專利名稱：具有低氯化鈉濃度的免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含蛋白質抗原且氯化鈉濃度小于等于IOOmM的免疫原性組合物。本發(fā)明也涉及包含抗原或抗原制劑、并且還包含一種或多種免疫刺激劑的這類免疫原性組合物。
背景技術：
為了確保能維持免疫原性，蛋白質抗原的配制尤為重要。有時使用免疫刺激劑以改善針對任何給定抗原而產生的免疫應答。然而，在疫苗或免疫原性組合物中包含佐劑會增加成分制備的復雜性以及疫苗組合物的分布和配制的復雜性。配制者必須考慮每種佐劑成分以及抗原性成分的制備。具體地講，應當考慮抗原性成分與佐劑成分的相容性。這尤其是在預期將凍干抗原或抗原制劑與佐劑制劑重配的情況下。在這種情況下，重要的是，佐劑制劑的緩沖液對于抗原或抗原制劑而言是合適的并且抗原的免疫原性或溶解度不會受到佐劑的影響。蛋白質抗原PRAME和NY-ES0-1 (分別描述于US5830753和US5804381)或其片段或衍生物都是對癌癥治療具有潛在益處的蛋白質抗原。發(fā)明概述本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)某些抗原例如PRAME和NY-ES0-1對被稱為“鹽析”的現(xiàn)象特別敏感，該現(xiàn)象可定義為通過鹽例如氯化鈉的飽和而使蛋白質從其溶液中沉淀下來。本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，當氯化鈉濃度低至150mM時，這些抗原就會聚集和沉淀。因此，在一個實施方案中，抗原或抗原制劑是當溶于含氯化鈉(NaCl)濃度或離子強度大于5禮、101111、151111、201111、301111、401111、501111、601111、701111、801111、901111或1001111的溶液之后沉淀、凝結或聚集的任何抗原。本發(fā)明提供包含PRAME或NY-ES0-1的免疫原性組合物，其中所述組合物的氯化鈉濃度小于IOOmM。附圖
簡述圖I. QS21溶解活性曲線。圖2.在不同ASA制劑中，每種3D-MPL同類物(congener)的百分率。圖3.用于凍干PRAME/CpG的凍干周期。圖4.在ASA(150mM NaCl)和ASA(山梨醇)中重配的PRAME和NYES0-1之間的圖示比較。圖5.在實驗I中經用不同佐劑組合物配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的體液應答。圖6.在實驗I中經用不同佐劑組合物配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的腫瘤保護作用。圖7.在實驗2中經用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液體制劑ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的體液應答。圖8.在實驗2中經用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液體制劑ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的CD4+應答。
圖9.在實驗2中經用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液體制劑ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的腫瘤保護作用。發(fā)明詳述本發(fā)明提供包含本文所述的抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度小于lOOmM。具體地講，本發(fā)明提供包含抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度小于約IOOmM,例如小于約 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物中的氯化鈉濃度小于IOmM或小于等于5mM。在另一個具體的實施方案中，免疫原性組合物基本不含氯化鈉?；静缓侵嘎然c濃度為或非常接近OmM。使用已知技術和試劑盒，技術人員可以容易地測試鈉離子(Na+)和氯離子(CD的濃度。例如，可使用試劑盒例如來自Biosupply的鈉的酶學測定試劑盒(Sodium Enzymatic
