專利名稱：人抗TNF-α抗體的穩(wěn)定高蛋白質(zhì)濃度制劑的制作方法
人抗TNF-α抗體的穩(wěn)定高蛋白質(zhì)濃度制劑相關(guān)申請
本申請要求于2009年5月4日提交的美國臨時申請?zhí)?1/175，380的優(yōu)先權(quán)，其完整內(nèi)容引入本文作為參考。背景
已知制劑必須是經(jīng)濟(jì)上和治療上成功的眾多所需性質(zhì)，例如穩(wěn)定性、用于施用的適合性、濃度，治療用蛋白質(zhì)例如抗體的制劑通常是挑戰(zhàn)。在制造、貯存和遞送過程中，治療用蛋白質(zhì)已知經(jīng)歷物理和化學(xué)降解。這些不穩(wěn)定性可以減少蛋白質(zhì)的效力且增加在患者中的不利事件的危險，并且因此，顯著影響管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)(參見例如，Wang，等人(2007) J Pharm Sci 96:1)。因此，穩(wěn)定蛋白質(zhì)制劑是治療用蛋白質(zhì)成功必需的。為了是有效的，許多治療用蛋白質(zhì)需要高劑量的施用，這優(yōu)選以高濃度制劑進(jìn)行配制。高蛋白質(zhì)濃度制劑是希望的，因為它們可以影響藥物對受試者的施用方式(例如靜脈內(nèi)與皮下比較)和頻率。盡管高蛋白質(zhì)濃度制劑的利益，但配制高濃度治療用蛋白質(zhì)仍提出了眾多挑戰(zhàn)。 例如，增加蛋白質(zhì)濃度經(jīng)常負(fù)面影響蛋白質(zhì)聚集、可溶性、穩(wěn)定性和粘度(參見例如，Shire, 等人(2004) J Pharm Sci 93:1390)。其為關(guān)于高蛋白質(zhì)溶液的非常通常挑戰(zhàn)的粘度增加可以對制劑的施用具有負(fù)面后果，例如感覺疼痛和燒傷綜合征以及在制備、加工、灌裝封裝 (fill-finish)和藥物遞送設(shè)備選擇中的局限性(參見例如，Shire，等人(2004) J Pharm Sci 93:1390)。即使對于具有常見結(jié)構(gòu)特征的治療用蛋白質(zhì)例如抗體，迄今為止批準(zhǔn)的制劑也具有改變的成分和濃度范圍。例如，抗⑶20抗體抗體Rituxan配制用于以10 mg/mL 的濃度靜脈內(nèi)施用，而抗RSV抗體Synagis配制用于以100 mg/mL的濃度肌內(nèi)施用。因此， 可以用于治療目的的高蛋白質(zhì)制劑尤其是抗體制劑仍是挑戰(zhàn)。因此，存在關(guān)于提供給藥和管理優(yōu)點的穩(wěn)定、高濃度蛋白質(zhì)制劑的需要。發(fā)明概述
本發(fā)明至少部分基于人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合片段例如阿達(dá)木單抗 (adalimumab)的新高濃度制劑的發(fā)現(xiàn)。給定抗體的高濃度，本發(fā)明的制劑提供了許多令人驚訝的特征。例如，盡管蛋白質(zhì)的高濃度，本發(fā)明的制劑在延長的時間段期間仍維持物理和化學(xué)穩(wěn)定性，并且具有適合于皮下施用的粘度。本發(fā)明的制劑至少部分在下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)上確立人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合部分在高濃度(例如100 mg/mL)可以保持穩(wěn)定，并且保持不聚集同時維持適合于注射(例如皮下施用)的粘度。本發(fā)明的制劑也是令人驚訝的，這是因為高濃度(例如100 mg/mL)的人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合部分在廣泛ρΗ 范圍例如約PH 5.2 -約ρΗ 6.0內(nèi)可以保持溶解，并且保持不聚集和化學(xué)穩(wěn)定的(例如無氧化或脫酰胺作用)。這些有利特征無需NaCl作為穩(wěn)定劑而達(dá)到，并且伴隨糖醇賦形劑中的增加。本發(fā)明的一個方面提供了包含超過40 mg多元醇和至少約100 mg/mL人抗TNF-a 抗體或其抗原結(jié)合部分的液體藥物制劑。本發(fā)明的另一個方面提供了包含超過20 mg多元醇和至少約100 mg/mL人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合部分的液體藥物制劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑不含有 NaCl。本發(fā)明的特征還在于具有約5. 0 - 6. 4的ρΗ且包含至少約100
抗體或其抗原結(jié)合部分的液體藥物制劑，其中所述制劑不含有NaCl，并且在標(biāo)準(zhǔn)M小時攪拌應(yīng)力(stir-stress)測定后或在作為液體長期貯存M個月后具有小于60 NTU的濁度。本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有約5. 0 - 6. 4的ρΗ且包含至少約100
抗體或其抗原結(jié)合部分的液體藥物制劑，其中所述制劑不含有NaCl，并且在標(biāo)準(zhǔn)48小時攪拌應(yīng)力測定后具有小于100 NTU的濁度。本發(fā)明的另一個方面包括具有約5. 0 - 6. 4的ρΗ且包含至少約100 mg/mL人抗 TNF-α抗體或其抗原結(jié)合部分的液體藥物制劑，其中所述制劑不含有NaCl，并且在5°C、 25°C或40°C 3個月貯存后具有小于40 NTU的濁度。本發(fā)明還提供了液體藥物制劑，其包含至少約100 mg/mL人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合部分；
超過約20 mg/mL多元醇；0. 1-2. 0 mg/mL表面活性劑；約1. 15-1. 45 mg/mL檸檬酸* H2O ；約 0. 2-0. 4 mg/mL 脫水檸檬酸鈉；約 1. 35-1. 75 mg/mL Na2HPO4* 2 H2O ；約 0. 75-0. 95 mg/mL NaH2PO4* 2 H2O,其中所述制劑具有約4. 7 - 6. 5的pH，并且不包含NaCl。本發(fā)明的制劑適合于皮下施用。因此，本發(fā)明還包括包含人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分的本發(fā)明的制劑用于治療與受試者中的有害TNFa活性相關(guān)的病癥的用途。在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑具有一定濃度的人TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分和約3. 1 - 3. 3 mPas*s的粘度。在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑包含超過20 mg多元醇?？梢园ㄔ诒景l(fā)明的制劑中的另外量的多元醇是超過30 mg多元醇?？商娲兀^40 mg多元醇可以在本發(fā)明的制劑中使用，包括但不限于40-45 mg或約42 mg。在一個實施方案中，在本發(fā)明的制劑中使用的多元醇是糖醇，例如但不限于甘露糖醇或山梨糖醇。在一個實施方案中，制劑包含約40-45 mg/mL甘露糖醇或山梨糖醇。本領(lǐng)域已知的各種表面活性劑可以在本發(fā)明的制劑中使用。在一個實施方案中， 表面活性劑是聚山梨醇酯80。在進(jìn)一步的實施方案中，約0. 1-2.0 mg/mL聚山梨醇酯80在本發(fā)明的制劑中使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，制劑包含約1. 30-1. 31 mg/mL檸檬酸* H2O0在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑包含約0. 30-0. 31 mg/mL脫水檸檬酸鈉。在本發(fā)明的另外一個實施方案中，制劑包含約1. 50-1. 56 mg/mL Na2HPO4* 2 H2O0在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案中，制劑包含約0.83-0. 89 mg/mL NaH2PO4* 2 H2O0在另一個實施方案中，本發(fā)明的制劑的ρΗ范圍為約4. 8 -約6. 4。例如，本發(fā)明的制劑的PH可以范圍為約5.0 -約5.4 (例如約5. 2)或可以范圍為約5. 8 -約6. 4 (例如約6.0)。本發(fā)明的制劑的優(yōu)點是它提供了抗體的高濃度而無增加的蛋白質(zhì)聚集，所述蛋白質(zhì)聚集通常伴隨增加的蛋白質(zhì)濃度而發(fā)生。在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑具有小于約
的聚集蛋白質(zhì)。作為本發(fā)明的部分還預(yù)期的是具有至少約50 mg/mL濃度的人抗TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分的本文描述的制劑。在一個實施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈包括包含如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域，且所述重鏈包括包含如SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列的CDR3結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體具有包含SEQ ID NO :3，或通過在位置1、4、5、7 或8上的單個丙氨酸取代，或通過在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1 - 5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO :3修飾的氨基酸序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，并且具有包含SEQ ID NO 4, 或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代，或通過在位置2、3、4、5、6、8、
