專利名稱：包含晝夜節(jié)奏基因激活物和Sirt1基因激活物的協(xié)同組合的皮膚修復(fù)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在皮膚處理領(lǐng)域中。更具體而言，本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)皮膚細(xì)胞中的損傷DNA修復(fù)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
目前充分理解皮膚處于來自各種環(huán)境和生活方式因素的每日襲擊下。這些因素的短列舉包括UVA輻射、UVB輻射、污染、吸煙、飲食不良、休息不足和心理學(xué)應(yīng)激。這種襲擊表現(xiàn)為對(duì)皮膚細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的損傷。皮膚中的皺紋和褶皺在皮膚細(xì)胞損傷的較不嚴(yán)重后果中，而黑素瘤是更嚴(yán)重情況之一。DNA 損傷
某些環(huán)境和生活方式因素與皮膚細(xì)胞DNA和/或蛋白質(zhì)直接相互作用，以引起損傷，某些因素間接引起損傷，并且某些因素可以引起這兩種損傷。直接DNA損傷的一個(gè)例子將是當(dāng)皮膚細(xì)胞DNA吸收來自光譜的UVB部分的光子時(shí)。光子的吸收可以引起DNA序列中的突變。例如，所有黑素瘤發(fā)生中的約8%是由于直接DNA突變。對(duì)皮膚細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的間接損傷的一個(gè)例子在紫外線光子進(jìn)入皮膚且由生色團(tuán)吸收時(shí)可見。在激發(fā)狀態(tài)，生色團(tuán)進(jìn)入導(dǎo)致活性氧種類形成的反應(yīng)內(nèi)。例如，在人皮膚中，UVB暴露與過氧化氫的產(chǎn)生相關(guān)，而UVA與單線態(tài)氧的產(chǎn)生相關(guān)。如果皮膚不能通過中和活性種類維持穩(wěn)態(tài)，那么活性種類將通過氧化損傷皮膚細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)。對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的這種損傷稱為氧化性應(yīng)激且是皮膚衰老的主要原因。此外，所有黑素瘤發(fā)生中的約92 %是由于間接、氧化性DNA損傷。DNA損傷預(yù)防和謁制與修復(fù)比較
含DNA的皮膚細(xì)胞包括角化細(xì)胞干細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。估計(jì)單次日光灼傷導(dǎo)致無數(shù)DNA誘變堿基修飾，例如受累細(xì)胞中的T-T (硫胺素-硫胺素)二聚物；8_氧代-7，8- 二氫-2’ -脫氧鳥苷(8-氧代-DG) ；06MeG (06-甲基鳥嘌呤)；環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD);和6-4光產(chǎn)物(6-4PP)。這些突變觸發(fā)在皮膚細(xì)胞內(nèi)的各種應(yīng)答，這可以導(dǎo)致細(xì)胞的進(jìn)一步DNA損傷或凋亡的預(yù)防。例如，黑色素細(xì)胞中的黑色素產(chǎn)生已知通過UV輻射上調(diào)，作為防護(hù)措施。為了處理來自UV的威脅，黑色素通過下表皮中的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，并且在向外遷移的角化細(xì)胞的幫助下，它分布遍及上和下表面。在第一種情況下，黑色素看起來通過充當(dāng)UV濾器阻止進(jìn)一步的UV誘導(dǎo)DNA損傷，所述UV濾器限制穿透至下表皮的UV的量，黑色素細(xì)胞和角化細(xì)胞干細(xì)胞定位于所述下表皮。然而，作為第二線防御，通過誘導(dǎo)角化細(xì)胞的凋亡，黑色素含有由于UV輻射的DNA損傷。通過促進(jìn)凋亡，受損DNA得以包含，所述受損DNA具有傳遞給子細(xì)胞的較少機(jī)會(huì)(參見例如，Yamaguchi等人，Melanin mediated apoptosisof epidermal cells damaged by ultraviolet radiation: factors influencing theincidence of skin cancer Arch Dermatol Res. 2008 Apr ；300 Suppl I: S43-S50)。除預(yù)防和含有DNA損傷外，健康角化細(xì)胞和黑色素細(xì)胞具有用于修復(fù)DNA損害的天然內(nèi)部機(jī)制。這些機(jī)制不同于預(yù)防和遏制的那些機(jī)制，其涉及不同的(盡管有時(shí)重疊的)反應(yīng)級(jí)聯(lián)。本發(fā)明的組合物和方法最主要涉及DNA損傷的修復(fù)。存在細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，以修復(fù)來自各種原因的DNA損害，不僅是我們已討論的UV誘導(dǎo)的損傷。然而，DNA損害的修復(fù)花費(fèi)時(shí)間。例如,如果不通過外來影響加速,通過UVB暴露形成的TT 二聚物和6-4PP損傷的修復(fù)可以分別花費(fèi)高達(dá)48和8小時(shí)。由于UVA或UVB暴露、臭氧或吸煙和污染的8-氧代-dG和06MeG損害的修復(fù)可以花費(fèi)高 達(dá)2小時(shí)。理想地，DNA損害在細(xì)胞分裂發(fā)生前修復(fù)。如果不如此，那么優(yōu)選后果是凋亡。但如果DNA損傷碰巧不利地影響凋亡的上調(diào)，或如果突變變得未被檢測(cè)，那么受損DNA可以傳遞給下一代。本發(fā)明的組合物和方法最主要涉及在細(xì)胞分裂發(fā)生前使DNA損傷的修復(fù)達(dá)到最大。細(xì)胞的預(yù)防矛口{I條復(fù)梢‘吿1|受.晝夜節(jié)春餅KCircadian Clock)控吿l|