Assay Kit)(目錄號BQ011EAEL)來檢測鈉?？墒褂迷噭┖欣鐏碜訠iosupply的氯的酶學測定試劑盒(Chloride Enzymatic Assay Kit)(目錄號BQ006EAEL)來檢測氯。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供包含本文所述的抗原的免疫原性組合物，其中離子強度小于 IOOmM,例如小于 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物中的離子強度小于IOmM或小于等于5mM。在又一個具體的實施方案中，免疫原性組合物的離子強度為或非常接近OmM(即l、2、3mM)。可使用技術人員已知的技術來測定本發(fā)明的佐劑或免疫原性組合物的離子強度，例如使用電導儀。因此，在一個實施方案中，抗原或抗原制劑是當溶于含氯化鈉(NaCl)濃度的溶液或其中溶液離子強度大于 5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或IOOmM的溶液之后沉淀、凝結或聚集的任何抗原。本領域技術人員可以通過將抗原溶于和/或混合于該溶液中來確定抗原是否滿足該定義。不滿足該定義的抗原在溶解和/或混合后24小時將仍留在溶液中，即液體仍澄清而無沉淀。在溶于含IOOmM氯化鈉濃度的溶液中之后沉淀、凝結或聚集的抗原，在24小時或更短時間之后，可通過溶液的濁度而觀察到沉淀。另外，無法目測的聚集也可使用技術人員已知的方法來觀察，所述方法包括但不限于SEC-HPLC。在一個實施方案中，提供包含抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度小于IOOmM,例如小于約 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM、10 或 5mM，并且其中所述抗原是PRAME (也稱為DAGE)或其片段或衍生物。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供包含抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的離子強度小于 IOOmM,例如小于 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM，并且其中所述抗原是PRAME(也稱為DAGE)或其片段或衍生物。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物的離子強度小于IOmM或小于等于5mM，并且其中所述抗原是PRAME或其片段或衍生物。抗原及其制備描述于美國專利號5，830，753。PRAME以下列登錄號存在于注釋的人類基因數(shù)據(jù)庫(Annotated Human Gene Database, H-Inv DB) U65011. I、BC022008. I、AK129783. UBC014974. 2、CR608334. UAF025440. UCR591755. UBC039731. UCR623010. I、CR611321. UCR618501. U CR604772. U CR456549. I 和 CR620272. I。也可使用包含PRAME抗原的融合蛋白?？墒褂肞RAME或其片段或衍生物，任選其形式是與異源融合伴侶融合的融合蛋白。具體地講，可適當?shù)厥褂肞RAME抗原，其形式是與B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae B)的蛋白D或其部分或其衍生物的融合蛋白?？蛇m當使用的蛋白D部分并不包含分泌序列或信號序列。適當?shù)?，融合伴侶蛋白包括在融合蛋白序列N端上或其中的氨基酸Met-Asp-Pro并且其中融合伴侶蛋白不包含蛋白D的分泌序列或信號序列。例如融合伴侶蛋白可包括蛋白D的大約或正好氨基酸17-127、18-127、19-127或20-127或者由它們組成。基于與蛋白D的融合蛋白的合適PRAME抗原描述于W02008/087102，所述文獻通過引用全部結合到本文中。在一個實施方案中，提供包含抗原的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度小于IOOmM,例如小于約 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM、10 或 5mM，并且其中所述抗原是NY-ES0-1或其片段或衍生物。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供包含抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的離子強度小于 IOOmM,例如小于 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM，并且其中所述抗原是NY-ES0-1或其片段或衍生物。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物的離子強度小于IOmM或小于等于5mM，并且其中所述抗原是NY-ES0-1或其片段或衍生物。NY-ES0-1可以是全長的或者可使用其片段或其衍生物，任選其形式是與異源融合伴侶的融合蛋白。NY-ES0-1描述于US5804381，所述文獻通過引用全部結合到本文中。蛋白NY-ES0-1的長度大約為180個氨基酸并被描述成由3個區(qū)域組成(a)約氨基酸1_70的N-端區(qū)，(b)約氨基酸71-134的中央?yún)^(qū)，和(c)約氨基酸135-180的C端區(qū)。NY-ES0-1可用作融合蛋白，例如作為與LAGE-I或其片段的融合物，參見W02008/089074，所述文獻通過引用全部結合到本文中。當使用NY-ES0-1片段時，這些適當?shù)匕ㄒ粋€或多個MHCl類或
