專利名稱：抗鈣粘著蛋白抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及識別鈣粘著蛋白的特定結構域，且具有高抗體依賴性細胞毒性的抗鈣粘著蛋白抗體。
背景技術：
癌癥是占據(jù)死亡原因的前位的重要疾病，但其治療需求尚未得到滿足。近年來，為了解決現(xiàn)有的化學療法對正常細胞也造成損害的問題，積極研究利用分子靶標藥的癌癥治療，該分子靶標藥是將癌細胞中特異性表達的特定分子作為靶標來設計藥物而進行治療。能成為對于癌癥的分子治療藥的靶標的分子可以列舉鈣粘著蛋白。鈣粘著蛋白是作為鈣依賴性地參與同種親和性的細胞粘著的分子而發(fā)現(xiàn)的膜蛋白質(zhì)(Yoshida andTakeichi, Cell 28:217-224，1982)。具有由相互同源性高的約110個氨基酸殘基組成的 丐粘著蛋白重復序列(ECs)的蛋白質(zhì)被稱為I丐粘著蛋白超豕族，其中存在120種以上的蛋白質(zhì)，它們對多細胞結構的維持發(fā)揮了重要的作用。報告了鈣粘著蛋白在癌細胞中表達升高的例子，研究了對于與正常組織相比癌組織中的鈣粘著蛋白的表達高的癌細胞，將使抗癌劑與識別鈣粘著蛋白的抗體結合的藥物、或具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity)的抗體用于癌癥的治療(W02002/097395號公報、W02007/102525號公報)。屬于鈣粘著蛋白超家族的蛋白質(zhì)根據(jù)其結構特征可以大體分類為1)經(jīng)典鈣粘著蛋白、2)橋粒鈣粘著蛋白、3)原鈣粘著蛋白、4)其他。作為鈣粘著蛋白超家族的主要成員的經(jīng)典鈣粘著蛋白的相互同源性高(圖I)。即，是形成二聚體的單次跨膜蛋白質(zhì)，具有在細胞外區(qū)域中的EC1-EC5的5個鈣粘著蛋白結構域及細胞內(nèi)結構域。經(jīng)由經(jīng)典鈣粘著蛋白的細胞粘著具有在同種細胞間粘著的特征，其通過細胞相互識別根據(jù)細胞種類而特異性地表達狀態(tài)不同的同種鈣粘著蛋白分子來進行。通過E-鈣粘著蛋白識別E-鈣粘著蛋白并與其結合，P-鈣粘著蛋白識別P-鈣粘著蛋白并與其結合的機制，同種細胞相互粘著(圖2)。鈣粘著蛋白相互的同種/異種的識別取決于位于細胞外結構域的N端的鈣粘著蛋白結構域 I(ECl) (Nose A.等人，Cell 61:147-155，1990)。Klingel 等人揭示，當人P-鈣粘著蛋白的氨基酸序列的第I位 第213位(序列編號2)替換人E-鈣粘著蛋白的對應的區(qū)域時，其不與E-鈣粘著蛋白結合，而與P-鈣粘著蛋白結合(Klingel H.等人，Jof Cell Science 113:2829-36，2000)。這樣可以認為，以E-鈣粘著蛋白、P-鈣粘著蛋白為代表的經(jīng)典鈣粘著蛋白通過相同的機制相互結合。近年來，作為分子靶標藥的許多癌癥治療用抗體藥物實際已上市并且正在提高治療效果?？贵w依賴性細胞毒性(ADCC)是作為已上市的抗癌劑的曲妥珠單抗(Trastuzumab)、利妥昔單抗(Rituximab)等的主要抗腫瘤機制,ADCC活性的增強關系到治療效果的提高、副作用的降低等。因此，正在進行探索ADCC活性更高的抗體的研究、及增強ADCC活性的技術的開發(fā)。例如正在開發(fā)去除與抗體的Fe部分結合的糖鏈的末端的巖藻糖的技術(W000/61739號公報)、通過置換Fe部分的氨基酸來提高與效應細胞的親和性并增強ADCC活性的技術(W02008/121160號公報)。如上所述，使用具有ADCC活性的抗體作為癌癥的治療藥的概念是公知的。但是，雖然存在關于結構域結構和包含P-鈣粘著蛋白的經(jīng)典鈣粘著蛋白的功能的關聯(lián)的報告，但并未暗示ADCC活性的強度與經(jīng)典鈣粘著蛋白的結構的關聯(lián)?，F(xiàn)有技術文獻 專利文獻
專利文獻I :W02002/097395號公報 專利文獻2 W02007/102525號公報 專利文獻3 W000/61739號公報專利文獻4 W02008/121160號公報 非專利文獻
非專利文獻 I Yoshida and Takeichi, Cell 28 :217-224, 1982
非專利文獻 2:Nose A.等人，Cell 61:147-155，1990