在正常條件下，包括DNA表達(dá)和修復(fù)的細(xì)胞功能不在隨機(jī)時(shí)間以等概率發(fā)生。相反，每種細(xì)胞具有約24小時(shí)(即晝夜節(jié)律)的內(nèi)源周期(或鐘)，并且細(xì)胞的活性受這種內(nèi)源周期調(diào)節(jié)。不存在某些外部刺激，每個(gè)細(xì)胞將根據(jù)其內(nèi)源性鐘自由運(yùn)行。然而，遍及全身的細(xì)胞的內(nèi)源性鐘是同步的。為了同步細(xì)胞與彼此和環(huán)境的活性，身體能夠接受來自環(huán)境的暗示。最顯著的環(huán)境暗示是日光的存在或不存在。因此，晝夜節(jié)奏周期由與太陽日的時(shí)期大致同時(shí)的亮和暗時(shí)期組成。目前理解晝夜節(jié)律允許細(xì)胞預(yù)期環(huán)境中可能影響細(xì)胞的改變，且以及時(shí)的方式適應(yīng)那些改變。只要細(xì)胞晝夜節(jié)律的遺傳機(jī)制適當(dāng)起作用，細(xì)胞就在對(duì)于細(xì)胞活力和/或穩(wěn)態(tài)最佳的時(shí)候以同步方式執(zhí)行其多種功能中的每一種。例如，當(dāng)日光接近時(shí)(但甚至是在皮膚處于來自UV的襲擊下之前)，某些基因激活以產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞不受預(yù)期UV輻射損傷的蛋白質(zhì)。隨后，當(dāng)日光減弱時(shí)，這些基因關(guān)閉。另一方面，晝夜節(jié)奏基因自身可以遭受通過環(huán)境因素的攻擊。對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的晝夜節(jié)律的一種或多種基因的損傷可以使細(xì)胞脫離與環(huán)境和其他細(xì)胞的同步。核心晝夜節(jié)春機(jī)制
轉(zhuǎn)錄因子是與特異性DNA序列結(jié)合，以控制遺傳信息從DNA到RNA的轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。核心晝夜節(jié)奏機(jī)制或“細(xì)胞鐘”包含參與異相、負(fù)和正反饋環(huán)的轉(zhuǎn)錄因子，這導(dǎo)致擺動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。在哺乳動(dòng)物的主要負(fù)反饋環(huán)中，CLOCK和BMALl轉(zhuǎn)錄因子的異二聚體激活perioi/(.per)和cryptochrome (cry)基因的轉(zhuǎn)錄。在人中，基因?qū)嶋H上是3種基因per\、per2和per >的家族，并且cry基因家族包括crjd和cry2。在其轉(zhuǎn)錄后，PER和CRY蛋白質(zhì)遷移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)且形成PER/CRY復(fù)合物。翻譯后調(diào)節(jié)產(chǎn)生故意延遲，這之后PER/CRY復(fù)合物再定位到細(xì)胞核內(nèi)。在核中PER和CRY的濃度在晝夜節(jié)奏日間結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，在這時(shí)CRY蛋白質(zhì)隨后作用于抑制CL0CK/BMAL1異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性。因此，CRY看起來關(guān)閉其自身轉(zhuǎn)錄。另一方面，在一個(gè)正反饋環(huán)中，在易位至核后，PER2看起來上調(diào)BMALl的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致和c/y基因的轉(zhuǎn)錄。此外，CL0CK/BMAL1 二聚體看起來上調(diào)renrA α和rora基因。Rora激活BMALl轉(zhuǎn)錄，而rev-erb α抑制CLOCK和BMALl。所謂的“規(guī)范時(shí)鐘基因” iclock、bmall、peri、per2、per >、cry I和c/y2)的峰活性是異相的,從而使得自我維持環(huán)產(chǎn)生，其具有約24小時(shí)的時(shí)期。細(xì)朐周期
細(xì)胞周期指在細(xì)胞中發(fā)生的系列事件，其導(dǎo)致細(xì)胞的分裂和復(fù)制。周期通常描述為需要約24小時(shí)完成的4個(gè)或5個(gè)序貫時(shí)期。在細(xì)胞周期的每個(gè)時(shí)期內(nèi)，存在確保給定時(shí)期的所有必要過程在下一個(gè)時(shí)期起始前完成的檢查點(diǎn)。在人細(xì)胞中，“第一個(gè)”時(shí)期是其中拷貝且合成細(xì)胞的DNA的合成(S)期。S期一般可以持續(xù)6-8小時(shí)。在持續(xù)3-4小時(shí)的G2期中，合成蛋白質(zhì)且細(xì)胞大小加倍。在有絲分裂(M)過程中，核被膜分解， 從而使得遺傳物質(zhì)的每個(gè)拷貝可以分離至細(xì)胞的相反極。在圍繞每組染色體的新核被膜形成后，細(xì)胞縮成2個(gè)(胞質(zhì)分裂)。M期約I小時(shí)長(zhǎng)。第四個(gè)和最長(zhǎng)的時(shí)期(6 - 12小時(shí))是G1，其特征在于RNA和蛋白質(zhì)合成。從Gl期開始，細(xì)胞可再次進(jìn)入S期或它可進(jìn)入GO期。在GO中，細(xì)胞是靜止的。GO可以持續(xù)數(shù)天或數(shù)年。干細(xì)胞可以從GO期返回，在Gl進(jìn)入。分化細(xì)胞一般不從GO返回。此外，具有受損DNA的細(xì)胞可以進(jìn)入G0，而不是凋亡。細(xì)胞周期檢杳點(diǎn)抑制受損DNA傳遞
