專利名稱：新膠原材料及其獲得方法
新膠原材料及其獲得方法本發(fā)明涉及新膠原材料，并更特別地適用于膠原膜、管狀物、薄膜、海綿狀物、凝膠、基質(zhì)和線狀物。所述材料兼有優(yōu)異的彈性和機械強度特性。本發(fā)明還涉及使用腱的酸性纖維膠原制備膠原材料的方法，其還包括膠原的受控交聯(lián)。本發(fā)明還涉及具有長纖維的腱的酸性纖維膠原，涉及其獲得方法以及其在特別是制造膠原膜、管狀物、薄膜、海綿狀物、 凝膠、基質(zhì)和線狀物中的應用。膠原是自古以來為人所知的蛋白。長久以來，由于其突出的物理化學和生物特性而用于制造醫(yī)療裝置。過去曾用于制備止血敷布(hemostatic compress)，其生物相容性及其對傷口愈合和瘢痕形成的活性使其成為用于制備生物材料(如牙科手術中用于引導的組織再生的膜)和用于顱頂強化和人工血管的涂覆材料(以促進其整合并確保其緊密)的理想選擇。完全由膠原制成的材料，如止血敷布、用于防止粘附的膜和用于神經(jīng)再生的導管狀物(W02007/147739，F(xiàn)I^810889)是商業(yè)上可獲得的。只要膠原提取過程導致充分的純化，該產(chǎn)物完全是生物相容的，并良好地完成其功能。取決于適應癥和在體內(nèi)相應的所需吸收期間，可將膠原交聯(lián)。交聯(lián)膠原的方法是公知的，并得到廣泛描述?？商峒埃鏓P086M68和US4931M6。將氧化的糖原作為膠原交聯(lián)劑已描述于FR2877669以及!^orest等和Rousseau等的公開文獻。根據(jù)所述交聯(lián)劑的特性和比例，以及交聯(lián)條件(PH，反應時間)，較容易以可控方式變化材料的吸收時間。然而，交聯(lián)的困難之處主要在于交聯(lián)速率的選擇，這必須使得能夠產(chǎn)生穩(wěn)定而可重復產(chǎn)生的、 具有所需吸收時間并具有與其應用相容的機械特性的材料。該問題對于長壽命的材料而言更加嚴重，因為膠原材料交聯(lián)越多則越堅固。該物理特征，表示為對撕裂的易感性的增加和縫線保持強度(suture retention strength)的減少，對于某些手術應用而言可為完全不可接受的。然而，目前并無精確地并可重復地控制膠原交聯(lián)速率，并相應地控制最終材料的剛度的交聯(lián)方法。因此，在某些情況下，且特別是當外科醫(yī)師和/或患者在植入后對材料施以強機械應力時，所述現(xiàn)有的膠原材料達到了其極限。對于專利FM877669中和!^orest等Q007) 的科學文獻中所述的材料而言即為如此。所述材料非常良好地實現(xiàn)了其功能，但在極端情況下，當縫線纖細或應力更強時，材料的強度不足。膠原材料的機械特性取決于三個因素-膠原結構化水平(levelof structuring)的選擇，-網(wǎng)化劑(reticulatingagent)和交聯(lián)速率的選擇，-用于制備和形成材料的方法。外科醫(yī)師當面對新的手術技術和廣泛的可能性時，越來越對強至足以制成縫線并置于張力下的生物可降解產(chǎn)品(任選地，但非必需地，例如通過織物網(wǎng)格(textile lattice)強化)感興趣。對于供引導的組織再生的膜而言特別如此。為了制備此種材料， 本領域技術人員會選擇高度結構化的膠原，并會強烈地交聯(lián)該膠原。然而，結果會是非常剛性、可斷裂且對于外科醫(yī)師不易操作的產(chǎn)品。選定的膠原可為所謂纖維膠原，即并非非常未結構化的，但缺乏提取過程中的控制限制了用該膠原產(chǎn)生的材料的可能性。交聯(lián)通過例如浸沒或與甲醛或戊二醛蒸汽相接觸來進行，但并不產(chǎn)生柔性和受控的交聯(lián)。因此，迄今為止并無具有機械強度(張力，縫線)并具有柔性和相容性且具有合適吸收時間(幾個月)的膠原材料。交聯(lián)的膠原材料的制造一般包括制備膠原水溶液，任選地添加交聯(lián)劑，通過澆注或模塑所述膠原水溶液，蒸發(fā)溶劑然后在浴、蒸汽中或減壓下通過物理或化學方法處理獲得的材料以形成交聯(lián)鍵，去除和/或失活殘余的交聯(lián)劑或任何不需要的分子，然后進行干燥材料的新步驟(若材料的最終形式需要此種步驟)，來形成材料。所述現(xiàn)有技術方法需要對膠原材料的多次操作，且無法使得交聯(lián)步驟的充分控制能夠進行，特別是在交聯(lián)鍵密度和膠原結構方面。重要的是，所述方法無法使得足夠持續(xù)的 (progressive)凝結/纖維化步驟或凝結/纖維化/交聯(lián)步驟能夠進行以使得膠原分子的三維組織能夠進行。其結果，一般而言獲得的交聯(lián)材料或者是強而剛性的，或者是柔性但相對較弱的。本發(fā)明在此描述了用于獲得膠原材料的方法，特別是獲得具有高拉伸強度和撕裂強度的膠原膜，而保持充分的柔性和彈性以特別用于手術應用的方法。事實上，本發(fā)明人開發(fā)了制備膠原材料的新方法，包括在形成所述膠原材料過程中用氨氣處理濕的纖維膠原。此種用氨氣的持續(xù)處理使得能夠在纖維膠原的形成過程中獲得其凝結和纖維化。本發(fā)明因此還涉及用于形成纖維膠原的方法，并特別涉及弱堿如氨氣用于確保凝膠形式的膠原的完全凝結和纖維化的用途。