可以互換使用，尤其對于能夠編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)之結(jié)構(gòu)域的核酸分子或核酸序列。術(shù)語“多核苷酸”也可以與術(shù)語“核酸分子”或“核酸序列”互換使用。重組的核酸分子指這樣的分子，它可以包括至少一種編碼任何一種或多種本文所述蛋白質(zhì)的核酸序列，其可操作連接至至少一種能夠有效調(diào)節(jié)核酸分子在待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。盡管短語“核酸分子”主要指物理上的核酸分子，而短語“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是這兩個(gè)短語可以互換使用，尤其對于能夠編碼蛋白質(zhì)的核酸分子或核酸序列。另外，短語“重組分子”主要指可操作連接至轉(zhuǎn)錄控制序列的核酸分子，但是可以與施用于動(dòng)物的短語“核酸分子”互換使用。重組核酸分子包括重組載體，其是任何核酸序列，通常是異源序列，其可操作連接至編碼本發(fā)明融合蛋白的分離的核酸分子，其依照本發(fā)明能夠使得融合蛋白的重組生產(chǎn)成為可能，且能夠投遞核酸分子入宿主細(xì)胞。這樣的載體可包含這樣的核酸序列，即在自然界中沒有找到該核酸序列鄰接待插入載體的分離的核酸分子。載體可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本發(fā)明中優(yōu)選的是，載體是病毒或質(zhì)粒。重組載體可用于核酸分子的克隆、測序、和/或其它操作，而且可用于此類分子的投遞(例如在DNA組合物或基于病毒載體的組合物中)。重組載體優(yōu)選用于核酸分子的表達(dá)，而且還可稱為表達(dá)載體。優(yōu)選的重組載體能夠在受到轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的重組分子中，可以將核酸分子可操作連接至包含調(diào)控序列的表達(dá)載體，所述調(diào)控序列諸如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點(diǎn)、和與宿主細(xì)胞相容的且控制本發(fā)明核酸分子表達(dá)的其它調(diào)控序列。具體而言，本發(fā)明的重組分子包括可操作連接至一種或多種表達(dá)控制序列的核酸分子。短語“可操作連接”指將核酸分子連接至表達(dá)控制序列，其連接方式使得該分子在轉(zhuǎn)染(即轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)入宿主細(xì)胞后表達(dá)。依照本發(fā)明，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”用于指可以將外源核酸分子(即重組核酸分子)插入細(xì)胞的任何方法。在此類術(shù)語用于指將核酸分子導(dǎo)入微生物細(xì)胞諸如藻類、細(xì)菌和酵母時(shí)，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”可以與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”互換使用。在微生物系統(tǒng)中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”用于描述由于微生物獲得外源核酸而引起的遺傳變化(inherited change)，而且尤其與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”同義。因此，轉(zhuǎn)染技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)化、細(xì)胞的化學(xué)處理、顆粒轟擊、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染、吸附、感染和原生質(zhì)體融合。提供下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是為了例示而非意圖限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例下文實(shí)施例中使用了下述材料和方法。小鼠和腫瘤細(xì)胞系對于體外刺激淋巴細(xì)胞，雌性C57BL/6 (H_2b)小鼠得自國家癌癥研究所弗雷德里克癌癥研究和開發(fā)中心(Frederick，MD)。人CEA基因表達(dá)呈純合的C57BL/6小鼠育種對 (CEA-Tg)由 John Shively 博士 (City of Hope, Duarte, CA)惠贈(zèng)。通過對小鼠尾 DNA 的 PCR 分析確認(rèn)了 CEA 表達(dá)的純合性(Greiner et al.，Cancer Res 2002 Dec 1 ；62 (23) 6944-51)。6至8周齡雌性小鼠用于所有實(shí)驗(yàn)，而且依照AAALAC方針在無病原體的條件下在微型分隔籠中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)性研究在NIH內(nèi)部動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。靶腫瘤細(xì)胞系EL-4(H-2b，胸腺瘤)得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)。LL/26鼠肺腺癌腫瘤細(xì)胞由 Chandan Guha博士 (Albert Einstein College of Medicine,New York,NY) 饋贈(zèng)。