在細(xì)胞分裂過程中，檢查點(diǎn)用于調(diào)節(jié)細(xì)胞通過細(xì)胞周期的進(jìn)展。檢查點(diǎn)阻止細(xì)胞進(jìn)展至下一個(gè)時(shí)期，直至所有必需過程完成，包括受損DNA的任何修復(fù)。以這種方式，檢查點(diǎn)確保受損或不完全DNA不傳遞給子細(xì)胞。存在幾個(gè)檢查點(diǎn)。G1/S檢查點(diǎn)(限制檢查點(diǎn))中斷細(xì)胞周期，從而使得可以做出進(jìn)入靜止期或不進(jìn)入的“決定”。在G2/M檢查點(diǎn)，如果檢測(cè)到受損DNA，那么細(xì)胞周期停止，這并不罕見。復(fù)制后檢查點(diǎn)涉及已在合成期中復(fù)制的受損DNA。受損DNA的復(fù)制觸發(fā)細(xì)胞應(yīng)答，這阻止細(xì)胞周期進(jìn)展直至復(fù)制后修復(fù)過程完成。在人細(xì)胞中，復(fù)制后檢查點(diǎn)通過延遲有絲分裂期的開始產(chǎn)生用于修復(fù)的時(shí)間。chk\基因施加對(duì)復(fù)制后檢查點(diǎn)的控制，而P沿基因在觸發(fā)G1/S和G2/M檢查點(diǎn)處的控制機(jī)制中起重要作用。晝夜節(jié)春鐘還調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖
近年來，晝夜節(jié)奏鐘在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中的重要性已得到理解。例如
“晝夜節(jié)奏定時(shí)的破壞…已對(duì)細(xì)胞分裂的正常調(diào)節(jié)引起深遠(yuǎn)后果。”(Reddy等人，2005Circadian clocks: neural and peripheral pacemakers that impact upon the celldivision cycle. Mutation Research 574 76 - 91)
“對(duì)鐘成分與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)相互作用的機(jī)制的詳細(xì)洞察來自近期的小鼠研究，例如，…在肝組織的去除(部分肝切除術(shù))與隨后的第一波有絲分裂之間的延遲取決于實(shí)施手術(shù)的日子的時(shí)間。”(Vallone 等人,2007 Start the clock! Circadian rhythms anddevelopment. Developmental Dynamics 236 142_ 155)
“從藍(lán)細(xì)菌到高級(jí)脊椎動(dòng)物，存在晝夜節(jié)奏鐘的許多例子，所述晝夜節(jié)奏鐘“門控”細(xì)胞周期的S-期和有絲分裂在夜間期間發(fā)生?！?Vallone等人)。[大概，DNA合成和有絲分裂在夜間發(fā)生以保護(hù)DNA免于有害的UV或來自日光的其他電離輻射]。因此，晝夜節(jié)奏鐘對(duì)DNA和蛋白質(zhì)合成、有絲分裂和胞質(zhì)分裂、RNA合成和修復(fù)的細(xì)胞周期發(fā)揮拱形影響。因此，當(dāng)環(huán)境因素干擾細(xì)胞的晝夜節(jié)奏機(jī)制時(shí)，細(xì)胞功能受損。我們假定當(dāng)處理可以產(chǎn)生或再次同步細(xì)胞的晝夜節(jié)奏鐘時(shí)，或當(dāng)處理可以恢復(fù)晝夜節(jié)奏基因表達(dá)的“正常”水平時(shí)，那么細(xì)胞功能可以得到改善，細(xì)胞損傷可以以加速方式得到修復(fù)，或凋亡可以以更及時(shí)的方式發(fā)生。環(huán)境可以使晝夜節(jié)律脫離同步
干擾調(diào)節(jié)細(xì)胞的晝夜節(jié)律的一種或多種基因的試劑可以使細(xì)胞脫離與環(huán)境和其他細(xì)胞的同步。例如，在UV暴露后的數(shù)小時(shí)，可能多達(dá)20小時(shí)，人角化細(xì)胞中clock、bmall和pari基因表達(dá)的水平是顯著降低的(參見圖I)。“顯著降低的”意指低于這些基因在其正常晝夜節(jié)奏周期中經(jīng)歷的最低表達(dá)，如上所述。此外，在UV暴露后，可描述為大致正弦式的基因表達(dá)的通常模式喪失。在圖I中，水平線標(biāo)記基因表達(dá)的通常平均水平，且在UV暴露 后約44小時(shí)時(shí)開始，顯示關(guān)于那條線的一般晝夜節(jié)奏變動(dòng)。相比之下，在UVB暴露后即刻，基因表達(dá)的水平下降到充分低于正常，并且不回到正常水平達(dá)約20小時(shí)。在該20小時(shí)過程中，基因表達(dá)的正常模式對(duì)于所有3種基因是喪失的。并且即使當(dāng)基因表達(dá)的水平不回到接近正常水平時(shí)，需要約20小時(shí)至約44小時(shí)的時(shí)期用于表達(dá)的正常正弦式模式恢復(fù)。因此UV暴露實(shí)際上具有2種效應(yīng)。一種效應(yīng)是在晝夜節(jié)奏基因的表達(dá)水平中的顯著減退，并且另一種是模式，也就是說，其表達(dá)的時(shí)機(jī)。在UV暴露后O至約44小時(shí)，DNA和蛋白質(zhì)合成、有絲分裂和胞質(zhì)分裂、RNA合成和修復(fù)以及程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的時(shí)機(jī)都受損。當(dāng)然，UV暴露在日間期間發(fā)生，特別是在關(guān)鍵的10 a.m.至2 p.m.窗口期間。如已指出的，在核中PER和CRY蛋白質(zhì)的濃度在晝夜節(jié)奏日間結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，在這時(shí)CRY蛋白質(zhì)作用于抑制CL0CK/BMAL1異二聚體的轉(zhuǎn)錄。達(dá)到關(guān)閉clock和Imall表達(dá)的臨界濃度中的任何延遲將延長(zhǎng)晝夜節(jié)奏周期。因此，UV暴露趨于延長(zhǎng)晝夜節(jié)奏周期。這使細(xì)胞周期脫離與環(huán)境的同步。DNA復(fù)制和有絲分裂可能在對(duì)于細(xì)胞復(fù)制是最佳的晚上不發(fā)生。此外，晝夜節(jié)奏基因?qū)?xì)胞周期施加的門控影響可能是受損的，從而使得DNA損傷可未檢測(cè)到或可不進(jìn)行修復(fù)，并且可允許傳遞給子細(xì)胞。據(jù)報(bào)道Sirtuins延遲有絲分裂的發(fā)牛