2類表位，例如被稱為 A31、DR1、DR2、DR4、DR7、DP4、B35、B51、Cw3、Cw6 和 A2 的那些(參見W02008/089074)。盡管并非同樣對NaCl敏感，但是可用于本發(fā)明的又一種抗原是例如MAGE-3家族例如MAGE-A3的MAGE抗原。MAGE-3抗原已被描述為例如可適宜地與NY-ES0-1配制在一起一參見W02005/105139，所述文獻通過引用全部結合到本文中。MAGE抗原例如MAGE-A3可按原樣使用或者以衍生物(例如經化學修飾的衍生物)形式和/或以與異源融合伴侶融合的融合蛋白形式使用。例如MAGE抗原可含有還原型二硫橋，以構成游離巰基，其可用例如甲酰胺或羧甲基衍生，參見W099/40188，所述文獻通過引用全部結合到本文中。具體地講，MAGE抗原可適宜地以與B型流感嗜血桿菌的蛋白D或其部分或其衍生物融合的融合蛋白形式使用。例如蛋白D的大約1/3或蛋白D的N-端100-110氨基酸可用作融合伴侶，參見W099/40188。在又一實施方案中，抗原或抗原性組合物可以是本文所述抗原的任何衍生物。本文所用的術語“衍生物”是指相對于其天然存在形式而言被修飾的抗原。本發(fā)明的衍生物與天然抗原非常類似，保持了抗原性并保留了允許針對天然抗原而產生免疫應答的能力。給定衍生物是否產生這樣的免疫應答，可通過合適免疫學測定例如ELISA或流式細胞術來檢測。本文所用的術語“片段”是指腫瘤相關抗原的片段或抗原衍生物，其含有至少一個表位，例如CTL表位，通常是至少8個氨基酸的肽。認為長度為至少8個氨基酸，例如8-10個氨基酸或至多20、50、60、70、100、150或200個氨基酸的片段落入本發(fā)明范圍之內，只要所述片段具有抗原性，也就是說該片段保留了主要表位(例如CTL表位)并且該片段能夠誘導與天然存在的腫瘤相關抗原交叉反應的免疫應答。示例性片段的長度可以是8-10、10-20、20-50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200 個氨基酸殘基(包括這些范圍之內的任何數(shù)值)。免疫原性組合物可包含一種或多種抗原。眾所周知的是，對于胃腸外給予，溶液應當是生理等滲的(即具有藥學上可接受的重量摩爾滲透壓濃度)，以避免細胞變形或裂解?！暗葷B劑”是生理上可耐受的并賦予制劑(例如本發(fā)明的免疫原性組合物)合適張力的化合物，以防跨越與制劑接觸的細胞膜的水的凈流動。通常，氯化鈉(NaCl)用作等滲劑。本發(fā)明人已經證明某些抗原對“鹽析”特別敏
感，鹽析是指溶液中的蛋白質在含高濃度鹽的溶液中聚集或凝結的過程，是用于制備本文描述為等滲的本發(fā)明免疫原性組合物的替代方式。在一個具體的實施方案中，提供還包含非離子型等滲劑的免疫原性組合物。用于免疫原性組合物的合適的非離子型等滲劑應當適用于人類，并且與抗原性組合物中的抗原相容并且還與其它成分例如免疫刺激劑相容。在本發(fā)明的一個實施方案中，合適的非離子型等滲劑是多元醇、糖類(尤其是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖)或氨基酸例如甘氨酸。在一個實施方案中，多元醇是糖醇，尤其是C3-6糖醇。示例性的糖醇包括甘油、赤蘚糖醇、蘇糖醇、阿拉伯糖醇、本糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、衛(wèi)矛醇和艾杜糖醇。在該實施方案的一個具體實例中，合適的非離子型等滲劑是山梨醇。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本發(fā)明組合物中的非離子型等滲劑是蔗糖和/或山梨醇。在一個實施方案中，免疫原性組合物中多元醇的合適濃度介于約3至約15% (w/v)之間,尤其是介于約3至約10% (w/v)例如介于約3至約7% (w/v)之間，例如介于約4至約6% (w/v)之間。在該實施方案的一個具體實例中，多元醇是山梨醇。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，免疫原性組合物包含一種或多種免疫刺激劑。在一個實施方案中，該免疫刺激劑可以是皂苷。