專利名稱：用于治療亨廷頓病的組織激肽釋放酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療成人亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作、青少年亨廷頓病和相關(guān)病癥的方法。
背景技術(shù)：
亨廷頓病(Huntington's disease,HD)是由HD基因5，端CAG三核苷酸重復(fù)片段不穩(wěn)定擴(kuò)展引起的多谷氨酰胺神經(jīng)變性疾病(TheHuntington' s Disease Collaborative Research Group，1993)。該突變導(dǎo)致突變亨廷頓蛋白的形成，該蛋白在其N末端帶有一段谷氨酰胺殘基。HD是常染色體遺傳疾病，其中突變HD基因的等位基因不穩(wěn)定并且CAG重復(fù)片段能夠增加或者減少。CAG重復(fù)片段的數(shù)量是疾病嚴(yán)重程度的主要決定因素(Butterworth et al.，1998)，其中35-39個重復(fù)片段與老年發(fā)作有關(guān)，40-50個重復(fù)片段與常見的成人發(fā)作有關(guān)，更多的重復(fù)片段與青少年發(fā)作有關(guān)(The Huntington' s Disease Collaborative Research Group,1993)。該疾病的流行率為每100，000名個體中有5-10例，在北美洲有約30，000名患病個體(Hersch and Rosas, 2008) 0臨床發(fā)作的平均年齡為約37歲(成人發(fā)作)，在發(fā)作后約10-15年，患者一般死于心臟衰竭或吸入性肺炎。導(dǎo)致成人發(fā)作HD的潛在過程被認(rèn)為在HD明確顯現(xiàn)之前10-20年就已經(jīng)起作用，并且通過運(yùn)動障礙的存在而在臨床上被診斷出來。從HD顯現(xiàn)前的前驅(qū)癥狀到診斷(表現(xiàn)出HD)的轉(zhuǎn)變可通過由PET和MRI檢測的紋狀體、大腦皮層和大腦白質(zhì)區(qū)域的進(jìn)行性神經(jīng)元代謝減退和神經(jīng)變性(神經(jīng)細(xì)胞喪失/腦萎縮 / 體積喪失)看出(Ciarmiello et al. ,2006 ；Harriset al.，1999)。在前驅(qū)階段，可見運(yùn)動技能、行為、代謝和心理區(qū)域的逐漸變化。HD被歸為運(yùn)動障礙，其在最早期的階段引起輕度運(yùn)動技能異常，包括躁動、眼睛運(yùn)動異常、反射亢進(jìn)、手指輕敲障礙、手迅速交替運(yùn)動和輕度構(gòu)音障礙(Aubeeluck and Wilson, 2008) 0在所述疾病的中期，非自主運(yùn)動異常變得更加顯著，包括舞蹈癥(快速不停的運(yùn)動)。自主運(yùn)動損傷將包括吞咽困難(吞咽)、構(gòu)音困難和步態(tài)障礙。在該疾病的末期，運(yùn)動徐緩、運(yùn)動功能減退、僵硬和肌張力障礙成為主導(dǎo)，并代替舞蹈癥運(yùn)動。到該階段， 很多HD患者還會由于運(yùn)動減少和吞咽食物困難而遭受肌肉萎縮、脫水和體重喪失，因此需要在護(hù)理者的幫助下更多地進(jìn)食、飲水和輔助運(yùn)動。非運(yùn)動癥狀也出現(xiàn)在HD中，包括在注意力、組織、空間感知和記憶技能方面的認(rèn)知缺陷(癡呆)，和非認(rèn)知精神病學(xué)缺陷，其包括抑郁(精力少、睡眠障礙)、人格改變(易怒、精力少、冷淡并快感缺失)和雙相型障礙(妄想、幻覺、偏執(zhí)狂)。
目前的治療集中在預(yù)防癥狀，包括抗精神病藥(氟哌丁苯、氯丙嗪、奧氮平)、 抗抑郁藥(氟西汀(fluoxetine)、鹽酸舍曲林(sertralinehydrochloride)、去甲替林
(nortriptyline))、鎮(zhèn)靜劑(苯并二氣$ (benzodiazepine)、中白羅西汀(paroxetine) >
文拉法新(venlafaxin), β阻滯劑)、情緒穩(wěn)定劑(鋰、丙戊酸鈉(valproate)、卡馬西平 (carbamazepine))和肉毒毒素(用于肌肉收縮和下頌咬緊)藥物。HD的神經(jīng)變性的一個標(biāo)志是大腦紋狀體區(qū)域的萎縮(Vonsattel et al.，1985)。 在紋狀體內(nèi)，被稱作中等多棘神經(jīng)元(medium spiny neuron)的特定神經(jīng)元群體最容易變性。這些神經(jīng)元是產(chǎn)生抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Y-氨基丁酸(GABA)的GABA能神經(jīng)元，從而負(fù)責(zé)控制身體、肢體和眼睛的運(yùn)動(Giland Rego，2008)。它們從黑質(zhì)致密帶和大腦皮層分別接受多巴胺能和谷氨酰胺能興奮輸入。因此認(rèn)為這些中等多棘神經(jīng)元抑制性輸入的神經(jīng)變性損傷導(dǎo)致了在HD患者中出現(xiàn)的不受控運(yùn)動。所述具有延伸的N-末端多谷氨酰胺尾的突變亨廷頓蛋白被認(rèn)為是所述神經(jīng)變性的主要原因。野生型亨廷頓蛋白的正常細(xì)胞功能仍不完全清楚，但是，似乎是通過各種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用參與多個細(xì)胞過程和途徑，所述蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用例如HAPl/ 動力蛋白激活蛋白(dynactin) (BDNF的膜泡運(yùn)輸)(Gauthier et al.，2004)、HIPl (細(xì)胞骨架和內(nèi)吞作用)(Kaltenbach et al. ,2007 ；Waelter et al.，2001)、HIP2 (遍在蛋白介導(dǎo)的由蛋白酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)降解)(de Pril et al.，2007)、GAPDH(糖酵解)(Kaltenbach et al.，2007)、PSD95(NMDA受體在突觸后膜上的錨定)(Sun et al.，2001)、細(xì)胞質(zhì)中 REST-NRSF轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(可使BDNF轉(zhuǎn)錄，神經(jīng)元細(xì)胞存活)(Zuccato et al.，2003)、 阻止胱天蛋白酶(caspase)』、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-8的活化(抗細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞存活)(Gil and Rego，2008)。然而，突變亨廷頓蛋白的毒性被認(rèn)為是通過導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙和細(xì)胞凋亡的亨廷頓蛋白功能的多重突變獲得和野生型喪失介導(dǎo)的。突變亨廷頓蛋白能夠阻斷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的錯誤折疊蛋白質(zhì)的遍在蛋白-蛋白酶體降解(Jana et al.，2001)。所述突變蛋白能夠通過與轉(zhuǎn)錄因子(例如，CBP、 CBP-TAFII130、Spl、NFkB)的異常相互作用不利地影響組蛋白乙?；娃D(zhuǎn)錄(Roze et al.，2008)。它不再結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的REST/NRSF抑制因子，導(dǎo)致BDNF (—種重要的神經(jīng)元存活因子)表達(dá)的抑制(Zuccato et al. ,2003)以及正常情況下受野生型亨廷頓蛋白抑制的胱天蛋白酶-8的活化(Gervais et al.，2002)。突變亨廷頓蛋白還能夠抑制PGC-I α的活性(Cui et al.，2006)，導(dǎo)致ROS-解毒酶轉(zhuǎn)錄和線粒體生物合成減少，這導(dǎo)致線粒體機(jī)能障礙(ATP減少、ROS氧化脅迫增加)。突變亨廷頓蛋白還干擾軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致突觸處的機(jī)能障礙。這包括不能與HAPl相互作用進(jìn)行軸突轉(zhuǎn)運(yùn)和排空參與膜泡再循環(huán)和受體內(nèi)吞作用的蛋白質(zhì)(例如，復(fù)蛋白II、 小突觸泡蛋白-2、Rab親和蛋白A) (Gil andRego, 2008)。突變亨廷頓蛋白和PSD-95之間缺乏相互作用(Sim et al. ,2001)導(dǎo)致NMDA(NR2B亞基)受體向突觸的轉(zhuǎn)運(yùn)增多，其通過過多Ca2+流和引發(fā)凋亡的線粒體機(jī)能障礙導(dǎo)致谷氨酰胺興奮性神經(jīng)毒性。興奮性毒性被多巴胺增強(qiáng)(Tang et al.，2007)，多巴胺是一種以高濃度存在于紋狀體中的神經(jīng)遞質(zhì)。目前沒有一種用于HD的療法能夠防止由神經(jīng)變性引起的HD發(fā)作或發(fā)展，它們僅暫時性地緩解該疾病的一些癥狀。由于沒有已經(jīng)證實(shí)的神經(jīng)保護(hù)性療法，目前進(jìn)行的藥物CN 102458454 A說明書3/18