Sirtuin I (也稱為SIRTl或沉默信息調(diào)節(jié)物二直向同源物I)是響應(yīng)應(yīng)激調(diào)節(jié)代謝和細(xì)胞存活的酶。它與細(xì)胞壽命相關(guān)。編碼SIRTl酶的I基因不是晝夜節(jié)奏基因。Chua等人已建議SIRTl通過停滯細(xì)胞周期促進(jìn)復(fù)制性衰老(Chua等人(2005) Mammalian SIRTllimits replicative life span in response to chronic genotoxic stress. CellMetabolism 2，67_76)。US 2009-0082278 (整體引入本文作為參考)進(jìn)一步描述這種基因和可能上調(diào)其的局部皮膚組合物。段落8-13寫到
“申請(qǐng)人近期已發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)在皮膚細(xì)胞機(jī)制中的牽涉，其在衰老過程和細(xì)胞保護(hù)中
有重要作用?！?br> “申請(qǐng)人已證明，SIRT蛋白質(zhì)、并且更準(zhǔn)確地SIRTl蛋白質(zhì)在皮膚細(xì)胞中表達(dá)，并且其表達(dá)與皮膚細(xì)胞遇到的不同應(yīng)激有關(guān)。他們已具體證明，應(yīng)用不同試劑對(duì)該蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)允許細(xì)胞保護(hù)并且更好地幫助它們對(duì)抗應(yīng)激和內(nèi)在衰老?！?br> “SIRT蛋白質(zhì)是Sirtuin家族的一部分，并且是在組蛋白脫乙?；衅鹬匾饔玫腘AD+依賴性核蛋白質(zhì)。編碼SIR蛋白質(zhì)的SIR基因(沉默信息調(diào)節(jié)物)在1979年在釀酒酵母(S. cerevisiae)中首次描述(Rine J和 A I. ,Genetics 1979)。其后，證明 SIR2P 蛋白質(zhì)在秀麗隱桿線蟲(C. elegans)中的過量表達(dá)允許該生物體的壽命增加(Tissenbaum和AI. , Nature 2001)。該研究允許假設(shè)這些蛋白質(zhì)與壽命有關(guān)?！?br> “SIRT1蛋白質(zhì)是最佳表征的人sirtuin并且與眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物相互作用。人SIRTl蛋白質(zhì)已描述為牽涉p53調(diào)節(jié)(Cheng H L和A I. Proc Natl Acad Sci USA. 2003),并且在更近期描述為細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)劑(Langley E和A I. ,EMBO J. 2002)。其它人SIRT蛋白質(zhì)已得到發(fā)現(xiàn)(SIRT2、SIRT3、SIRT4-7)。人SIRT2蛋白質(zhì)被研究得非常少；但一些研究已證明其在有絲分裂活性的控制中的作用(Dryden S C和A I. Mol Cell Bio. 2003)以及其在p53蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)中的牽涉(Vaziri H和A I. ,Cell. 2001)。迄今,脫乙酰酶sirtuins被認(rèn)為是在細(xì)胞死亡及其生命周期中起重要作用的酶家族(Porcu M.和Chiarugi A, TrendsPharmacol Sci. ,2005)?！? “本發(fā)明[即US 2009-0082278]涉及美容或藥物組合物，其包含在美容或藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中的可能激活皮膚細(xì)胞中SIRT蛋白質(zhì)合成的至少一種化合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，該化合物會(huì)激活特定類型的SIRT蛋白質(zhì)，SIRTl蛋白質(zhì)。”
“迄今，尚未描述充當(dāng)皮膚細(xì)胞中SIRT家族蛋白質(zhì)的合成的誘導(dǎo)物的化合物的應(yīng)用”。本說明書做出下述論點(diǎn)迄今為止，包含與晝夜節(jié)奏基因激活物協(xié)同的Wril激活物的組合物的使用從未得到描述，即使在US2009-0082278中。就申請(qǐng)人所知，包含一種或多種非晝夜節(jié)奏、有絲分裂延遲試劑的，致力于人表皮角化細(xì)胞中CLOCK和PERl蛋白質(zhì)的降低水平的局部組合物是未知的。用于DNA修復(fù)的局部(topical)組合物
用于應(yīng)用于皮膚以促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)過程的局部產(chǎn)品是已知的。例如，此類產(chǎn)品可以包括用于改善天然細(xì)胞DNA修復(fù)的有效性的DNA修復(fù)酶、用于維持角化細(xì)胞水合的保濕成分、用于改善皮膚屏障功能的補(bǔ)水成分等等。雖然這些成分可以改善角化細(xì)胞修復(fù)自身的能力，但始終存在改善的空間。與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明提供了恢復(fù)皮膚細(xì)胞中未受損晝夜節(jié)奏蛋白質(zhì)的水平的方法，和恢復(fù)晝夜節(jié)奏基因表達(dá)的正常模式的方法，所述方法與抑制受損DNA傳遞給子細(xì)胞的方法組合。發(fā)明目的