如先前所述(Robbins et al. ,Cancer Res 1991 Jul 15 ；51 (14) :3657-62)，通過用 CEA cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染而生成表達(dá)人CEA的LL/2鼠肺癌細(xì)胞(LL2-CEA)。在完全培養(yǎng)基(DMEM，補(bǔ)充10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、和100 μ g/ml鏈霉素)中維持細(xì)胞。疫苗構(gòu)建體含有鼠B7-1、ICAM-I、和LFA-3基因以及人CEA基因的重組痘苗(rV)和重組禽痘 (rF)病毒(rV/F-CEA/TRIC0M)先前已有記載(Hodge et al.，Cancer Res 1999 Nov 15 ； 59(22) :5800-7 ；及Grosenbach et al. ,Cancer Res 2001 Junl ；61(11) :4497-505)。表達(dá)鼠 GM-CSF 的 rF 病毒(rFGM-CSF)先前已有記載(Kass et al.，Cancer Res 2001 Jan 1 ； 61(1) :206-14)。表達(dá)全長CEA蛋白的重組啤酒糖酵母構(gòu)建體(酵母-CEA)先前已有記載 (Bernstein et al. ,Vaccine 2008Jan 24 ； 26 (4) :509-21)。如先前所述(Haller et al.， Vaccine 2007 Feb 9 ；25 (8) :1452-63)，生成并熱殺死酵母-CEA以進(jìn)行這些研究。接種進(jìn)度表對于血清細(xì)胞因子分析，如先前所述(Wansley et al. ,Clin Cancer Res 2008Jul 1 ；14(13) :4316-25)，給 CEA-Tg 小鼠(n = 2)接種 lxl08pfu rVCEA/TRICOM 或 4YU/ 動(dòng)物 (IYU= IO7個(gè)酵母顆粒)的酵母-CEA。對于所有其它研究，在rV/F-CEA/TRIC0M疫苗組中， 在第 0 天給 CEA-Tg 小鼠引發(fā)與 lxl(fpfu rF-GM-CSF 混合的 lxl(fpfu rV_CEA/TRIC0M，并天 7天加強(qiáng)與lxl(fpfu rF-GM-CSF混合的IxlO8Pfu rF_CEA/TRIC0M。對于依照本發(fā)明的別處和實(shí)施例的剩余部分，此疫苗方案一般會(huì)稱作“rV/F-CEA/TRIC0M”。在酵母-CEA疫苗組中， 每7天給CEA-Tg小鼠接種酵母-CEA (4YU/小鼠)。給接受rV/F_CEA/TRIC0M和酵母-CEA 疫苗組合的小鼠引發(fā)lxl(fpfu rV-CEA/TRIC0M(皮下施用在右背側(cè)上)和4YU/小鼠的酵CN 母-CEA(皮下投遞在腿內(nèi)側(cè)和肩胛骨上)。在多個(gè)部位上分拆酵母-CEA劑量先前已有記載 (Wansley, 2008，見上文)，而且本文中不僅用于酵母-CEA疫苗，而且用于rV/F_CEA/TRIC0M 的分拆，以靶向小鼠中的多個(gè)引流淋巴結(jié)。對于研究的剩余部分，以1周間隔給組合組中的小鼠加強(qiáng) lxl(fpfu rF-CEA/TRICOM 和酵母-CEA (4YU/ 小鼠)。細(xì)胞因子表汰譜對于血清細(xì)胞因子分析，在接種后第0天、第2天、和第4天對接種小鼠(見上文接種進(jìn)度表)放血，并分離血清。由Linco Diagnostic Services (St. Charles，M0)使用Thl/Th2和促炎性細(xì)胞因子組分析細(xì)胞因子表達(dá)。為了測量由來自接種rV/F-CEA/ TRICOM或酵母-CEA的小鼠(n = 5)的⑶8+Τ細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，將⑶8+Τ細(xì)胞大量培養(yǎng)并在CEA-572-579肽(GIQNSVSA，稱作CEA-572且在本文中呈現(xiàn)于SEQ ID NO :11)或 CEA-526-533 肽(EAQNTTYLj^t CEA_5^ 且在本文中呈現(xiàn)于 SEQ ID NO 12) (10 μ g/ml)存在下再刺激，如先前所述(Wansley et al.，2008，見上文)。使用小鼠炎性細(xì)胞因子細(xì)胞計(jì)量珠陣列試劑盒和小鼠Thl/Th2細(xì)胞因子細(xì)胞計(jì)量珠陣列試劑盒(BD Biosciences, San Jose, CA)依照制造商的說明書測量細(xì)胞因子水平。T細(xì)胞警體(TCR)譜使用RNeasy迷你試劑盒^jiagen，Inc.，Valencia, CA)依照制造商的說明書分離 RNA。然后將 RNA用于使用 hvitrogenSuperScript RT-PCR第一鏈合成系統(tǒng) Qnvitrogen, 8 Carlsbad, CA)依照制造商的說明書進(jìn)行的RT-PCR反應(yīng)。使用先前為19種Va和對種νβ基因記載的引物和條件擴(kuò)增Va和νβ基因(Pannetier et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 1993 May 1 ；90 (9) :4319-23 ；Arden et al. , Nature 1985 Aug 29-Sep 4 ； 316(6031) :783-7)。使用 Agilent 2100 生物分析儀和 Agilent DNA 1000 試劑盒(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)依照制造商的說明書通過芯片電泳分析PCR產(chǎn)物。使用 Agilent 2100 Expert 軟件(version B. 02. 06SI418[Patch 01])通過大小(bp)和數(shù)量 (nmol/L)來鑒定PCR產(chǎn)物。對于每一份樣品，對存在的每一種基因的數(shù)量求和，并對于每一種基因，計(jì)算總TCR Va或νβ全集的百分比。使用由對小鼠TCR νβ 2、3、4、5· 1 和 5· 2、6、7、8· 1 和 8. 2,8. 3、9、10、11、12、13、14、