非專利文獻 3 :Klingel H.等人，J of Cell Science 113:2829-36，2000。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將提供具有高抗體依賴性細胞毒性的抗鈣粘著蛋白抗體作為應解決的課題。本發(fā)明者為了解決上述課題而進行深入研究，對P-鈣粘著蛋白抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，其具有根據(jù)ADCC活性的強弱而分為2群的傾向。因此，根據(jù)各抗體識別的區(qū)域而進行分類后，判明ADCC活性強的抗體以高概率識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一種。規(guī)定抗體的ADCC活性的要素可以列舉抗體的Fe部分對效應細胞的Fe受體的親和性、抗體對抗原的親和性、抗體識別的表位。為了發(fā)揮ADCC活性，必須使抗體與抗原結合，并使效應細胞的Fe受體與抗體的Fe部位結合，但是推定，由于抗體結合的CDH3的區(qū)域的差異，效應細胞與抗體的Fe部位的結合存在空間限制，并產(chǎn)生ADCC活性的差異。本發(fā)明是根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)而完成的。即，根據(jù)本發(fā)明，提供了以下發(fā)明。(I)抗鈣粘著蛋白抗體，其識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者隹丐粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一I丐粘著蛋白結構域,且抗體濃度為Iy g/mL時的抗體依賴性細胞毒性為30%以上。(2)根據(jù)⑴所述的抗體，其中鈣粘著蛋白為P-鈣粘著蛋白。(3)根據(jù)(I)或(2)所述的抗體，其是從將可溶型P-鈣粘著蛋白作為免疫原而給予的免疫動物取得的抗體產(chǎn)生細胞所產(chǎn)生的抗體。(4)根據(jù)⑴至(3)中任一項所述的抗體，其為單克隆抗體。(5)雜交瘤，其產(chǎn)生根據(jù)(4)所述的抗體。(6)細胞毒劑，其包含根據(jù)⑴至⑷中任一項所述的抗體。(7)根據(jù)(6)所述的細胞毒劑，其給予癌細胞。另外，本說明書中的ECl的上游區(qū)域表示E-鈣粘著蛋白、P-鈣粘著蛋白、N-鈣粘著蛋白的ECl的上游側(cè)24個氨基酸殘基的區(qū)域、以及其他的鈣粘著蛋白的對應區(qū)域。本發(fā)明的抗鈣粘著蛋白抗體的特征是識別鈣粘著蛋白的ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域，且具有高抗體依賴性細胞毒性。能夠發(fā)揮高細胞毒性的抗體用作用于制備修飾抗體、變異抗體的材料。另外，通過將本發(fā)明的抗鈣粘著蛋白抗體給予表達鈣粘著蛋白的癌癥，可以發(fā)揮以抗體依賴性細胞毒性為機制的抗癌作用。即，本發(fā)明的抗鈣粘著蛋白抗體用作抗癌劑。


圖I示出除了 E-鈣粘著蛋白(⑶HI)、N_鈣粘著蛋白(⑶H2)、P_鈣粘著蛋白(CDH3)的信號及前肽序列的成熟蛋白質(zhì)的序列。圖2示出屬于經(jīng)典鈣粘著蛋白家族的分子的粘著機制。
圖3示出使人CDH3強制表達細胞系和市售抗人CDH3抗體反應的流式細胞術的結果。A :CDH3強制表達CHO細胞、B =CHO細胞。a :抗CDH3抗體0. 01 u g/ml、b :抗CDH3抗體0. I u g/ml、c :抗 CDH3 抗體 I u g/ml。圖4示出3例取得抗體和各細胞系的典型的流式細胞術結果。A :⑶H3強制表達CHO細胞、B =CHO細胞、C :源自肺癌的細胞系NCI-H358。a :抗CDH3抗體0. 01 u g/ml、b :抗CDH3 抗體 0. I u g/ml、c :抗 CDH3 抗體 I u g/ml。圖5示出各抗體的ADCC活性。圖6示出⑶H3部分長度蛋白質(zhì)片段I 5與⑶H3細胞外區(qū)域的對應。圖7示出CDH3部分長度蛋白質(zhì)的表達結果。A :片段1、B :片段2、C :片段3、D 片段4、E:片段5。圖8示出⑶H3部分長度蛋白質(zhì)與各抗體通過蛋白質(zhì)印跡法的反應。A :片段1、B 片段2、C :片段3、D :片段4、E :片段5。圖9示出使用肽陣列的PPMX13的表位解析的結果。X軸的數(shù)值表示肽陣列的編號。A :PPMX13、B :無初次抗體。圖10示出各種腫瘤組織的⑶H3的mRNA的表達結果。A :正常組織、B :各種癌組織、C :胰腺癌分化度。圖11示出各種腫瘤組織中的⑶H3的表達結果。圖12示出在移植源自人肺癌的細胞系NCI-H351得到的異種移植物中，PPMX12產(chǎn)生抗體的抗腫瘤效果。圖13示出在移植源自人胰腺癌的細胞系PK-45P得到的異種移植物中，PPMX12產(chǎn)生抗體的抗腫瘤效果。圖14示出在移植源自人皮膚癌的細胞系A431得到的異種移植物中，PPMX12產(chǎn)生抗體的抗腫瘤效果。