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供局部組合物，當(dāng)應(yīng)用時(shí)，所述局部組合物以加速方式恢復(fù)皮膚細(xì)胞中晝夜節(jié)奏蛋白質(zhì)的正常水平，且恢復(fù)晝夜節(jié)奏基因表達(dá)的正常模式。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過上調(diào)clock和peri基因表達(dá)并且通過延遲皮膚細(xì)胞的有絲分裂修復(fù)光損傷和/或氧化損傷的皮膚的局部組合物。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供減少增殖性受損皮膚細(xì)胞DNA的機(jī)會(huì)的局部組合物。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供減少已通過環(huán)境攻擊物特別是UV暴露而損傷的增殖性皮膚細(xì)胞DNA的機(jī)會(huì)的局部組合物。本發(fā)明的又一目的是提供用于處理皮膚的組合物，其包含至少一種角化細(xì)胞clock或基因激活物、至少一種非晝夜節(jié)奏有絲分裂延遲試劑和任選地至少一種DNA修復(fù)酶。發(fā)明概述
所有前述通過局部組合物實(shí)現(xiàn)，所述局部組合物包含上調(diào)皮膚細(xì)胞中的晝夜節(jié)奏基因表達(dá)的至少一種試劑和延遲皮膚細(xì)胞中的有絲分裂的至少一種非晝夜節(jié)奏試劑。已發(fā)現(xiàn)，包含上調(diào)(或激活)基因和pari基因、同時(shí)還增加SIRTl的水平的試劑的組合物協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞活力、細(xì)胞壽命，抑制由于環(huán)境攻擊物的細(xì)胞損傷，改善DNA損傷的修復(fù)且協(xié)同減少增殖性受損皮膚細(xì)胞DNA的機(jī)會(huì)。任選地，該組合物包含一種或多種DNA修復(fù)酶。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是表現(xiàn)上述效應(yīng)的局部皮膚組合物。優(yōu)選地，此類組合物包含一種或多種角化細(xì)胞和peri基因激活物，連同SIRTl或一種或多種激活物。優(yōu)選地，此類組合物是易于使用，有效，美容上可接受的，化學(xué)、熱力學(xué)和光穩(wěn)定的，對(duì)于局部使用安全的，具有很少的副作用或無副作用，并且在個(gè)人護(hù)理市場(chǎng)中商業(yè)上可行的。附圖描沭
圖I顯示在UV暴露后72小時(shí)，人角化細(xì)胞中clock、bmal\和基因表達(dá)的水平。
圖2顯示sirn激活物Orsirtine "和白藜蘆醇對(duì)人角化細(xì)胞存活的作用。圖3顯示與sirt\激活物Orsirtine 和白藜蘆醇組合的晝夜節(jié)奏基因激活物的作用。發(fā)明詳沭
就申請(qǐng)人已知，包含與恢復(fù)正常晝夜節(jié)奏周期的晝夜節(jié)奏基因激活物的局部應(yīng)用協(xié)同，促進(jìn)細(xì)胞周期停滯的sirtl激活物的局部組合物的使用從未得到描述。定義
本文提及的所有百分率是重量百分率，除非另有說明。與基因有關(guān)，術(shù)語“激活”和“上調(diào)”或語源上相關(guān)的術(shù)語意指引起由該基因編碼的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)的成分。術(shù)語“鐘基因(clock gene)”有時(shí)在文獻(xiàn)中用于指所謂的“規(guī)范”晝夜節(jié)奏基因中的任何，包括clock、bmal I 'period和ciyptochrome基因。在本說明書中，“clock” (以斜體)總是指編碼CLOCK蛋白質(zhì)的基因?？偟膩碚f，基因、bmal I、periot/和cryp tochrome在本文中稱為“晝夜節(jié)奏基因”。術(shù)語“DNA修復(fù)酶”意指能夠修復(fù)DNA堿基誘變損傷的酶。此類酶通常通過其修復(fù)的DNA損傷類型分類。例如，BER (堿基切除修復(fù))酶、核苷酸切除修復(fù)(NER)酶；錯(cuò)配修復(fù)(MMR)酶；DNA解旋酶；DNA聚合酶等等。例如，突變例如8-氧代-7，8- 二氫_2’_脫氧鳥苷可以通過OGGl(8-氧代鳥嘌呤糖基化酶修復(fù)。T-T 二聚體可以通過核苷酸切除修復(fù)酶光解酶修復(fù)。6-4光產(chǎn)物可以通過NER修復(fù)。06-甲基鳥嘌呤可以通過06-烷基鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(AGT)修復(fù)。就皮膚或皮膚細(xì)胞而言，“修復(fù)”意指角化細(xì)胞活力、強(qiáng)度和壽命是一般上改善的。修復(fù)的例子包括修復(fù)受損角化細(xì)胞DNA，且逆轉(zhuǎn)由于UV光、吸煙或其他環(huán)境攻擊物的細(xì)胞水合的喪失?！皩?duì)于局部使用安全的”意指順應(yīng)管理美容產(chǎn)品的安全性的所有地區(qū)和當(dāng)?shù)匾?guī)章?！懊廊萆峡山邮艿摹币庵附M合物的外觀、感覺和氣味在消費(fèi)者可接受性的限制內(nèi)，如由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的?！盎瘜W(xué)穩(wěn)定的”、“熱力學(xué)穩(wěn)定的”和“光穩(wěn)定的”意指從制造到至少6個(gè)月(更優(yōu)選3年)的時(shí)期，組合物保持美容上可接受的?！霸趥€(gè)人護(hù)理市場(chǎng)中商業(yè)上可行的”意指組合物的制造和發(fā)送成本應(yīng)不超過個(gè)人護(hù)理工業(yè)中已經(jīng)歷的。CLOCK 和 PERIODI 上調(diào)
本發(fā)明的組合物含有上調(diào)clock和/或pari角化細(xì)胞基因的至少一種試劑?？偟膩碚f，相對(duì)于最終組合物的總重量，這些試劑的建議濃度范圍為約O. 000001 -約40%、優(yōu)選約O. 000005 - 35%、更優(yōu)選約O. 00001 - 25%。一般而言，這些范圍可以理解為是有效量。“有效量”意指在環(huán)境襲擊下在應(yīng)用于人皮膚的局部組合物中，這些試劑的濃度足以使角化細(xì)胞存活比率改善至少5%。合適的clock或激活物可以以植物提取物、多肽、肽、氨基酸等的形式存在。特別優(yōu)選的clock和/或per\基因激活物包含式(I)的肽