研發(fā)指向各種類型的細(xì)胞機(jī)能障礙突變亨廷頓蛋白起因。這包括使用抗氧化劑(CoQIO、 乙基-EPA、肌酸、半胱胺、吲哚-3-丙酸、N-乙酰半胱氨酸)來防止線粒體機(jī)能障礙并且改善能量代謝，使用抗凋亡藥物來防止引發(fā)程序性細(xì)胞死亡(二甲胺四環(huán)素、牛熊去氧膽酸(tauroursodexoycholic acid)、甲醋唑胺(methazolamide)、胱天蛋白酶-6 抑制劑)， 阻斷谷氨酰胺興奮性毒性(二甲金剛烷(memantine)、瑞馬酰胺(remacemide))，穩(wěn)定線粒體(dimebon)，阻斷多巴胺的效應(yīng)(丁苯那嗪(tetrabenazine))，使用神經(jīng)營養(yǎng)因子來促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和存活(FGF2、神經(jīng)秩蛋白(Neurturin))，防止突變亨廷頓蛋白等位基因表達(dá) (RNAi，反義技術(shù))，增加例如BDNF的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以存活(半胱胺、HDAC抑制劑、氰肽氟苯胺(Citalopram))，誘導(dǎo)自體吞噬以清除亨廷頓蛋白聚集體(異搏定(verapamil)、 可樂定(clonidine)、雷帕霉素(rampamycin))或者使用恢復(fù)性干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段或其癥狀以及青少年亨廷頓病或其癥狀的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。在一方面，治療患有(a)亨廷頓病或其癥狀或(b)青少年亨廷頓病或其癥狀的方法包括給予所述患者治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。在一方面，所述組織激肽釋放酶可以分離形式、合成形式或重組形式的KLK1。在另一方面，分離的KLKl可以是人KLKl (SEQ ID NO :1)。在另一方面，分離的KLKl可以是阿拉伯狒狒(hamadryas baboon) KLKl (SEQ ID Ν0· 2)、食蟹猴(crab eating macaque) KLKl (SEQ ID NO. 3)、棉冠獠狨(cotton top tamarin) KLKl (SEQ ID NO. 4)、狗KLKl (SEQID NO. 5)、綿羊KLKl (SEQ ID NO. 6)、兔KLKl (SEQ ID NO. 7)、牛 KLKl (SEQ ID NO. 8)、馬 KLKl (SEQ ID NO. 9)或野豬(sus scrofa) KLKl (SEQ ID NO. 10)，或它們的變體或活性片段。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，組織激肽釋放酶或其變體或活性片段與可用于治療亨廷頓病或青少年亨廷頓病的第二種治療性化合物同時給予。另一方面，一種藥物組合物包含約1至約1000IU/天的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段和可藥用賦形劑，配制用于口服給藥。另一方面，一種藥物組合物包含約0. 001至約5000IU/劑量頻率的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段和可藥用賦形劑，配制用于鼻內(nèi)給藥。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含與佐劑結(jié)合的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，所述佐劑是乳化劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含與親脂微團(tuán)結(jié)合的組織激肽釋釋放酶或其變體或活性片段。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還包括用于治療亨廷頓病的第二種治療性化合物。本發(fā)明的另一個方面包括組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療(a)亨廷頓病或其癥狀，或(b)青少年亨廷頓病或其癥狀。本發(fā)明的另一個方面包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療以下疾病的用途(a)亨廷頓病或其癥狀，或(b)青少年亨廷頓病或其癥狀。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的使用還包括同時使用可用于治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段以及青少年亨廷頓病的第二種治療性化合物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述第二種治療性化合物可以是營養(yǎng)補(bǔ)劑、抗氧化劑、抗凋亡化合物、NDMA受體拮抗劑、線粒體穩(wěn)定劑、多巴胺阻斷劑、BDNF誘導(dǎo)劑、轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑、突變亨廷頓等位基因表達(dá)的阻斷劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、自體吞噬誘導(dǎo)劑或恢復(fù)性神經(jīng)干細(xì)胞治療、抗精神病藥、抗抑郁藥、鎮(zhèn)靜劑、情緒穩(wěn)定劑或肌肉松弛劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，營養(yǎng)補(bǔ)劑可以是CoQIO、乙基-EPA或肌酸。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，抗氧化劑可以是半胱胺、吲哚-3-丙酸、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽或布西拉明(bucillamine)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，抗凋亡化合物選自二甲胺四環(huán)素、牛熊去氧膽酸、 甲醋唑胺或胱天蛋白酶-6-抑制劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，NDMA受體拮抗劑可以是二甲金剛烷或瑞馬酰胺。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，線粒體穩(wěn)定劑可以是dimebon。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，多巴胺阻斷劑可以是丁苯那嗪。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，BDNF誘導(dǎo)劑可以是半胱胺或氰肽氟苯胺。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑可以是HDAC抑制劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，突變亨廷頓蛋白等位基因表達(dá)的阻斷劑可以是亨廷頓基因特異RNAi或反義分子。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)因子可以是FGF2或神經(jīng)秩蛋白。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，自體吞噬誘導(dǎo)劑可以是異搏定、可樂定或雷帕霉
ο在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可引入使分離的干細(xì)胞進(jìn)入大腦中的恢復(fù)性神經(jīng)干細(xì)胞治療。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，抗精神病藥可以是氟哌啶醇(haloperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)或奧蘭扎平(olanzapine)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，抗抑郁藥可以包括氟西汀、鹽酸舍曲林或去甲替林。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，鎮(zhèn)靜劑可以是苯并二氮罩、帕羅西汀、文拉法新或 β阻滯劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，情緒穩(wěn)定劑可以包括鋰、丙戊酸鈉和卡馬西平。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述肌肉松弛劑可以是肉毒毒素、安定(diaz印am)、噁唑甲苯醚(skelaxin)、卡立普多(cariosprodol)或環(huán)苯扎林 (eyelobenzaprine)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可鼻內(nèi)給予治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，治療有效劑量是約0. 001至約5000國際單位(IU)劑量頻率。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段可口服給予。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段可以是每天約0. 001至約1000IU。在另一個方面，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的用途可以是改善有需要的患者大腦的氧攝入。在另一個方面，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的用途可以是用于改善流向有需要的患者大腦的血流。在另一個方面，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的用途可以是用于改善有需要的患者大腦的葡萄糖攝入。在另一個方面，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的用途可以是用于改善有需要的患者大腦體積。在另一個方面，治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的用途可以是用于改善有需要的患者大腦中的細(xì)胞代謝。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段或青少年亨廷頓病的方法可通過使用標(biāo)準(zhǔn)化尺度來評估并監(jiān)測，所述標(biāo)準(zhǔn)化尺度包括統(tǒng)一亨廷頓病分級尺度(Unified Huntington' s Disease RatingScale, UHDRS)的總功能能力(Total Functional Capacity, TFC)部分禾口微型精神狀態(tài)測試(mini—mental state examination, MMSE)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)化尺度包括但不限于統(tǒng)一亨廷頓病分級尺度 (UHDRS)的總功能能力(TFC)部分和微型精神狀態(tài)測試(MMSE)或它們的結(jié)合。