用于本發(fā)明的一種尤其合適的皂苷是QuiI A及其衍生物。QuiI A是分離自南美樹QuiIIaja saponaria Molina的一種阜苷制劑，首次由 Dalsgaard等人描述于 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. fiir die gesamteVirusforschung,第 44 卷,Springer Verlag, Berlin，第 243-254 頁)，其具有佐劑活性。Quil A的純化片段已通過HPLC分離，其保留佐劑活性，而沒有與Quil A(EP 0 362 278)例如QS7和QS21 (也稱為QA7和QA21)相關的毒性。QS-21是源自Quillaja saponariaMolina的一種天然皂苷，其誘導⑶8+細胞毒T細胞(CTL)、Thl細胞和主要IgG2a抗體應答。QS21是本發(fā)明的優(yōu)選皂苷。在本發(fā)明的合適形式中，免疫原性組合物中的阜苷佐劑是saponaria molinaquil A的衍生物，優(yōu)選Quil A的免疫活性片段，例如QS-17或QS-21，適宜的是QS-21。在一個具體的實施方案中，在其反應原性較低的組合物中提供QS21，其中它被外源固醇例如膽固醇猝滅。存在著其中QS21被外源膽固醇猝滅的反應原性較低的組合物的若干種具體形式。在一個具體的實施方案中，皂苷/固醇呈脂質體結構的形式(WO96/33739，實施例I)。在該實施方案中，脂質體適宜含有天然脂質，例如磷脂酰膽堿，其在室溫下適宜為非晶性的，例如卵黃磷脂酰膽堿、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)或二月桂基磷脂酰膽堿。脂質體也可含有帶電荷的脂質，其對于由飽和脂質構成的脂質體而言能增加脂質體-QS21結構的穩(wěn)定性。在這些情況下，帶電荷脂質的量適宜為1-20% w/w，優(yōu)選5-10%。固醇與磷脂的比率為1-50% (mol/mol)，適宜地為20-25%。合適的固醇包括￠-谷固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇和膽固醇。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物包含膽固醇作為固醇。這些固醇是本領域眾所周知的，例如膽固醇公開于默克索引(Merck Index，第11版，第341頁)，是存在于動物脂肪中的天然存在的固醇。當活性皂苷部分是QS21時，QS21 :固醇的比率通常為約I : 100至I : I (w/w)，適宜地介于I : 10至I : l(w/w)之間,優(yōu)選I : 5至I : I (w/w) o適當過量的固醇存在，QS21 固醇的比率為至少I : 2 (w/w)。在一個實施方案中，QS21 固醇的比率為I : 5(w/
W)。固醇適宜為膽固醇。在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含免疫刺激劑，其是Toll-樣受體4(TLR4)激動劑。“TLR激動劑”是指能通過TLR信號轉導途徑而引起信號轉導反應的成分，或者是作為直接配體或者間接通過產生內源或外源配體(Sabroe等，JI 2003 pl630_5)。TLR4激動劑能通過TLR-4信號轉導途徑而引起信號轉導反應。TLR4激動劑的合適實例是脂多糖，適宜的是脂質A的無毒衍生物，尤其是單磷酰脂質A或更尤其是3-脫酰單磷酰脂質 A(3D-MPL)。3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N. A.售賣，名稱是 MPL，并且在全文中都稱為MPL或3D-MPL。參見例如美國專利號4，436，727 ;4，877，611 ;4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要是促進具有IFN-g(Thl)表型的⑶4+T細胞應答?？砂凑誈B2220211A所公開的方法制備3D-MPL。從化學上說，它是具有3、4、5或6條?；湹?-脫酰單磷酰脂質A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，小顆粒3D-MPL可用于制備免疫原性組合物。小顆粒3D-MPL的粒徑使其可通過0. 22 ii m濾器進行除菌過濾。這樣的制劑描述于WO94/21292。優(yōu)選地，粉狀3D-MPL用于制備本發(fā)明的免疫原性組合物?？墒褂玫钠渌黅LR4激動劑是氨基葡糖苷磷酸烷基酯(AGP)，例如公開于W098/50399或美國專利號6，303, 347 (也公開了 AGP的制備工藝)的那些，適宜的是RC527或RC529或美國專利號6，764，840所公開的AGP的藥學上可接受的鹽。某些AGP是TLR4激動劑，而某些則是TLR4拮抗劑。