所述方法還通過在澆注或模塑形成膠原之前，直接將交聯(lián)劑添加至纖維膠原溶液而使得在膠原形成過程中能夠進行伴隨的交聯(lián)。因此膠原交聯(lián)速率可以準確而可重現(xiàn)的方式得到控制。此外，本方法還使得能夠在材料中進行可察覺的均質(zhì)交聯(lián)，S卩，在材料外側和內(nèi)側交聯(lián)速率可基本上相同。這顯著地使得所述材料能夠與在外側的交聯(lián)遠大于內(nèi)側(或在內(nèi)側幾乎不存在交聯(lián))的交聯(lián)的材料相比，具有改善的特性。因此，本方法可提供具有改善的機械和/或吸收特性的材料。不愿拘于該理論，有可能對吸收速率的更佳控制是由于材料體積中的交聯(lián)和/或結構均一性。特別是在本發(fā)明的上下文中“更佳控制”意指在一個材料樣品與另一個的比較，特別是兩個不同制造批次之間的比較，和/或一個患者與另一個的比較中，顯示比來自現(xiàn)有技術的已知方法獲得的材料的情況下差異更小的吸收速率。此外，所述材料可具有作為時間的函數(shù)可察覺地為恒定的，或線性的吸收。因此， 這可導致降解部分的持續(xù)釋放。另一方面，在其中交聯(lián)在其體積中并不均一的現(xiàn)有材料的情況下，降解可為突然性的。不愿拘于該理論，有可能一旦外側部分降解，具有較低程度交聯(lián)的內(nèi)側部分降解更為迅速，或甚至非常迅速。因此，這可導致降解產(chǎn)物數(shù)量的迅速增加，或甚至突然的炎癥爆發(fā) (flare-up)0優(yōu)選地，所述方法是用纖維膠原并優(yōu)選是用具有長纖維的膠原實施的。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了用于制備腱的酸性纖維膠原的方法，所述膠原的特征為特別長和有彈性的纖維。獲得的纖維膠原可用于制備纖維材料，特別是本發(fā)明的膜、薄膜、海綿狀物、凝膠、基質(zhì)、線狀物和管狀物。本發(fā)明的方法使得能夠制造具有以標準膠原材料生產(chǎn)方法在機械強度、彈性、可縫性和相容性方面從未獲得的特性的醫(yī)療裝置，特別是膜、薄膜、海綿狀物、凝膠、基質(zhì)、線狀物和管狀物。由本發(fā)明的方法獲得的材料可用于一般和特殊手術，特別是泌尿科、婦科、 心臟、胸部、血管、關節(jié)、消化道、整形外科、脊椎、神經(jīng)科、骨科、創(chuàng)傷、牙科、口腔科和頌面手術，以供引導的瘢痕形成或組織替代(硬膜(dura matter)、牙齦、骨、神經(jīng)、腱、韌帶、內(nèi)臟、 心包、腹膜、一般結締組織、真皮、肌肉、軟骨)，無論制造的相應材料為何種形式。所述材料，考慮到其特征，可以以膜或薄膜形式在任何其中瘢痕形成期中需要分隔兩個器官或組織的手術中用作引導的瘢痕形成和/或抗粘附屏障，如在神經(jīng)和腱再生中外科醫(yī)師按其期望裝配(fabricate)的管狀物或筒形式的再生引導，或當膠原為海綿狀物形式時用于組織工程的再生基質(zhì)。由于所述材料是使用膠原制造的，它們具有相容性，使其易于使用，并使其能夠遵循它們所放置在的組織的輪廓，同時具有可縫性，使其視需要可保持在該位置上。取決于植入位點和所需的吸收時間，可通過變化起始膠原溶液中膠原和交聯(lián)劑反應基團的比例(和/或通過增加或減少氨的量和/或與氨接觸的時間)來調(diào)整交聯(lián)。 為達到同樣目標，亦可調(diào)整材料的厚度。優(yōu)選的用途為獲得膜(以供在多種類型的手術中引導的組織再生和組織替代(硬膜，心包等))，管狀物(以供神經(jīng)再生，例如用于腱和韌帶再生)和基質(zhì)(例如用于組織工程)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及制備腱的酸性纖維膠原的方法，包括下述步驟a)將豬、牛、羊、驢(foal)的腱或其混合物在0. IM至0. 5M乙酸水溶液中溶脹至少 7曰，b)機械研磨所述腱以獲得水懸液，c)從步驟b)的水懸液沉淀并洗滌纖維膠原，d)將所述膠原脫水，e)獲得酸性纖維膠原。優(yōu)選地，步驟a)涉及溶脹幼于10個月的豬的腱。優(yōu)選地，在步驟c)中，將所述膠原在0. 45-1. 2M NaCl溶液中沉淀并洗滌。通常，在步驟d)中，膠原的脫水包括用丙酮處理。本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明的方法獲得的酸性纖維膠原。有利地，本發(fā)明涉及具有長纖維，從而使得在0. 1 %水溶液中少于20 %、15 %或10 %的包含于溶液中的纖維留在 50 μ m尼龍濾器上，而超過20 %、25 %或30 %穿過5 μ m尼龍濾器的纖維膠原。本發(fā)明還涉及用于制備膠原材料的方法，包括下述步驟a)制備酸性形式的膠原的水溶液，b)任選地，添加在酸性pH非反應性的醛交聯(lián)劑，c)對所述膠原水溶液進行模塑或澆注，d)通過用氨氣處理使得所述膠原水溶液凝結并任選地交聯(lián)，e)去除過量的氨，并通過干燥獲得膠原材料。