具體實(shí)施例方式定義“組織激肽釋放酶”或“KLK1”是一種主要因其通過將激肽原切割為賴氨酰緩激肽(胰激肽)而控制高血壓的作用而為人所知的絲氨酸蛋白酶(Yousef and Diamandis, 2001)。盡管在所述KLK家族中有很多酶，但是本發(fā)明人相信，除了在高血壓調(diào)節(jié)方面為人所知的作用外，KLKl看起來是遍在或多目標(biāo)作用酶，并且因此可在專門治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段以及青少年亨廷頓病中起重要的作用。本文使用的術(shù)語“組織激肽釋放酶”與以下術(shù)語同義血管舒緩素(callicrein)、舒血管素(glumorin)、padreatin、 怕杜丁 (padutin)、月夷舒血管素(kallidinogenase) > bradykininogenase、月夷激月太釋方文 It (pancreatic kallikrein) > onokrein P> dilminal D、depot—Padutin、尿―月太釋方文 (urokallikrein)或尿激月太釋放Sl (urinary kallikrein)。 本文使用的術(shù)語“胰激肽”是指賴氨酰緩激肽。激肽釋放酶將激肽原切斷為胰激肽。胰激肽能夠活化緩激肽2受體。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案是人組織激肽釋放酶前體多肽(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(KLKl)或其變體或活性片段，并且具有以下序列(SEQ ID NO 1)NP_002248 GI :4504875 人(Homo sapiens)KLK1_ 人
1-18 信號肽19-24 前肽25-262 成熟肽MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFWSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDT
CV⑶SGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS (SEQ ID NO 1)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括阿拉伯狒狒(hamadryas baboon)組織激肽釋放酶 (腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID NO. 2)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有90% 的序列同一性Q2877 KLK1_PAPHAMWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHPQWVLTAAHCI⑶NYQLWLGRHNLFDDEDTAQFVHVSESFPHPCF匪SLLKNHTRQADEDYSHDLMLLRLTQPAEITDAVQVVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSYPDDLQCVDLKILPNDKCAKAHTQKVTEFMLCAGHLEGGKDTCVGDSGGPLTCDGVLQGVTSWGYIPCGSPNKPAVFVRVLSYVKWIEDTIAENS(SEQ ID NO 2)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括食蟹猴(crab eating macaque)組織激肽釋放酶 (腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID NO. 3)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有90% 的序列同一性Q07276-1 KLK1_MACFAMWFLVLCLALSLGGTGRAPPIQSRIVGGWECSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHPQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDEDTAQFVHVSESFPHPGF匪SLLKNHTRQADDYSHDLMLLRLTQPAEITDAVQVVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLEILPNDECAKAHTQKVTEFMLCAGHLEGGKDTCVGDSGGPLTCDGVLQGVTSWGYIPCGSPNKPAVFVKVLSYVKWIEDTIAENS(SEQ ID NO 3)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括棉冠獠狨(cotton top tamarin)組織激肽釋放酶 (腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID N0. 4)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有82% 的序列同一性Q9N1Q1_SAG0E MWFLVLCLALSLGGTGAVPPIQSRIVGGWDCKQHSQPWQAALYHYSTFQCGGVLVHPQWVLTAAHCISDHYQLWLGRHDLFENEDTAQFVFVSKSFPHPDFNMSLLKNHTRLPGEDYSHDLMLLQLKQPVQITDAVKVVELPTEGIEVGSTCLASGffGSIKPEKFSFPDILQCVDLKILPNDECDKAHAQKVTEFMLCAGPLKDGQDTCV⑶SGGPLTCDGVLQGIISWGYIPCGSPNKPSVFVRVLSYVKWIKDTIADNS (SEQ ID N0. 4)
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括狗組織激肽釋放酶(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID NO. 5)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有74%的序列同一性Q29474_CANFAMWFLVLCLALSLAGTGAAPPVQSRIIGGffDCTKNSQPffQAALYHYSKFQCGGVLVHPEWVVTAAHCINDNYQLWLGRYNLFEHEDTAQFVQVRESFPHPEFNLSLLKNHTRLPEEDYSHDIMLLRLAEPAQITDAVRVLDLPTQEPQVGSTCYASGWGSIEPDKFIYPDDLQCVDLELLSNDICANAHSQKVTEFMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLICDGVLQGITSWGHVPCGSPNMPAVYTKVISHLEWIKETMTANP (SEQ ID NO 5)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括綿羊組織激肽釋放酶-1 (SEQ IDN0. 6)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有72%的序列同一性A5A2L9_SHEEPMWFPVLCLALSLAGTGAVPPVQSRIVGGQECEKHSQPWQVAIYHFSTFQCGGVLVAPQWVLTAAHCKSENYQVWLGRHNLFEDEDTAQFAGVSEDFPNPGFNLSLLENHTRQPGEDYSHDLMLLRLQEPVQLTQDVQVLGLPTKEPQLGTTCYASGWGSVKPDEFSYPDDLQCVDLTLLPNEKCATAHPQEVTDCMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLICEGMLQGITSWGHIPCGTPNKPSVYTKVIVYLDWINKTMTDNP (SEQ ID NO 6)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括兔組織激肽釋放酶-1(SEQ ID N0.7)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有73%的序列同一性A5A2M0_RABITMWLPVLCLALSLGGTGAAPPLQSRIIGGffVCGKNSQPffQAALYHYSNFQCGGVLVHPQWVLTAAHCFSDNYQLWLGRHNLFEDEAEAQFIQVSGSFPHPRFNLSLLENQTRGPGEDYSHDLMLLKLARPVQLTNAVRVLELPTQEPQVGTSCLASGWGSITPIKFTYPDELQCVDLSILANSECDKAHAQMVTECMLCAGHLEGGRDTCV⑶SGGPLVCNNELQGITSWGHVPCGSPNKPAVFTKVLSYVEWIRNTIANNP (SEQ ID NO 7)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括牛腺激肽釋放酶-1前體(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID NO. 8)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有72%的序列同一性Q6H320_B0VINMWFPVLCLALSLAGTGAVFPIQSRIVGGQECEKHSQPWQVAIYHFSTFQCGGVLVAPQWVLTAAHCKSDNYQVWLGRHNLFEDEDTAQFAGVSEDFPNPGFNLSLLENHTRHPGEDYSHDLMLLRLQEPVQLTQNVQVLGLPTKEPQLGTTCYASGWGSVKPDEFSYPDDLQCVDLTLLPNEKCATAHPQEVTEWMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLICEGMLQGITSWGHIPCGTPNKPSVYTKVILYLDWINKTMTDNP (SEQ ID NO 8)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括馬腺激肽釋放酶-1前體(SEQ IDN0.9)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有70%的序列同一性Q6H322_H0RSE