9、10、11和/或12上的1- 5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO :4修飾的氨基酸序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗體可以具有某些功能特征。例如，人抗體或其抗原結(jié)合部分可以以1 χ
10、或更少的Kd與人TNFα解離，以1 χ ΙΟ、—1或更少的K。ff速率常數(shù)與人TNF α解離， 兩者都通過表面等離振子共振進(jìn)行測定，和/或在標(biāo)準(zhǔn)體外測定中以1 χ 10_7M或更少的IC5tl中和人TNF α細(xì)胞毒性。在一個實施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分是人IgGl κ抗體。在本發(fā)明的一個實施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈進(jìn)一步包括包含如 SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域，和包含如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域，和/或人抗體的重鏈包括包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的⑶R2 結(jié)構(gòu)域，和包含如SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中， 人抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，并且人抗體的重鏈包含如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明中還包括的是具有這樣的氨基酸序列的人抗體或其抗原結(jié)合部分，所述氨基酸序列與本文所述的SEQ ID NOs至少80%、85%、 90%,95%,96%,97%,98%^； 99%等同。在本發(fā)明的另外一個實施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達(dá)木單抗。附圖簡述


圖1是描述在包含0. 1% Solutol的溶液中高分子量(hmw)蛋白質(zhì)樣品的存在的曲線圖。根據(jù)MALS (灰線)，聚集體摩爾質(zhì)量最高幾乎等于109g/mol，占總蛋白的2. 6% (UV280, 黑線)。在40°C貯存12周。圖2A和2B是描述在40°C貯存過程中出現(xiàn)的高分子量(hmw)聚集體的早期檢測的曲線圖。雖然經(jīng)由UW80 (黑曲線)不能檢測到聚集體，但MALS (灰曲線)明確地證明了 hmw 樣品的存在。一周貯存(A)與原始樣品(B)比較。圖3是描述制劑F1-F6的濁度與凍/融循環(huán)比較的曲線圖。圖4是描述制劑F1-F6的多分散性指數(shù)與凍/融循環(huán)比較的曲線圖。圖5是描述制劑F1-F6的通過SEC的聚集體水平與凍/融循環(huán)比較的曲線圖。圖6是描述在TO時通過制劑F1-F6的DSC以。C表示的Tm的曲線圖。圖7是描述制劑F1-F6的通過SEC的聚集體水平與攪拌時間比較的曲線圖。圖8是描述在F2、F6和F7 (3個代表性批次01032-0134)的3個月貯存后，在穩(wěn)定性研究中獲得的濁度值比較的曲線圖。圖9是描述在F2、F6和F7 (3個代表性批次01032-0134)的3個月貯存后，在穩(wěn)定性研究中獲得的通過DAC得分的可見粒子值比較的曲線圖。圖10是描述在F2、F6和F7 (3個代表性批次01032-0134)的3個月貯存后，在穩(wěn)定性研究中獲得的亞可見(sub-visible)粒子值(>=10Mm)比較的曲線圖。圖11是描述在F2、F6和F7 (3個代表性批次01032-0134)的3個月貯存后，在穩(wěn)定性研究中獲得的亞可見粒子值(>=25Mm)比較的曲線圖。圖12是描述在F2、F6和F7 (3個代表性批次01032-0134)的3個月貯存后，在穩(wěn)定性研究中獲得的殘留單體含量比較的曲線圖。圖13是描述在F2、F6和F7 (3個代表性批次01032-0134)的3個月貯存后，在穩(wěn)定性研究中獲得的賴氨酸變體總和比較的曲線圖。圖14是描述在M小時后就針對以不同攪拌速度的攪拌應(yīng)力的穩(wěn)定性而言，比較 F2、F6和F7的濁度數(shù)據(jù)的曲線圖。圖15是描述在M小時后就針對以不同攪拌速度的攪拌應(yīng)力的穩(wěn)定性而言，比較 F2、F6和F7的DLS數(shù)據(jù)(Z平均值)的曲線圖。圖16是描述在幾個泵循環(huán)前和后就針對應(yīng)力的穩(wěn)定性而言，比較F2、F6和F7的濁度數(shù)據(jù)的曲線圖。圖17是描述在幾個泵循環(huán)前和后就穩(wěn)定性而言，比較F2、F6和F7的DLS數(shù)據(jù)(Z 平均值)的曲線圖。圖18是描述在幾個泵循環(huán)前和后就穩(wěn)定性而言，比較F2、F6和F7的SEC數(shù)據(jù)(聚集體水平)的曲線圖。圖19是描述使用蠕動泵填充的100 mg/mL制劑的視覺得分的曲線圖。圖20是描述使用活塞泵填充的100 mg/mL制劑的視覺得分的曲線圖。圖21是描述使用蠕動泵填充的100 mg/mL制劑的濁度的曲線圖。圖22是描述使用活塞泵填充的100 mg/mL制劑的濁度的曲線圖。圖23是描述制劑F8-F11在TO時和在5°C的4周貯存后的濁度的曲線圖。圖M是描述制劑F8-F11在TO時和在5°C的4周貯存后的單體含量的曲線圖。圖25是描述制劑F8-F11在TO時和在5°C的4周貯存后的聚集體水平的曲線圖。圖沈是描述制劑F8-F11在TO時和在5°C的4周貯存后的亞可見粒子計數(shù)的曲線圖。發(fā)明詳述
I.定義
為了本發(fā)明可以更容易理解，首先定義了某些術(shù)語。此外，應(yīng)當(dāng)指出每當(dāng)敘述參數(shù)的值或值范圍時，預(yù)期對于所述值中間的值和范圍也預(yù)期是本發(fā)明的部分。術(shù)語“藥物制劑”指這樣的制劑，其為此種形式以便允許活性成分的生物學(xué)活性明確有效，并且不含有對于制劑將施用于其的受試者明顯有毒的另外組分。短語“藥學(xué)可接受的載體”是領(lǐng)域公認(rèn)的，并且包括適合于施用于哺乳動物的藥學(xué)可接受的材料、組合物或載體。載體包括液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊化 (encapsulating)材料，涉及攜帶或轉(zhuǎn)運主題試劑從身體的一個器官或部分到身體的另一個器官或部分。每個載體必須是在與制劑的其他成分相容的意義上“可接受的”，并且對患者的安全無害或不影響患者的安全。
“藥學(xué)可接受的賦形劑”(載體、添加劑)是可以合理地施用于主題哺乳動物以提供采用的活性成分的有效劑量的那些。術(shù)語“賦形劑”指可以加入制劑中以提供所需一致性例如改變膨脹性質(zhì)，以改善穩(wěn)定性和/或調(diào)整重量摩爾滲透壓濃度的試劑。常用賦形劑的例子包括但不限于糖、多元醇、 氨基酸、表面活性劑和聚合物。常用賦形劑是多元醇。如本文使用的，“多元醇”是具有多個羥基的物質(zhì)，并且包括糖(還原和非還原糖)、糖醇和糖酸。本文優(yōu)選的多元醇具有小于約600 kD的分子量(例如在約120 -約400 kD的范圍中)。多元醇的非限制性例子是果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、蘇糖醇、山梨糖醇、甘油、L-葡糖酸及其金屬鹽。如本文使用的，“緩沖液”指通過其酸堿共軛組分的作用抵抗pH中的改變的緩沖溶液。本發(fā)明的緩沖液具有在約4 -約8范圍中的pH ；優(yōu)選約4.5 -約7;并且最優(yōu)選具有在約5.0 -約6. 5范圍中的pH。將pH控制在這個范圍中的緩沖液的例子包括磷酸鹽、乙酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、谷氨酸、組氨酸、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸緩沖液。在一個實施方案中，適合于在本發(fā)明的制劑中使用的緩沖液是檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液。術(shù)語“表面活性劑”一般包括保護(hù)制劑中的蛋白質(zhì)不受空氣/溶液界面誘導(dǎo)的應(yīng)力和/或溶液/表面誘導(dǎo)的應(yīng)力的那些試劑。例如，表面活性劑可以保護(hù)蛋白質(zhì)不受聚集。 合適的表面活性劑可以包括例如聚山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35. RTM.，或泊洛沙姆例如Tween 20,Tween 80或泊洛沙姆188。