和17特異性的單克隆抗體組成的小鼠V^TCR篩選組(BD Pharmingen, San Jose, CA)，使用FACScan細(xì)胞儀(Becton Dickinson)通過流式細(xì)胞術(shù)在蛋白質(zhì)水平鑒定TCR V β表達(dá)。cDNA寡聚物陣列CEA-Tg小鼠或是無處理或是以1周間隔接種3次rV/F_CEA/TRIC0M或酵母-CEA。 在第33天，收獲脾細(xì)胞，并分離RNA0使用T和B細(xì)胞活化、趨化因子和趨化因子受體、和常見細(xì)胞因子cDNA寡聚物陣列(SABiosciences，F(xiàn)rederick，MD)來調(diào)查基因表達(dá)變化。依照制造商的推薦，若基因的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度比> 2或< 0. 5 倍截留)，則分別認(rèn)定基因上調(diào)或下調(diào)。CEA特異性CTL細(xì)胞系和體外測定法在含CEA-5^或CEA-572肽(1 μ g/ml)和IL_2 (10U/ml)及新鮮照射的APC的培養(yǎng)中維持自接種rV/F-CEA/TRIC0M或酵母-CEA的小鼠生成的CEA_5^特異性和CEA-572特異性T細(xì)胞系。為了測量T細(xì)胞系裂解經(jīng)111M標(biāo)記的靶的能力，在96孔U底板中于37°C 和5% CO2 一式三份將多種比例的T細(xì)胞與經(jīng)過標(biāo)記的靶一起溫育。在某些研究中，使用
42抗MHC I類阻斷性抗體(H2Db，BD Pharmingen)來區(qū)分TCR介導(dǎo)的與NK樣的細(xì)胞毒性。使用伽馬計(jì)數(shù)器(Corba Autogamma, Packard Instruments, Downers Grove, IL)測量上清液中的放射性。腫瘤裂解的百分比如下計(jì)算％腫瘤裂解=[(實(shí)驗(yàn)cpm-自發(fā)cpm)/(最大 cpm-自發(fā)cpm)]X100。為了評估CEA特異性CTL系的親合力，如先前所述測試腫瘤殺死活性(Hodge et al，2005，J Immunol 174(10) :5994-6004)。對數(shù)據(jù)取平均值并作為 Δ %特異性裂解繪圖。為了標(biāo)準(zhǔn)化每一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)的各組，還將數(shù)據(jù)表述為最大裂解對肽濃度的百分比。最后，將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的自然對數(shù)針對肽濃度繪圖。每一種T細(xì)胞群的親合力定義為導(dǎo)致50%最大靶裂解的肽濃度的對數(shù)負(fù)數(shù)(Hodge et al.，2005，見上文及Derby et al, 2001，J Immuno 1 166 (3) :1690-1697)，并表述為 nM。HIV-gag-390-398 肽(SQVTNPANI， 稱作HIV-gag肽且在本文中呈現(xiàn)于SEQ ID NO 13)在此實(shí)驗(yàn)中用作陰性對照。對CEA_5^ 和CEA-572特異性的MHC I類肽四聚物得自Beckman Coulter (Fullerton, CA) 指示時(shí)， 如 Wunderlich et al. (1994,"Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. "In :Coligan J,Kruisbeek A,Margulies D,Shevach E,Strober W(eds)Current Protocols in Immunology, Wiley, Hoboken, NJ)所述，將 CTL 活性換算成裂解單位(LU)。腫瘤療法研究對于涉及LL2-CEA腫瘤的療法研究，給6至8周雌性CEA-Tg小鼠在尾中靜脈內(nèi)注射ΙΟΟμ 1體積中的3xl05個(gè)LL2-CEA細(xì)胞。腫瘤植入后4天，如上所述給小鼠引發(fā)，然后加強(qiáng)。為了對肺部轉(zhuǎn)移計(jì)數(shù)，將來自處死小鼠的肺膨脹，用黑墨染色，并在i^ekete氏溶液中固定(Wexler，J Natl Cancer Inst 1966 Apr ；36 (4) :641-5)。統(tǒng)計(jì)分析使用 GraphPad Prism version 4. Oa for Macintosh(GraphPad Software, San Diego, CA)對體內(nèi)數(shù)據(jù)實(shí)施統(tǒng)計(jì)分析。對第45天每只小鼠的平均腫瘤鼠實(shí)施雙尾非參數(shù) Mann-Whitney檢驗(yàn)。對第45天攜帶> 10個(gè)肺部腫瘤小結(jié)的小鼠(認(rèn)為余生< 1周)實(shí)施時(shí)序(Mantel-Cox)檢驗(yàn)。以95%置信區(qū)間計(jì)算所有數(shù)值，而且< 0. 05的ρ值認(rèn)定為顯
-frh-