認為這兩類都可用作免疫刺激劑。其它合適的TLR-4激動劑描述于W02003/011223和WO 2003/099195,例如W02003/011223的第4_5頁或W02003/099195的第3_4頁上公開的化合物I、化合物II和化合物III，尤其是公開于W02003/011223的那些化合物ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 和 ER804764。例如，一種合適的TLR-4激動劑是ER804057。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物同時包含皂苷和TLR4激動劑。在一個具體的實例中，免疫原性組合物包含QS21和3D-MPL。每份人用劑量的免疫原性組合物中可以使用的TLR-4激動劑例如脂多糖例如3D-MPL的量介于1-100 u g之間。可使用的3D-MPL的水平為約50 u g，例如介于40-60 u g之間，適宜地為介于45-55 u g之間或介于49-51 u g之間或50 u g。在又一個實施方案中，免疫原性組合物的人用劑量包含3D-MPL的水平為約25 u g，例如介于20-30 u g之間，適宜地為介于21-29 u g之間或介于22-28 u g之間或介于28-27 u g之間或介于24-26 y g之間或 25y g。每份人用劑量的免疫原性組合物中可以使用的皂苷例如QS21的量介于1-100 u g之間。可使用的QS21水平為約50 ii g，例如介于40-60 ii g之間，適宜地為介于45-55 ii g之間或介于49-51118之間或5011§。在又一個實施方案中，免疫原性組合物的人用劑量包含QS21的水平為約25ii g，例如介于20-30ii g之間，適宜地為介于21-29 y g之間或介于22-28 u g之間或介于28-27 u g之間或介于24-26 u g之間或25 u g。
當TLR4激動劑和皂苷同時存在于免疫原性組合物中時，TLR4激動劑與皂苷的重量比適宜地為介于I : 5-5 I之間，適宜地為I : I。例如，在每份人用劑量的免疫原性組合物中，當3D-MPL含量為50iig或25iig時，適宜地QS21的含量也可分別為50 y g或25 u go在一個實施方案中，免疫刺激劑是TLR9激動劑，例如W02008/142133所給出的那些。在一個具體的實例中，所述TLR9激動劑是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。這樣的寡核苷酸是眾所周知的并描述于例如WO 96/02555、WO99/33488和US 5，865，462。用于本文所述的免疫原性組合物的合適的TLR9激動劑是含有CpG的寡核苷酸，任選含有被至少3個、適宜地為至少6個或更多個核苷酸分隔的兩個或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鳥嘌呤核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵(internucleotide bond)是二硫代磷酸鍵，或可能是硫代磷酸鍵，但磷酸二酯鍵和其它核苷酸間鍵也可使用，包括具有混合核苷酸間鍵的寡核苷酸。制備硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5，666，153、US5, 278，302和W095/26204?？紤]了包含不同核苷酸間鍵的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯類。可使用能穩(wěn)定寡核苷酸的其它核苷酸間鍵。適合本文所述的免疫原性組合物所包含的CpG寡核苷酸的實例具有以下序列。在一個實施方案中，這些序列含有經硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。OLIGO I (SEQ ID NO: I) TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)OLIGO 2 (SEQ ID NO 2) TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)OLIGO 3 (SEQ ID NO :3) ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4 (SEQ ID NO :4) TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)OLIGO 5 (SEQ ID NO :5) TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)可選擇的CpG寡核苷酸可包含上述序列，其中它們可具有不連續(xù)缺失或添加。