優(yōu)選去污劑是泊洛沙姆例如泊洛沙姆188、 泊洛沙姆 407 ；聚氧乙烯燒基醚例如 Brij 35. RTM.、Cremophor A25、Sympatens ALM/230 ； 和聚山梨醇酯/Tweens，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Mirj和泊洛沙姆例如泊洛沙姆 188、以及 Tweens 例如 Tween 20 禾P Tween 80?！胺€(wěn)定”制劑是其中在制備過程期間和/或在貯存時抗體在其中基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性的那種。用于測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)是本領(lǐng)域可獲得的，并且在 P印tide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker, Inc.，New York, N. Y.，Pubs. (1991)禾口 Jones，A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10 :29-90中綜述。例如，在一個實施方案中，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性根據(jù)溶液中的單體蛋白質(zhì)百分比進(jìn)行測定，具有低百分比的降解(例如片段化的)和/或聚集的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，制劑在室溫(約30°C)或在40°C穩(wěn)定至少1個月和/或在約2-8°C穩(wěn)定至少 1年或至少2年。此外，制劑優(yōu)選在制劑的冷凍(至例如_70°C )和融化后是穩(wěn)定的，下文稱為“凍/融循環(huán)”。如果在顏色和/或透明度的視覺檢查時，或如通過UV光散射或通過尺寸排阻層析測量的，抗體基本上未顯示例如聚集、沉淀和/或變性的征兆，那么它在藥物制劑中“保持其物理穩(wěn)定性”。聚集是由此個別分子或復(fù)合物共價或非共價結(jié)合以形成聚集體的過程。聚集可以進(jìn)行至形成可見沉淀的程度。制劑的穩(wěn)定性例如物理穩(wěn)定性可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行評估，包括樣品的光表觀衰減(apparent attenuation)(吸光度或光密度)的測量。光衰減的此種測量涉及制劑的濁度。制劑的濁度部分是在溶液中溶解的蛋白質(zhì)的固有性質(zhì)，并且通常通過比
9濁法進(jìn)行測定，且以比濁法濁度單位(NTU )進(jìn)行測量。例如隨溶液中一種或多種組分的濃度，例如蛋白質(zhì)和/或鹽濃度而變的濁度程度，也稱為制劑的“乳光”或“乳光外觀”。濁度程度可以通過參考使用已知濁度的懸浮液生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。用于測定關(guān)于藥物組合物的濁度程度的參考標(biāo)準(zhǔn)可以基于歐洲藥 ；ftt示}11(European Pharmacopoeia,4 Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe (EDQM)，Strasbourg，F(xiàn)rance)。根據(jù)歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn),透明溶液定義為具有小于或等于參考懸浮液的濁度的那種，所述參考懸浮液根據(jù)歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)具有約3的濁度。比濁法濁度測量可以檢測瑞利散射(Rayleigh scatter)，在不存在結(jié)合或非理想作用的情況下，這一般隨著濃度線性改變。用于評估物理穩(wěn)定性的其他方法是本領(lǐng)域眾所周知的。如果在給定時間的化學(xué)穩(wěn)定性是這樣的，從而抗體被視為仍保持其如下定義的生物學(xué)活性，那么抗體在藥物制劑中“保持其化學(xué)穩(wěn)定性”?；瘜W(xué)穩(wěn)定性可以通過例如檢測且定量化學(xué)改變形式的抗體進(jìn)行評估?；瘜W(xué)改變可以涉及大小修飾(例如修剪)，這可以使用例如尺寸排阻層析、SDS-PAGE和/或基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜法(MALDI/T0F MS)進(jìn)行評價。其他類型的化學(xué)改變包括電荷改變(例如由于脫酰胺作用或氧化而發(fā)生)，這可以通過例如離子交換層析進(jìn)行評價。如果藥物制劑中的抗體對于其預(yù)期目的是生物學(xué)活性的，那么抗體在藥物制劑中 “保持其生物學(xué)活性”。例如，如果藥物制劑中抗體的生物學(xué)活性在制備藥物制劑時顯示出的生物學(xué)活性的約30%、約20%或約10%內(nèi)(在測定的誤差內(nèi))(例如，如在抗原結(jié)合測定中測定的)，那么生物學(xué)活性被保持。在藥理學(xué)意義上，在本發(fā)明的背景中，抗體的“治療有效量”或“有效量”指在抗體對于其治療是有效的病癥癥狀的預(yù)防或治療或減輕中有效的量?！安“Y”是將獲益于用抗體治療的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使受試者易患所討論的病癥的那些病理學(xué)狀況?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防或防止措施。需要治療的那些包括已具有病癥的那些以及其中待預(yù)防病癥的那些。如本文使用的，短語“腸胃外施用”和“腸胃外施用的”意指除腸和局部施用外的施用方式，通常通過注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、 真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、顱內(nèi)(intriacranial)、關(guān)節(jié)內(nèi)、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和輸注。如本文使用的，短語“全身施用”、“全身施用的”、“外周施用，，和“外周施用的，，意指化合物、藥物或其他材料除直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)之外的施用，從而使得它進(jìn)入患者的系統(tǒng)并且因此實施代謝和其他類似過程，例如皮下施用。如本文使用的，術(shù)語“人TNF- α，，(本文縮寫為hTNF- α、TNF α或簡單地hTNF)意指人細(xì)胞因子，其作為17 kD分泌形式和沈kD膜結(jié)合形式存在，其生物學(xué)活性形式由非共價結(jié)合的17 kD分子的三聚體組成。hTNF-α的結(jié)構(gòu)在例如Permica，D.，等人(1984) Nature 312:724-729 ；Davis, J. Μ.，等人(1987)Biochem 26 1322-1326 ；和 Jones，Ε. Y.， 等人(1989) Nature 338 225-2 中進(jìn)一步描述。術(shù)語人TNF-α意欲包括重組人TNF-a (rhTNF-a )，這可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)法制備或商業(yè)購買(R & D Systems,目錄號210-TA，Minneapolis, Minn.)。如本文使用的，術(shù)語“抗體”意指免疫球蛋白分子，其包含通過二硫鍵互連的4條多肽鏈一一 2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。改變結(jié)構(gòu)的其他天然存在的抗體例如駱駝科動物(camel id)抗體也包括在這個定義中。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH) 和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域一一 CH1、CH2*CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域一一 CL。VH和VL 區(qū)可以進(jìn)一步再分成稱為互補性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，由稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域點綴。每個VH和VL由3個CDRs和4個FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發(fā)明的一個實施方案中，制劑含有具有如同美國專利號6，090, 382和6，258，562中所述那些的CDR1、CDR2和CDR3序列的抗體，所述專利各自引入本文作為參考。如本文使用的，術(shù)語“CDR”指在抗體可變序列內(nèi)的互補決定區(qū)。在重鏈和輕鏈的可變區(qū)的每一個中存在3個⑶Rs，這對于每個可變區(qū)命名為⑶R1、⑶R2和⑶R3。這些⑶Rs 的確切邊界已根據(jù)不同系統(tǒng)不同定義。由Kabat (同上)描述的系統(tǒng)不僅提供了可應(yīng)用于抗體的任何可變區(qū)的明確殘基編號系統(tǒng)，還提供了限定3個CDRs的精確殘基邊界。