者O實(shí)施例1下述實(shí)施例顯示免疫療法載體在誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子宿主先天性免疫應(yīng)答 (其隨后可影響CEA特異性T細(xì)胞應(yīng)答)中的作用。在此實(shí)驗(yàn)中，調(diào)查了免疫療法載體在誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子宿主先天性免疫應(yīng)答(其隨后可影響CEA特異性T細(xì)胞應(yīng)答)中的作用。簡言之，給CEA-Tg小鼠(η = 2)接種rV-CEA/TRICOM或酵母-CEA。在第O天、第2天、和第4天收集血清，合并并使用Thl/ Th2和促炎性細(xì)胞因子組分析一組細(xì)胞因子。如圖1所示，rV-CEA/TRIC0M(實(shí)心方框)誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞因子譜，其中MIPl α、RANTES、GM-CSFJP IL_12p70水平高而IL-5水平低(分別為圖1A、B、C、和E)。相反，酵母-CEA接種誘導(dǎo)混合型Thl/Th2細(xì)胞因子譜，其中IL-6水平升高(圖1D)，MIPl α、RANTES, IL-13、和IL-5水平低(分別為圖1Α、B、F、和I)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為每一天的pg/ml細(xì)胞因子。這些數(shù)據(jù)顯示接種rV-CEA/TRIC0M與酵母-CEA誘導(dǎo)不同細(xì)胞因子表達(dá)，指示每一種疫苗平臺(tái)誘導(dǎo)不同T細(xì)胞群。實(shí)施例2下述實(shí)施例演示接種rV/F-CEA/TRIC0M與酵母-CEA誘導(dǎo)獨(dú)特TCR全集。
此實(shí)驗(yàn)試圖確定接種任一平臺(tái)是否誘導(dǎo)具有獨(dú)特TCR全集的CD8+T細(xì)胞群。如上文材料和方法部分所述，給CEA-Tg小鼠(n = 5每組)接種rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA 任一。無處理小鼠充當(dāng)陰性對照(圖2A和2D)。在接種后14天自接種小鼠收獲脾并合并。 使用19種Va特異性和對種\^特異性引物實(shí)施RT-PCR反應(yīng)。然后分析PCR產(chǎn)物并為每一種基因計(jì)算總TCR全集的百分比(圖2 ；星號指示在來自接種一種疫苗的小鼠的T細(xì)胞中與另一種疫苗相比獨(dú)特表達(dá)的基因)。來自無處理小鼠和接種rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠的脾細(xì)胞的TCR Va譜指示每一個(gè)組具有獨(dú)特TCR Va表達(dá)譜(圖2A至C)。 19種Va基因中12種的表達(dá)在由兩種疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞之間是相似的，而7種Va基因?qū)τ趤碜砸环N疫苗的T細(xì)胞群與另一種疫苗相比是獨(dú)特的(圖2B和C)。來自這些相同動(dòng)物的 νβ全集的比較指示除少數(shù)例外，Vi3譜在兩組小鼠間也有區(qū)別(圖2D至Ε)。24種Vi3基因中14種的表達(dá)在由兩種疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞之間是相似的，而疫苗也誘導(dǎo)獨(dú)特νβ基因。 如圖2Ε和F所示，10種V β基因由來自rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA任一接種CEA-Tg小鼠的 T 細(xì)胞獨(dú)特表達(dá)(νβ 1、V β 4、V β 5. 1、V β 5. 2、V β 5. 3、V β 8. 1、V β 8. 3、V β 9、V β 10、 和νβ 20)。這些數(shù)據(jù)指示來自無處理小鼠和接種rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA的小鼠的 T細(xì)胞的V α和ViiTCR全集具有共享的和獨(dú)特的TCR基因表達(dá)樣式。然而，不知道這些差異是否是由于受到不同載體感染的細(xì)胞對CEA抗原的不同加工和呈遞，或者是由于載體自身。下文實(shí)施例描述了自接種兩種載體平臺(tái)的CEA-Tg小鼠創(chuàng)建的對兩種不同CEA表位特異性的T細(xì)胞系的TCR全集。實(shí)施例3下述實(shí)施例顯示，接種rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA，誘導(dǎo)了共享的和獨(dú)特的、響應(yīng)載體和抗原的基因表達(dá)。為了調(diào)查載體和抗原二者對脾細(xì)胞的基因表達(dá)的影響，使用cDNA寡聚物陣列來進(jìn)一步表征通過接種rV/F-CEA/TRICOM或酵母-CEA誘導(dǎo)的T細(xì)胞群。調(diào)查了接種rV/FCEA/ TRICOM或酵母-CEA的CEA-Tg小鼠的脾細(xì)胞對涉及T和B細(xì)胞活化、趨化因子、趨化因子受體、和細(xì)胞因子的252種基因的表達(dá)。表1顯示對于每一個(gè)陣列，rV/FCEA/TRIC0M和酵母-CEA都誘導(dǎo)相同基因的表達(dá)變化，包括將沈種基因上調(diào)至少2倍，其中大多數(shù)涉及細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)。另外，兩種疫苗都上調(diào)涉及免疫細(xì)胞趨化性的白三烯受體Ltb4r2、涉及T細(xì)胞增殖的基因諸如分泌型磷蛋白-KSppl或骨橋蛋白)、和腫瘤抑制基因hha。同時(shí)，每一種疫苗平臺(tái)均誘導(dǎo)數(shù)種基因的獨(dú)特表達(dá)變化(表1，粗體)。酵母-CEA下調(diào)涉及免疫細(xì)胞趨化性的基因諸如Ccll2、Cxcl9、Ccr9，而rV/F-CEA/TRICOM不改變?nèi)魏芜@些基因的表達(dá)。 來自此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指示兩種疫苗平臺(tái)誘導(dǎo)共享的和獨(dú)特的基因表達(dá)變化。表權(quán)利要求