優(yōu)選地，步驟a)的水溶液包含按重量計0. 05%至3%酸性形式的膠原。優(yōu)選地，所述酸性形式的膠原是天然膠原或變性膠原。優(yōu)選地，用選自豬腱、牛腱、羊腱和驢腱的膠原的酸性纖維膠原制備步驟a)的水溶液。在一個有利的實施方案中，使膠原溶液凝結并任選地交聯(lián)是通過用氨氣處理至少 M小時實施的。在一個有利的實施方案中，所述方法包括添加在酸性pH無反應性的醛交聯(lián)劑，并通過用氨氣處理使膠原水溶液凝結和交聯(lián)。有利地，所述醛交聯(lián)劑選自糖原和醛支鏈淀粉(aldehydes amylopectin) 0更有利地，所述醛交聯(lián)劑是氧化的糖原。優(yōu)選地，所述醛交聯(lián)劑是以0. 05至5的醛交聯(lián)劑的CHO比對于膠原的NH2的比例范圍添加的。在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述膠原材料是膜，在步驟C)中，膠原水溶液沉積于平的模具上，并在步驟e)中，去除過量的氨并通過干燥獲得膠原膜。本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明的方法和/或本說明書中描述的方法獲得的膠原材料。更特別地，所述材料是通過所述方法獲得的，所述材料是直接通過所述方法獲得的。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明還涉及具有均一交聯(lián)的膠原材料，特別是膜。在本發(fā)明的上下文中，“均一交聯(lián)”意指外側表面的交聯(lián)和內(nèi)側的交聯(lián)，特別是朝向材料中間，更特別地在材料中間的交聯(lián)之間的差異小于或等于20%，特別是小于或等于 15%，更特別地小于或等于10%，且十分特別地小于或等于5%。交聯(lián)差異的百分比可對應于[((外側交聯(lián)-內(nèi)側交聯(lián))/ (內(nèi)側交聯(lián)+外側交聯(lián))) xlOO]的絕對值。交聯(lián)可通過每mg材料游離賴氨酸的摩爾數(shù)，特別是以實施例7中所述的方式來評價。所述具有均一交聯(lián)的材料，特別是膜，可具有至少50 μ m的干燥厚度，且十分特別地，其長度、寬度和高度均大于或等于50 μ m。十分特別地，所述材料為具有至少50 μ m的干燥厚度的膜的形式。所述膜的長度和寬度可為大于或等于1cm，更特別地5cm。根據(jù)其又一個方面，本發(fā)明涉及與非交聯(lián)的膠原材料相比具有大于或等于;rc，特別是大于或等于5°c，更特別地大于或等于7°C的變性溫度的增加。該交聯(lián)溫度的不同可通過差示掃描量熱法(DSC)，特別是以實施例8中所述的方式測量。所述交聯(lián)膠原材料可與非交聯(lián)材料相比具有至少5%，特別是8%，更特別是至少 10%的變性溫度的增加。該溫度增加的百分比對應于下述公式[((交聯(lián)材料變性溫度/非交聯(lián)材料溫度)-1)xlOO]。交聯(lián)材料變性溫度相對于非交聯(lián)材料變性溫度的增加可用于驗證該材料是否確實是交聯(lián)的。優(yōu)選地，所述膠原材料可包括膠原膜、膠原薄膜、膠原線狀物、膠原管狀物、膠原海綿狀物或膠原凝膠。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及膠原膜，其可通過本發(fā)明的方法獲得，并具有 30 μ m至200 μ m,優(yōu)選80 μ m至120 μ m的干燥厚度，。優(yōu)選地，所述膠原材料包括非多孔膠原單層，其具有50 μ m至150 μ m,優(yōu)選80 μ m 至120 μ m的干燥厚度。根據(jù)本發(fā)明獲得的膠原膜有利地具有12mg/cm2至16mg/cm2的密度，少于6的溶脹比，大于IN的縫線保持強度，大于4MPa的屈服強度和和少于35%的通過胰蛋白酶的酶降解百分比。本發(fā)明還涉及膠原膜，其具有80 μ m至120 μ m的干燥厚度，12mg/cm2-16mg/cm2的密度，少于6的溶脹比，大于IN的縫線保持強度，大于4MPa的屈服強度和和少于35%的通過胰蛋白酶的酶降解百分比。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及膠原膜，其具有4至6的溶脹比，IN至2. 5N的縫線保持強度，4MPa至7MPa的屈服強度和20%至35%的胰蛋白酶的酶降解百分比。有利地，獲得的膠原膜用可吸收的或不可吸收的紡織品強化。
具體實施例方式本發(fā)明因此涉及用于從年幼動物的腱提取膠原的方法，其得到的膠原的纖維長度和彈性在制造醫(yī)療裝置的用途中，使得能夠獲得機械上具有強度、彈性、可縫性和相容性的材料。因此，本發(fā)明的一個目標涉及用于制備腱的酸性纖維膠原的方法，包括下述步驟a)將豬、牛、羊、驢的腱或其混合物在0. IM至0. 5M乙酸水溶液中溶脹至少7日，b)機械研磨所述腱以獲得水懸液，c)從步驟b)的水懸液沉淀并洗滌纖維膠原，d)將所述膠原脫水。優(yōu)選地，纖維膠原的提取是對幼于10個月的動物的腱進行的，且更優(yōu)選是對幼于 10個月的豬進行的。因此，第一步包括收獲來自幼于10個月的豬足部的腱(腱亦可從牛、羊和驢收獲)，清理，徹底去除結締組織和其他非腱組織，然后將腱切為大約Icm長的小塊，并用水漂洗。