MWLPVLCLALSLVGTGAAPPIQSRIIGGWECKNHSKPWQAAVYHYSSFQCGGVLVDPQWVLTAAHCKGDYYQIWLGRHNLFEDEDTAQFFLVAKSFPHPDF匪SLLENNNRLPGEDYSHDLMLLQVEQPDQITVAVQVLALPTQEPVLGSTCYASGWGSIEPDKFTYPDELRCVDLTLLSNDVCDNAHSQNVTEYMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLICDGVFQGVTSWGHIPCGRPNKPAVYTKLIPHVQWIQDTIAANP (SEQ ID NO :9)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括豬腺激肽釋放酶-1前體(SEQ ID NO. 10)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有67%的序列同一性NP_001001911 GI :50054435 野豬(Sus scrofa)1-17 信號肽18- 前肽25-263 成熟肽>gil50054435|ref|NP_001001911. 1|kallikrein 1 [Sus scrofa]MWSLVMRLALSLAGTGAAPPIQSRIIGGRECEKDSHPWQVAIYHYSSFQCGGVLVDPKWVLTAAHCKNDNYQVWLGRHNLFENEVTAQFFGVTADFPHPGFNLSLLKNHTKADGKDYSHDLMLLRLQSPAKITDAVKVLELPTQEPELGSTCQASGffGSIEPGPDDFEFPDEIQCVELTLLQNTFCADAHPDKVTESMLCAGYLPGGKDTCMGDSGGPLICNGMWQGITSWGHTPCGSANKPSIYTKLIFYLDWINDTITENP (SEQ ID NO :10)術(shù)語“活性片段”是指保留有全長KLKl多肽活性的KLKl多肽或KLKl多肽變體的較小部分。初始或參考多肽的“變體”或“突變體”是具有以下性質(zhì)的多肽1)其氨基酸序列不同于所述初始或參考多肽的氨基酸序列，并且幻其通過天然或人工(人為的)突變從所述初始或參考多肽衍生而來。這樣的變體包括，例如從目標(biāo)多肽的氨基酸序列中缺失和/ 或插入和/或取代殘基。本文中變體氨基酸是指與初始或參考多肽序列(例如源抗體或抗原結(jié)合片段的序列)的相應(yīng)位置上的氨基酸不同的氨基酸?？梢灾圃烊笔А⒉迦牒腿〈娜魏谓Y(jié)合來實(shí)現(xiàn)最終的變體或突變體構(gòu)建體，條件是所述最終的構(gòu)建體具有所需要的功能特點(diǎn)。所述氨基酸變化還可以改變所述多肽的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。美國專利No. 5，534，615描述了產(chǎn)生多肽的氨基酸序列變體的方法，其以引用的方式明確地納入本文?！耙吧?，，或“參考，，序列或者“野生型”或“參考”蛋白質(zhì)/多肽的序列可以是通過引入突變而從中衍生出變體多肽的參考序列。總之，給定蛋白質(zhì)的“野生型”序列是自然界中最常見的序列。類似地，“野生型”基因序列是自然界中最常見的該基因的序列?？赏ㄟ^天然方法或通過人工誘導(dǎo)方法將突變引入“野生型”基因(從而引入其編碼的蛋白質(zhì))。 這樣的方法的產(chǎn)物是原始“野生型”蛋白質(zhì)或基因的“變體”或“突變體”。對于本文中指出的多肽“百分比(％ )氨基酸序列同一性”被定義為在比對候選序列和參考序列并——如果必要的話——引入空位以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，并且不將任何保守取代考慮為序列同一性的一部分的情況下，所述候選序列中與所述參考序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)中的各種方法來實(shí)現(xiàn)以確定百分比氨基酸序列同一性為目的的比對，所述方法例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定度量比對的合適參數(shù)，包括在被比對序列的全長中實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任何算法。ALIGN-2程序可通過加利福尼亞南圣弗朗西斯科的Genentech公司公開獲得。對于本文目的，給定氨基酸序列A對于、與或相對給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其還能夠被表述為對于、與或相對給定氨基酸B具有或包括某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)計(jì)算如下100X 分?jǐn)?shù) X/Y，其中X是在A和B的程序比對中由序列比對程序計(jì)為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，并且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)理解當(dāng)氨基酸序列A的氨基酸長度不等于氨基酸序列B的長度時，A對B的％氨基酸序列同一性會不等于B對A的％氨基酸序列同一性?！鞍俜直?％ )核酸序列同一性”被定義為在比對候選序列和參考多肽編碼核酸序列并——如果必要的話——引入空位以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，所述候選序列中與所述參考多肽編碼核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)中的各種方法來實(shí)現(xiàn)以確定百分比核酸序列同一性為目的的比對，所述方法例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或 Megalign(DNASTAR)軟件?？赏ㄟ^已知方法確定度量比對的合適參數(shù)，包括在被比對序列的全長中實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任何算法。對于本文目的，給定核酸序列C對于、與或相對給定核酸序列D的％核酸序列同一性(其還能夠被表述為對于、與或相對給定核酸序列D具有或包括一定％核酸序列同一性的給定核酸序列C)計(jì)算如下100X 分?jǐn)?shù) W/Z，其中W是在C和D的程序比對中由序列比對程序計(jì)為相同匹配的核苷酸的數(shù)目， 并且其中Z是D中核苷酸的總數(shù)。應(yīng)理解當(dāng)核酸序列C的氨基酸長度不等于核酸序列D的長度時，C對D的％核酸序列同一性會不等于與D對C的％核酸序列同一性。應(yīng)理解在本領(lǐng)域中，相似序列經(jīng)常會有相似功能。例如，全長與另一序列具有80%同一性的序列經(jīng)常與所述另一序列具有相似的功能。術(shù)語“氨基酸”以其最廣義含義使用，意欲包括天然存在的La -氨基酸或殘基。本文使用常用的天然存在氨基酸的單字母或三字母縮寫(Lehninger，A.L. , Biochemistry, 2d ed.，pp. 71-92，(1975)，WorthPublishers, New York)。所述術(shù)語還包括所有 D-氨基酸以及化學(xué)修飾的氨基酸，例如氨基酸類似物，天然存在的但通常不被納入蛋白質(zhì)的氨基酸，例如正亮氨酸，以及具有本領(lǐng)域已知為氨基酸所特有性質(zhì)的化學(xué)合成化合物。例如，氨基酸的定義包括苯丙氨酸或脯氨酸的類似物或模擬物，其可使肽化合物具有與天然Phe或Pro相同構(gòu)象限制。這樣的類似物或模擬物在本文中被稱為氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其他實(shí)例由 Roberts 禾口 Vellaccio 在 The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, Gross andMeiehofer, Eds. , Vol. 5p 341，Academic Press, Inc,N. Y. 1983 中列出，其以引用方式納入本文?！岸嚯摹被颉暗鞍踪|(zhì)”是指含有兩個或多個由肽鍵連接的氨基酸的肽或蛋白質(zhì)，并且包括肽、寡聚體和蛋白質(zhì)等。多肽可包含天然的、修飾的或合成的氨基酸。多肽還可以通過天然方式修飾，例如通過翻譯后加工，或者通過化學(xué)方法修飾，例如酰胺化酰化作用、交聯(lián)等。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于抗體、酶、凝集素和受體；脂蛋白和脂多肽；以及糖蛋白和糖多肽?！叭诤系鞍住焙汀叭诤隙嚯摹笔侵妇哂泄矁r(jià)連接在一起的兩個部分的多肽，其中每個部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物學(xué)特性，例如在體外或在體內(nèi)的活性。所述特性還可以是簡單的化學(xué)或物理特性，例如與目的抗原的結(jié)合、對反應(yīng)的催化等。所述兩個部分可通過單個肽鍵直接連接或者通過包含一個或多個氨基酸殘基的肽連接物連接。所述兩個部分和所述連接物一般會互相處于閱讀框中。所述多肽的兩個部分優(yōu)選來自異源或不同的多肽。術(shù)語“治療有效量”是指能夠有效“減輕”或“治療”受試者或哺乳動物的疾病或障礙的本發(fā)明組合物的量。總的來說，減輕或治療疾病或障礙涉及減少與所述疾病或障礙相關(guān)的一個或多個癥狀或醫(yī)學(xué)問題。在一些實(shí)施方案中，它是能夠改善氧攝入、血流、葡萄糖攝入、其體積和細(xì)胞代謝混合物的量。術(shù)語“治療”是指抑制、減輕并治愈亨廷頓病，包括但不限于亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段、青少年亨廷頓病、以及它們的病癥和癥狀?！爸委煛笔侵钢委熜灾委?，其中目的是防止或減緩(減輕)所治療的病理性病癥或障礙。治療可通過給予治療有效量的至少一種本發(fā)明的化合物來進(jìn)行。術(shù)語“改善的氧攝入”是指增加向大腦和大腦細(xì)胞的氧運(yùn)輸，而術(shù)語“改善的血流” 是指增加循環(huán)通過大腦的血液體積。使用本領(lǐng)域建立的MRI和SPECT結(jié)合成像，可對前驅(qū) HD和HD患者的大腦的血流立體成像(Harris et al.，1999)。經(jīng)常使用Tc_99m HMPAO示蹤器來檢測腦血流。腦血流使得噴流發(fā)生處的周圍組織可攝入氧。在前驅(qū)HD和HD中，基底神經(jīng)節(jié)——其包括紋狀體(尾狀核和殼核)——內(nèi)的腦血流減少，從而氧攝入也減少。通過對亨廷頓病患者腦中血流和氧攝入不足的區(qū)域進(jìn)行定位，使用年齡匹配的非亨廷頓病患者作為對照，可在治療期間和之后評估改善情況。“增加”是指與患者治療前的血流或氧攝入相比，治療后所述患者血流或氧攝入更多。術(shù)語“改善的葡萄糖攝入”是指大腦利用來自血流的葡萄糖的能力增加。亨廷頓病的一個標(biāo)志是在例如但不限于皮層和基底神經(jīng)節(jié)的區(qū)域的葡萄糖攝入和代謝降低(代謝減退)。通過使用利用氟標(biāo)記的葡萄糖造影劑的腦PET成像(18F-FDG PET)確定疾病前驅(qū)階段和疾病發(fā)作的此標(biāo)記(Ciarmiello et al.，2006)。通過比較由此方法在治療前、期間和之后得到的圖像，同時使用年齡匹配的非亨廷頓病對照受試者，能夠評估之前表現(xiàn)出葡萄糖攝入減少的亨廷頓病患者腦區(qū)域葡萄糖攝入的改善情況。