在一個實施方案中，免疫刺激劑是母育酚。母育酚是本領域眾所周知的并描述于EP0382271。在一個具體的實施方案中，母育酚是a-生育酚或其衍生物例如a -生育酚琥珀酸酯(也稱為琥珀酸維生素E)。本發(fā)明也提供本發(fā)明免疫原性組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟a.將本文所述的抗原凍干，任選與本文所述的免疫刺激性寡核苷酸一起；和b.將步驟a)的凍干組合物與含水佐劑組合物重配，其中所述含水佐劑組合物的NaCl 濃度或離子強度小于 100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM 或10mM。在一個具體的實施方案中，凍干抗原是當溶于含氯化鈉濃度或離子強度大于10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 的溶液之后沉淀、凝結或聚集的任何抗原。在又一實施方案中，凍干抗原選自PRAME或NY-ES0-1。在一個實施方案中，步驟b)的佐劑組合物(上述)包含如上所述的皂苷和/或TLR-4激動劑，例如QS21和/或3D-MPL。在又一個實施方案中，皂苷和/或TLR4激動劑在脂質體制劑中。在一個實施方案中，佐劑組合物包含在脂質體制劑中的TLR4激動劑和皂苷，以及本文所述的非離子型等滲劑。尤其是本發(fā)明的佐劑組合物可包含山梨醇。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供包含以下成分的藥盒a.凍干抗原，任選與CpG —起凍干；和b.含水佐劑組合物，其中NaCl濃度或離子強度小于lOOmM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM 或 10mM。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，本文所述藥盒中的抗原包含PRAME或者NY-ES0-1和它們的片段和/或衍生物。在一個替代實施方案中，提供藥盒，其中CpG不與抗原一起凍干?？蓪pG與含水佐劑組合物混合，或者以含水或凍干形式裝入單獨小管中。用于本發(fā)明藥盒的含水佐劑可以是本文所定義的任何佐劑組合物。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，含水佐劑組合物包含TLR4激動劑和/或呈脂質體形式的皂苷。在一個具體的實施方案中，TLR4激動劑是3D-MPL，皂苷是QS21。本文所用的含水佐劑可包含等滲劑，例如多元醇，例如山梨醇。本發(fā)明還提供用于癌癥的免疫治療性治療的本文所述的免疫原性組合物。在該實施方案的具體實例中，本發(fā)明提供用于選自以下的一種或多種癌癥的免疫治療性治療的本文所述的免疫原性組合物前列腺癌、乳癌、結直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌或黑素瘤。本發(fā)明還提供在有需要的個體中治療或預防癌癥的方法，所述方法包括給所述個體提供有效量的本文所述的免疫原性組合物的步驟。在該實施方案的具體實例中，本發(fā)明提供選自以下的癌癥的治療或預防方法前列腺癌、乳癌、結直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌或黑素瘤。根據(jù)以下非限制性實例將進一步描述本發(fā)明。
實施例實施例I :佐劑組合物ASA(山梨醇)的制備制備佐劑組合物，其中包含脂質體制劑中的3-脫酰MPL和QS21。其制備如下A.脂質體的制備方法將脂質(例如合成磷脂酰膽堿)、膽固醇和3-0-脫酰MPL的有機溶液的混合物真空干燥。再加入含水溶液(例如磷酸緩沖鹽水[IOOmM NaCl、20mM磷酸鹽pH 6. I])并攪拌容器直到所有脂質呈懸浮狀態(tài)。用高剪切混合器將該懸浮液預均質，再進行高壓均質，直到脂質體大小降低到經DLS測定約為90nm+/-10nm。然后將脂質體除菌過濾。
B. ASA 的配制步驟I :濃縮脂質體的稀釋當稀釋10倍時，將Na2/K磷酸鹽緩沖液IOOmM pH6. I加入到注射用水中，在終制劑中達到IOmM磷酸鹽緩沖液濃度。再加入30% (w/v)山梨醇的注射用水(WFI)溶液，在終制劑中達到4. 7%的濃度。將其在室溫下攪拌15-45分鐘。再將濃縮脂質體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、膽固醇和MPL制成)加入到該混合物中，在終制劑中達到IOOii g/ml MPL的濃度。然后將混合物在室溫下攪拌15-45分鐘。步驟2:加入QS21使用蠕動泵，以200ml/min蠕動泵的速率將QS21貯液(在室溫下融化24小時或在4°C融化2天，200ml)加入到稀釋的脂質體中，同時磁力攪拌，在終制劑中達到100 y g/ml的濃度。