這些 ⑶Rs可以稱為Kabat⑶Rs。Chothia等人發(fā)現(xiàn)在Kabat⑶Rs內(nèi)的某些亞部分采用幾乎等同的肽主鏈構(gòu)象，盡管在氨基酸序列水平上具有極大多樣性(Chothia等人(1987) Mol. Biol. 196:901-917 ；Chothia 等人(1989) Nature 342:877-883)這些亞部分命名為 Li、 L2和L3或HI、H2和H3，其中“L”和“H”分別指定輕鏈和重鏈區(qū)域。這些區(qū)域可以稱為 Chothia CDRs，這具有與Kabat CDRs重疊的邊界。限定與Kabat CDRs重疊的CDRs的其他邊界已由 Padlan (1995) FASEB J. 9 133-139 和 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262 (5):732-45描述。另外其他的CDR邊界定義可能不嚴(yán)格遵循本文描述的系統(tǒng)之一，但仍將與Kabat⑶Rs重疊，盡管它們依照特定殘基或殘基組或甚至整個⑶Rs不顯著影響抗原結(jié)合的預(yù)測或?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)可以是縮短或加長的。本文使用的方法可以利用根據(jù)這些系統(tǒng)中的任何一種定義的⑶Rs，盡管某些實施方案使用Kabat或Chothia定義的⑶Rs。如本文使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡單地“抗體部分”)指保持與抗原(例如hTNF-α )特異性結(jié)合能力的抗體的一個或多個片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長抗體的片段執(zhí)行。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段的例子包括(i ) Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii ) F (ab’)2片段，包括由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd 片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(ν)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341 544-546);和(vi )分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組法通過合成接頭進(jìn)行連接，所述合成接頭使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如，Bird等人(1988) kience 242:423-426 ；^P Huston 等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此種單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。還包含了其他形式的單鏈抗體例如雙抗體。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用太短而不允許相同鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，且產(chǎn)生2個抗原結(jié)合部位(參見例如Holliger，P.，等人(1993)ftx)c. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ；Poljak, R. J.，等人(1994) Mructure 2:1121-1123)。在本發(fā)明的一個實施方案中，制劑包含美國專利號6，090, 382和6，258，562中所述的抗原結(jié)合部分，所述專利各自整體引入本文作為參考。再進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是更大免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子由抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價結(jié)合形成。 此種免疫粘附分子的例子包括鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)的使用，以制備四聚scFv分子 (Kipriyanov, S. Μ.，等人(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6 93-101 )，以及半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端聚組氨酸標(biāo)簽的使用，以制備二價和生物素化的scFv分子 (Kipriyanov, S. Μ.，等人(1994) Mol. Immunol. 31 1047-1058)。抗體部分例如 Fab 和 F (ab’)2片段可以使用常規(guī)技術(shù)由完整抗體進(jìn)行制備，例如分別地完整抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得，如本文描述的。如本文所使用的，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。在本發(fā)明中使用的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，在體外通過隨機(jī)或位點專一誘變或在體內(nèi)通過體細(xì)胞突變引入的突變)，例如，在CDRs且特別是CDR3中。然而，如本文所使用的，術(shù)語“人抗體”不意欲包括其中衍生自另一個哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。如本文所使用的，術(shù)語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(在下文部分II 中進(jìn)一步描述)，從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體(在下文部分III中進(jìn)一步描述)，從對于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動物(例如小鼠)中分離的抗體(參見例如，Taylor, L. D.，等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 6沘7_6295)，或通過任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列的剪接。此種重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而，在特定實施方案中，對此種重組人抗體實施體外誘變(或當(dāng)使用對于人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動物時，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，盡管其衍生自人種系VH和VL序列且與人種系VH和VL序列有關(guān)，但可能在體內(nèi)不天然存在于人抗體種系譜內(nèi)。如本文所使用的，“分離的抗體”意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合hTNF α的分離的抗體基本上不含特異性結(jié)合除hTNF α外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合hTNFa的分離的抗體可以與其他抗原例如來自其他物種的 TNFa分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)試劑。如本文所使用的，“中和抗體”(或“中和hTNFa活性的抗體”)意指其與hTNF α的結(jié)合導(dǎo)致hTNFa生物學(xué)活性的抑制的抗體。hTNFa生物學(xué)活性的這種抑制可以通過測量 hTNFa生物活性的一種或多種指示劑進(jìn)行評估，例如hTNF α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(在體外或在體內(nèi))、hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞活化和hTNFa與hTNF α受體結(jié)合。hTNFa生物學(xué)活性的這些指示劑可以通過幾種標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)測定中的一種或多種進(jìn)行評估，所述測定是本領(lǐng)域已