1.一種在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療癌癥的至少一種癥狀，延長具有癌癥的個(gè)體的存活， 和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種癌癥抗原的治療性免疫應(yīng)答的方法，包括對該個(gè)體施用a)包含重組痘苗病毒的第一免疫療法組合物，該重組痘苗病毒包含編碼至少一種共刺激性分子的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域；其中該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該重組痘苗病毒包含編碼共刺激性分子B7-1、ICAM-I和 LFA-3的核酸序列。
3.一種在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療癌癥的至少一種癥狀，延長具有癌癥的個(gè)體的存活， 和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種癌癥抗原的治療性免疫應(yīng)答的方法，包括對該個(gè)體施用a)包含下述各項(xiàng)的第一免疫療法組合物i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組痘苗病毒；和 )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域；其中該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。
4.權(quán)利要求3的方法，進(jìn)一步包括在第一次施用后至少一周對該個(gè)體施用a)包含下述各項(xiàng)的第三免疫療法組合物i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組禽痘病毒；和 )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域；其中該第二和第三免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體。
5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的方法，其中該抗原是包含CAP-1-6D表位的經(jīng)修飾CEA。
6.免疫療法組合物的組合在制備藥物中的用途，該藥物并行施用于個(gè)體，以在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療癌癥的至少一種癥狀，延長具有癌癥的個(gè)體的存活，和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答，該免疫療法組合物包含a)包含下述各項(xiàng)的第一免疫療法組合物i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組痘苗病毒；和 )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種癌癥抗原或其免疫原性域。
7.權(quán)利要求6的用途，進(jìn)一步包含第三免疫療法組合物，該第三免疫療法組合物包含下述各項(xiàng)i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組禽痘病毒；和 )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法或用途，其中該痘苗病毒是經(jīng)修飾的安卡拉(Ankara) 痘苗病毒(MVA)。
9.一種在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療疾病或狀況的至少一種癥狀，延長具有疾病或狀況的個(gè)體的存活，和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答的方法，包括對該個(gè)體施用a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物；其中該第一和第二免疫療法組合物并行施用于該個(gè)體；且其中該第一和第二免疫療法組合物之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。
10.免疫療法組合物的組合在制備藥物中的用途，該藥物并行施用于個(gè)體，以在個(gè)體中預(yù)防、改善或治療疾病或狀況的至少一種癥狀，延長個(gè)體的存活，和/或在個(gè)體中誘導(dǎo)針對一種或多種抗原的治療性免疫應(yīng)答，該免疫療法組合物包含a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒含病毒基因組或其部分；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物；其中該第一和第二免疫療法組合物之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域。
11.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的方法或用途，其中該第一免疫療法組合物包含重組病毒，該重組病毒包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。