具體實施例方式以下，更詳細地對本發(fā)明進行說明。本發(fā)明的抗體是特征為識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一I丐粘著蛋白結構域,且抗體濃度為lug/mL時的抗體依賴性細胞毒性為30%以上的抗鈣粘著蛋白抗體；是特征為識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域，且抗體濃度為0. I ii g/mL時的抗體依賴性細胞毒性為25%以上(例如強于PPMX5的活性)的抗鈣粘著蛋白抗體；或者是識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域，且ADCC的最大活性為35%以上(例如強于PPMX6的活性)的抗鈣粘著蛋白抗體。此處，ADCC的最大活性是指提高抗體濃度而ADCC活性的上升達到穩(wěn)定時的ADCC活性。本說明書中，P-鈣粘著蛋白、P-鈣粘著蛋白及N-鈣粘著蛋白的ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域I (ECl)、鈣粘著蛋白結構域2 (EC2)、鈣粘著蛋白結構域3 (EC3)、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)、鈣粘著蛋白結構域5(EC5)分別表示以下區(qū)域。另外，其他鈣粘著蛋白的對應的區(qū)域可以通過對由Genbank等得到的公知的I丐粘著蛋白蛋白質(zhì)的序列進行比較而確定。序列的比較可以使用公知的程序例如ClustalW2(Thompson JD等人，Nucleic Acids Research 22 (22) 3673-3680、1994)或者 ClustalX2 (Thompson JD 等人，Nucleic Acids Research 25 (24) 4876-4882，1997)等來進行。P-鈣粘著蛋白(CDH3)
ECl的上游區(qū)域序列編號2的氨基酸序列的第108位 第131位 鈣粘著蛋白結構域I (ECl):序列編號2的氨基酸序列的第132位 第236位 鈣粘著蛋白結構域2 (EC2):序列編號2的氨基酸序列的第237位 第348位 鈣粘著蛋白結構域3 (EC3):序列編號2的氨基酸序列的第349位 第461位 鈣粘著蛋白結構域4 (EC4):序列編號2的氨基酸序列的第462位 第550位 鈣粘著蛋白結構域5 (EC5):序列編號2的氨基酸序列的第551位 第654位。E-鈣粘著蛋白(CDHl)
ECl的上游區(qū)域序列編號4的氨基酸序列的第155位 第178位 鈣粘著蛋白結構域I (ECl):序列編號4的氨基酸序列的第179位 第283位 鈣粘著蛋白結構域2 (EC2):序列編號4的氨基酸序列的第284位 第395位 鈣粘著蛋白結構域3 (EC3):序列編號4的氨基酸序列的第396位 第507位 鈣粘著蛋白結構域4 (EC4):序列編號4的氨基酸序列的第508位 第597位 鈣粘著蛋白結構域5 (EC5):序列編號4的氨基酸序列的第598位 第704位。N-鈣粘著蛋白(CDH2)
ECl的上游區(qū)域序列編號6的氨基酸序列的第160位 第183位 鈣粘著蛋白結構域I (ECl):序列編號6的氨基酸序列的第184位 第288位 鈣粘著蛋白結構域2 (EC2):序列編號6的氨基酸序列的第289位 第402位 鈣粘著蛋白結構域3 (EC3):序列編號6的氨基酸序列的第403位 第518位 鈣粘著蛋白結構域4 (EC4):序列編號6的氨基酸序列的第519位 第607位 鈣粘著蛋白結構域5 (EC5):序列編號6的氨基酸序列的第608位 第719位?？贵w依賴性細胞毒性(ADCC活性)可以使用公知的方法測定。本說明書的ADCC活性的數(shù)值是指在與實施例4中的測定相同的條件下測定時的抗體依賴性細胞毒性。具體 地，如下所述。(I)效應細胞的制備從C3H/HeJ Jcl小鼠(8周齡、雄性、日本CLEA公司)的股骨采集骨髄細胞，將該細胞在含有 10%FBS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基中制備成 2 X IO6 個 /mL，在 50ng/mL 人 IL_2 (PEPROTECH公司)、10ng/mL小鼠GM-CSF (PEPROTECH公司)存在下培養(yǎng)6天。在測定當天回收細胞，使用含有10%FBS的HAM培養(yǎng)基清洗后，制成效應細胞溶液。(2)靶標細胞的制備
使用全長⑶H3表達CHO細胞(EXZ1501)作為靶標細胞。將細胞從板上剝離后，將其懸浮于含有10%FBS的HAM培養(yǎng)基中使其達到I X IO7個/mL，添加51Cr以達到終濃度150uCi，在5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)I. 5小時。將該細胞用培養(yǎng)基清洗2次后，添加含有10%FBS的HAM培養(yǎng)基，種植于96孔U形底板(NUNC公司)中使其達到I X IO4個/孔，制成靶標細胞。(3) ADCC活性的測定
在靶標細胞中以50 ii L/孔分開注入分別制備成0. 001 u g/mL、0. 01 u g/mL、0. I u g/mL、I u g/mL濃度的抗體溶液后,在室溫下溫育15分鐘，接著，分開注入100 u L效應細胞(IXlO5細胞/孔)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時?；厥张囵B(yǎng)上清液，利用閃爍計數(shù)器測定100 u L培養(yǎng)上清液中的放射活性。細胞毒性可以根據(jù)下式求出。
細胞毒性(%) = (A - C) / (B - C) X 100A :各抗體添加孔的放射活性值(cpm)