將混合物攪拌15-45分鐘。最終ASA 制劑中含有 IOOu g MPL/ml 和 100 U g QS21/ml。步驟3 :檢查 pH 為 6. 1+/-0. 3步驟4:除菌過濾以400ml/min的恒定流速,在來自PALL Corporation的聚醚砜(PES)濾器上進行除菌過濾。步驟5 :在+2°C至+8°C貯存獲得佐劑組合物，其中包含在在脂質體制劑中的3-0-脫酰MPL和QS21并含有山梨醇(稱為ASA(山梨醇))，然后貯存在4°C。實施例2 :佐劑組合物ASA(150mM NaCl)的制備A.脂質體的制備方法將脂質(例如合成磷脂酰膽堿)、膽固醇和3-0-脫酰MPL的有機溶液的混合物真空干燥。再加入磷酸緩沖鹽水并攪拌容器直到所有脂質呈懸浮狀態(tài)。再用高剪切混合器將該懸浮液預均質，然后進行高壓均質，直到脂質體大小降低到經DLS測定約為90nm+/-10nm。然后將脂質體在0. 22 y m PES膜上除菌過濾。B. ASA 的配制步驟I :濃縮脂質體的稀釋當稀釋10倍時，將Na2/K磷酸鹽緩沖液IOOmM pH6. 45和NaCl I. 5M加入到注射用水中，在終制劑中分別達到IOmM磷酸和NaCl 150mM的濃度。將該混合物在室溫下攪拌5分鐘。再將濃縮脂質體(分別由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的D0PC、膽固醇和MPL制成)加入到該混合物中，在終制劑中達到100 u g/ml MPL的濃度。然后將所得混合物在室溫下攪拌5-15分鐘。步驟2:加入QS21將QS21貯液(在室溫下融化24小時或在4°C融化2天，200ml)加入到稀釋的脂質體中，同時磁力攪拌，在終制劑中達到IOOiI g/ml的濃度。將混合物在室溫下攪拌。步驟3 :檢查 pH 為 6. 1+/-0. I.步驟4:除菌過濾在來自PALL Corporation的聚醚砜(PES)濾器上進行除菌過濾。
步驟5 :在+2°C至+8°C貯存最終ASA 組合物是每毫升 2mg D0PC、500 ii g 膽固醇、IOOii g3-0-脫酰 MPL、IOOii gQS21。實施例3. QS21裂解活件已知QS21能裂解紅細胞(RBC)。測試實施例I中制備的ASA (山梨醇)佐劑組合物，以確保QS21的裂解活性以與包含150mM NaCl的等量佐劑組合物(ASA(150mM NaCl))中所觀察到的同樣方式被猝滅。通過溶血測定，使用雞紅細胞(chicken Red Blood cell, RBC)測定QS21的裂解活性。將RBC在550g于4°C離心。棄去上清液。將沉淀小心重懸于PBS緩沖液中達原先體積并且重復同樣操作，直到上清液不再呈紅色(通常3次)。如果不直接使用的話，將沉淀貯存于4°C最多3-4天(并在使用當天再次洗滌)，或者如果在同一天使用的話，將其在緩
沖液中稀釋大約10倍。臨時在ASA緩沖液(在測定ASA樣品后在鹽或在山梨醇緩沖液中)中制作QS21劑量范圍曲線并且制備佐劑樣品(含50 ii g或90 ii g等量QS21，即相當于500 ill或900 U IASA)。在標準品和樣品中用適當緩沖液(含或不含山梨醇，隨所測試樣品的緩沖液而定)將終體積調節(jié)至900iU。因為其為乳白色，ASA干擾光密度(0D)。因此制備ASA “空白”并從ASA測試樣品的OD值中減去“空白”0D。這些空白相當于與樣品中測試的體積相同的ASA體積，但用緩沖液調節(jié)至lml。這些空白中不加RBC。然后將標準品和樣品與RBC—起(將100 U I稀釋RBC加入到900 u I標準品和樣品中)在室溫下(RT)溫育30分鐘。再將樣品在900g離心5分鐘。離心后在540nm處測定光密度。通過界限試驗(limit test)進行裂解活性的測定。I.檢測限(LOD)定義為導致OD的最低QS21濃度-比基礎水平更高(0D> 0. I)-比緩沖液(“0u g” QS21)的OD高約3倍-在曲線的上升部分-對每次試驗進行測定。2.如果佐劑樣品的OD大于ODmi，則佐劑樣品中QS21的裂解活性始終是正的。QS21曲線的實例
權利要求
1.包含抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的氯化鈉濃度或離子強度小于IOOmM0
2.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述抗原或抗原制劑是在溶于含氯化鈉濃度或離子強度大于 5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 的溶液之后沉淀、凝結或聚集的任何抗原。
3.權利要求I或2的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度小于IOOmM并且其中所述抗原是PRAME或其片段或衍生物。