12知的并且在各自引入本文作為參考的美國專利號6，090，382和6，258，562中描述。優(yōu)選地， 抗體中和hTNFa活性的能力通過抑制hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行評估。作為另外或可替代的hTNF α活性參數(shù)，可以評估抗體抑制hTNF α誘導(dǎo)的在HUVEC上的ELAM-I 表達(dá)的能力，作為hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞活化的量度。如本文使用的，術(shù)語“表面等離振子共振”指允許通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)濃度中的改變分析實時生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如使用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,瑞典禾口 Piscataway, N. J.)。關(guān)于進(jìn)一步描述， 參見 Jonsson，U.，等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51 19-26 ；Jonsson，U.，等人(1991) Biotechniques 11:620-627 ;Johnsson，B.，等人(1995)J. Mol. Recognit. 8:125-131;禾口 Johnnson，B.，等人(1991) Anal. Biochem. 198:268—277。如本領(lǐng)域已知的，如本文使用的，術(shù)語“K。n”意指關(guān)于結(jié)合蛋白(例如抗體)與抗原結(jié)合以形成例如抗體/抗原復(fù)合物的結(jié)合速率常數(shù)。如本文使用的，術(shù)語“K。ff ”意指關(guān)于抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。如本文使用的，術(shù)語“Kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)，并且指在滴定測量中在平衡時，或通過將解離速率常數(shù)(k。ff)除以結(jié)合速率常數(shù)(k。n)獲得的值。本發(fā)明的各個方面在下文小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述。II.本發(fā)明的制劑
本發(fā)明的特征在于與領(lǐng)域公認(rèn)的制劑相比較具有改善的性質(zhì)的液體藥物制劑(例如抗體制劑)。本發(fā)明基于下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)通過去除NaCl且添加超過20 mg/mL多元醇例如糖醇，制劑中人TNF α抗體的濃度可以增至約100 mg / mL。盡管抗體的高濃度，但例如在制備、貯存和/或反復(fù)凍/融加工步驟或延長的暴露于增加的空氣-液體界面的過程中， 本發(fā)明的制劑仍能夠維持蛋白質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性。此外，盡管具有約100 mg / mL的抗體，但本發(fā)明的制劑維持低水平的蛋白質(zhì)聚集(即小于1%)。盡管具有約100 mg / mL的抗體，但本發(fā)明的制劑還令人驚訝地維持在適合于皮下注射的范圍內(nèi)的低粘度。此外，本發(fā)明的制劑例如高濃度TNF α抗體維持可溶性，維持適合于皮下注射的低粘度，并且維持在幾乎1的PH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，例如pH 5. 2 - ρΗ 6. 0。在一個實施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)48小時攪拌應(yīng)力測定后，制劑的濁度小于100 NTU0因此，本發(fā)明的高抗體制劑克服了關(guān)于制劑的許多已知挑戰(zhàn)，包括穩(wěn)定性、粘度、濁度和物理降解挑戰(zhàn)。本發(fā)明的制劑令人驚訝的特征是在不存在NaCl的情況下，雖然抗體濃度高(例如，100 mg/mL或更大)，但制劑的總體粘度保持為低的(例如約3. 1 - 3.3 mPas*s，例如約 3. 00,3. 05,3. 10,3. 15,3. 20,3. 25,3. 30,3. 35 或約 3. 40 mPas*s)。一般地，粘度隨著蛋白質(zhì)濃度增加而增加(關(guān)于綜述參見Siire等人(2004) J Pharm Sci 93:1390)。此種增加幾乎總是通過添加離子賦形劑例如NaCl和MgCl2來抵抗，然而，此種賦形劑的添加還可以導(dǎo)致溶液增加的濁度。增加的濁度經(jīng)常與不溶性蛋白質(zhì)聚集體、沉淀或蛋白質(zhì)顆粒(例如聚集)形成相關(guān)。因此，本發(fā)明的液體藥物制劑提供了具有適合于皮下施用的粘度的高抗體濃度(例如至少100 mg/ mL)，而不需添加NaCl。在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑包括高濃度的蛋白質(zhì)，從而使得液體制劑不顯示顯著乳光、聚集或沉淀。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的制劑包括高濃度的蛋白質(zhì)，從而使得適合于例如皮下施用而無顯著感覺的疼痛(例如，如通過直觀模擬標(biāo)尺(visual analog scale) (VAS) 得分測定的)。本發(fā)明的制劑包含高蛋白質(zhì)濃度，包括例如約50 mg/mL或約100 mg/mL人抗 TNF-α抗體或其抗原結(jié)合片段的蛋白質(zhì)濃度。因此，如下文實施例1中所述，在本發(fā)明的一個方面，液體藥物制劑包含約50 mg/mL的人抗TNF α抗體濃度。如下文實施例2_6中所述， 在本發(fā)明的另一個方面，液體藥物制劑包含約100 mg/mL的人抗TNFa抗體濃度。在本發(fā)明的另外一個方面，液體藥物制劑包含約150 mg/mL的人抗TNF α抗體濃度。盡管本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是包含高蛋白質(zhì)濃度的制劑，但還預(yù)期本發(fā)明的制劑可以包含約1 mg/mL -約150 mg/mL或約40 mg/mL-125 mg/mL的抗體濃度。對于上述濃度中間的濃度和范圍也預(yù)期是本發(fā)明的部分(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、 135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、 154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、 173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 mg/mL)。在另一個方面，本發(fā)明提供了液體藥物組合物，其包含多元醇、表面活性劑和緩沖系統(tǒng)，其量足以配制抗體例如阿達(dá)木單抗，用于以大于約例如100 mg/mL的濃度用于治療用途。在一個實施方案中，液體藥物組合物不包含NaCl。然而，應(yīng)當(dāng)指出盡管本發(fā)明的優(yōu)選制劑不包含NaCl，但小量NaCl可以存在于制劑中，例如約0.01 mM -約300 mM。此外，預(yù)期包括對于所述值中間的任何量的NaCl。在一個方面，本發(fā)明提供了液體藥物組合物，其包含人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合片段(例如阿達(dá)木單抗)、多元醇，而不添加NaCl，其量足以配制抗體用于治療用途。本發(fā)明還提供了液體制劑，其包含人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合片段，處于約 5.0 - 6. 4的pH，和在標(biāo)準(zhǔn)M小時攪拌應(yīng)力測定后小于約60 NTU的濁度，而不添加NaCl (例如約 20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62 或 63 NTU)。在另一個方面，本發(fā)明提供了液體制劑，其包含人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合片段，處于約5.0 -6. 4的ρΗ，和在標(biāo)準(zhǔn)48小時攪拌應(yīng)力測定后小于約100 NTU的濁度，而不添加NaCl (例如約 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 NTU)。在另外一個方面，本發(fā)明提供了液體制劑，其包含人抗TNF-α抗體或其抗原結(jié)合片段，處于約5.0 - 6.4的？禮和在5°C、25°C或40°C 3個月貯存后小于約40 NTU的濁度，而不添加NaCl(例如約20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