B :在靶標細胞中添加100 ii L的2%NP40溶液、50 u L含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基的孔的放射活性值(cpm)
C :在靶標細胞中添加包含效應細胞的150 y L含有10%FBS的培養(yǎng)基的孔的放射活性值(cpm)。本發(fā)明的抗體識別的鈣粘著蛋白的種類期望的是經(jīng)典鈣粘著蛋白。其例子可以列舉E-鈣粘著蛋白、N-鈣粘著蛋白、P-鈣粘著蛋白，但并不限定于這些。用以制備本發(fā)明的抗體的抗原可以使用鈣粘著蛋白或其部分肽。一個例子是可以使用可溶型CDH3蛋白質(zhì)等，但并不限定于此。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。本發(fā)明的抗體(多克隆抗體及單克隆抗體)可以通過各種方法中的任意一種來制造。這樣的抗體的制造法在本領域中為眾所周知[例如參照Sambrook, J等人，Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)]。(a)多克隆抗體的制備
為了制備多克隆抗體，將鈣粘著蛋白或作為其部分肽的ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域優(yōu)選地作為抗原，并將該抗原給予哺乳動物例如大鼠、小鼠、兔等。每只動物的抗原給予量在不使用佐劑時為0. Img lOOmg，在使用佐劑時為Iiig IOOii g。佐劑可以列舉弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要通過注入靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)等來進行。另外，免疫的間隔并無特別限定，以數(shù)天至數(shù)周間隔、優(yōu)選2周 5周間隔，進行I次 10次、優(yōu)選2次 5次免疫。然后，從最后的免疫日起6天 60天后，利用酶免疫測定法(ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)或EIA (酶免疫測定))、放射性免疫測定法(RIA ;放射免疫測定)等測定抗體效價，在顯示最大的抗體效價的當天采血，獲得抗血清。在需要從抗血清純化抗體時，可以通過適當選擇硫酸銨鹽析法、離子交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法等公知的方法或?qū)⑦@些方法加以組合而純化。(b)單克隆抗體的制備
為了制備單克隆抗體，首先，將鈣粘著蛋白或作為其部分肽的ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域優(yōu)選地作為抗原，并給予哺乳動物例如大鼠、小鼠、兔等。每只動物的抗原的給予量在不使用佐劑時為0. Img lOOmg，在使用佐劑時為Iii g IOOii g。佐劑可列舉弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要通過注入靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)來進行。另外，免疫的間隔并無特別限定，以數(shù)天至數(shù)周間隔、優(yōu)選2周 5周間隔，進行I次 10次、優(yōu)選2次 5次免疫。然后，從最后的免疫日起I天 60天后、優(yōu)選I天 14天后采集抗體產(chǎn)生細胞?？贵w產(chǎn)生細胞可列舉脾臟細胞、淋巴結細胞、末梢血細胞等，優(yōu)選脾臟細胞或局部淋巴結細胞。為了獲得細胞融合雜交瘤，進行抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合。與抗體 產(chǎn)生細胞融合的骨髓瘤細胞可以使用小鼠等動物的一般可得的確立細胞株。所使用的細胞系優(yōu)選具有藥物選擇性，并且具有在未融合的狀態(tài)下無法在HAT選擇培養(yǎng)基(包含次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中生存、而僅可在與抗體產(chǎn)生細胞融合的狀態(tài)下生存的性質(zhì)的細胞系。骨髓瘤細胞例如可以列舉？3乂634§.8.仍( 3仍)、吧-1等小鼠骨髓瘤細胞系。接著，使上述骨髓瘤細胞和抗體產(chǎn)生細胞進行細胞融合。細胞融合是在不含血清的DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基等動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，將IX IO6個/ml IX IO7個/ml的抗體產(chǎn)生細胞和2X IO5個/ml 2X IO6個/ml的骨髓瘤細胞混合(抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞的細胞比優(yōu)選為5 :1)，在細胞融合促進劑存在下進行融合反應。