R1- (AA) n_ X1 _ S - T _ P _ X2 - (AA) p _ R2
其中(AA)n- X1 -S-T-P-X2- (AA)p 是(SEQ ID No. I)和
X1代表蘇氨酸或絲氨酸，或等于不存在，
X2代表異亮氨酸或亮氨酸或脯氨酸或纈氨酸或丙氨酸或甘氨酸，或等于不存在，
AA代表任何氨基酸或其衍生物，并且η和P是在O - 4之間(包括O和4在內(nèi))的整
數(shù)，
R1代表游離或由保護(hù)基團(tuán)取代的N末端氨基酸的伯胺官能，所述保護(hù)基團(tuán)可以選自乙酰基、苯甲?；⒓妆交酋；蚱S氧羰基，
R2代表由保護(hù)基團(tuán)取代的C末端氨基酸的羧基官能的羥基，所述保護(hù)基團(tuán)可以選自C1-C20烷基鏈或NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y代表C1 - C4烷基鏈，
并且其中通式(I)的序列包含約3 - 13個(gè)氨基酸殘基。通式(I)的序列可以含有氨基酸X1和X2由其他化學(xué)等價(jià)氨基酸的取代，其中氨基酸是丙氨酸(Α)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(Ε)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(Μ)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(Τ)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。式I的更優(yōu)選形式是如下的肽
(SEQ ID No. 2) Y - V-S -T -P - Y - N- NH2
Tyr-Val-Ser-Thr-Pro-Tyr-Asn_NH2
(SEQ ID NO. 3) NH2 - V -S -T -P -E - NH2
NH2-Val-Ser-Thr-Pro-Glu-NH2
S -T -P - NH2
Ser-Thr-Pro-NH2
(SEQ ID No. 4) NH2 - L -H -S -T- P - P - NH2
NH2-Leu-HiS-Ser-Thr-Pro-Pro-NH2
(SEQ ID No. 5) CH3NH -R-H -S -T -P -E - NH2
CH3-NH-Arg-His-Ser-Thr-Pro-Glu-NH2
(SEQ ID No. 6) CH3NH - H -S -T -P -E - CH3NH
CH3-NH-His-Ser-Thr-Pro-Gl u-CH3-ML更優(yōu)選的是S-T-P-NH2肽、SEQ ID No. 4或其混合物。最優(yōu)選的是在商品名Chronolux 下具有INCI名稱三肽-32的由ISP-Vinscience制造的肽。相關(guān)申請(qǐng)US12/367，705的

圖1、2和3以及描述這些圖的正文證實(shí)Chronolux 改善針對(duì)UV誘導(dǎo)的應(yīng)激的角化細(xì)胞存活的能力，尤其是當(dāng)與至少一種DNA修復(fù)酶組合時(shí)。同時(shí)應(yīng)用〃704和/7#1基因激活物將產(chǎn)生有益結(jié)果不是立即顯而易見的。畢竟，在正常晝夜節(jié)律中，CLOCK和Periodl蛋白質(zhì)的細(xì)胞濃度是異相的(out of phase)。然而，有益結(jié)果得以實(shí)現(xiàn)?？梢园凳驹诃h(huán)境襲擊下皮膚細(xì)胞在CLOCK和Periodl蛋白質(zhì)水平方面被如此耗盡，使得通過盡可能快速上調(diào)2種蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)益處。SIRTUIN1 h 調(diào)
我們已意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與角化細(xì)胞《siril激活物組合時(shí),通過應(yīng)用和角化細(xì)胞基因激活物實(shí)現(xiàn)的有益結(jié)果得以修飾，有時(shí)得以顯著改善。SIRTl趨于誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯?？紤]到晝夜節(jié)奏機(jī)制及其與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相互作用的復(fù)雜性，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可能未預(yù)期誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯同時(shí)恢復(fù)晝夜節(jié)奏蛋白質(zhì)的正常水平將是有利的。盡管不希望受任何一種理論束縛，應(yīng)當(dāng)理解除通過晝夜節(jié)奏失察外，PERl在細(xì)胞周期中具有直接作用。例如，除其作為晝夜節(jié)奏周期的核心組分的作用外，據(jù)報(bào)道PERl能夠激活A(yù)TM激酶途徑，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。ATM (突變的運(yùn) 動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥)激酶是響應(yīng)DNA雙鏈斷裂召募的核蛋白激酶。ATM激酶使CHKl和CHK2細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)物磷酸化，其涉及細(xì)胞周期停滯且延遲進(jìn)入有絲分裂內(nèi)。由于某些環(huán)境應(yīng)激，當(dāng)PERl表達(dá)不足時(shí)，細(xì)胞周期停滯可能不發(fā)生或可能是延遲的。