12.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的方法或用途，其中該第一免疫療法組合物包含包含病毒基因組或其部分和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組病毒，和包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列的重組病毒。
13.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的方法或用途，其中該第一免疫療法組合物包含重組病毒，該重組病毒包含編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列和編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。
14.權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)的方法或用途，其中該重組病毒或該第一免疫療法組合物中的病毒是痘病毒。
15.權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)的方法或用途，其中該重組病毒或該第一免疫療法組合物中的病毒是重組痘苗病毒。
16.權(quán)利要求15的方法或用途，其中該痘苗病毒是經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
17.權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)的方法或用途，其中該重組病毒或該第一免疫療法組合物中的病毒是禽痘病毒。
18.權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)的方法或用途，其中該免疫刺激性分子包含一種或多種共刺激性分子。
19.權(quán)利要求18的方法或用途，其中該免疫刺激性分子包含B7-1、ICAM-I和LFA-3。
20.權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)的方法或用途，其中該免疫刺激性分子包含一種或多種細(xì)胞因子。
21.權(quán)利要求20的方法或用途，其中該細(xì)胞因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)。
22.權(quán)利要求1至21任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第二免疫療法組合物包含表達(dá)至少一種抗原或其免疫原性域的酵母媒介。
23.權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第二免疫療法組合物中的酵母媒介是完整酵母。
24.權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第二免疫療法組合物中的酵母媒介是完整、熱殺死酵母。
25.權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第二免疫療法組合物中的酵母媒介來自糖酵母屬(Saccharomyces)0
26.權(quán)利要求1至25任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第一和第二免疫療法組合物施用于個(gè)體中不同部位。
27.權(quán)利要求1至25任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第一和第二免疫療法組合物施用于個(gè)體中相同部位或鄰近部位。
28.權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第一和第二免疫療法組合物均包含至少一種抗原或其免疫原性域。
29.權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第一和第二免疫療法組合物均包含相同抗原或其免疫原性域。
30.權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第一免疫療法組合物包含至少一種抗原或其免疫原性域，且其中該第二免疫療法組合物不包含抗原或其免疫原性域。
31.權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)的方法或用途，其中該第二免疫療法組合物包含至少一種抗原或其免疫原性域，且其中該第一免疫療法組合物不包含抗原或其免疫原性域。
32.權(quán)利要求1至31任一項(xiàng)的方法或用途，進(jìn)一步包括對該個(gè)體加強(qiáng)該免疫療法組合物之一或二者。
33.權(quán)利要求32的方法或用途，包括對該個(gè)體加強(qiáng)該第二免疫療法組合物，比該第一免疫療法組合物更加頻繁。
34.權(quán)利要求1至31任一項(xiàng)的方法或用途，進(jìn)一步包括對該個(gè)體加強(qiáng)與該第一免疫療法組合物不同的包含重組病毒的第三免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分。
35.權(quán)利要求34的方法或用途，其中該第一免疫療法組合物包含重組痘苗病毒，且其中該第三免疫療法組合物包含禽痘病毒。
36.權(quán)利要求1至31任一項(xiàng)的方法或用途，進(jìn)一步包括對該個(gè)體加強(qiáng)該抗原或其免疫原性域的另一來源。
37.權(quán)利要求1至36任一項(xiàng)的方法或用途，進(jìn)一步包括對該個(gè)體施用至少一種生物應(yīng)答修飾劑。
38.權(quán)利要求1至37任一項(xiàng)的方法或用途，其中該個(gè)體具有癌癥。
39.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該方法在個(gè)體中降低腫瘤負(fù)荷或抑制腫瘤生長。