1448、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 NTU)。本發(fā)明的制劑的特征是包括大于20 mg/mL濃度的多元醇例如糖醇。在一個實施方案中，多元醇是山梨糖醇或甘露糖醇。應(yīng)當(dāng)指出山梨糖醇或甘露糖醇對蛋白質(zhì)溶液的添加不總是與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中的增加相關(guān)。例如，當(dāng)在熱應(yīng)力或界面應(yīng)力條件過程中評估時， 山梨糖醇不提供針對豬生長激素沉淀的優(yōu)點-分別與Tween 20和羥丙基-β-環(huán)糊精形成對比(Charman 等人(1993) Pharm Res. 10 (7) 954-62)。在一個實施方案中，在本發(fā)明的制劑中使用的合適多元醇是糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇。包含多元醇的本發(fā)明的液體制劑一般包含超過約20 mg的多元醇。在一個實施方案中，制劑包含超過約30 mg/mL的多元醇。在另一個實施方案中，制劑包含超過約40 mg/mL的多元醇。在另一個實施方案中，制劑包含約40-45 mg/mL的多元醇，例如約35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 或 55 mg/mL。此外，預(yù)期包括使用任何上述值的組合作為上和/或下限的值范圍。在本發(fā)明的一些實施方案中，制備包含在pH緩沖溶液中的抗體的液體制劑。本發(fā)明的緩沖液具有范圍為約4 -約8的pH，優(yōu)選約4.5 -約7.0，更優(yōu)選約4.5 -約6.0，甚至更加優(yōu)選約4. 8 -約5. 5，并且最優(yōu)選具有約5.0 -約6.4的pH。在一個實施方案中， 本發(fā)明的制劑的PH是約5. 2。在另一個實施方案中，本發(fā)明的制劑的pH是約6.0。對于上述PH中間的范圍也預(yù)期是本發(fā)明的部分(例如4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3、 5. 4,5. 5,5. 6,5. 7,5. 8,5. 9,6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4)。預(yù)期包括使用任何上述值的組合作為上和/或下限的值范圍，例如5. 2 - 5.8。將控制pH在這個范圍內(nèi)的緩沖液的例子包括磷酸鹽、乙酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、谷氨酸、組氨酸、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸緩沖液。在本發(fā)明的特定實施方案中，制劑包含含有檸檬酸鹽和/或磷酸鹽以維持PH在約 5.0 -約6. 4的范圍中的緩沖系統(tǒng)。在一個實施方案中，制劑的pH是約5.2。在另一個實施方案中，制劑的PH是約6.0。在另一個優(yōu)選實施方案中，緩沖系統(tǒng)包括檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉二水合物和/或磷酸二氫鈉二水合物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，緩沖系統(tǒng)包括約 1. 15-1. 45 mg/ml 檸檬酸(例如約 1. 15,1. 20,1. 25,1. 30,1. 35,1. 40 或 1. 45)、約 0. 2-0. 4 mg/mL脫水檸檬酸鈉(例如約0. 2,0. 25,0. 3,0. 35或0. 4)、約1. 35-1. 75 mg/mL脫水磷酸氫二鈉(例如 1. 35、1. 40、1. 45、1. 50、1. 55、1. 60、1. 65、1. 70 或 1. 75)、約 0. 75-0. 95 mg/mL 脫水磷酸二氫鈉(例如約0. 75,0. 80、0. 85、0. 9或0. 95)。對于上述濃度中間的值和范圍也預(yù)期是本發(fā)明的部分。此外，預(yù)期包括使用任何上述值的組合作為上和/或下限的值范圍，例如1. 20-1. 40 mg/mL。在其他實施方案中，緩沖系統(tǒng)包括1. 30-1. 31 mg/mL檸檬酸(例如約1. 305 mg/ mL)。在另一個實施方案中，緩沖系統(tǒng)包括約0. 27-0. 33 mg/mL脫水檸檬酸鈉(例如約0. 305 mg/mL)。在一個實施方案中，緩沖系統(tǒng)包括約1. 5-1. 56 mg/mL脫水磷酸氫二鈉(例如約1. 53 mg/mL)。在另一個實施方案中，緩沖系統(tǒng)包括約0.83-0. 89 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物(例如約 0. 86 mg/mL)。去污劑或表面活性劑也可以添加到本發(fā)明的抗體制劑中。示例性去污劑包括非離子去污劑例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污劑的量是這樣的，從而使得它減少配制的抗體的聚集和/或使制劑中的微粒形成降到最低和/或減少吸附。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，制劑包括其為聚山梨醇酯的表面活性劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，制劑含有去污劑聚山梨醇酯80。在一個優(yōu)選實施方案中，制劑含有約0. 1 -約2. 0 mg/mL聚山梨醇酯80，例如約1 mg/mL。對于上述濃度中間的值和范圍也預(yù)期是本發(fā)明的部分，例如0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、 0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、1· 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9。此外，預(yù)期包括使用任何上述值的組合作為上和/或下限的值范圍，例如0.3 - 1.1 mg/mL。在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑基本上由至少約100 mg/mL濃度的人TNF α抗體或其抗原結(jié)合部分、表面活性劑(例如聚山梨醇酯80)、多元醇例如(例如超過20 mg/mL 山梨糖醇或甘露糖醇)、和緩沖系統(tǒng)(例如檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉二水合物和/或磷酸二氫鈉二水合物)組成，并且不含有NaCl。在一個實施方案中，制劑含有上文鑒定的試劑(即至少約100 mg/mL濃度的抗體、 緩沖系統(tǒng)、多元醇和表面活性劑，不含NaCl)，并且基本上不含防腐劑例如苯甲醇、酚、間甲酚、氯代丁醇和苯索氯銨Cl。在另一個實施方案中，防腐劑可以包括在制劑中。一種或多種其他藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑例如Remington’ s Pharmaceutical Sciences第 16版，0sol，A. Ed. (1980)中描述的那些可以包括在制劑中，條件是它們不會顯著不利地影響制劑的所需特征?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在采用的劑量和濃度對于接受者是無毒的，并且包括；另外的緩沖劑；共溶劑；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑例如EDTA ；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物);生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或成鹽抗衡離子例如鈉。本文的制劑還可以與如對于待治療的特定適應(yīng)癥所必需的一種或多種其他治療劑組合，優(yōu)選具有不會不利地影響制劑的抗體的互補活性的那些。此種治療劑以對于預(yù)期目的有效的量適當(dāng)?shù)卮嬖谟诮M合中?？梢耘c本發(fā)明的制劑組合的另外治療劑在美國專利號 6，090，382和6，258，562中進(jìn)一步描述，所述專利各自引入本文作為參考。待用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這通過在制劑制備前或后經(jīng)過無菌濾過膜過濾容易地完成。如上所述，本發(fā)明的液體制劑具有有利的穩(wěn)定性和貯存性質(zhì)。液體制劑的穩(wěn)定性不取決于貯存形式，并且包括但不限于冷凍、凍干、噴霧干燥的制劑，或活性成分懸浮于其中的制劑。穩(wěn)定性可以在所選溫度測量所選時間段。在本發(fā)明的一個方面，液體制劑中的蛋白質(zhì)以液體形式穩(wěn)定至少約3個月；至少約4個月、至少約5個月；至少約6個月；至少約 12個月；至少約18個月。對于上述時間段中間的值和范圍也預(yù)期是本發(fā)明的部分，例如約 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或約 24 個月。此外，預(yù)期包括使用任何上述值的組合作為上和/或下限的值范圍。優(yōu)選地，制劑在室溫(約30°C)或 40°C穩(wěn)定至少約1個月和/或在約2-8°C穩(wěn)定至少約1年，或更優(yōu)選在約2-8°C穩(wěn)定至少約 2年。此外，制劑優(yōu)選在制劑的冷凍(至例如_80°C )和融化后是穩(wěn)定的，下文稱為“凍/融循環(huán)”。液體制劑中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性還可以定義為制劑中蛋白質(zhì)的單體、聚集體或其片段或組合的百分比。如果在顏色和/或透明度的視覺檢查后，或如通過UV光散射或通過尺寸排阻層析測量的，蛋白質(zhì)基本上未顯示聚集、沉淀和/或變性的征兆，那么它在制劑中“保持其物理穩(wěn)定性”。在本發(fā)明的一個方面，穩(wěn)定液體制劑是具有小于約10%且優(yōu)選小于約 5%在制劑中作為聚集體存在的蛋白質(zhì)的制劑。在一個實施方案中，液體制劑的物理穩(wěn)定性通過測定在攪拌應(yīng)力測定，例如M小時或48小時攪拌應(yīng)力測定后制劑的濁度進(jìn)行測定。例如，攪拌應(yīng)力測定可以通過下述執(zhí)行將合適體積的液體制劑置于具有磁攪拌器例如(多點(multipoint)HP，550 rpm)的燒杯中，在任何合適時間例如在T0-T48 (小時)取出等分試樣，并且根據(jù)需要對等分試樣執(zhí)行合適測定。在相同條件下但不含攪拌的制劑樣品充當(dāng)對照。濁度測量可以使用來自Hach (德國)的實驗室濁度測量系統(tǒng)執(zhí)行，并且報道為比濁法單位(NTU)。本發(fā)明的液體制劑還具有有利的可容許性(tolerability)性質(zhì)?？扇菰S性使用疼痛直觀模擬標(biāo)尺(VAS)基于受試者察覺到的注射位點疼痛評估進(jìn)行評價。(VAS)是當(dāng)其范圍跨越值的連續(xù)區(qū)例如從無到極度量的疼痛時測量疼痛的測量儀器。在操作上VAS是水平線，長度約100 mm，通過數(shù)字和/或詞描述符例如0或10、或‘無疼痛’或‘極痛’固定，任選伴隨在極端之間的另外詞或數(shù)字描述符，例如輕度、中度和重度； 或 1 到 9)(參見例如，Lee JS，等人(2000) Acad Emerg Med 7:550)。可以測量的可容許性的另外指示物包括例如Draize Scale (出血、瘀點、紅斑、水腫、瘙癢)和擦傷。III.用于在本發(fā)明的制劑中使用的抗體