因此，在有絲分裂或胞質(zhì)分裂前，可能存在不足夠的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)對(duì)受損DNA的修復(fù)。同時(shí)，PERl的表達(dá)減少已與凋亡減少相關(guān)聯(lián)。因此，應(yīng)死亡的受損細(xì)胞可能存活且分裂。因此，考慮到環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致PERl水平中的異常減少(這導(dǎo)致不能停滯細(xì)胞周期)和減少的凋亡(這導(dǎo)致受損DNA的傳播)，可以預(yù)期pari激活將校正該問題。然而，我們已觀察到當(dāng)Wril基因激活物與^704和/7#1基因激活物組合使用時(shí)，角化細(xì)胞活力得到顯著改善。雖然不希望受任何一種理論束縛，但這個(gè)觀察可以暗示peri自身的激活未能足夠快速恢復(fù)PERl的水平，以在受損DNA可以傳播至子細(xì)胞前實(shí)現(xiàn)修復(fù)?！癝IRT1激活物”意指可能支持SIRTl蛋白質(zhì)的內(nèi)源產(chǎn)生的任何化合物，特別是涉及前體例如DNA或RNA的正面控制的分子。在皮膚細(xì)胞中可能激活SIRTl蛋白質(zhì)的合成的這些化合物中，不同分子例如多酚已得到描述。更具體而言，可以提及反式-芪的衍生物(例如白藜蘆醇、白皮杉醇(piceatannol))、查耳酮的衍生物(例如異甘草素、紫鉚因)、和黃酮的衍生物(例如漆黃素(fistein)、木犀草素、槲皮素)。與至少一種DNA修復(fù)酶組合的白藜蘆醇或白藜蘆醇衍生物的功效已顯示于相關(guān)申請(qǐng)US 11/837,658中。然而，由于其與皮膚中的肽的固有結(jié)構(gòu)相似性，某些肽是優(yōu)選Wril激活物。更優(yōu)選的是一種或多種肽激活物和白藜蘆醇的協(xié)同作用(關(guān)于這點(diǎn)更多在下文描述)。肽sirt\激活物
由于其與皮膚中的肽的固有結(jié)構(gòu)相似性，肽是優(yōu)選Wril激活物。在肽性質(zhì)的化合物中，可以提及蛋白質(zhì)片段、肽和多肽片段、肽以及通過肽鍵連接在一起的2個(gè)或更多個(gè)氨基酸的所有序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，肽片段大小范圍為3 - 50個(gè)氨基酸，更具體而言3 - 10個(gè)氨基酸。所有這些肽片段具有生物學(xué)活性。優(yōu)選肽是
(SEQ ID No. 7) (AA)n- G-L-Y-D-N-L-E - (AA)n(AA)n- Gly - Leu - Tyr - Asp - Asn - Leu- Glu - (AA)n其中(AA)是任何特定氨基酸或其衍生物，并且n是在0 - 3之間(包括O和3在內(nèi))的整數(shù)。特別優(yōu)選的肽是
(SEQ ID No. 8) G-L-Y-D-N- L- E Gly-Leu-Tyr-Asp-Asn-Leu-Gluο這種妝可作為可從ISP Vincience獲得的Orsirtine GL (INCI名稱:水(和)甘油(和)水稻(Oryza Sativa)(稻)提取物)獲得。在本發(fā)明的組合物中，相對(duì)于最終組合物的總重量，肽SIRTl激活物以約O. 000001% - 20%的量、且優(yōu)選以約O. 0001 - 5%的
量存在。白藜蘆醇及其衍生物
白藜蘆醇也稱為3，5，4’ -三羥基芪，是存在于紅葡萄、覆盆子、藍(lán)莓和某些其他植物漿果或提取物中的多羥基取代的芪化合物，其具有通式
權(quán)利要求
1.皮膚護(hù)理組合物，其包含至少一種角化細(xì)胞晝夜節(jié)奏基因激活物和至少一種角化細(xì)胞sir (I基因激活物。
2.權(quán)利要求I的組合物，其中所述角化細(xì)胞晝夜節(jié)奏基因激活物包含具有3- 13個(gè)氨基酸殘基且為式(I)的肽 (SEQ ID No. I) R1- (AA)n- X1-S-T-P-X2- (AA)p - R2，其中 X1代表蘇氨酸、絲氨酸，或等于不存在； X2代表異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸，或等于不存在； AA代表任何氨基酸或其衍生物； n和p是O - 4的整數(shù)； R1代表游離或由保護(hù)基團(tuán)取代的N末端氨基酸的伯胺官能，所述保護(hù)基團(tuán)可以選自乙?；?、苯甲?；?、甲苯磺酰基或芐氧羰基； R2代表可以由保護(hù)基團(tuán)取代的C末端氨基酸的羧基官能的羥基，所述保護(hù)基團(tuán)可以選自C1 - C20烷基鏈或NH2、NHY或NYY基團(tuán)，其中Y代表C1 - C4烷基鏈； 并且其中所述式(I)序列可以含有氨基酸X1和X2由其他化學(xué)等價(jià)氨基酸的取代。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述晝夜節(jié)奏基因激活物選自 (SEQ ID No. 2) Y - V-S -T -P - Y- N- NH2Tyr-Val-Ser-Thr-Pro-Tyr-Asn_NH2 (SEQ ID No. 3) NH2 - V -S -T -P -E - NH2NH2-Val-Ser-Thr-Pro-Glu-NH2 S -T -P - NH2Ser-Thr-Pro-NH2 (SEQ ID No. 4) NH2 - L -H -S -T- P - P - NH2NH2-Leu-HiS-Ser-Thr-Pro-Pro-NH2 (SEQ ID No. 5) CH3NH -R-H -S -T -P -E - NH2CH3-NH-Arg-His-Ser-Thr-Pro-Glu-NH2 (SEQ ID No. 6) CH3NH - H -S -T -P -E - CH3NHCH3-NH-His-Ser-Thr-Pro-Glu-CH3-NH2 及其混合物。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述晝夜節(jié)奏基因激活物包含三肽-32。