細胞融合促進劑可以使用平均分子量為1000道爾頓 6000道爾頓的聚乙二醇等。另外，也可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售細胞融合裝置使抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞融合。從細胞融合處理后的細胞挑選目標雜交瘤。挑選的方法是使用例如含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基等將細胞懸浮液適當稀釋后，在微量滴定板上以3X IO5個/孔左右在各孔中添加選擇培養(yǎng)基，以后適當?shù)馗鼡Q選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其結果是在使用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)開始后，可以獲得從14天前后繁殖的細胞作為雜交瘤。接著，在增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清液中，篩選是否存在目標抗體。雜交瘤的篩選根據(jù)通常的方法進行即可，并無特別限定。例如，可以采集繁殖為雜交瘤的孔中所含的培養(yǎng)上清液的一部分，利用酶免疫測定法、放射性免疫測定法等，篩選產(chǎn)生與鈣粘著蛋白的ECl的上游區(qū)域、EC4或者EC5結構域結合的抗體的雜交瘤。融合細胞的克隆可以利用限度稀釋法等來進行，最后確立作為單克隆抗體產(chǎn)生細胞的雜交瘤。從所確立的雜交瘤采集單克隆抗體的方法可以采用通常的細胞培養(yǎng)法或腹水采集法等。在細胞培養(yǎng)法中，將雜交瘤在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基等動物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在通常的培養(yǎng)條件(例如37°C、5%的CO2濃度)下培養(yǎng)7天 14天，并從其培養(yǎng)上清液取得抗體。在使用腹水采集法的情況下，在提供骨髓瘤細胞的哺乳動物和同種系動物的腹腔內(nèi)給予約I X IO7個雜交瘤，并使雜交瘤大量地增殖。接著，在I周 2周后采集腹水。在上述抗體的采集方法中需要抗體純化時，可以通過適當選擇硫酸銨鹽析法、離子交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法等公知的方法，或?qū)⑦@些方法加以組合來純化。本發(fā)明的抗體的種類并無特別限制，可以是小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、羊抗體、駱駝抗體、雞抗體等，或為了降低針對人的異種抗原性等而人為改變的基因重組型抗體例如嵌合抗體、人化抗體等的任意一種。基因重組型抗體可以使用已知的方法來制造。嵌合抗體是包含人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體，該抗體可以通過將編碼小鼠抗體的可變區(qū)的DNA和編碼人抗體的恒定區(qū)的DNA連接，并將該DNA整合入表達載體并導入宿主中而產(chǎn)生抗體來獲得。人化抗體是將人以外的哺乳動物例如小鼠抗體的互補性決定區(qū)(CDR)移植至人抗體的互補性決定區(qū)所得的抗體，其通常的基因重組方法也是已知的。具體而言，利用PCR法，由制備成末端部具有重疊的部分的多個寡核苷酸，合成設計為連接小鼠抗體的CDR和人抗體的骨架區(qū)(framework region ；FR)的DNA序列。將所得的DNA和編碼人抗體的恒定區(qū)的DNA連接，接著整合入表達載體，將表達載體導入宿主而產(chǎn)生抗體(EP239400號公報、國際公開W096/02576號公報等)。 另外，人抗體的取得方法也為已知。例如也可以使人淋巴細胞在體外通過所期望的抗原或者表達所期望的抗原的細胞致敏，使致敏淋巴細胞和人骨髓瘤細胞例如U266融合，獲得對抗原具有結合活性的所期望的人抗體(參照日本特公平1-59878)。另外，可以通過利用所期望的抗原對具有人抗體基因的全部組分的轉(zhuǎn)基因動物進行免疫，取得所期望的人抗體(參照 W093/12227、W092/03918、W094/02602、W094/25585、W096/34096、W096/33735)。而且，使用人抗體文庫，通過淘選而取得人抗體的技術也為已知。例如，可以將人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)通過噬菌體展示法在噬菌體的表面表達，選擇與抗原結合的噬菌體。如果解析所選擇的噬菌體的基因，則可以確定編碼與抗原結合的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果清楚了與抗原結合的scFv的DNA序列，則可以由該序列制備適當?shù)谋磉_載體而取得人抗體。