術(shù)語“改善的體積”是指由MRI測得腦體積增加。在亨廷頓病的前驅(qū)和疾病發(fā)作階段可見灰質(zhì)基底神經(jīng)節(jié)(包括紋狀體)、皮層和腦白質(zhì)的體積變化(減少)。通過與年齡匹配非HD對照受試者比較腦體積MRI掃描并且確定體積差異，可以測量HD患者的腦組織萎縮(Ciarmiello etal.，2006)。通過比較HD患者治療前后的MRI圖像，能夠評估一般由亨廷頓病引起減小的腦區(qū)域治療后體積的改善情況。術(shù)語“改善的細(xì)胞代謝”是指由MRS測量的代謝物比率水平的改變，其反映腦恢復(fù)至正常細(xì)胞代謝。某些代謝物比率是由異常代謝引起的神經(jīng)變性的標(biāo)志，包括HD患者紋狀體中下降的N-乙酰天冬氨酸(NAA)/肌酸比率、升高的膽堿/肌酸比率和升高的乳酸/肌酸比率(Jenkins et al.，1998)。通過檢測與非HD年齡匹配對照的正常比率水平相比較的HD患者的代謝物比率異常，可評估治療之前、期間和之后的比率改變。細(xì)胞代謝的改善可從代謝物比率恢復(fù)到接近正常水平或回到正常水平看出。術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)化尺度”是指評估患有亨廷頓病的個體的問卷和細(xì)目，包括但不限于 統(tǒng)一亨廷頓病分級尺度(UHDRS)的總功能能力(TFC)部分和微型精神狀態(tài)測試。本文使用的術(shù)語“統(tǒng)一亨廷頓病分級尺度(UHDRS)的總功能能力(TFC)部分”是指用于評估疾病進(jìn)展程度的尺度，其被表征為數(shù)值，分值為13表示正常程度的功能，而分值為0表示嚴(yán)重的殘障狀態(tài)(HuntmgtonStudy Group, 1996)。術(shù)語“微型精神狀態(tài)測試(MMSE) ”是指用于評估認(rèn)知損傷程度和測量認(rèn)知損傷隨時間變化的尺度，其被表征為數(shù)值。分值為30表示最高分和正常認(rèn)知，分值為O表示最低分和非常嚴(yán)重的認(rèn)知損傷(Folstem et al.，1975)。治療亨廷頓病的方法本發(fā)明包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段、青少年亨廷頓病、或其癥狀的用途。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，可將組織激肽釋放酶或其變體或活性片段與可用于治療亨廷頓病的第二種治療性化合物同時給予。可用于治療亨廷頓病的化合物的實(shí)例在下文詳細(xì)討論?？山?jīng)口腔，或者更優(yōu)選地鼻內(nèi)給予治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。給藥方法在下文進(jìn)一步詳細(xì)討論。本發(fā)明還提供組織激肽釋放酶或其變體或活性片段治療與亨廷頓病相關(guān)的病癥的用途，所述與亨廷頓病相關(guān)的病癥包括坐立不安的輕度運(yùn)動技能異常、異常眼球運(yùn)動、 反射亢進(jìn)、手指輕敲障礙、手迅速交替運(yùn)動和輕度構(gòu)音困難(說話)；非自主運(yùn)動異常，例如舞蹈癥(快速不停的運(yùn)動)、運(yùn)動徐緩、運(yùn)動功能減退、僵硬和肌張力障礙；自主運(yùn)動損傷， 例如吞咽困難(吞咽)、構(gòu)音困難和步態(tài)障礙；肌肉萎縮、脫水和體重喪失；非運(yùn)動癥狀在注意力、組織、空間感知和記憶技能方面的認(rèn)知缺陷(癡呆)，和抑郁(精力少，睡眠障礙)、 人格改變(易怒、精力少、冷淡并快感缺失)和雙相型障礙(妄想、幻覺、偏執(zhí)狂)的非認(rèn)知精神病學(xué)缺陷。亨廷頓病的前驅(qū)階段是在成人HD發(fā)作之前腦的紋狀體、大腦皮層和白質(zhì)的進(jìn)行性神經(jīng)代謝減退和神經(jīng)變性(神經(jīng)細(xì)胞喪失/腦萎縮/體積喪失)，其由PET和MRI檢測。 HD的前驅(qū)階段被認(rèn)為是成人發(fā)作之前10-20年的持續(xù)過程，可觀察到運(yùn)動技能、行為和心理方面逐漸變化。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療亨廷頓病的前驅(qū)階段的用途。青少年亨廷頓病被歸類為亨廷頓病出現(xiàn)時小于20歲的亨廷頓病。所述青少年型傾向于在突變HD基因中有50個或更多的CAG重復(fù)片段，重復(fù)片段的數(shù)目越多，疾病的發(fā)作越早。發(fā)作越早，出現(xiàn)僵硬的可能性就越大，顯示舞蹈運(yùn)動的可能性就越小。青少年亨廷頓病的獨(dú)特特征是癲癇發(fā)作傾向，其在成人發(fā)作HD中未見?；加性摷膊〉膬和瘯@示出行為和認(rèn)知功能方面的逐漸變化。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療青少年亨廷頓病的用途。亨廷頓病與因突變亨廷頓蛋白的表達(dá)引起的以下方面的腦特異性異常有關(guān)轉(zhuǎn)錄、BDNF存活信號傳導(dǎo)、遍在蛋白-蛋白酶體降解線粒體代謝和ROS解毒酶、軸突轉(zhuǎn)運(yùn)、谷氨酰胺-NMDA受體信號傳導(dǎo)和胱天蛋白酶活化。在表達(dá)具有150個CAG重復(fù)片段的人HD基因的N-末端片段的轉(zhuǎn)基因R6/2小鼠中，出現(xiàn)的神經(jīng)學(xué)癥狀類似于HD的很多癥狀，包括運(yùn)動協(xié)調(diào)下降、運(yùn)動活力改變、認(rèn)知行為受損、癲癇發(fā)作、腦紋狀體和皮層區(qū)域的顯著萎縮，其由神經(jīng)變性所致(Turmaine et al. ,2000 ；Zourlidouet al.，2007)。R6/2 小鼠表現(xiàn)出海馬齒狀回區(qū)域神經(jīng)發(fā)生受損(Phillips et al.，2005)，這樣神經(jīng)變性修復(fù)可能受損。神經(jīng)生長因子(NGF)是促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Frielingsdorf et al.，2007)。神經(jīng)發(fā)生的增加可導(dǎo)致神經(jīng)元遷移至腦的變性區(qū)域并修復(fù)損傷，并且逆轉(zhuǎn)萎縮，致使體積增加， 其可通過MRI掃描檢測。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于改善HD患者的腦體積的用途。亨廷頓病患者表現(xiàn)出在皮層和基底神經(jīng)節(jié)區(qū)域(包括紋狀體)中攝入葡萄糖的能力下降，并且可與在HD腦中檢測到的異常細(xì)胞代謝相關(guān)，所述異常細(xì)胞代謝包括N-乙酰天冬氨酸水平(NAA/肌酸比率)下降和膽堿水平(膽堿/肌酸比率)上升——兩者都是神經(jīng)變性的標(biāo)志——以及乳酸增多。突變亨廷頓蛋白引起的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致異常的細(xì)胞代謝，如喪失ROS解毒酶和線粒體生物發(fā)生，導(dǎo)致線粒體機(jī)能障礙。這導(dǎo)致能量ATP產(chǎn)生減少和對細(xì)胞的ROS氧化應(yīng)激增加。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括改善患者腦的葡萄糖攝入和細(xì)胞代謝的方法，包括給予治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括改善患者腦血流和/或氧攝入的方法，包括給予治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。組織激肽釋放酶的給藥治療腦疾患的常規(guī)給藥方式包括口服以及靜脈內(nèi)給藥途徑。這些方式并不總是理想的?；衔锏目诜o藥導(dǎo)致生物利用率有限(溶解性、第一輪肝臟降解、血腦屏障限制) 以及可能引起不利腸胃副作用的延時釋放問題。但是，組織激肽釋放酶(KLKl)似乎能夠穿過并且可能繞過血腦屏障從而對腦起作用。靜脈內(nèi)(i.V.)給藥需要受訓(xùn)醫(yī)療工作人員，這對于衛(wèi)生保健系統(tǒng)是耗費(fèi)時間并且昂貴的。它還引起患者順應(yīng)性問題。與靜脈內(nèi)給藥相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)包括注射部位的感染和對患者和給予藥劑的專業(yè)人員的安全問題。但是，在受控環(huán)境中，靜脈內(nèi)給藥可以是有效的。鼻內(nèi)給藥可使藥物“迅速作用”，因?yàn)樗幬锬軌蛞愿苯拥耐緩降竭_(dá)腦。鼻內(nèi)給藥是方便的，并且實(shí)際上會消除通過靜脈內(nèi)給藥所觀察到的患者順應(yīng)性問題。嗅上皮細(xì)胞是選擇透過性的。因此，通過鼻內(nèi)途徑，例如KLKl的蛋白質(zhì)可以穿過和繞過血腦屏障。因此， KLKl的鼻內(nèi)給藥可直接對腦起作用一一從而使外周作用最小化。這歸因于鼻通路上部嗅區(qū)的參與。鼻內(nèi)給藥的物質(zhì)在嗅區(qū)可行進(jìn)兩種可能的途徑——神經(jīng)元內(nèi)途徑和神經(jīng)元外途徑。神經(jīng)元內(nèi)途徑包括肽被攝入嗅神經(jīng)元內(nèi)，在此肽沿著軸突繞過血腦屏障。通過嗅區(qū)上皮細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞間隙是可使肽擴(kuò)散進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下隙的細(xì)胞外途徑。細(xì)胞外途徑是更優(yōu)選的，因?yàn)橥ㄏ蚰X更迅速，避免了神經(jīng)元內(nèi)途徑中涉及的蛋白水解降解(Born et al. ,Nat.Neurosci. 2002,5(6) :514-6)，并且可在腦的多個位點(diǎn)迅速引起生物學(xué)效應(yīng)(Throne et al.，2004)。鼻內(nèi)給藥相對口服給藥的優(yōu)點(diǎn)在于其能將KLKl更直接地遞送至需要作用的位點(diǎn) (腦)。本發(fā)明的藥物組合物可通過口服、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)給藥。適于鼻內(nèi)給藥的制劑包括軟膏劑、膏劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑、油劑等?？赏ㄟ^常規(guī)方法，例如用點(diǎn)滴器、移液管或噴霧器將溶液劑或懸浮劑直接施用于鼻腔。制劑可以以單劑量或多劑量的形式提供。