5.權(quán)利要求I的組合物，其中所述角化細(xì)胞Sirtl基因激活物是一種或多種反式-芪或其衍生物、能夠激活角化細(xì)胞Wrd基因的一種或多種肽、或其組合。
6.權(quán)利要求5的組合物，其包含白藜蘆醇和下列式(II)的肽的協(xié)同組合 (SEQ ID No. 7) (AA)n- G-L-Y-D-N-L-E - (AA)n，其中 (AA)是任何特定氨基酸或其衍生物；和 n是0 - 3的整數(shù)。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述肽是 (SEQ ID No. 8) G-L-Y-D-N- L- E Gly-Leu-Tyr-Asp-Asn-Leu-Gluo
8.皮膚護(hù)理組合物，其包含相對(duì)于最終組合物的總重量為0. 00001% - 25%的三肽-32 ； 相對(duì)于最終組合物的總重量為0. 0001%- 5%的(SEQ ID No. 8) G - L - Y - D - N-L- E ;和 相對(duì)于最終組合物的總重量為0. 001% -約95%的白藜蘆醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其進(jìn)一步包含相對(duì)于最終組合物的總重量為0.0001% -25%的至少一種DNA修復(fù)酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述DNA修復(fù)酶選自堿基切除修復(fù)(BER)酶、核苷酸切除修復(fù)(NER)酶、DNA聚合酶、DNA解旋酶、錯(cuò)配修復(fù)(MMR)酶及其混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述DNA修復(fù)酶選自擬南芥{ArabidopsisThaliana )提取物、乳桿菌屬^Lactobacillus')發(fā)酵物、微球菌屬(.Micrococcus )裂解物、浮游生物提取物、雙歧桿菌發(fā)酵裂解物及其混合物。
12.預(yù)防由于環(huán)境攻擊物的對(duì)人角化細(xì)胞的損傷的方法，其包括 對(duì)處于角化細(xì)胞損傷的危險(xiǎn)中的皮膚應(yīng)用包含0.00001% - 25%的至少一種角化細(xì)胞晝夜節(jié)奏基因激活物的組合物；和 對(duì)處于角化細(xì)胞損傷的危險(xiǎn)中的皮膚應(yīng)用包含0. 0001% - 5%的至少一種角化細(xì)胞sirtl基因激活物的組合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述至少一種角化細(xì)胞晝夜節(jié)奏基因激活物和所述至少一種角化細(xì)胞sirtl基因激活物在連續(xù)應(yīng)用的單獨(dú)組合物中。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述至少一種角化細(xì)胞晝夜節(jié)奏基因激活物和所述至少一種角化細(xì)胞Wrd基因激活物是單一組合物的一部分，所述單一組合物是化學(xué)、熱力學(xué)和光穩(wěn)定的，對(duì)于局部使用安全的，具有很少的副作用或無副作用，并且在個(gè)人護(hù)理市場(chǎng)中商業(yè)上可行的。
15.修復(fù)由于環(huán)境攻擊物的對(duì)人角化細(xì)胞的損傷的方法，其包括 對(duì)面部應(yīng)用包含0.00001% - 25%的至少一種角化細(xì)胞晝夜節(jié)奏基因激活物的組合物；和 對(duì)面部應(yīng)用包含0. 0001% - 5%的至少一種角化細(xì)胞sirtl基因激活物的組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述晝夜節(jié)奏和基因激活物在上床30分鐘內(nèi)應(yīng)用。
17.權(quán)利要求15的方法，其包括 清潔人皮膚的一部分； 隨后將化妝水應(yīng)用于皮膚的所述部分；和 隨后應(yīng)用所述晝夜節(jié)奏和sirt\基因激活物。
18.局部組合物,其為化學(xué)、熱力學(xué)和光穩(wěn)定的，且對(duì)于局部使用安全的,其包含式II和白藜蘆醇或其衍生物的協(xié)同組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求I的組合物在修復(fù)對(duì)于人角化細(xì)胞的UVB損傷中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物在修復(fù)對(duì)于人角化細(xì)胞的UVB損傷中的應(yīng)用。
21.權(quán)利要求I的組合物，其進(jìn)一步包括 包含多糖、丙烯酸聚合物或其混合物的至少一種水相結(jié)構(gòu)試劑； 至少一種非離子型有機(jī)表面活性劑，其為烷氧基化醇；和至少一種保濕劑，其為C2_4烷撐二醇或甘 油。
全文摘要
用于增強(qiáng)皮膚細(xì)胞中受損DNA修復(fù)的組合物和方法。局部組合物包含上調(diào)皮膚細(xì)胞中的晝夜節(jié)奏基因表達(dá)的至少一種試劑和延遲皮膚細(xì)胞中的有絲分裂的至少一種非晝夜節(jié)奏試劑。優(yōu)選地，此類組合物包含一種或多種角化細(xì)胞clock和per1基因激活物，連同SIRT1或一種或多種sirt1激活物。更優(yōu)選地，sirt1激活物是特異性肽sirt1激活物和白藜蘆醇的協(xié)同組合。優(yōu)選地，此類組合物是易于使用，有效，美容上可接受的，化學(xué)、熱力學(xué)和光穩(wěn)定的，對(duì)于局部使用安全的，具有很少的副作用或無副作用，并且在個(gè)人護(hù)理市場(chǎng)中商業(yè)上可行的。
文檔編號(hào)A61K8/64GK102802656SQ201080028201
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者D.H.梅斯, N.A.佩爾諾代, T.馬莫納, D.F.科林斯, L.斯盧特斯基, K.戈德格拉本, J.T.麥卡錫, E.佩爾里 申請(qǐng)人:Elc 管理有限責(zé)任公司