40.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原來自選自下組的癌癥黑素瘤，鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌，頭頸癌，甲狀腺癌，軟組織肉瘤，骨肉瘤，睪丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮膚癌，腦癌，血管肉瘤(angiosarcoma)，血管肉瘤(hemangiosarcoma)，肥大細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，原發(fā)性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃腸癌，腎細(xì)胞癌，造血瘤形成及其轉(zhuǎn)移癌。
41.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原選自下組癌胚抗原(CEA)，突變的Ras癌蛋白，Brachyury，MUC-I, EGFR, BCR-Abl, MART-I, MAGE-I, MAGE-3, GAGE, GP-100，MUC-2， 正常的和點(diǎn)突變的p53癌蛋白，PSMA，酪氨酸酶，TRP-I (gp75)，NY-ES0-1, TRP-2，TAG72， KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c_erb/B2，hTERT, p73, B-RAF,腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)，Myc, 馮·希佩爾-林道蛋白(VHL)，Rb-I，Rb-2，雄激素受體(AR)，Smad4, MDRl，F(xiàn)lt-3, BRCA-I， BRCA-2, pax3-fkhr, ews-fli-1，HERV-H，HERV-K, TWIST,間皮素，NGEP，此類抗原的修飾，此類抗原的剪接變體，和此類抗原的表位激動(dòng)劑。
42.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原是癌胚抗原(CEA)。
43.權(quán)利要求42的方法或用途，其中該CEA包含CAP1-6D表位。
44.權(quán)利要求43的方法或用途，其中該CEA包含氨基酸序列SEQID NO :2。
45.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原是突變的Ras。
46.權(quán)利要求45的方法或用途，其中該抗原是包含一個(gè)或多個(gè)Ras片段的多域融合蛋白，每個(gè)片段包含Ras位置12、13、59、61和/或76處的一處或多處突變。
47.權(quán)利要求45的方法或用途，其中該抗原具有氨基酸序列SEQID NO :4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID N0:8、和/或SEQ ID NO: 10。
48.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原是Brachyury。
49.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原是MUC-I。
50.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原是EGFR。
51.權(quán)利要求38的方法或用途，其中該抗原是BCR-Abl。
52.權(quán)利要求38至51任一項(xiàng)的方法或用途，進(jìn)一步包括用化療治療該個(gè)體。
53.權(quán)利要求38至51任一項(xiàng)的方法或用途，進(jìn)一步包括用放療治療該個(gè)體。
54.權(quán)利要求1至37任一項(xiàng)的方法或用途，其中該個(gè)體具有由病原體引起的或與病原體有關(guān)的疾病。
55.權(quán)利要求M的方法或用途，其中該方法減輕或預(yù)防病原體對個(gè)體的感染。
56.權(quán)利要求M的方法或用途，其中該方法降低個(gè)體中的病原體滴度。
57.權(quán)利要求討的方法或用途，其中該抗原選自下組病毒抗原，真菌抗原，細(xì)菌抗原， 蠕蟲抗原，寄生物抗原，外寄生物抗原，和原生動(dòng)物抗原。
58.權(quán)利要求M的方法或用途，其中該抗原來自選自下組的病毒腺病毒，沙粒病毒， 布尼亞病毒，冠狀病毒，柯薩奇病毒，巨細(xì)胞病毒，埃巴二氏病毒，黃病毒，肝DNA病毒，肝炎病毒，皰疹病毒，流感病毒，慢病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，粘病毒，致癌病毒，正粘病毒，乳頭瘤病毒，乳多泡病毒，副流感病毒，副粘病毒，細(xì)小病毒，微小RNA病毒，痘病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，呼腸病毒，桿狀病毒，風(fēng)疹病毒，披膜病毒，水痘病毒，和T-淋巴營養(yǎng)性病毒。
59.權(quán)利要求M的方法或用途，其中該抗原來自選自下組的屬的感染因子曲霉(Aspergillus),博德特氏菌(Bordatella, Bordetella)，布魯絲蟲(Brugia)，假絲酵母(Candida)，衣原體(Chlamydia)，球蟲(Coccidia)，隱球菌(Cryptococcus)，惡絲蟲(Dirofilaria)，埃希氏菌(Escherichia)，弗朗西絲氏菌(Francisella)，淋球菌(Gonococcus)，組織胞菜菌(Histoplasma)，利什曼原蟲(Leishmania)，分枝桿菌 (Mycobacterium)，支原體(Mycoplasma)，草履蟲(Paramecium)，百日咳(Pertussis)， 癥原蟲(Plasmodium),月市炎球菌(Pneumococcus),月市囊蟲(Pneumocystis),立克次氏體(Rickettsia)，沙門氏菌(Salmonella)，志賀氏菌(Shigella)，葡萄球菌(Staphtlococcus),鏈球菌(Streptococcus)，弓形體(Toxoplasma),霍舌匕弧菌 (Vibriocholerae),禾口耳口爾森氏菌(Yersinia)。