在0. IM至0. 5M，優(yōu)選0. 3M乙酸浴中在攪拌下以201至301，優(yōu)選251的體積對 Ikg腱進行溶脹至少7日并最多至15日，優(yōu)選15日。第二步包括輕柔地研磨，使得長的腱纖維能夠從溶脹的腱碎片中釋放。含有經(jīng)溶脹的腱的碎塊的溶脹浴的體積的研磨是例如以300rpm進行2分鐘，然后進行一系列每個均包含用水稀釋介質(zhì)接著在相同條件下研磨的步驟，直至獲得干物質(zhì)濃度在4. 8g/kg至 6. 5g/kg 的糊。第三步包括從由研磨獲得的糊沉淀纖維膠原，然后根據(jù)標準方法將其純化。該步驟可包括一次或多次使用終濃度為0. 45M至1. 2M,更特別是0. 6M的濃度的氯化鈉的沉淀， 以及一步或多步在0. 45M至1. 2M，優(yōu)選0. 6M NaCl溶液中的洗滌步驟。一般而言，所述方法還包括在IN氫氧化鈉溶液中在20°C進行1小時的病毒滅活步驟。通過其對非膠原蛋白水解作用，該步驟構成附加的純化。在該步驟結束時，進行用0.6M NaCl的新的洗滌。然后， 為了使膠原脫水并去除鹽，進行丙酮處理，從而獲得干燥纖維。該施于腱的特定方法得到與現(xiàn)有膠原不同的膠原，區(qū)別之處在于該膠原包含長纖維，而不包含組織碎塊，且其保留了一部分可溶性膠原。本發(fā)明還涉及下述纖維膠原，其中在0. 水溶液中少于20%、15%或10%的包含于溶液中的纖維留在50 μ m尼龍濾器上，而超過20 %、25 %或30 %穿過5 μ m尼龍濾器的
纖維膠原。測量根據(jù)本發(fā)明獲得的纖維膠原小于5 μ m和大于50 μ m的尺寸的級分的實驗方案如下所述-在磁力或機械攪拌16至M小時制備0.1 %膠原水溶液(使用500mg)。-將溶液施于裝載在9cm直徑環(huán)狀支持物上的5μ m或50 μ m尼龍篩。在大氣壓下使分子在篩中擴散。施于該篩的壓力在對于63cm2截面不超過km的水柱高度時被視為可忽略的。-將篩上的溶液用平的方形片狀物(blade)攪拌，其不刮擦纖維，但置于纖維上數(shù)毫米(最多幻。攪拌速度為80rpm。-該片狀物的寬度為7cm。。其置于所述環(huán)狀支持物的中心。-在膠原溶液不再流過篩之后，用50ml的0.05M乙酸洗滌滲余物，并觀察壓力差異
直至流動停止。重復該操作3次。-然后，回收級分(濾過物和滲余物)，并通過添加NaCl以致達到0.6M的最終濃度而從每個級分沉淀膠原。然后通過離心或過濾收集沉淀，然后用丙酮脫水，在減壓下干燥，并稱重。本發(fā)明還涉及供制備膠原材料的形成酸性膠原的方法。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備膠原材料的方法，其特征在于包括下述步驟a)制備包含按重量計0. 05% 酸性形式的膠原的水溶液，b)對所述膠原水溶液進行模塑或澆注，c)通過用氨氣處理使所述膠原水溶液凝結，d)去除氨并獲得膠原材料。因此，在一個特別有利的實施方案中，本發(fā)明涉及制備膠原材料的方法，其特征在于包括下述步驟a)制備酸性形式的膠原的水溶液，b)添加在酸性pH非反應性的醛交聯(lián)劑，c)對所述膠原水溶液進行模塑或澆注，d)通過用氨氣處理使所述膠原水溶液凝結和交聯(lián)，e)去除氨并獲得膠原材料。本發(fā)明方法的第一步包括制備膠原水溶液?！澳z原水溶液”亦指膠原懸液。本發(fā)明的方法使用酸性形式的膠原?！八嵝孕问降哪z原”指其中大多數(shù)羧基官能團質(zhì)子化并在水中的懸液或溶液中具有酸性PH的膠原。優(yōu)選地，本發(fā)明制備膠原材料的方法使用酸性纖維膠原。
“纖維膠原”指其中膠原分子并未單體化(individualize)或單體化不良，并因此包含由通過弱鍵和共價鍵及此類結構的集合天然地相互連接的膠原分子構成的纖維和原纖維的膠原。纖維膠原特別包含在水性介質(zhì)中分散得到均一懸液的長顆粒(當水合時大多大于5 μ m)。特別地，纖維膠原可為皮膚纖維膠原或腱纖維膠原。皮膚纖維膠原由于該組織的天然架構(organization)包含相對較短的纖維，可溶于酸的膠原和小聚集物。腱的膠原包含長纖維和非常少的可溶性膠原。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是用腱纖維膠原，優(yōu)選用豬腱纖維膠原，且更優(yōu)選用幼于10 個月的豬的腱纖維膠原實施的。有利地，本發(fā)明的方法使用根據(jù)如上所述的方法制備、具有長纖維的酸性腱纖維膠原。因此，第一步包括將膠原溶于水。這是根據(jù)文獻中描述的標準方法進行的。當所述膠原為酸性纖維膠原時，該步驟使得由微纖維膠原和保持纖維化所需結構的所謂可溶性膠原圍繞的纖維的懸浮。通常，所述膠原水溶液包含按重量計0.05%至3%的膠原和優(yōu)選0.05%和0. 1%, 0.8%U%>1.5%,2%,2. 5%、以及和3%之間的膠原。有利地，所述水溶液包含按重量計 0.8%的膠原。所述溶解通常是在水中通過機械攪拌，優(yōu)選在減壓下進行的。所述懸液或溶液亦可在30-100°C的溫度加熱2分鐘至20分鐘以使所述膠原部分或完全變性。本發(fā)明的方法使得可能獲得按照模塑或澆注中選定的形式的多種膠原材料。