這些方法已經(jīng)為眾所周知，可以參考W092/01047、W092/2079U W093/06213, W093/11236, W093/19172, W095/01438, W095/15388。另外，這些抗體只要不喪失作為識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域，且抗體濃度為I U g/mL時的抗體依賴性細胞毒性為30%以上，識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5(EC5)中的任一I丐粘著蛋白結構域,且抗體濃度為0. I ii g/mL時的抗體依賴性細胞毒性為25%以上(例如強于PPMX5的活性)的抗體，或者識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域，且ADCC的最大活性為35%以上(例如強于PPMX6的活性)的抗體的特性，則可以為一價抗體、二價抗體、多價抗體中的任一種抗體，也可以為抗體片段(fragment)等低分子化抗體或抗體的修飾物等。另外還可以為在抗體片段或低分子化抗體例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv(單鏈Fv)、雙抗體等中融合Fe部分而賦予ADCC活性的抗體。為了獲得這樣的抗體，構建編碼這些抗體的基因、將所構建的基因?qū)氡磉_載體后在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_即可?？贵w的修飾物也可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。另外，也可以在抗體中結合放射性同位素、化學治療劑等，特別地，放射性標記抗體是有用的。這樣的抗體修飾物可以通過對所得的抗體實施化學修飾而獲得。另外，抗體的修飾方法也為本領域技術人員所公知。
本發(fā)明的抗體由于表現(xiàn)出高抗體依賴性細胞毒性，所以可以作為細胞毒劑使用。本發(fā)明的細胞毒劑可以通過與例如表達鈣粘著蛋白的癌細胞接觸而傷害癌細胞。本發(fā)明的細胞毒劑中，除了本發(fā)明的抗體外，還可以根據(jù)需要適當含有藥學上所容許的載體、賦形劑、稀釋劑等。本發(fā)明的細胞毒劑例如可以制成注射劑。對于本發(fā)明的細胞毒劑的給予量，依賴于患者的癥狀的程度、年齡及體重、給予方法等，作為有效成分的抗體的重量通常在約IOng 約100mg/kg體重的范圍。通過以下的實施例更具體地對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不受實施例限定。實施例
實施例I :⑶H3表達CHO細胞系的確立 為了獲得抗CDH3抗體篩選用細胞系，進行表達全長CDH3的CHO細胞的確立。(I)⑶H3基因表達載體的制備
為了將序列編號I所示的全長人⑶H3DNA插入哺乳類表達載體pEF4/myc-HisB (Invitrogen 公司)，利用 2 種限制酶 Kpn I (Takara Bio 公司)及 Xba I (TakaraBio公司)將該DNA在37°C處理I小時后，利用T4 DNA連接酶(Promega公司)根據(jù)常用方法將該DNA插入利用相同的Kpn I及Xba I處理的pEF4/myC-HisB中，獲得表達載體pEF4-CDH3-myc-His。(2)⑶H3穩(wěn)定表達系的取得
根據(jù)FuGENE(注冊商標)6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics公司)的方案，在轉(zhuǎn)染前一天在尺寸IOcm皿中種植8X105個細胞的CHO細胞并培養(yǎng)一晚后，將g的表達載體 pEF4-CDH3-myc-His 和 16 y L 的 FuGENE6 試劑在 400 y L 的無血清 RPMI1640 培養(yǎng)基(SIGMA-ALDRICH公司)中混合并室溫放置15分鐘后，將其添加至細胞培養(yǎng)液中進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染第三天使用選擇試劑(Zeocin(注冊商標))通過限度稀釋法進行克隆。CDH3全長表達CHO的克隆分選通過使用抗c_Myc單克隆抗體(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY公司)的蛋白質(zhì)印跡法來進行，其結果是，獲得表達量高、且增殖良好的⑶H3全長表達CHO細胞系(EXZ1501)。使用市售抗⑶H3抗體(R & D SYSTEMS公司)并利用流式細胞術所測定的該細胞系的結果示于圖3中。實施例2 可溶型⑶H3抗原的制備
為了獲得制備抗CDH3抗體的免疫原，制備使C末端跨膜區(qū)域及其以后區(qū)域缺損的可溶型CDH3(sCDH3)蛋白質(zhì)。(I)可溶型⑶H3抗原表達載體的制備