可以在本發(fā)明的制劑中使用的抗體是針對抗原TNF-α包括人TNF-α (或hTNF-α)的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的特征在于分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，其以高親和力和低解離速率與人TNF-α結(jié)合，并且還具有高中和能力。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的人抗體是重組、中和人抗hTNF-α抗體。本發(fā)明的最優(yōu)選的重組、中和抗體在本文中稱為D2E7，也稱為HUMIRA 或阿達(dá)木單抗(D2E7 VL區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :1中； D2E7 VH區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :2中)。D2E7 (阿達(dá)木單抗/ HUMIRA )的性質(zhì)已在Salfeld等人，美國專利號6，090，382,6, 258，562和6，509，015中描述，所述專利各自引入本文作為參考。在一個實施方案中，人TNF-α或其抗原結(jié)合部分以1 χ 10_8 M或更少的Kd和1 χ 10-3 s-1或更少的Koff速率常數(shù)與人TNF-α解離，兩者都通過表面等離振子共振測定， 并且在標(biāo)準(zhǔn)體外測定中以1 χ 10-7 M或更少的IC50中和人TNF-α細(xì)胞毒性。更優(yōu)選地，分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分以5 χ 10-4 s-1或更少的KofT，或甚至更加優(yōu)選地以1 χ 10-4 s-1或更少的KofT與人TNF-α解離。更優(yōu)選地，分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在標(biāo)準(zhǔn)體外測定中以1 χ 10-8 M或更少的IC50，甚至更加優(yōu)選地以1 χ 10-9 M 或更少的IC50且更加優(yōu)選地以1 χ 10-10 M或更少的IC50中和人TNF-α細(xì)胞毒性。在優(yōu)選實施方案中，抗體是分離的人重組抗體或其抗原結(jié)合部分。本領(lǐng)域眾所周知抗體重和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對于抗原的結(jié)合特異性/親和力中起重要作用。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及通過施用人抗體治療Crohn氏病，所述人抗體對于與hTNF-α的結(jié)合具有慢解離動力學(xué)，并且具有在結(jié)構(gòu)上等同于D2E7的那些或與D2E7的那些相關(guān)的輕和重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。D2E7 VL⑶R3的位置9可以由Ala或Thr占據(jù)，而基本上不影響Koff。因此，關(guān)于D2E7 VL⑶R3的共有基序包含氨基酸序列 Q-R-Y-N-R-A-P-Y- (T/A) (SEQ ID NO :3)。另外，D2E7 VH CDR3 的位置 12 可以由 Tyr 或 Asn占據(jù)，而基本上不影響Koff。因此，關(guān)于D2E7 VH⑶R3的共有基序包含氨基酸序列 V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D- (Y/N) (SEQ ID NO :4)。此外，如美國專利號 6，090，382 的實施例2中證實的，D2E7重和輕鏈的⑶R3結(jié)構(gòu)域可適合于由單個丙氨酸殘基的取代(在VL⑶R3 內(nèi)的位置1、4、5、7或8上或在VH CDR3內(nèi)的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上)，而基本上不影響Koff。再進(jìn)一步地，技術(shù)人員將認(rèn)識到，已知D2E7 VL和VH⑶R3結(jié)構(gòu)域?qū)νㄟ^丙氨酸取代的適應(yīng)性，在CDR3結(jié)構(gòu)域內(nèi)其他氨基酸的取代可以是可能的，同時仍保持抗體的低解離速率常數(shù)，特別是由保守氨基酸的取代。優(yōu)選地，在D2E7 VL和/或VH CDR3結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行不超過1 - 5個保守氨基酸取代。更優(yōu)選地，在D2E7 VL和/或VH⑶R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行不超過1 - 3個保守氨基酸取代。另外，保守氨基酸取代不應(yīng)在對于與hTNF α結(jié)合關(guān)鍵的氨基酸位置上進(jìn)行。D2E7 VL⑶R3的位置2和5以及D2E7 VH⑶R3的位置1和7看起來對于與hTNFa的相互作用是關(guān)鍵的，并且因此保守氨基酸取代優(yōu)選不在這些位置上進(jìn)行(盡管在D2E7 VL⑶R3的位置5上的丙氨酸取代是可接受的，如上所述)(參見美國專利號 6，090，382)。因此，在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選含有下述特征
a)如通過表面等離振子共振測定的，以1χ 10-3 s-1或更少的KofT速率常數(shù)與人 TNF α解離；
b)具有包含SEQID N0:3，或通過在位置1、4、5、7或8上的單個丙氨酸取代，或通過在位置1、3、4、6、7、8和/或9上的1 - 5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO 3修飾的氨基酸序列的輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域；
c)具有包含SEQID N0:4，或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代，或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12上的1 - 5個保守氨基酸取代由SEQ ID NO 4修飾的氨基酸序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地，人抗體或其抗原結(jié)合部分以5 χ 10-4 s-1或更少的Koff與人TNF α解離。甚至更加優(yōu)選地，人抗體或其抗原結(jié)合部分以1 χ 10-4 s-1或更少的KofT與人TNF α解離。在另外一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選含有輕鏈可變區(qū)(LCVR)且具有重鏈可變區(qū)(HCVR)，所述LCVR具有包含SEQ ID NO :3，或通過在位置1、4、5、7或8上的單個丙氨酸取代由SEQ ID NO :3修飾的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域，所述HCVR具有包含SEQ ID NO :4，或通過在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上的單個丙氨酸取代由SEQ ID Ν0:4修飾的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，LCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域(即D2E7 VL⑶R2)，并且HCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域(即D2E7 VH⑶R2)。甚至更加優(yōu)選地，LCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO 7 的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域(即D2E7 VL⑶Rl )，并且HCVR具有包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域(即D2E7 VH⑶R1)。