因此，所述膠原材料可特別地成為膜、基質(zhì)、薄膜、線狀物、凝膠、管狀物或海綿狀物的形式。膠原水溶液的澆注或模塑對本領域技術人員是公知的，并在文獻中有所描述。因此，第二步為將所述膠原溶液澆注或模塑入模中，其中其厚度根據(jù)所需材料和模表面而變化。膠原膜為在含有一部分纖維和原纖維的膠原溶液或均一懸液的平模(flat mold) 中干燥所得的二維材料。該膠原可為交聯(lián)或非交聯(lián)的。干燥的懸液的濃度確定最終材料的厚度，其范圍可為數(shù)微米至幾百微米。膠原薄膜是在均一膠原溶液的平模中干燥所得的二維材料。該膠原可為交聯(lián)或非交聯(lián)的。干燥的懸液的濃度確定最終材料的厚度。薄膜和膜可折疊形成筒，視需要可用縫線或膠使筒閉合。其厚度可從幾微米變動至幾百微米。膠原管狀物是中空的三維圓柱形物， 其壁可為膠原膜或薄膜。管狀物可通過在模周圍模塑或通過擠出獲得。壁厚度是由沉積于膜上或用于擠出溶液的膠原的量確定的。膠原線狀物是下述膠原的大量集合，其機械強度足以使其稱為更大的多鏈線狀物、復合或非復合紡織品或其他膠原材料的組合物的部分。膠原海綿狀物可通過凍干膠原溶液或懸液(或這兩種的混合物)來獲得。在凍干之前或之后，可交聯(lián)所述膠原。凍干一般導致三維材料或粉末。為了獲得膜或薄膜，可將膠原溶液沉積于平模上以在使溶液或懸液干燥之后獲得二維材料。所述膜或薄膜可通過蒸發(fā)溶劑獲得。膠原管狀物是通過將所述溶液或懸液沉積于圓柱形模并干燥或凍干來獲得的。為了獲得海綿狀物，可通過凍干，而不通過蒸發(fā)液體形式的溶劑來去除溶劑。
之前已知使用氨用來凝結并形成膠原，但一般而言已知方法涉及使用氨以在例如擠出中凝結溶液或凝膠。然后，用氨處理非常迅速，在浴中進行。本發(fā)明的方法依賴于氨在膠原溶液中的擴散速率，該速率主要取決于該堿在溶液表面的濃度。使膠原和氨接觸充分時間以使得膠原在整個經(jīng)處理的溶液中能夠凝結，但亦能夠纖維化。這導致下述膠原材料的制備，其具有現(xiàn)有技術方法無法獲得的機械特性，包括拉伸強度、彈性和縫線保持強度。因此，第三步是通過用氨處理膠原一段足以而膠原凝結和纖維化的時間而使其凝結。通常，氨處理進行4小時、8小時、12小時、24小時、36小時或48小時。優(yōu)選地，處理期間大于M小時或36小時?？烧{(diào)整氨的量以將酸性pH的膠原凝膠的pH增加至至少大于8。更特別地，凝膠的交聯(lián)起始于膠原凝膠達到至少大于8的pH。該長時間處理使得膠原pH持續(xù)增加，這不僅導致其凝膠，還導致其纖維化。取決于使用的膠原纖維的長度，所述纖維化形成網(wǎng)絡，賦予所述材料機械強度和彈性兩者。在一個優(yōu)選實施方案中，氨氣是從釋放其的氨溶液制備的。一般而言，在 IO0C -25°c的溫度從至少30%的氨溶液獲得合適量的氨氣。優(yōu)選地，該步驟是在氣密外殼中以使得氨氣在該外殼內(nèi)擴散并與膠原溶液接觸的方式進行的，其中所述膠原溶液不與氨溶液相接觸。處理獲得的膠原凝膠以去除過量氨，并照原樣或以脫水狀態(tài)保存。為此目的，可將凝膠置于配備有去除水分的系統(tǒng)和/或氨吸收儀(absorber)的外殼中。在去除過量氨之后，通過將凝膠在干燥空氣流下脫水來獲得膜、薄膜和管狀物，而通過凍干凝膠獲得海綿狀物、3-D基質(zhì)和管狀物?？蓪⒛z維持在水合狀態(tài)。在所述制備膠原材料的方法中，纖維化工藝發(fā)生于高度粘稠的液體介質(zhì)中。由于氨的擴散，所述纖維化從溶液外側向內(nèi)側發(fā)生，并隨著PH的增加而進行。其發(fā)生于pH達到大于4或5的值時。氨蒸汽方法的優(yōu)點是無需將材料浸沒于中和溶液，這節(jié)約了時間，增加了利潤和均一度。當需要增加膠原醫(yī)療裝置的吸收時間時和強化其機械特性，可將膠原材料交聯(lián)。 對于本領域技術人員有許多公知的膠原交聯(lián)方法。其分為兩大類物理交聯(lián)如例如熱脫水， 和通過添加或與交聯(lián)劑接觸的化學交聯(lián)。最為人熟知的膠原交聯(lián)劑為醛試劑，特別是甲醛和戊二醛。所述交聯(lián)方法可當然地用于由上所獲得的膠原材料。因此，可將膠原和膠原材料交聯(lián)以增加其機械強度。所述交聯(lián)步驟因此在該方法的最后步驟d)之后進行，導致獲得膠原材料。例如，其為通過將膠原材料浸沒于包含選自甲醛、戊二醛、氧化的糖原和氧化的支鏈淀粉的交聯(lián)劑的浴中來進行的。特別有利地，交聯(lián)可相反地在一個單一步驟中發(fā)生，但以順次方式隨著膠原的凝結和纖維化發(fā)生。在該情況下，將不與膠原在酸性PH反應的醛試劑添加至起始膠原溶液然后進行氨處理以獲得至少大于8的pH。所述醛交聯(lián)劑優(yōu)選選自多糖，更特別地氧化的多糖。優(yōu)選地，所述醛交聯(lián)劑選自下組氧化的糖原和氧化的支鏈淀粉。可用于本發(fā)明方法的交聯(lián)劑為，例如，本領域技術人員已知的氧化的淀粉，氧化的右旋糖酐和氧化的纖維素。優(yōu)選地，所述醛交聯(lián)劑是氧化的糖原。將交聯(lián)劑以從0. 05,0. 1,0. 5、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5 至 5 的醛交聯(lián)劑的 CHO比對于膠原的NH2的比例范圍添加。