將CDH3全長cDNA作為模板，使用設計為使相當于CDH3細胞外區(qū)域的部分(相當于序列編號2的1-654、以下為s⑶H3cDNA)擴增的正向引物(序列編號 7 :CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT、 (hCDH3FullFW))和反向引物(序列編號 8:CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC、 (hCDH3SolbRV))進行 PCR 反應。反應中使用KOD-Plus (東洋紡公司)，在94°C -15秒、55°C -30秒、68°C -90秒、30個循環(huán)的反應條件下進行。然后，通過瓊脂糖凝膠電泳切出包含作為目標尺寸的約2. Okbp的條帶的凝膠片段，使用QIA (注冊商標)快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN公司)，獲得目標sCDH3cDNA。為了將該sCDH3cDNA插入表達用載體pEF4/myc-HisB，使用2種限制酶KpnI及XbaI將該cDNA處理后，使用T4 DNA連接酶根據(jù)常用方法將該cDNA插入使用相同的KpnI及 XbaI 處理的 pEF4/myc_HisB 中，獲得表達載體 pEF4-sCDH3-myc_His。(2)可溶型⑶H3蛋白質(zhì)的表達
根據(jù)FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑的方案，在轉(zhuǎn)染前一天在尺寸IOcm的皿中種植8 X IO5個CHO細胞并培養(yǎng)一晚后，將8 ii g的表達載體pEF4-sCDH3-myc-His和16 y L的FuGENE6試劑于400 u L的無血清RPMI1640培養(yǎng)基中混合，室溫放置15分鐘后，將其添加于細胞培養(yǎng)液中進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染第三天使用選擇試劑(Zeocin)通過限度稀釋法進行克隆。可溶型⑶H3表達CHO細胞的分選通過使用抗c-Myc單克隆抗體(SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY公司)的蛋白質(zhì)印跡法來進行。選擇向培養(yǎng)上清液中的分泌量多且增殖良好的細胞系，結果獲得可溶型CDH3表達CHO細胞系(EXZ1702)。對于所選擇的可溶型CDH3表達CHO細胞系(EXZ1702)，使用3個培養(yǎng)面積為1，500cm2的滾瓶，在每個滾瓶的333mL無 血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM-II (Invitrogen公司)中培養(yǎng)72小時，并回收培養(yǎng)上清液。從所得的培養(yǎng)上清液中，通過利用HisTrap (注冊商標)HP柱(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)的親和色譜法和利用Superdex (注冊商標)200pg柱(GE HEALTHCARE BIO SCIENCES公司)的凝膠過濾色譜法，獲得可溶型CDH3蛋白質(zhì)。實施例3 抗⑶H3單克隆抗體的制備
(I)將可溶型CDH3蛋白質(zhì)作為免疫原的單克隆抗體的制備
通過將溶解于生理鹽水中的50ii g的可溶型⑶H3蛋白質(zhì)和Titer-MAX Gold(注冊商標)(TiterMax公司)等量混合，并注射至MRL/lpr小鼠(日本SLC株式會社)的腹腔內(nèi)及皮下而進行初次免疫。第2次及以后的免疫通過將同樣制備的相當于25 u g蛋白質(zhì)量的可溶型⑶H3蛋白質(zhì)和Titer-MAX Gold混合并注射至腹腔內(nèi)及皮下而實施。從最后免疫起3天后從小鼠無菌性地制備脾臟細胞，根據(jù)常用方法，通過聚乙二醇法進行與小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0-Agl4 或 P3-X63-Ag8. 653 的細胞融合。(2)抗⑶H3抗體產(chǎn)生雜交瘤的分選
抗⑶H3抗體的分選利用使用表達全長⑶H3的CHO細胞系(EXZ1501)的流式細胞術來進行。S卩，通過使用2mM的EDTA-PBS處理表達全長CDH3的CHO細胞系(EXZ1501)而將CHO細胞系從培養(yǎng)板剝離后，將CHO細胞系懸浮于FACS溶液中使其達到I X IO6個/mL。將該細胞懸浮液種植至96孔板中使其達到50 y L/孔，添加雜交瘤培養(yǎng)上清液在4°C下反應60分鐘，使用FACS溶液(200 y L/孔)清洗2次后，添加AlexaFluor488標記抗小鼠IgG山羊F(ab’)JInvitrogen公司)，在4°C下反應30分鐘。然后使用FACS溶液清洗2次后，實施流式細胞術，分選對CDH3表達CHO細胞見到強反應的雜交瘤。將由該雜交瘤獲得的抗體與⑶H3表達CHO細胞(EXZ1501)、作為親株的CHO細胞及確認CDH3為高表達的癌細胞NCI-H358的典型的反應結果示于圖4中。確認了所分選的所有雜交瘤與⑶H3表達CHO細胞(EXZ1501)及NCI-H358反應，而不與CHO細胞反應。實施例4 抗⑶H3抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性的測定