關(guān)于VL的構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來自V κ I人種系家族，更優(yōu)選來自Α20人種系Vk基因，并且最優(yōu)選來自美國專利號6，090, 382的圖IA和IB中所示的D2E7 VL構(gòu)架序列。關(guān)于VH的構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來自VH3人種系家族，更優(yōu)選來自DP-31人種系VH基因，并且最優(yōu)選來自美國專利號6，090, 382的圖2Α和2Β中所示的D2E7 VH構(gòu)架序列。因此，在另一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選含有包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)(即D2E7 VL)和包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)(即D2E7 VH)0在某些實施方案中，抗體包含重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)或IgG4 重鏈恒定區(qū)。此外，抗體可以包含輕鏈恒定區(qū)，κ輕鏈恒定區(qū)或λ輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地， 抗體包含κ輕鏈恒定區(qū)?？商娲?，抗體部分可以是例如Fab片段或單鏈Fv片段。在另外其他實施方案中，本發(fā)明包括含有D2E7相關(guān)VL和VH⑶R3結(jié)構(gòu)域的分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的用途。例如，抗體或其抗原結(jié)合部分具有輕鏈可變區(qū)(LCVR)或具有重鏈可變區(qū)(HCVR)，所述輕鏈可變區(qū)(LCVR)具有包含選自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 的氨基酸序列的 CDR3 結(jié)構(gòu)域， 所述重鏈可變區(qū)(HCVR)具有包含選自 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29,SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34 禾口 SEQ ID NO 35的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的方法和組合物中使用的抗體或抗體部分可以通過免疫球蛋白輕和重鏈基因在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)而制備。為了重組表達(dá)抗體，用攜帶DNA片段的一種或多種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述DNA片段編碼抗體的免疫球蛋白輕和重鏈，從而使得輕和重鏈在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且優(yōu)選分泌到宿主細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)，從所述培養(yǎng)基中可以回收抗體。標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法用于獲得抗體重和輕鏈基因，將這些基因摻入重組表達(dá)載體內(nèi)，并且將載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis (編輯)， Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N. Y., (1989), Ausubel, F. M.等人(編輯)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等人的美國專利號4，816，397中描述的那些。為了表達(dá)阿達(dá)木單抗(D2E7)或阿達(dá)木單抗(D2E7)相關(guān)抗體，首先獲得編碼輕和重鏈可變區(qū)的DNA片段。這些DNAs可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通過種系輕和重鏈可變序列的擴(kuò)增和修飾獲得。關(guān)于人重和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如,“Vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫；還參見Kabat，Ε. A.，等人(1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91—3242 ；Tomlinson, I. M.，等人(1992)"The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798 ；和 Cox，J. P. L.等人 (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836 ；所述參考文獻(xiàn)各自的內(nèi)容特別引入本文作為參考)。為了獲得編碼D2E7或D2E7相關(guān)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA片段，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增人種系VH基因的VH3家族成員。最優(yōu)選地，擴(kuò)增DP-31 VH種系序列。為了獲得編碼D2E7 或D2E7相關(guān)抗體的輕鏈可變區(qū)的DNA片段，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增人種系VL基因的V κ I家族成員。最優(yōu)選地，擴(kuò)增Α20 VL種系序列。適合于在擴(kuò)增DP-31種系VH和Α20種系VL序列中使用的PCR引物可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法基于上文引用的參考文獻(xiàn)中公開的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計。一旦獲得了種系VH和VL片段，這些序列就可以進(jìn)行突變以編碼本文公開的D2E7 或D2E7相關(guān)氨基酸序列。由種系VH和VL DNA序列編碼的氨基酸序列首先與D2E7或D2E7 相關(guān)VH和VL氨基酸序列進(jìn)行比較，以鑒定D2E7或D2E7相關(guān)序列中與種系不同的氨基酸殘基。隨后，種系DNA序列的合適核苷酸這樣突變，從而使得突變的種系序列編碼D2E7或 D2E7相關(guān)氨基酸序列，其中使用遺傳密碼以測定應(yīng)進(jìn)行哪些核苷酸改變。種系序列的誘變通過標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行，例如PCR介導(dǎo)的誘變(其中將突變的核苷酸摻入PCR引物內(nèi)，從而使得 PCR產(chǎn)物包含突變)或位點定向誘變。此外，應(yīng)當(dāng)注意如果通過PCR擴(kuò)增獲得的“種系”序列編碼構(gòu)架區(qū)中與真實種系構(gòu)型的氨基酸差異(即與真實種系序列相比較在擴(kuò)增的序列中的差異，例如由于體細(xì)胞突變)，可能希望將這些氨基酸差異改變回到真實種系序列(即構(gòu)架殘基到種系構(gòu)型的“回復(fù)突變”)。一旦獲得了編碼D2E7或D2E7相關(guān)VH和VL區(qū)段的DNA片段(例如通過種系VH和 VL基因的擴(kuò)增和誘變，如上所述)，這些DNA片段就可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作， 例如以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿L抗體鏈基因，F(xiàn)ab片段基因或scFv基因。在這些操作中， 編碼VL或VH的DNA片段與編碼另一種蛋白質(zhì)例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭的另一個DNA片段可操作地連接。如這個背景中使用的，術(shù)語“可操作地連接的”意指2個DNA片段這樣連接，從而使得由2個DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合讀框。通過使編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2和CH3)的另一個DNA分子可操作地連接，可以使編碼VH區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)變?yōu)槿L重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat，Ε. A.，等人(1991) kquences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U. S. Department of Health and Human Services,NIH
發(fā)明者克勞澤 H-J., 諾伊 M., 弗勞恩霍弗 W. 申請人:艾博特生物技術(shù)有限公司