交聯(lián)劑的比例可由本領域技術人員根據(jù)所需的交聯(lián)率進行調(diào)整。因此，待添加至膠原溶液的交聯(lián)劑的量可使用本領域技術人員的一般知識來確定。優(yōu)選地，由此制備了選定的氧化的多糖的濃縮(15% )水溶液。氧化率和待添加的交聯(lián)劑的量是根據(jù)所需的吸收和所尋求的機械特性確定的。然后可以將交聯(lián)劑以完美控制和可重現(xiàn)的量添加至膠原(不像例如通過甲醛蒸汽或浸沒于浴進行的交聯(lián))。在此，僅添加的交聯(lián)劑可參與反應。在澆注或成型之前將交聯(lián)溶液添加至膠原溶液，即在減壓下勻漿結束時添加。所得的介質(zhì)是膠原和交聯(lián)劑的均一混合物，盡管狀物兩者之間的鍵合尚未形成， 因為該混合物尚未達到堿性PH。后續(xù)步驟與膠原的纖維化相同，其中纖維化和交聯(lián)以此順序連續(xù)進行。本領域技術人員能夠調(diào)適氨的量和暴露時間以取得所需的纖維化和交聯(lián)。本發(fā)明方法的該步驟由于幾個原因是重要的。通過醛多糖的交聯(lián)已描述于文獻 (Gagnieu CH和forest P0, EP0862468) 0此種交聯(lián)可通過下述方法進行，將待交聯(lián)的材料浸沒于氧化的多糖溶液中，或者將氧化的多糖添加至該材料然后將干燥產(chǎn)物浸沒于浴中， 使得交聯(lián)反應能夠發(fā)生(PH增加)。一般而言，PH的變化是通過緩沖液進行的?？紤]到公知的交聯(lián)原理(Maillard反應一交聯(lián)劑的CHO基團與膠原的NH2基團的反應)，應避免使用自身具有胺殘基的堿改變PH。因此，在氨的存在下，該理論預測氧化的多糖會與氨的氨基反應并接著會失活。因此交聯(lián)無法進行。實踐中，結果發(fā)現(xiàn)氨的存在令人滿意地改變了膠原凝膠的pH以使得不僅纖維化而且交聯(lián)能夠進行。以非常令人驚訝的方式，交聯(lián)以有效的速率進行，因為本應必然發(fā)生在氨和交聯(lián)劑的醛之間，從而使后者失活的Mailard反應不存在或非常弱，或無法與氧化的多糖的醛基團和膠原的賴氨酸氨基之間的交聯(lián)反應相競爭。這可由下述事實說明首先，以此方式交聯(lián)的材料不再溶于酸性水性介質(zhì)，并與非交聯(lián)材料相比，在與蛋白分解酶接觸時具有較少的降解，其次，水合形式的材料的機械特性，特別是機械強度，與非交聯(lián)材料相比也有所改善。本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明的方法獲得的膠原材料。優(yōu)選地，所述膠原材料是交聯(lián)的。所述膠原材料可例如包括膠原膜、膠原線狀物、膠原管狀物、膠原海綿狀物或膠原凝膠。因此，本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明的方法獲得的膠原薄膜、線狀物和管狀物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及可通過本發(fā)明方法獲得的膠原膜。根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠制備從數(shù)微米至數(shù)百微米范圍的不同厚度的干燥膜。 一般用于確保引導的瘢痕形成(維持切割平面)或組織替代物(泌尿科、婦科、心臟、胸部、 血管、關節(jié)、消化道、整形外科、脊椎、神經(jīng)科、骨科、創(chuàng)傷、牙科、口腔科和頌面手術中)，用于引導的組織瘢痕形成(硬膜(dura matter)、牙齦、骨、神經(jīng)、腱、韌帶、內(nèi)臟、心包、腹膜、一般結締組織、真皮、肌肉、軟骨)的厚度是30 μ m至200 μ m。因此，本發(fā)明涉及可通過本發(fā)明方法獲得、具有30μπι至200μπι的干燥厚度的膠原膜。優(yōu)選地，所述膜是交聯(lián)的。有利地，所述膜包含具有50 μ m至150 μ m干燥厚度的非孔狀膠原單層。在一個實施方案中，本發(fā)明的目標涉及具有80 μ m至120 μ m的干燥厚度，12mg/cm2至16mg/cm2的密度，低于6的溶脹比，大于IN的縫線保持強度，大于4MPa的屈服強度和少于35%的通過胰蛋白酶的酶降解百分比的膠原膜。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及具有4至6的溶脹比，IN至2. 5N的縫線保持強度，4MPa至7MPa的屈服強度和20%至35%的通過胰蛋白酶的酶降解百分比的如上所述的膠原膜。溶脹比的測量如下所述將20mg材料在37°C浸沒于IX磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7. 4 進行60分鐘。在一小時之后，用吸收紙去除過量水并再次稱量樣品。溶脹比是通過濕材料的重量對干燥材料的重量的比來計算的。機械應力(縫線保持強度和屈服強度)的測量是在潤濕的5mm寬試管中使用拉伸強度測試臺進行的。對于縫線保持強度，將編織的3-0聚酰胺縫線穿過膜，然后使用拉伸強度測試臺測量使縫線斷裂所施加的最大力。