ADCC活性的測定是根據(jù)使經(jīng)放射性標記的靶標細胞在效應細胞存在下與抗體作用、測定其游離放射活性的方法。(I)效應細胞的制備從C3H/HeJ Jcl小鼠(8周齡、雄性、日本CLEA公司)的股骨采集骨髄細胞，將該細胞在含有 10%FBS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基中制備為 2 X IO6 個 /mL，在 50ng/mL 人 IL_2 (PEPROTECH公司)、10ng/mL小鼠GM-CSF (PEPROTECH公司)存在下培養(yǎng)6天。在測定當天回收細胞，使用含有10%FBS的HAM培養(yǎng)基清洗后，制成效應細胞溶液。(2)靶標細胞的制備
靶標細胞使用全長⑶H3表達CHO細胞(EXZ1501)。將細胞從板剝離后，將其懸浮于含有10%FBS的HAM培養(yǎng)基中使其達到I X IO7個/mL，添加51Cr以達到終濃度150uCi，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)I. 5小時。將該細胞用培養(yǎng)基清洗2次后，添加含有10%FBS的HAM培養(yǎng)基，種植于96孔U形底板(NUNC公司)中使其達到I X IO4個/孔，制成靶標細胞。(3) ADCC活性的測定在靶標細胞中以50 ii L/孔分開注入分別制備成0. 001 u g/mL、0. 01 u g/mL、0. I u g/mL、I u g/mL濃度的抗體溶液后,在室溫下溫育15分鐘，接著，分開注入100 u L效應細胞(IXlO5細胞/孔)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時?；厥张囵B(yǎng)上清液，利用閃爍計數(shù)器測定100 u L培養(yǎng)上清液中的放射活性。此時，根據(jù)下式求出細胞毒性。
細胞毒性(%) = (A - C) / (B - C) X 100A :各抗體添加孔的放射活性值(cpm)
B :在靶標細胞中添加100 ii L的2%NP40溶液、50 u L含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基的孔的放射活性值(cpm)
C :在靶標細胞中添加包含效應細胞的150 y L含有10%FBS的培養(yǎng)基的孔的放射活性值(cpm)。對試驗進行3次重復測定，由其平均值算出細胞毒性(%)。將試驗結果示于表I及圖5中。在具有ADCC活性的抗體中發(fā)現(xiàn)了具有特別強的活性的抗體群。將抗體濃度為I U g/mL時的ADCC活性為30%以上的抗體設為高ADCC活性群，將抗體濃度為I U g/mL時的ADCC活性小于30%的抗體設為低ADCC活性群。[表 I]
權利要求
1.抗鈣粘著蛋白抗體，其識別ECl的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5 (EC5)中的任一I丐粘著蛋白結構域,且抗體濃度為I y g/mL時的抗體依賴性細胞毒性為30%以上。
2.根據(jù)權利要求I所述的抗體，其中鈣粘著蛋白為P-鈣粘著蛋白。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的抗體，其為從將可溶型P-鈣粘著蛋白作為免疫原而給予的免疫動物取得的抗體產(chǎn)生細胞所產(chǎn)生的抗體。
4.根據(jù)權利要求I至3中任一項所述的抗體，其為單克隆抗體。
5.雜交瘤,其產(chǎn)生根據(jù)權利要求4所述的抗體。
6.細胞毒劑，其包含根據(jù)權利要求I至4中任一項所述的抗體。
7.根據(jù)權利要求6所述的細胞毒劑，其給予癌細胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供具有高抗體依賴性細胞毒性的抗鈣粘著蛋白抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供識別EC1的上游區(qū)域、鈣粘著蛋白結構域4(EC4)或者鈣粘著蛋白結構域5(EC5)中的任一鈣粘著蛋白結構域，且抗體濃度為1μg/mL時的抗體依賴性細胞毒性為30%以上的抗鈣粘著蛋白抗體。
文檔編號A61K39/395GK102753579SQ20108002818
公開日2012年10月24日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2009年5月1日
發(fā)明者大西浩史, 張黎臨, 油谷浩幸, 甲田克志, 石井敬介, 粥川容子, 勝見惠子, 阪本愛彌 申請人:國立大學法人東京大學, 株式會社英仙蛋白質(zhì)科學