對于點(diǎn)滴器或移液管的情況，這可以通過給予患者合適的、預(yù)定體積的溶液劑或懸浮劑來實(shí)現(xiàn)。噴霧器包括計(jì)量霧化噴射泵。氣霧制劑的活性成分可以提供于帶有合適噴射劑的加壓容器中，所述噴射劑包括但不限于含氯氟烴(CFC)、二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或者二氧化碳或其他合適氣體。氣霧劑還可包含表面活性劑，例如卵磷脂。藥物劑量可由計(jì)量閥控制?；蛘?， 活性成分可以以干粉的形式提供?；衔锏姆勰┗旌衔锟稍诤线m的粉末基質(zhì)中，所述粉末基質(zhì)例如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(例如羥基丙基甲基纖維素)和聚乙烯吡咯烷(PVP)。所述粉末載體可在鼻腔內(nèi)形成凝膠。所述粉末組合物可以以單位劑型存在，包括但不限于膠囊或藥包(例如明膠或可通過吸入器從中給予所述粉末的吸塑包裝)?？诜o藥包括溶液劑、片劑、緩釋膠囊、腸溶衣膠囊、口腔崩解片劑和糖漿的經(jīng)腸給藥。“有效量”或“治療有效量”是指無毒但足以提供所需效果的藥物或試劑的量。在結(jié)合治療中，結(jié)合物的一種組分的“有效量”是當(dāng)與所述結(jié)合物的其他組分結(jié)合使用時有效提供所需效果的所述化合物的量?！坝行А绷恳蚴茉囌叨?，取決于個體的年齡和一般情況、 一種或多種特定活性劑等。任一病例中的合適“有效”量可使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。用于治療上述疾病或其癥狀的本發(fā)明化合物的治療有效量可以在所述疾病或癥狀發(fā)作之前、同時或之后給予。本發(fā)明的化合物可在所述疾病或癥狀發(fā)作的同時給予。本文使用的“同時給予”和“同時給藥”包括混合地給予本發(fā)明多肽和另一種治療劑，例如以藥物組合物或溶液的形式；或者分開地給予上述藥物，例如相繼、同時或在不同時間給予各自的藥物組合物或溶液，但所述不同時間不能間隔太久，以致本發(fā)明的化合物和所述另一種治療劑不能夠相互作用并且不能給予較少劑量的所述活性成分。本發(fā)明的另一個方面包括本文描述的一種方法，其還包括同時給予可用于治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段、青少年亨廷頓病、或其癥狀的另外的治療性化合物。另外的亨廷頓病治療性化合物包括但不限于營養(yǎng)補(bǔ)劑、抗氧化劑、抗凋亡化合物、NDMA受體拮抗齊U、線粒體穩(wěn)定劑、多巴胺阻斷劑、BDNF誘導(dǎo)劑、轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑、突變亨廷頓蛋白等位基因表達(dá)阻斷劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、自體吞噬誘導(dǎo)劑或恢復(fù)性神經(jīng)干細(xì)胞治療。營養(yǎng)補(bǔ)劑可以是CoQIO、 乙基-EPA或肌酸；抗氧化劑可以是半胱胺、吲哚-3-丙酸、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽或布西拉明；抗凋亡化合物選自二甲胺四環(huán)素、牛熊去氧膽酸、甲醋唑胺或胱天蛋白酶-6-抑制劑；NDMA受體拮抗劑可以是二甲金剛烷或瑞馬酰胺；線粒體穩(wěn)定劑可以是dimebon ；多巴胺阻斷劑可以是丁苯那嗪；BDNF誘導(dǎo)劑可以是半胱胺或氰肽氟苯胺；轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑可以是 HDAC抑制劑；突變亨廷頓蛋白等位基因表達(dá)阻斷劑可以是亨廷頓基因特異RNAi或反義分子；神經(jīng)營養(yǎng)因子可以是FGF2或神經(jīng)秩蛋白；自體吞噬誘導(dǎo)劑可以是異搏定、可樂定或雷帕霉素；恢復(fù)性神經(jīng)干細(xì)胞治療可以向大腦中引入分離的干細(xì)胞；抗精神病藥可以是氟哌啶醇、氯丙嗪或奧蘭扎平；抗抑郁藥可以是氟西汀、鹽酸舍曲林或去甲替林；鎮(zhèn)靜劑可以是
苯并二氮罩、帕羅西汀、文拉法新或β阻滯劑；情緒穩(wěn)定劑可以是鋰、丙戊酸鈉和卡馬西
平；肌肉松弛劑可以是肉毒毒素。“治療”是指抑制和/或減輕疾病和相關(guān)癥狀以及治愈影響哺乳動物器官和組織的疾病或癥狀?！胺乐埂笔侵甘顾黾膊〔话l(fā)生?？蓪⒅委熡行Я康谋景l(fā)明的組合物在任何上述病癥出現(xiàn)之前、期間和之后給予患者。藥物組合物本發(fā)明提供包含組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的藥物組合物，其適于口服和鼻內(nèi)給藥，以治療亨廷頓病的前驅(qū)和成人發(fā)作階段、青少年亨廷頓病、及其癥狀。在一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含約0. 001至約1000國際單位(IU)/劑量頻率的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段和可藥用賦形劑，配制用于口服給藥。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的鼻內(nèi)劑量可以是約0. 001至100IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的鼻內(nèi)劑量可以是約0.001至10IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的鼻內(nèi)劑量可以是約0.01至10IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的鼻內(nèi)劑量可以是約0. 01至1IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的鼻內(nèi)劑量可以是約0. 1至 1IU。在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含約0. 001至約5000IU/劑量頻率的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段和可藥用賦形劑，配制用于鼻內(nèi)給藥。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的口服劑量為約0. 001至500IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的口服劑量為約0. 001至50IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的口服劑量為約 0. 01至50IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的口服劑量為約0. 01至5IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的口服劑量為約0. 1至5IU。組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的口服劑量為約0. 1至1IU。所述藥物組合物還可以包含可用于治療上文所述亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和成人發(fā)作階段或青少年亨廷頓病的第二種治療性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括可口服、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)給藥的制劑。適于鼻內(nèi)給藥的制劑包括粉末劑、顆粒劑、溶液劑、滴劑、軟膏劑、膏劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑、油劑等?？赏ㄟ^常規(guī)方法將本發(fā)明的溶液劑或懸浮劑直接施用于鼻腔，所述常規(guī)方法包括，例如，使用點(diǎn)滴器、移液管或噴霧器?？梢砸詥蝿┝炕蚨鄤┝啃问教峁┲苿?。溶液劑可以是無菌、等滲或低滲的，并且適于通過注射或其他方式給藥，并且可包含合適的佐劑、緩沖劑、防腐劑和鹽。例如鼻滴劑的溶液劑可包含抗氧化劑、緩沖劑等。藥物組合物的粉末或顆粒形式可與溶液結(jié)合，以及與稀釋劑、分散劑和/或表面活性劑結(jié)合。用于氣霧給藥的制劑包括為鼻內(nèi)給藥設(shè)計(jì)的制劑?；钚猿煞挚商峁┯诤泻线m噴射劑的加壓容器，所述噴射劑例如含氯氟烴(CFC)(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其他合適氣體。氣霧劑還可包含表面活性劑，例如卵磷脂。藥物劑量可由計(jì)量閥控制?；蛘?，活性成分可以以干粉的形式提供，例如，在合適的粉末基質(zhì)中的所述化合物的粉末混合物，所述粉末基質(zhì)例如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(例如羥基丙基甲基纖維素)和聚乙烯吡咯烷(PVP)。所述粉末載體可在鼻腔內(nèi)形成凝膠。所述粉末組合物可以單位劑型存在，例如為由諸如明膠制成的膠囊或藥包，或者可借助某種裝置從中給予所述粉末的吸塑包裝。配制用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物包含約0. 001至約5000IU的KLKl或其變體或活性片段，可選地，還包含可藥用賦形劑。適于口服的制劑包括脂質(zhì)劑、丸劑、溶液劑、片劑、緩釋膠囊、腸溶衣膠囊或糖漿。配制用于口服給藥的藥物組合物包含約0.001至1000IU的 KLKl或其變體或活性片段，可選地還包含可藥用賦形劑?？捎糜诒莾?nèi)給藥的藥物組合物及其用涂本發(fā)明的一個方面包括配制用于鼻內(nèi)給藥的組合物，其包含約0. 001至約5000IU 的KLKl或其變體或活性片段，可選地還包含可藥用賦形劑?？蓪⒔M合物給至人或其他哺乳動物的鼻腔以通過嗅神經(jīng)途徑到達(dá)腦的患病區(qū)域。 所述方法可使用能夠?qū)LKl轉(zhuǎn)運(yùn)至腦的患病神經(jīng)元的藥物組合物。本發(fā)明的一種方法能夠通過跨神經(jīng)元逆向和順向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將化合物運(yùn)送至腦的患病區(qū)域。通過所述轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將神經(jīng)學(xué)試劑運(yùn)送至腦能夠以數(shù)種方式實(shí)現(xiàn)。一種技術(shù)包括將神經(jīng)學(xué)試劑單獨(dú)運(yùn)送至鼻腔。