為了確定通過胰蛋白酶的酶降解，將重量為IOmg至20mg的材料碎片浸沒于:3ml 的1XPBS，pH 7. 6，并將500單位的胰蛋白酶添加至樣品。在降解48小時之后，收集、脫水并稱重消化的樣品。然后計算相對于起始重量的重量喪失。本發(fā)明還涉及用可吸收的的不可吸收的紡織品強化的膠原膜。所述經(jīng)紡織品強化的膜構成顱頂強化材料，并特別適于內(nèi)臟和泌尿生殖系統(tǒng)手術或適于強化、延伸或替代韌帶或腱的韌帶補片(ligament patch)。因此，本發(fā)明的另一個目的涉及復合材料，其包含在一側由如上所述的膠原材料覆蓋的紡織品，或由其組成。特別地，其可為在其一側攜帶本發(fā)明的膠原膜的紡織品。此種假體織物及其制造方法，描述于，例如US6451032。本發(fā)明的織物強化的膠原膜可進一步根據(jù)本領域技術人員公知的方法來制造。在本發(fā)明的上下文中，此種方法可包括下述步驟-制備酸性形式的膠原水溶液，-添加在酸性pH非反應性的醛交聯(lián)劑，-對膠原水溶液進行模塑或澆注，-將所述紡織物沉積于膠原上，-通過用氨處理使所述膠原水溶液凝結和交聯(lián)，-去除氨并獲得膠原材料。根據(jù)如上所述的方法在一側用紡織品強化的膜特別適于顱頂手術。或者，所述方法可包括下述步驟-制備酸性形式的膠原水溶液，-添加在酸性pH非反應性的醛交聯(lián)劑，-對膠原水溶液進行模塑或澆注，-將紡織品納入膠原中，-通過用氨處理使所述膠原水溶液凝結和交聯(lián)，-去除氨并獲得所述膠原材料。因此，在其兩側包含本發(fā)明的膜的紡織品特別適于，例如韌帶手術。因此，本發(fā)明的另一個目的涉及復合材料，其包含用如上所述的膠原材料覆蓋其兩側，更特別是每一側的紡織品，其中特別是該紡織品可容納于所述膠原材料中。將本發(fā)明的膠原材料與紡織品組合的其他方法對于本領域技術人員是已知的。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的膠原材料，特別是膜，與紡織品組合。本發(fā)明的方法還導致制備管狀物以確保在神經(jīng)、腱、韌帶和血管手術中引導器官。 用于該適應癥的膜亦可為卷攏的和通過縫線和/或膠封閉為筒的。最后，所述方法使得能夠制備厚度大于200 μ m的多孔或無孔狀3D基質(zhì)，其使得能夠在手術植入所述材料以供再生醫(yī)學中的應用時或之前接種細胞，但不限于此，且其使得供心臟應用、硬膜再生和軟組織和硬組織的引導的可縫性和彈性補片可以獲得。實施例實施例1 酸件腱纖維膠原的產(chǎn)?！斓娜苊浨謇硪磺Э藖碜载i足部的腱去除肌肉和腱膜組織。將其在20°C (士2°C )在緩慢攪拌下浸沒于2 的0. 3M乙酸水溶液中10日?！心ル鞂@得的三升懸液以3000rpm在刀式粉碎機(knife mill)中粉碎2分鐘。將介質(zhì)用21水稀釋，然后勻漿1分鐘。將介質(zhì)在具有200 μ m孔徑大小的過濾器上過濾，并用0. 6M NaCl調(diào)整濾過物以沉淀膠原?！z原的回收和洗滌將懸液過濾或離心以從上清分離沉淀。收集沉淀并將其在101的0. BMNaCl中在攪拌下洗滌至少1小時；再次通過在織物上過濾或離心收集沉淀。洗滌步驟可根據(jù)最終膠原的所需純度進行所需次數(shù)的洗滌(理想為兩次)?！《臼Щ詈拖礈鞂⒊恋砗托D(zhuǎn)干燥的膠原在攪拌下溶解16小時于水至1%。將介質(zhì)的濃度調(diào)至 IM NaOH,并在20°C將溶液攪拌1小時。在失活步驟結束時，用6M鹽酸中和溶液直至膠原沉淀。通過過濾或離心回收膠原?？蓪⒛z原再次在101的0. 6M NaCl中洗滌，然后通過在織物上過濾或通過離心收集。洗滌步驟可根據(jù)最終膠原的所需純度進行所需次數(shù)的洗滌(理想為兩次)?！斋@和干燥在純化工藝結束時，將沉淀的膠原旋轉(zhuǎn)干燥，然后在丙酮浴中干燥。將膠原在控制氣流下最終干燥以去除剩余的丙酮，然后在例如-20°C儲存。實施例2 酸性腱纖維膠原的批次的表征將603mg具有17. 05%水含量的酸性腱纖維膠原在磁力攪拌下分散于500ml去礦物質(zhì)水中16小時。將具有50 μ m孔徑的織物置于容器上的9cm直徑的圓柱形支持物。將一定體積的膠原溶液以不超過4cm高度的方式傾于織物上。將7cm直徑的葉片置于距織物 2cm處，并以SOrpm旋轉(zhuǎn)；將膠原溶液逐漸流過織物。當上部腔室中所含的體積不再減少時， 以不超過4cm高度的方式重新加載系統(tǒng)。進行所述操作直至制備的溶液耗盡。在系統(tǒng)平衡時，將滲余物用3x50ml的0. 05M乙酸用相同系統(tǒng)洗滌，而保持各自的壓力差。收集上部級分?；厥障虏考壏植⒗^續(xù)以相同方式繼續(xù)在具有5μπι孔徑的織物上進行分析。收集滲余物以及濾過物。將三個級分，即來自50 μ m過濾的滲余物和來自5 μ m過濾的滲余物和濾過物調(diào)至0.6M NaCl，并通過離心回收膠原，然后在兩個70%丙酮和三個100%丙酮的浴中干燥。 通過在空氣流下干燥來去除過量的丙酮。稱量級分，并將其與收集的總重量相比較。分析顯示6. 5 %的纖維保留在50 μ m過濾器上，27 %的纖維穿過5 μ m過濾器，因此66. 