4.權利要求I或2的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度小于IOOmM并且其中所述抗原是NY-ESO-I或其片段或衍生物。
5.權利要求1-4中任一項的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度或離子強度小于約100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM。
6.權利要求5的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度或離子強度小于10mM。
7.權利要求6的免疫原性組合物，其中氯化鈉濃度或離子強度小于5mM。
8.權利要求7的免疫原性組合物，其基本不含氯化鈉。
9.前述權利要求中任一項的免疫原性組合物，所述組合物還包含非離子型等滲劑。
10.權利要求9的免疫原性組合物，其中所述非離子型等滲劑是多元醇。
11.權利要求10的免疫原性組合物，其中所述多元醇是山梨醇。
12.權利要求11的免疫原性組合物,其中山梨醇濃度介于約3%至約15%(w/v)之間。
13.權利要求12的免疫原性組合物，其中山梨醇濃度介于約4%至約10%(w/v)之間。
14.前述權利要求中任一項的免疫原性組合物，所述組合物包含約5mM氯化鈉和介于5 %至6 % w/v之間的山梨醇。
15.權利要求1-14中任一項的免疫原性組合物，所述組合物包含一種或多種免疫刺激劑。
16.權利要求15的免疫原性組合物，其中所述免疫刺激劑是皂苷和/或TLR-4激動劑。
17.權利要求16的免疫原性組合物，其中所述免疫刺激劑呈脂質體形式。
18.權利要求16或17的免疫原性組合物，其中所述皂苷是QuilA或其衍生物。
19.權利要求18的免疫原性組合物，其中所述QuilA的衍生物是QS21。
20.權利要求16-19中任一項的免疫原性組合物，其中所述TLR-4激動劑是3D-MPL。
21.權利要求16-20中任一項的免疫原性組合物，所述組合物還包含CpG寡核苷酸。
22.用于藥物的權利要求1-21中任一項的免疫原性組合物。
23.用于治療癌癥的權利要求1-21中任一項的免疫原性組合物。
24.權利要求1-21中任一項的免疫原性組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
25.權利要求1-22中任一項的免疫原性組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟 a.將抗原凍干，任選與免疫刺激性寡核苷酸一起；和 b.將步驟a)的凍干組合物與含水佐劑組合物重配，其中NaCl濃度或離子強度小于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM 或 10mM。
26.藥盒,所述藥盒包含 a.凍干抗原，任選與CpG—起凍干；和 b.含水佐劑組合物，其中NaCl濃度或離子強度小于100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM 或 10mM。
27.權利要求26的方法或權利要求27的藥盒，其中所述含水佐劑組合物包含TLR-4激動劑、以及呈脂質體形式的皂苷和非離子型等滲劑。
28.權利要求27的方法或藥盒，其中所述非離子型等滲劑是山梨醇。
29.權利要求28的方法或藥盒，其中山梨醇濃度介于約3%至15%(w/v)之間，介于4%至10% (w/v)之間或介于約5%至6% (w/v)之間。
30.權利要求27或28的方法或藥盒，其中所述皂苷是QS21。
31.權利要求27-30中任一項的方法或藥盒，其中所述TLR-4激動劑是3D-MPL。
32.權利要求25-31中任一項的方法或藥盒，其中在所述含水佐劑組合物中NaCl濃度為約5mM。
33.權利要求25-32中任一項的方法或藥盒，其中所述抗原在溶于含氯化鈉濃度或溶液離子強度大于 10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 的溶液之后沉淀、凝結或聚集。
34.權利要求25-33中任一項的方法或藥盒，其中所述抗原選自PRAME或NY-ESO-I。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含抗原的免疫原性組合物，其中所述組合物的氯化鈉濃度或離子強度小于100mM，并且提供了它們在藥物中的用途。
文檔編號A61K39/00GK102802660SQ201080026416
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權日2009年6月10日
發(fā)明者V·亨德里克斯, D·I·勒穆瓦納 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司