在這種情況下，KLKl的化學(xué)特性可便于其轉(zhuǎn)運(yùn)至腦的患病神經(jīng)元。嗅神經(jīng)途徑的周圍神經(jīng)細(xì)胞可被使用以將KLKl運(yùn)送至與嗅球連接的大腦區(qū)域的受損神經(jīng)元?？蓪LKl單獨(dú)或者與可用于治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和成人發(fā)作階段以及青少年亨廷頓病的第二種治療性化合物結(jié)合給至鼻腔?？蓪LKl與載體和/或其他佐劑結(jié)合以形成藥物組合物?？赡艿淖魟┌ǖ幌抻贕M-1、磷脂酰絲氨酸(PQ和例如聚山梨醇酯 80的乳化劑。其他的補(bǔ)充性物質(zhì)包括但不限于親脂性物質(zhì)，例如神經(jīng)節(jié)苷脂和磷脂酰絲氨酸(PS)。本發(fā)明的一種方法將KLKl運(yùn)送至哺乳動物的鼻腔。優(yōu)選將KLKl遞送至鼻腔內(nèi)上三分之一的嗅區(qū)，特別是嗅上皮，以促進(jìn)所述試劑被運(yùn)送至周圍嗅神經(jīng)元，而不是呼吸上皮的毛細(xì)血管。從而使KLKl通過神經(jīng)系統(tǒng)被運(yùn)送至腦和腦的受損神經(jīng)元。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，KLKl能夠與由親脂物質(zhì)構(gòu)成的微團(tuán)結(jié)合。這樣的微團(tuán)能夠改變鼻膜的透過性并且增強(qiáng)所述試劑的吸收。親脂微團(tuán)包括神經(jīng)節(jié)苷脂，尤其是 GM-I神經(jīng)節(jié)苷酯和磷脂酰絲氨酸(PS)。一旦KLKl穿過嗅上皮，本發(fā)明還提供KLKl沿著嗅神經(jīng)路徑的運(yùn)送。KLKl能夠在嗅系統(tǒng)中運(yùn)動。具體地，神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和神經(jīng)發(fā)生(neuritogenic)物質(zhì)已經(jīng)被證明容易進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞膜并且對神經(jīng)細(xì)胞受體部位有親和性。為向嗅神經(jīng)元遞送KLKl，可將KLKl單獨(dú)地或與其他物質(zhì)結(jié)合(作為藥物組合物) 給至位于鼻腔內(nèi)上部三分之一的嗅區(qū)。組合物可以以粉末或液體噴霧劑、鼻滴劑、凝膠劑或軟膏劑的形式通過軟管或?qū)Ч堋⑼ㄟ^注射器、通過packtail、通過拭子或者通過粘膜下層灌注來鼻內(nèi)給藥。用于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物可被配制為粉末劑、顆粒劑、溶液劑、軟膏劑、膏劑、氣霧劑、粉末劑或滴劑。溶液劑可以是無菌、等滲或低滲的，并適于通過注射或其他方式給藥。 除了 KLK1，溶液還可包含合適的佐劑、緩沖劑、防腐劑和鹽。粉末或顆粒形式的藥物組合物可與溶液結(jié)合，以及和稀釋劑、分散劑和/或表面活性劑結(jié)合。例如鼻滴劑的溶液可包含抗氧化劑、緩沖劑等。
嗅系統(tǒng)為外界環(huán)境和腦之間提供了直接的連接，從而提供了 KLKl的快速和容易的遞送，以治療亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和成人發(fā)作階段、青少年亨廷頓病和遺忘性輕度認(rèn)知損傷。此外，鼻內(nèi)施用藥物組合物的方式可以是多種形式的，例如粉末劑、噴霧劑或鼻滴劑， 其避免了靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射并且簡化了治療性藥劑的給藥。下面將參考多個具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)來描述本發(fā)明。但是，應(yīng)理解在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)可做出很多改變和修改。實(shí)施例實(shí)施例1 用KLKl治療后防止R6/2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的亨廷頓病給予KLKl改善了亨廷頓病(HD)的R6/2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的行為缺陷、體重喪失和存活。方法在所述實(shí)驗(yàn)中使用45只雄性和雌性R6/2轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠和15只雄性和雌性野生型同窩出生仔畜(Jackson Labs, USA) 0在標(biāo)準(zhǔn)溫度(22+1 °C )和光控環(huán)境(從上午7點(diǎn)至下午8點(diǎn)光照)下圈養(yǎng)動物，自由飲食。所述動物被分為以下處理組1)用PBS溶媒(Vehicle) (24 μ 1)以鼻內(nèi)給藥方式處理15只野生型同窩出生仔畜，從4周齡開始每天處理，持續(xù)至20周齡的終點(diǎn)。2)用PBS溶媒(Μμ )以鼻內(nèi)給藥方式處理15只R6/2TG小鼠，從4周齡開始每天處理，持續(xù)至20周齡的終點(diǎn)。3)用溶于M μ 1 PBS的5mg/ml KLKl以鼻內(nèi)給藥方式處理15只Re/^TG小鼠，從 4周齡開始每天處理，持續(xù)至20周齡的終點(diǎn)。4)用溶于M μ 1 PBS的50mg/ml KLKl以鼻內(nèi)給藥方式處理15只R6/2TG小鼠，從 4周齡開始每天處理，持續(xù)至20周齡的終點(diǎn)。每天監(jiān)測每只動物的一般健康狀態(tài)，如果動物的健康顯著惡化(包括在M小時的觀察期間沒有自發(fā)運(yùn)動并且不能飲食、大量出血、自發(fā)的炎癥、解剖結(jié)構(gòu)損毀(missing anatomy)、腫脹或腫瘤)，則將其處死。體重和存活在所述研究開始時G周齡)，測量并記錄體重，之后每周兩次直至20周齡所述研究結(jié)束為止。此外，每天兩次觀察小鼠的死亡情況并記錄結(jié)果。運(yùn)動技能測試旋轉(zhuǎn)杠通過將小鼠放置在旋轉(zhuǎn)杠(TSE Systems,Germany)上對所述動物進(jìn)行測試以評估運(yùn)動協(xié)調(diào)性。在4、6、8、10和12周齡時對每個小組進(jìn)行所述測試，并對小鼠進(jìn)行連續(xù)兩天的測試。首先將小鼠逐個放置在所述裝置上訓(xùn)練5分鐘，恒定速度4rpm。如果小鼠在訓(xùn)練時掉下所述旋轉(zhuǎn)杠，將其放回至所述杠直到5分鐘過去。所述訓(xùn)練時間之后將它們放回籠中休息1小時。休息1小時后，在所述旋轉(zhuǎn)杠裝置上逐個測試小鼠，在5分鐘內(nèi)加速(0-40rpm)， 測試兩次。每次測試之間間隔30分鐘的休息時間。每次小鼠從所述旋轉(zhuǎn)杠掉落時，記錄掉落的等待時間(latency)和掉落時旋轉(zhuǎn)杠的速度。握力對每個小組在4、6、8、10 和 12 周齡時使用 Ugo Basile machine (UgoBasile, Italy)進(jìn)行握力測量，一周一次。將小鼠放置在握力裝置上并強(qiáng)制其用前爪抓住小三角形手柄。接著，將測試的小鼠降至平臺，然后緩慢地通過尾巴拽離所述手柄直到所述測試小鼠放開其前爪抓住的所述手柄。重復(fù)該過程，對每只小鼠連續(xù)記錄5個分值。曠場測試對每個小組在4、6、8、10和12周齡時進(jìn)行曠場測試?；顒邮?MedAssociates Inc, St Albans5VT ；27x 27x 20.3cm)裝備有頂射束，將小鼠放在室內(nèi)中央，以5分鐘單元 (5-minute bin)記錄它們的行為15分鐘。以量度總運(yùn)動和后肢站立(rearing)頻率進(jìn)行定量分析。MRI 禾口 MRS 分析對所有小鼠在12周齡時在內(nèi)徑為30cm的水平4. 7T磁體(Magnex，Abington, UK)中進(jìn)行MRS和MRI分析，所述磁體裝備有Magnex梯度裝置(最大梯度場強(qiáng)170mT/m，孔 12. 5cm)，其聯(lián)接至 Varian UNIITIN0VA 儀表板(Varian, Inc.，Palo Alto, CA)，使用正交半卷線圈(線圈直徑16mm，HF成像LLC，Minneapolis,麗，USA)用于傳送和接收。將異氟醚麻醉的小鼠固定于頭固定架上并且以相對于梯度線圈的標(biāo)準(zhǔn)方向放置在所述磁體孔中。 對于腦、紋狀體和側(cè)腦室體積的測量，使用雙自旋回波序列獲取T2加權(quán)的多層(12-14連續(xù)層)圖像，絕熱重聚脈沖TR = 2s，TE = 65ms，矩陣尺度為256 X 128，F(xiàn)OV為20 * 20mm2，切片厚為0. 7mm，4張切片的厚度平均值。使用相同的試驗(yàn)設(shè)置收集IH-MRS數(shù)據(jù)。基于如上所述收集的T2加權(quán)圖像將 3X3X3mm3的體素(voxel)置于所述小鼠的紋狀體中。使用通過沿投影繪圖的快速自動填隙技術(shù)(Fast, Automatic ShimmingTechnique by Mapping Along Projections (FASTMAP)) 在所述體素中調(diào)整BO —致性。使用弛豫延遲時間(relaxation delay)優(yōu)化的可變功率射頻脈沖(VAPOR)壓制水信號來獲得Bl和Tl不靈敏性。與外容積壓制(outer volume suppression(OVS))結(jié)合的短回波時間STEAM序列(TE = 2，TM = 30ms)被用于預(yù)定位。 使用三個OVS塊(block)，插入有水壓制脈沖。通過平均256激發(fā)來收集數(shù)據(jù)，TR為4s，點(diǎn)數(shù)為2048，譜寬為2kHz。另外，使用相同的采集參數(shù)從同樣的體素中收集沒有水壓制的參考譜。使用LC-模型來分析主要代謝物(NAA，Cho, Tau, m-INS, Glu, Gin, GABA, Cr，PCr和 GIx)的峰面積并給出絕對值形式的結(jié)果。神經(jīng)發(fā)生為了檢測神經(jīng)發(fā)生，重復(fù)給予細(xì)胞增殖特異標(biāo)志5-溴脫氧尿苷(BrdU，Sigma)(溶于鹽水中的50mg/kg BrdU, i. p.，5ml/kg)。在18周開始BrdU注射，每天一次持續(xù)14天 (直到20周的終點(diǎn))。在20周齡時，處死所有組中的小鼠，從頭骨中取出大腦。通過浸漬于含4% PFA 的磷酸鹽緩沖液中M小時固定右腦半球。在30%蔗糖中冷凍保護(hù)2-3天并在液氮中凍結(jié)后，將所述右腦半球用恒冷箱切片機(jī)(Microm)切為20 μ m厚的冠狀位冷凍切片并收集在 SuperFrost Plus載玻片上。從背海馬平面開始收集4個玻片。所述海馬切片覆蓋齒狀回和腦室下區(qū)(SVZ)。使用標(biāo)準(zhǔn)IHC法進(jìn)行抗-BrdU免疫組織化學(xué)。簡要地，通過在0. IM PBS中孵育5分鐘將所述切片重水化，并用2XSSC/50%甲酰胺在65°C處理2小時，之后在 2 X SSC中孵育5分鐘，在2M HCl中孵育30分鐘，并在0. IM硼酸鹽緩沖液中孵育30分鐘以暴露抗原。用0. IMPBS沖洗后，通過在含0. 3% H2O2的甲醇中孵育來阻斷內(nèi)源過氧化物