60.權(quán)利要求M的方法或用途，其中該抗原來自選自下組的屬的細(xì)菌假單胞菌 (Pseudomonas)，博德特氏菌(Bordetella)，分枝桿菌(Mycobacterium)，弧菌(Vibrio)， 芽孢桿菌(Bacillus),沙門氏菌(Salmonella),弗朗西絲氏菌(Francisella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，鏈球菌(Streptococcus)，埃希氏菌(Escherichia)，腸球菌 (Enterococcus),巴斯德氏菌(Pasteurella),禾口耳口爾森氏菌(Yersinia)。
61.一種組合物，包含a)包含重組病毒的第一免疫療法組合物，該重組病毒包含病毒基因組或其部分；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，其中該第一和第二免疫療法組合物之一或二者包含至少一種抗原或其免疫原性域；和其中該第一和第二免疫療法組合物混合提供。
62.權(quán)利要求61的組合物，其中該第一免疫療法組合物包含重組病毒，該重組病毒包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。
63.權(quán)利要求61的組合物，其中該第一免疫療法組合物包含包含病毒基因組或其部分和編碼至少一種癌癥抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組病毒，和包含編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列的重組病毒。
64.權(quán)利要求61的組合物，其中該第一免疫療法組合物包含重組病毒，該重組病毒包含編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列和編碼一種或多種免疫刺激性分子的一種或多種核酸序列。
65.權(quán)利要求61至64任一項(xiàng)的組合物，其中該重組病毒或該第一免疫療法組合物中的病毒是痘病毒。
66.權(quán)利要求61的組合物，其中該第二免疫療法組合物包含表達(dá)至少一種抗原或其免疫原性域的酵母媒介。
67.權(quán)利要求61或權(quán)利要求66的組合物，其中該第二免疫療法組合物中的酵母媒介是完整、熱殺死酵母。
68.權(quán)利要求61、權(quán)利要求66、或權(quán)利要求67的組合物，其中該第二免疫療法組合物中的酵母媒介來自糖酵母屬。
69.權(quán)利要求61至68任一項(xiàng)的組合物，其中該抗原是癌癥抗原。
70.權(quán)利要求61至68任一項(xiàng)的組合物，其中該抗原來自病原體。
71.權(quán)利要求61至70任一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包含至少一種生物應(yīng)答修飾劑。
72.權(quán)利要求61至70任一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包含至少一種化療劑。
73.—種試劑盒，包含下述免疫療法組合物a)包含重組痘苗病毒的第一免疫療法組合物，該重組痘苗病毒包含編碼至少一種共刺激性分子的核酸序列和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種抗原或其免疫原性域。
74.權(quán)利要求73的試劑盒，其中該重組痘苗病毒包含編碼共刺激性分子B7-1、ICAM-I 和LFA-3的核酸序列。
75.—種試劑盒，其包含下述免疫療法組合物a)包含下述各項(xiàng)的第一免疫療法組合物i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組痘苗病毒；和 )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒；和b)包含酵母媒介的第二免疫療法組合物，該酵母媒介包含至少一種抗原或其免疫原性域。
76.權(quán)利要求75的試劑盒，進(jìn)一步包含包含下述各項(xiàng)的第三免疫療法組合物i)包含編碼B7-1、ICAM-I和LFA-I或其生物學(xué)活性部分的核酸序列和編碼至少一種抗原或其免疫原性域的核酸序列的重組禽痘病毒；和 )包含編碼GM-CSF或其生物學(xué)活性部分的核酸序列的重組禽痘病毒。
77.權(quán)利要求73至76任一項(xiàng)的試劑盒，其中該抗原是癌癥抗原。
78.權(quán)利要求73至76任一項(xiàng)的試劑盒，其中該抗原是包含CAP-1-6D表位的經(jīng)修飾CEA。
全文摘要
本發(fā)明公開了免疫治療性組合物和此類組合物的組合用于改進(jìn)誘導(dǎo)治療性免疫應(yīng)答和/或用于預(yù)防、改善和/或治療疾病(包括但不限于癌癥和傳染性疾病)的并行用途。
文檔編號A61K39/00GK102458458SQ201080026166
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者A.弗蘭朱索夫, J.施洛姆, J.霍奇 申請人:全球免疫股份有限公司, 美利堅(jiān)合眾國, 由健康及人類服務(wù)部部長代表