5 %為 5 μ m-50 μ m。實施例3 交聯(lián)膠原膜/薄膜#1的制備將SOOmg的酸性腱纖維膠原在機械攪拌下懸于IOOml水中進行16小時。將粘稠的懸液以^ig膠原/cm2的密度傾倒至模中。將含有所述膠原溶液的模在20°C置于含有aiil 的30%氨的31氣密外殼中M小時。將凝膠置于外殼中以用氨和水分吸收器去除過量的氨以獲得厚度大約40 μ m的薄膜。所述薄膜可照原樣使用或通過浸沒于不同濃度的甲醛、戊二醛、氧化的糖原或氧化的支鏈淀粉浴中以2分鐘至M小時的時間進行交聯(lián)。通過將薄膜在PH 8浸沒于0. IM甘氨酸溶液2小時來使交聯(lián)劑失活。然后再次干燥薄膜。例如，將在第一次干燥之后獲得的薄膜在0. 甲醛浴在pH 8中浸沒1小時，然后在0. IM甘氨酸浴，pH 8中漂洗2小時。在用水漂洗之后，再次干燥薄膜。實施例4 交聯(lián)膠原膜#2的制備為了獲得含有IOmg膠原/cm2的膜，將IOOg的膠原在機械攪拌下懸于12. 51水中進行16小時。與此同時，制備在pH 7. 7磷酸緩沖液中溶解至15%的2. 5g的氧化的糖原， 并在所述16小時結束時添加至懸液。在勻漿之后，將溶液傾倒至Im2模中(或等同物)。 將含有膠原溶液的模在20°C置于含有160ml的32%均勻分布的氨的大約3001氣密外殼中 48小時。在纖維化和交聯(lián)期結束時，將凝膠置于外殼中以用氨和水分吸收器去除過量的氨以獲得大約100 μ m厚度的膜。實施例5 實施例4中制備的膜的溶脹比的測量精確稱量20. 5mg、22mg和20mg材料的三個樣品，并將其在37°C浸沒于3ml的IX PBS, pH 7.4中1小時。在一小時后，去除來自每個樣品的多余水分，并再次稱量樣品。結果如下所述
樣品重量溶賬后重量溶賬比樣品 1__205__IJO__15_
權利要求
1.一種制備膠原材料的方法，其特征在于包括下述步驟a)制備酸性形式的天然或變性膠原的水溶液，b)添加在酸性PH非反應性的醛交聯(lián)劑，c)對所述膠原水溶液進行模塑或澆注，d)通過用氨氣處理使得所述膠原水溶液凝結并交聯(lián)，e)去除過量的氨，并通過干燥獲得所述膠原材料。
2.權利要求1的制備膠原材料的方法，其特征在于步驟a)的水溶液包含按重量計 0. 05%至3%的酸性形式的膠原。
3.權利要求1或權利要求2的制備膠原材料的方法，其特征在于步驟a)的水溶液是用選自下組膠原的酸性纖維膠原制備的豬腱、牛腱、羊腱和驢腱(et de tendons de poulain)。
4.權利要求1至3任一項的制備膠原材料的方法，其特征在于在步驟d)過程中，膠原溶液的凝結和交聯(lián)是通過用氨氣處理至少M小時來進行的。
5.權利要求1至4任一項的制備膠原材料的方法，其特征在于包括添加在酸性PH非反應性的醛交聯(lián)劑，并通過用氨氣處理使所述膠原水溶液進行凝結和交聯(lián)。
6.權利要求5的制備膠原材料的方法，其特征在于所述醛交聯(lián)劑選自糖原和醛支鏈淀粉。
7.權利要求6的制備膠原材料的方法，其特征在于所述醛交聯(lián)劑是氧化的糖原。
8.權利要求5至7任一項的制備膠原材料的方法，其特征在于所述醛交聯(lián)劑是以0.05 至5的醛交聯(lián)劑的CHO比對于膠原的NH2的比例范圍添加的。
9.權利要求1至8任一項的制備膠原材料的方法，其特征在于所述膠原材料是膜，其中在步驟c)中，將膠原水溶液沉積于平模上，且其中在步驟e)中去除過量的氨，并通過干燥獲得膠原膜。
10.通過權利要求1至9任一項的方法獲得的膠原材料，包括膠原膜、膠原薄膜、膠原線狀物、膠原管狀物、膠原海綿狀物或膠原凝膠。
11.膠原材料，特別是權利要求10的膠原材料，其具有均一的交聯(lián)，特別是外側表面上的交聯(lián)和材料內(nèi)側的交聯(lián)之間的差異小于或等于25%。
12.膠原材料，特別是權利要求10或權利要求11的膠原材料，其中變性溫度相對于非交聯(lián)的膠原材料的增加大于或等于3°C。
13.交聯(lián)的膠原材料，特別是權利要求10至12任一項的膠原材料，其中變性溫度相對于非交聯(lián)材料的增加為至少5%。
14.膠原膜，其具有80μ m至120 μ m的干燥厚度，12mg/cm2至16mg/cm2的密度，少于6 的溶脹比，大于IN的縫線保持強度，大于的屈服強度和少于35%的通過胰蛋白酶的酶降解百分比。
15.復合材料，包含在其一側或每一側由權利要求10至13任一項所述的材料覆蓋的紡織品，特別是所述紡織品可容納于所述膠原材料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的膠原材料，且特別涉及膠原膜、管狀物和線狀物。所述材料兼具增強的彈性和強度特性。本發(fā)明還涉及使用酸性纖維膠原制備膠原材料的方法，包括在氨氣存在下對膠原進行凝結和任選地交聯(lián)。
文檔編號A61L27/58GK102458493SQ201080028976
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權日2009年4月28日
發(fā)明者C.加紐, P.弗雷斯特, S.皮科特 申請人:比奧馬普公司