酶的活性。用含有0.05% Tween -20的o. IM PBS(pbst)沖洗3次(每次5分鐘)之后，用含10% NHS的PBST在室溫下封閉所述切片30分鐘。將所述切片沖洗并在室溫下在一抗(抗-BrdU)溶液(以1 300稀釋于含5%正常馬血清(MB)的PBST)中孵育過夜。在 PBST中沖洗3次(每次5分鐘)后，將所述切片在室溫下在二抗溶液(生物素化馬抗小鼠 IgG,l 200溶于5% NHS)中孵育2小時。將所述切片沖洗，之后在室溫下以親和素-生物素HRP復(fù)合物(Vector Vectastain ELITE試劑盒)孵育2小時。使用Ni-增強(qiáng)的DAB 作為底物可視化所述免疫反應(yīng)(Vector DAB試劑盒)。使用無偏體視分析(unbiased stereologic analysis)來計(jì)數(shù)BrdU免疫陽性細(xì)胞總數(shù)。使用CFI Plan Achro 4X物鏡來顯示指定的區(qū)域。使用配有3-芯片C⑶彩色攝影機(jī)和LEP電動載物臺(0. l-ym分辨率的3軸向計(jì)算機(jī)控制步進(jìn)電動機(jī)系統(tǒng))的 Eclipse E600 顯微鏡上的 CFI PlanAchro 100X 油浸物鏡(N. Α. 1. 30，W. D. 0. 20)來進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用 StereoInvestigator 7 軟件，光分級法(the optical fractionator method) (MicroBrightField, Colchester, VT)來估計(jì)總細(xì)胞數(shù)。所述軟件隨機(jī)覆蓋所畫出輪廓上面的14，400 μ m2(海馬)和8100 μ m2 (SVZ)的采樣網(wǎng)格區(qū)。用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)框架是 900μπι2。固定的切片的平均厚度為20 μ m。ζ維度上計(jì)數(shù)框架頂部的平面被設(shè)置為距離切片(觀察區(qū))的表面5 μ m。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)是BrdU陽性細(xì)胞核的頂部進(jìn)入析像器(dissector) 高度內(nèi)的焦距。結(jié)果存活。用KLKl治療延長了第3組和第4組小鼠的存活時間。與未處理的第2組相比，所述兩個小組在存活時間上顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加。運(yùn)動表現(xiàn)。第3組和第4組的運(yùn)動表現(xiàn)有改善，因?yàn)樵贙LKl處理的小組中從旋轉(zhuǎn)杠上掉落的等待時間增加。與第2組相比，第3組和第4組中掉落等待時間的改善是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。與未處理的第2組相比，第3組和第4組還表現(xiàn)出握力(以kg為單位測量的峰張力)增強(qiáng)，其是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。在曠場測試中，與第2組相比，第3組和第4組顯示出總運(yùn)動和后肢站立頻率分值增加。用KLKl治療的小鼠的這種增加被發(fā)現(xiàn)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。腦體積和代謝。與未處理的第2組相比，第3組和第4組顯示出腦體積顯著增加 (由MRI測量)。這表明KLKl治療幫助防止R6/2HD轉(zhuǎn)基因模型中出現(xiàn)的例如腦的紋狀體和皮層區(qū)域的腦萎縮。此外，與第2組相比，通過MRS的分析顯示用KLKl治療的第3組和第4 組小鼠中的細(xì)胞代謝有改善。所述差異是顯著的，因?yàn)榈?組和第4組比未處理的第2組更接近對照第1組中的正常NAA/肌酸水平，表明第3組和第4組中的細(xì)胞代謝有改善。該結(jié)果有助于解釋通過MRI研究看到的腦體積增加，因?yàn)槿绺纳频腘AA/肌酸比例所標(biāo)識的， 神經(jīng)變性有所減少。神經(jīng)發(fā)生與未處理的第2組相比，第3組和第4組在海馬齒狀回和腦下室(SVZ)區(qū)域中的 BrdU陽性細(xì)胞有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增多。該結(jié)果表明KLKl治療刺激神經(jīng)發(fā)生，因此幫助對抗可見于R6/2模型中的隨時間的神經(jīng)變性。
權(quán)利要求
1.一種治療亨廷頓病或其癥狀或者青少年亨廷頓病或其癥狀的方法，包括給予組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療是對亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段或其癥狀的治療。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法，其中所述組織激肽釋放酶是人KLKl(SEQ ID NO :1)。
4.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法，其中所述組織激肽釋放酶是阿拉伯狒狒(hamadryas baboon) KLKl (SEQ ID NO. 2)、食蟹猴(crab eatingmacaque) KLKl (SEQ ID NO. 3)、棉冠獠狨(cotton top tamarin) KLKl (SEQ ID NO. 4)、狗 KLKl (SEQ ID NO. 5)、綿羊 KLKl (SEQ ID NO. 6)、兔 KLKl (SEQ ID NO. 7)、牛 KIKl (SEQ ID NO. 8)、馬 KLKl (SEQ IDNO. 9)或豬(sus scrofa) KIKl (SEQ ID NO. 10)，或它們的變體或活性片段。
5.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法，其中所述組織激肽釋放酶、其變體或活性片段與人 KLKl (SEQ ID NO 1)具有 80% 的同一性。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述組織激肽釋放酶是分離形式、合成形式或重組形式的KLKl。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述組織激肽釋放酶與可用于治療亨廷頓病或青少年亨廷頓病的第二種治療性化合物同時給予。
8.一種治療亨廷頓病或其癥狀或者青少年亨廷頓病或其癥狀的方法，包括給予包含組織激肽釋放酶或其變體或活性片段和可藥用載體的組合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述治療是對亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作或其癥狀的治療。
10.權(quán)利要求8和9任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物組合物包含每天約1至約1000IU的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。
11.組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于制備治療青少年亨廷頓病或其癥狀或者亨廷頓病或其癥狀的藥物的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述亨廷頓病或其癥狀的治療是對亨廷頓病的前驅(qū)癥狀和發(fā)作階段或其癥狀的治療。
13.組織激肽釋放酶或其變體或活性片段用于治療亨廷頓病或其癥狀或者青少年亨廷頓病或其癥狀的用途。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的用途，其中所述組織激肽釋放酶是人KLKl(SEQ ID N01)。
15.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的用途，其中所述組織激肽釋放酶是阿拉伯狒狒KLKl(SEQ ID N0. 2)、食蟹猴 KLKl (SEQ ID N0. 3)、棉冠獠狨 KLKl (SEQ ID N0. 4)、狗 KLKl (SEQ ID N0. 5)、綿羊KLKl (SEQ IDN0. 6)、兔KLKl (SEQ ID N0. 7)、牛 KLKl (SEQ ID N0. 8)、馬 KLKl (SEQ ID N0. 9)或豬KLKl (SEQ ID NO. 10)，或它們的變體或活性片段。
16.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的用途，其中所述組織激肽釋放酶是分離形式、合成形式或重組形式的KLKl。
17.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的用途，其中所述組織激肽釋放酶、其變體或活性片段與人 KLKl (SEQ ID NO 1)具有 80% 的同一性。
18.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的用途，其中所述組織激肽釋放酶與可用于治療亨廷頓病或青少年亨廷頓病的第二種治療性化合物同時給予。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療亨廷頓病或其癥狀的前驅(qū)癥狀和成人發(fā)作階段和/或者青少年亨廷頓病或其癥狀的方法。本發(fā)明的方法包括給予治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段。本發(fā)明還涉及配制用于口服或鼻內(nèi)給藥的包含治療有效量的組織激肽釋放酶或其變體或活性片段的藥物組合物。
文檔編號A61K38/48GK102458454SQ201080027533
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者M·威廉姆斯, M·查爾斯 申請人:森諾姆尼有限公司